CN110988203B - 分析用试样的制备方法、分析方法和分析用试样的制备用试剂盒 - Google Patents

分析用试样的制备方法、分析方法和分析用试样的制备用试剂盒 Download PDF

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Abstract

提供分析用试样的制备方法、分析方法和分析用试样的制备用试剂盒。精度良好地分析供于使用HILIC用载体的纯化的糖链试样。分析用试样的制备方法用于进行试样中所含的糖链的分析，所述方法具备：使试样与碱性的反应溶液接触，进行使糖链中所含的内酯结构酰胺化的酰胺化反应；在供于酰胺化反应后的反应溶液中添加酸性溶液；以及，对于添加酸性溶液后的反应溶液中所含的试样，使用亲水相互作用色谱用的载体进行纯化。

Description

分析用试样的制备方法、分析方法和分析用试样的制备用试 剂盒
技术领域
本发明涉及分析用试样的制备方法、分析方法和分析用试样的制备用试剂盒。
背景技术
使用质谱分析等来分析包含糖链的试样时，进行如下操作：使用亲水相互作用色谱(Hydrophilic Interaction Chromatography：以下适宜地称为HILIC)用的载体对糖链进行纯化，制备分析用试样(参照专利文献1和非专利文献1)。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特许第6135710号公报
非专利文献
非专利文献1：Nishikaze T,Tsumoto H,Sekiya S,Iwamoto S,Miura Y,TanakaK."Differentiation of Sialyl Linkage Isomers by One-Pot Sialic AcidDerivatization for Mass Spectrometry-Based Glycan Profiling"AnalyticalChemistry,(美国),ACS Publications,2017年2月21日、Volume 89,Issue 4,pp.2353-2360
发明内容
发明要解决的问题
发明人发现了在制备用于分析糖链中所含的唾液酸的分析用试样时，使用碱性的溶液适宜地进行唾液酸的酰胺化的方法。但是，在将反应后得到的碱性的溶液用如专利文献1记载那样的包含0.1重量％左右的三氟乙酸的有机溶剂进行稀释，用HILIC用载体纯化时，存在如下问题：糖链的回收率降低、或质谱图中显著出现与污染物对应的峰等。
用于解决问题的方案
本发明的优选实施方式的分析用试样的制备方法用于进行试样中所含的糖链的分析，所述分析用试样的制备方法具备：使前述试样与碱性的反应溶液接触，来进行使前述糖链中所含的内酯结构酰胺化的酰胺化反应；在供于前述酰胺化反应后的前述反应溶液中添加酸性溶液；以及使用亲水相互作用色谱用的载体，对添加前述酸性溶液后的前述反应溶液中所含的前述试样进行纯化。
在进一步优选的实施方式中，添加前述酸性溶液后的前述反应溶液的pH为10以下。
在进一步优选的实施方式中，其具备：在前述酰胺化反应前，进行使前述糖链中所含的唾液酸的至少一部分内酯化的内酯化反应。
在进一步优选的实施方式中，前述内酯化反应通过使包含脱水缩合剂的内酯化反应溶液与前述试样接触来进行。
在进一步优选的实施方式中，前述酰胺化反应中使用的前述反应溶液包含氨或胺，前述内酯化反应溶液还包含与前述糖链中所含的前述唾液酸反应的亲核试剂，前述亲核试剂不同于前述酰胺化反应中使用的前述反应溶液中所含的氨或胺，前述内酯化反应中，在前述试样中添加前述内酯化反应溶液，根据前述唾液酸的连接方式，使前述唾液酸的一部分内酯化，使前述亲核试剂的至少一部分结合于前述唾液酸的另一部分。
在进一步优选的实施方式中，前述内酯化反应中，选自由α2,3-唾液酸、α2,8-唾液酸和α2,9-唾液酸组成的组中的至少一种前述唾液酸被内酯化。
在进一步优选的实施方式中，前述内酯化反应中，在前述试样中添加前述内酯化反应溶液，使α2,3-唾液酸内酯化，使前述亲核试剂的一部分结合于α2,6-唾液酸。
在进一步优选的实施方式中，前述酸性溶液为包含0.2重量％以上的三氟乙酸的溶液。
本发明的优选实施方式的分析方法具备：通过上述分析用试样的制备方法来制备分析用试样；以及，对所制备的前述分析用试样进行分析。
在进一步优选的实施方式中，所制备的前述分析用试样利用质谱分析和色谱中的至少一者来进行分析。
本发明的优选实施方式的分析用试样的制备用试剂盒具备酸性溶液，用于上述分析用试样的制备方法。
发明的效果
根据本发明，使用HILIC用载体对碱性的溶液中所含的糖链试样进行纯化的情况下，能够精度良好地分析该糖链试样。
附图说明
图1为示出一实施方式的分析方法的流程的流程图。
图2的(A)、(B)和(C)为示出实施例或比较例中使用的糖链的结构的图。
图3为将供于酰胺化反应后的包含酸性糖链的试样用乙腈(ACN)稀释后，导入到HILIC用柱中而得到分析用试样，对于该分析用试样以负离子模式进行质谱分析而得到的质谱图。
图4为将供于酰胺化反应后的包含中性糖链的试样分别用ACN(上部)、4％三氟乙酸(TFA)ACN溶液(中部)和5％TFA ACN溶液(下部)稀释后，导入到HILIC用柱中而得到分析用试样，对于这些分析用试样以负离子模式进行质谱分析而得到的质谱图。
图5为将供于酰胺化反应后的包含中性糖链的试样用ACN稀释后，分别导入到HILIC用柱A(推荐pH：2～7.5)和柱B(推荐pH：2～8.5)中而得到分析用试样，对于这些分析用试样以负离子模式进行质谱分析而得到的质谱图。
具体实施方式
以下，参照附图对用于实施本发明的方式进行说明。以下的实施方式的分析用试样的制备方法中，使用碱性的反应溶液使试样中所含的糖链酰胺化，在反应后的包含试样的溶液中添加酸性溶液后，使用HILIC用载体对糖链进行纯化。
-第1实施方式-
第1实施方式的分析用试样的制备方法中，对于试样中所含的糖链，进行与糖链中所含的唾液酸的连接方式(linkage type)相应的修饰。该修饰通过2阶段的反应来进行，通过第2阶段的反应进行了唾液酸的酰胺化后，使用HILIC用载体对试样中所含的糖链进行纯化。
唾液酸为生物体内大量存在的糖。唾液酸在生物体内包含在与蛋白质结合的糖链中，多存在于糖链的非还原末端。因此，唾液酸由于在这种糖蛋白分子中配置在分子的外侧、可被其他分子直接识别，因此具有重要的作用。
唾液酸与邻接的糖之间的连接方式有时会不同。例如已知人的N-连接型糖链(N型糖链)主要为α2,3-和α2,6-的连接方式，O-连接型糖链(O型糖链)、鞘糖脂在前述连接方式的基础上还有α2,8-和α2,9-的连接方式。根据这种连接方式的区别，唾液酸可以被不同的分子识别，具有不同的作用。
含有唾液酸的唾液酸化糖链的基于质谱分析的解析由于唾液酸具有负电荷而难以用正离子模式进行电离、唾液酸容易分解，因此并不容易。进而，区分唾液酸的连接方式而进行解析时，由于分子量不会根据唾液酸的连接方式而发生变化，因此更加困难。于是，为了使唾液酸稳定化、区分连接方式而进行解析，实施了进行连接方式特异性修饰的化学修饰法。
图1为示出本实施方式的分析用试样的制备方法的分析方法的流程的流程图。该分析方法中，利用化学修饰法区分唾液酸的连接方式而进行分析。步骤S1001中，准备包含糖链的试样。
包含糖链的试样没有特别限定，可以包含选自由游离糖链、糖肽和糖蛋白、以及糖脂组成的组中的至少一种分子。关于本实施方式的分析用试样的制备方法，由于适宜用于糖链中所含的唾液酸的分析，因此试样中的糖链优选含有N-连接型糖链、O-连接型糖链、糖脂型糖链等有可能在末端具有唾液酸的糖链。试样中的糖链更优选包含容易内酯化的α2,3-唾液酸、α2,8-唾液酸和α2,9-唾液酸中的至少一种。
试样包含游离糖链时，能够使用从糖蛋白、糖肽、糖脂游离出来的糖链。作为使糖链从糖蛋白、糖肽、糖脂游离的方法，可以采用使用N-糖苷酶、O-糖苷酶、鞘糖脂内切糖苷酶(Endoglycoceramidase)等的酶处理、肼分解、基于碱处理的β脱离等方法。使N-连接型糖链从糖肽和糖蛋白的肽链游离的情况下，可适宜使用基于肽-N-糖苷酶F(PNGase F)、肽-N-糖苷酶A(PNGase A)、内切-β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(Endo M)等的酶处理。另外，可以适宜进行糖链的还原末端的吡啶氨基化(PA化)等修饰。在酶处理前，可以进行后述糖肽或糖蛋白的肽链的切断。
试样包含糖肽或糖蛋白时，如后述的“关于糖肽和糖蛋白的副反应的抑制”的部分所述那样，可以适宜进行用于抑制肽部分的副反应的处理。另外，糖肽或糖蛋白的肽链的氨基酸的残基数多的情况下，优选通过酶切断等来将肽链切断而使用。例如制备质谱分析用的试样时，肽链的氨基酸残基数优选为30以下、更优选为20以下、进一步优选为15以下。另一方面，在要求明确糖链所结合的肽的来源的情况下，肽链的氨基酸残基数优选为2以上，更优选为3以上。
作为将糖肽或糖蛋白的肽链切断时的消化酶，可使用胰蛋白酶、Lys-C、精氨酸内肽酶、胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、蛋白酶K、链霉蛋白酶E等。可以将这些消化酶中的2种以上组合使用。切断肽链时的条件没有特别限定，可采用与所使用的消化酶相应的适宜的规程。在该切断前，可以进行试样中的蛋白质和肽的改性处理、烷基化处理。改性处理、烷基化处理的条件没有特别限定。
需要说明的是，上述肽链的切断处理可以在后述步骤S1003的内酯化反应后进行。另外，可以不是通过酶切断，而是通过化学切断等来将肽链切断。
步骤S1001结束后，进入步骤S1003。
(内酯化反应)
步骤S1003中，使试样与反应溶液(以下称为内酯化反应溶液)接触，进行对糖链中所含的唾液酸的至少一部分进行内酯化的内酯化反应(以下在记载为内酯化反应时，在没有特别提及的情况下，是指步骤S1003的内酯化反应)。内酯化反应中，优选对难以内酯化的α2,6-唾液酸等的唾液酸的一部分进行与内酯化不同的修饰，以下也以进行该修饰为例进行说明。内酯化反应中，适宜地对α2,3-唾液酸、α2,8-唾液酸和α2,9-唾液酸进行内酯化。
内酯化反应溶液包含脱水缩合剂以及含有醇、胺或它们的盐的亲核试剂。调整脱水缩合剂和亲核试剂的种类、浓度，以便根据唾液酸的连接方式选择性地引发脱水反应或亲核反应。
需要说明的是，不进行难以内酯化的α2,6-唾液酸等唾液酸的修饰的情况下，无需包含亲核试剂。
由α2,3-唾液酸的羧基的分子内脱水产生的内酯为六元环，有可能由α2,6-唾液酸的羧基的分子内脱水产生的内酯为七元环。因此，生成七元环稳定的六元环的α2,3-唾液酸与α2,6-唾液酸相比更容易内酯化。另外，α2,3-唾液酸的羧基与α2,6-唾液酸的羧基相比位于位阻较大的位置，因此与α2,6-唾液酸相比的话，大的分子较不容易与α2,3-唾液酸反应。根据这种由唾液酸的连接方式带来的分子结构的区别，调整脱水缩合剂和亲核试剂的种类、浓度，以便根据唾液酸的连接方式进行不同的修饰。
(内酯化反应中的脱水缩合剂)
脱水缩合剂优选含有碳二亚胺。这是由于，如果使用碳二亚胺，则与使用鏻系脱水缩合剂(所谓的BOP试剂)、脲鎓系脱水缩合剂作为脱水缩合剂的情况相比，存在于位阻大的部位的羧基不易被酰胺化。作为碳二亚胺的例子，可列举出：N,N’-二环己基碳二亚胺(DCC)、N-(3-二甲氨基丙基)-N’-乙基碳二亚胺(EDC)、N,N’-二异丙基碳二亚胺(DIC)、1-叔丁基-3-乙基碳二亚胺(BEC)、N,N’-二叔丁基碳二亚胺、1,3-二对甲苯酰基碳二亚胺、双(2,6-二异丙基苯基)碳二亚胺、双(三甲基甲硅烷基)碳二亚胺、1,3-双(2,2-二甲基-1,3-二氧杂环戊烷-4-基甲基)碳二亚胺(BDDC)、它们的盐。
(内酯化反应中的添加剂)
为了促进利用脱水缩合剂的脱水缩合且抑制副反应，优选在碳二亚胺的基础上还使用亲核性高的添加剂。作为亲核性高的添加剂，优选使用1-羟基苯并三唑(HOBt)、1-羟基-7-氮杂-苯并三唑(HOAt)、4-(二甲氨基)吡啶(DMAP)、2-氰基-2-(羟基亚氨基)乙酸乙酯(CHA)、N-羟基-琥珀酰亚胺(HOSu)、6-氯-1-羟基-苯并三唑(Cl-HoBt)、N-羟基-3,4-二氢-4-氧代-1,2,3-苯并三嗪(HOOBt)等。
(内酯化反应中的亲核试剂)
作为亲核试剂使用的胺优选含有含2个以上碳原子的烷基伯胺或烷基仲胺。烷基伯胺优选为乙胺、丙胺、异丙胺、丁胺、仲丁胺、叔丁胺等。烷基仲胺优选为二甲胺、乙基甲胺、二乙胺、丙基甲胺、异丙基甲胺等。从使如α2,3-唾液酸的羧基这样存在于位阻大的部位的羧基不易被酰胺化的角度来看，优选使用异丙胺这种具有支链烷基(以下“支链”表示烃链的支链)的胺。在内酯化反应溶液的亲核试剂使用胺的情况下，根据唾液酸的连接方式，对α2,6-唾液酸等一部分唾液酸的羧基进行酰胺化。
作为亲核试剂使用的醇没有特别限定，例如可以使用甲醇和乙醇等。在内酯化反应溶液的亲核试剂使用醇的情况下，根据唾液酸的连接方式，对α2,6-唾液酸等一部分唾液酸的羧基进行酯化。
需要说明的是，亲核试剂可以包含上述亲核试剂的盐。
(关于脱水缩合剂和亲核试剂的浓度)
内酯化反应溶液的脱水缩合剂的浓度例如优选为1mM～5M，更优选为10mM～3M。将碳二亚胺与HOAt、HOBt等亲核性高的添加剂并用的情况下，优选各自的浓度为上述范围。内酯化反应溶液的亲核试剂的浓度优选为0.01～20M、更优选为0.1M～10M。内酯化反应时的反应温度优选为-20℃～100℃左右、更优选为-10℃～50℃。使试样与内酯化反应溶液接触的时间根据试样、试剂的浓度、反应温度等来调整，例如为30分钟～几小时左右。
(进行内酯化反应的相)
内酯化反应可以以液相或以固相进行。只要能够使试样与内酯化反应溶液接触，则对引发内酯化反应时的试样的状态没有特别限定。
以固相进行反应的情况下，作为固相载体，只要可以将糖链、糖肽、糖蛋白等固定，则可以没有特别限制地使用。例如为了将糖肽、糖蛋白固定，可以使用具有环氧基、甲苯磺酰基、羧基、氨基等作为配体的固相载体。另外，为了将糖链固定，可以使用具有酰肼基、氨氧基等作为配体的固相载体。另外，也优选使糖链吸附于亲水相互作用色谱(HILIC)用的载体、即固定相，进一步优选该HILIC用载体含有酰胺基。
以固相进行内酯化反应的情况下，使固定于固相载体的试样与内酯化反应溶液作用来进行内酯化后，通过化学方法、酶反应等而使试样从载体游离并回收即可。例如，可以使用PNGase F等糖苷酶、胰蛋白酶等消化酶，将固定于载体的糖蛋白、糖肽进行酶切断并回收，也可以用弱酸性溶液使结合于具有酰肼基的固相载体的糖链游离并回收。HILIC中，能够利用以乙腈等为溶剂的内酯化反应溶液进行内酯化反应，用水等水系溶液将试样洗脱。
通过在将试样固定于固相载体的状态下进行反应，使得反应溶液的去除、脱盐纯化更为容易，能够将试样的制备简化。另外，使用固相载体的情况下，如上所述以糖蛋白、糖肽的状态固定试样，在内酯化反应后，进行利用PNGaseF等糖苷酶等的切断的话，也可以以游离糖链的形式将内酯化反应后的试样回收。
内酯化反应后的试样可以根据需要而通过公知的方法等进行纯化、脱盐、增溶、浓缩、干燥等处理。内酯化反应以液相进行的情况下，优选在HILIC用柱中导入反应溶液来进行糖链的纯化。
步骤S1003结束后，进入步骤S1005。
(酰胺化反应)
步骤S1005中，使试样与反应溶液(以下称为酰胺化反应溶液)接触，进行使通过内酯化反应而内酯化的唾液酸酰胺化的酰胺化反应(以下记载为酰胺化反应时，在没有特别提及的情况下，是指步骤S1005的酰胺化反应)。发明人发现了与迄今所进行的通过水解使内酯开环之后再对羧基进行酰胺化的技术常识完全不同，可以迅速地将内酯直接酰胺化的方法。该反应由于在无水条件下也可以适宜地进行，因此是不同于水解的反应，可认为是基于氨基与内酯的相互作用的氨解。以下，将在无水条件下也可进行的、利用氨、胺或它们的盐进行的内酯的开环和酰胺化称为氨解。
酰胺化反应溶液包含氨、胺或它们的盐作为亲核试剂(以下适宜地称为第2亲核试剂)。第2亲核试剂不同于内酯化反应溶液中所含的亲核试剂(以下适宜地称为第1亲核试剂)。采用质谱分析对通过本实施方式的分析用试样的制备方法所得到的分析用试样进行分析的情况下，第1亲核试剂与第2亲核试剂以质量不相同等能够以质谱分析区分的方式来选择。根据质谱分析的质量分辨率选择第1亲核试剂和第2亲核试剂，以对所得修饰体以高精度进行质量分离。第1亲核试剂和第2亲核试剂可以是不同的物质，也可以是利用稳定同位素来使质量不同的相同物质。另外，第1亲核试剂和第2亲核试剂可以包含以iTRAQ为代表的这种等量异位(isobaric)的标签。该情况下，该标签以使通过在第1级的质谱分析与第2级的质谱分析之间进行的断裂而得到的产物离子的m/z不同的方式进行设计，因此唾液酸的连接方式、内酯体的识别可以通过串联质谱分析(MS/MS)进行。如此，在对分别通过第1亲核试剂和第2亲核试剂进行了修饰的修饰体进行2级以上的质谱分析时，能够在任一级通过不同的m/z将这些修饰体分离即可。用色谱对通过本实施方式的分析用试样的制备方法所得到的分析用试样进行分析的情况下，为了易于用色谱相互分离而优选第1亲核试剂和第2亲核试剂具有不同的取代基。
(酰胺化反应中的胺)
使用胺作为第2亲核试剂的情况下，该胺优选伯胺、更优选具有直链烃基的伯胺、进一步优选具有直链烷基的伯胺。关于酰胺化反应溶液中所含的胺，作为具有直链烷基的伯胺，优选碳数为10以下的伯胺，更优选碳数为7以下的伯胺，进一步优选甲胺、乙胺、丙胺、丁胺、戊胺，最优选甲胺。酰胺化反应溶液中所含的胺具有不具备支链的直链状的结构、或碳数较少时更高效地使内酯化的唾液酸酰胺化，故而优选。
酰胺化反应溶液中所含的胺为具有不饱和链式烃基的伯胺的情况下，优选该不饱和链式烃基含有双键，更优选该不饱和链式烃基含有烯丙基(Allyl)，最优选该胺为烯丙胺(Allylamine)。酰胺化反应溶液中所含的胺可以为包含羟基的伯胺，此时优选乙醇胺。酰胺化反应溶液中所含的胺可以含有除烷基以外的各种官能团。糖链发生酰胺化反应的结果，以含有这种官能团的方式被修饰，由此不仅通过质谱分析、而且通过色谱等也更容易将受到该修饰的糖链分离。
需要说明的是，酰胺化反应溶液可以包含上述氨或胺的盐。
(关于脱水缩合剂)
酰胺化反应中无需脱水缩合剂，可以不包含。优选的是，酰胺化反应仅通过使试样与酰胺化反应溶液接触来进行，以简便的操作使内酯化的唾液酸稳定化。
需要说明的是，酰胺化反应中无需脱水缩合剂，但也可以在酰胺化反应溶液中包含脱水缩合剂。例如，通过在不去除步骤S1003中添加到试样中的内酯化反应溶液的情况下添加氨、胺或它们的盐，从而也可以制备包含试样的酰胺化反应溶液。此时，不进行内酯化反应溶液的去除，相应地操作被简化。
(酰胺化反应溶液的浓度)
酰胺化反应溶液中的氨、胺和它们的盐的浓度优选为0.1M(M为mol/l)以上，更优选为0.3M以上，进一步优选为0.5M以上，进一步优选为1.0M以上，最优选为3.0M以上。作为适宜的例子，酰胺化反应溶液包含氨或伯胺、特别是甲胺，该氨、或甲胺等伯胺的浓度优选为0.1M以上、更优选为0.3M以上、进一步优选为0.5M以上、进一步优选为1.0M以上、最优选3.0M以上。酰胺化反应溶液的胺等的浓度越高，越能够更可靠地进行内酯化的唾液酸的酰胺化。酰胺化反应溶液中的胺的浓度可以适宜地设为50％以下等。
(酰胺化反应溶液的溶剂)
酰胺化反应溶液的溶剂可以为水系溶剂也可以为有机溶剂，从防止内酯的水解且可靠地引发迅速的酰胺化的观点出发，优选水含量少。酰胺化反应溶液的溶剂优选施加了抑制水含量的脱水操作的脱水溶剂、进一步优选无水溶剂。酰胺化反应溶液的溶剂优选包含甲醇和乙腈(ACN)中的至少一者。
需要说明的是，酰胺化反应溶液可以含有相当量的水(H2O)，酰胺化反应溶液的溶剂可以为水。
(酰胺化反应溶液的pH)
酰胺化反应溶液的pH为7.7以上、优选大于8、更优选大于10、进一步优选为12以上。酰胺化反应溶液的pH越高，越可更迅速且可靠地使内酯被酰胺化，故而优选。
(用于引发酰胺化反应的时间)
酰胺化反应在几秒～几分钟以内完成。因此，为了通过酰胺化反应对内酯进行酰胺化，使试样与酰胺化反应溶液接触的时间(以下称为反应时间)优选不足1小时、更优选不足30分钟、进一步优选不足15分钟、进一步优选不足5分钟、最优选不足1分钟。可以适宜地用酰胺化反应溶液洗涤试样，或者只以短时间对保持于载体等的试样进行液体流通。如此，酰胺化反应以短时间完成，因此能够防止不稳定的内酯发生分解而损害糖链的解析的定量性。另外，通过将酰胺化反应的反应时间设定得较短，能够更高效地进行试样的解析。
(进行酰胺化反应的相)
本实施方式的分析用试样的制备方法中，酰胺化反应以液相进行。
步骤S1005结束后，进入步骤S1007。
(酰胺化反应后的反应溶液的pH的调节)
步骤S1007中，在酰胺化反应后的反应溶液中添加用于降低pH的酸性溶液(以下记载为酸性溶液的情况下，是指步骤S1007中添加到反应溶液中的酸性溶液)，使该反应溶液的pH为规定值以下。该规定值优选为10以下、更优选为8以下。该规定值也优选为适于步骤S1009中使用的HILIC用柱的pH、尤其是也更优选从该柱的厂商等推荐的pH(以下称为推荐pH)的范围中选择。本实施方式中，pH不足7时设为酸性，pH超过7时设为碱性。酸性溶液的pH更优选为6以下、进一步优选为4以下。
酸性溶液的组成没有特别限定，能以期望的精度进行后述使用HILIC用柱的糖链的纯化和质谱分析等分析即可。酸性溶液中所含的酸的种类没有特别限定，例如从可溶于有机溶剂的强酸的观点出发可以使用三氟乙酸(TFA)等。酸性溶液优选在有机溶剂中包含0.2重量％以上的浓度的TFA的溶液、更优选包含1重量％以上的浓度的TFA的溶液，进一步优选包含2.4重量％以上的浓度的TFA的溶液，更加优选包含4重量％以上的浓度的TFA的溶液，更进一步优选包含5重量％以上的浓度的TFA的溶液。酸性溶液的pH越低，越能够更高效地降低酰胺化反应后的反应溶液的pH。构成酸性溶液的上述有机溶剂优选乙腈，但没有特别限定。另外，酸性溶液可以适宜包含水。
如后述比较例所示，以往仅进行在利用HILIC用柱的纯化之前进行的利用有机溶剂的稀释等的情况下，酰胺化反应后的利用HILIC用柱的纯化会引起试样的回收率降低、质谱图中出现与污染物对应的峰。然而，通过本实施方式的分析用试样的制备方法进行酰胺化反应后的反应溶液的pH的调整，从而如实施例所示那样试样的回收率得以改善，质谱图中与污染物对应的峰也减少。
步骤S1007结束后，进入步骤S1009。
(使用HILIC用载体的糖链的纯化)
步骤S1009中，在HILIC用柱中导入在步骤S1007中调节了pH的反应溶液，使用该柱内的HILIC用载体对糖链进行纯化。该操作后，获得分析用试样。调节了pH的反应溶液被导入到HILIC用柱，糖链吸附于载体后，适当通过液体流通来进行洗涤，通过向柱中导入水、水系溶液等而提高水或极性溶剂的浓度，从而使包含糖链的试样被洗脱。
本实施方式中，HILIC用柱只要能对酰胺化反应后的试样中的糖链进行纯化，就没有特别限定，优选固相萃取用等前处理用柱。作为前处理用柱，例如可以使用移液器吸头型、离心吸附柱(spin column)型、注射器型、孔板型等各种各样的柱。
需要说明的是，HILIC用柱也可以使用在分析用试样被导入LC/MS的分析柱前的试样浓缩等中使用的捕获柱。另外，也可以通过将HILIC用载体导入到装有试样的容器中来进行吸附的批次式的方法而进行纯化。
HILIC用柱中的载体只要能够对酰胺化反应后的试样中的糖链进行纯化就没有特别限定。该载体包含未修饰二氧化硅、修饰有氨丙基、酰胺基、二醇、氰基、聚琥珀酰亚胺衍生物和环糊精等具有极性的官能团的硅胶等。从适宜地分离包含酰胺化的糖链的试样的观点出发，该载体优选具有酰胺基。或者，HILIC用柱中的载体可以为包含纤维素、琼脂糖凝胶(Sepharose)或琼脂糖(agarose)等的多糖系载体。此外，HILIC用柱中的载体可以包含具有多个磺基或季铵等离子性官能团的硅胶或聚合物。
使用HILIC用载体的纯化后的试样可以根据需要通过公知方法等进行纯化、增溶、脱盐、浓缩、干燥等处理。
通过上述制备方法，α2,6-唾液酸等难以内酯化的连接方式的唾液酸在内酯化反应中利用第1亲核试剂进行修饰。α2,3-、α2,8-和α2,9-唾液酸等容易内酯化的连接方式的唾液酸在内酯化反应中被内酯化，在酰胺化反应中利用第2亲核试剂进行修饰。
步骤S1009结束后，进入步骤S1011。
步骤S1011中，利用质谱分析和色谱中的至少一者来分析试样。通过上述内酯化反应和酰胺化反应，分别受到第1亲核试剂和第2亲核试剂的修饰的糖链的质量不同。因此，通过质谱分析，能够将这些糖链根据唾液酸的连接方式进行分离。
质谱分析中的电离的方法没有特别限定，可以使用基质辅助激光解吸电离(MALDI)法、电喷雾(ESI)法、纳米电喷雾电离(nano-ESI)法等。电离的方法特别优选MALDI法。质谱分析中的电离可以使用正离子模式和负离子模式中的任一种。质谱分析可以以多级进行，由此可以适宜地解析除唾液酸的连接方式以外的糖链的结构、肽链的结构。
用色谱进行分析的情况下，优选液相色谱。液相色谱中使用的色谱柱没有特别限定，可以适当使用C30、C18、C8、C4等疏水反相柱、碳柱、HILIC用的正相柱等。进行液相色谱后通过质谱分析进行测定在通过多次分离来精密进行试样中的成分的分析的方面是优选的。该情况下，更优选以在线控制在质谱仪中直接通过ESI等对来自液相色谱仪的洗脱液进行电离。
对通过质谱分析或色谱所得到的数据进行解析。该解析中，区分连接方式而进行包含容易内酯化的α2,3-唾液酸等唾液酸的糖链和包含难以内酯化的α2,6-唾液酸等唾液酸的糖链的定量、质谱图所对应的数据的制作等。通过质谱分析或色谱所得到的数据的解析方法没有特别限定。
步骤S1011结束后，结束处理。
(关于糖肽和糖蛋白的副反应的抑制)
在糖肽或糖蛋白中加入内酯化反应溶液和酰胺化反应溶液，如上所述对唾液酸进行了修饰的情况下，有时会在与位于糖肽或糖蛋白中含有的氨基酸的侧链、主链的末端的氨基、羧基之间发生分子内脱水缩合等副反应。该情况下，存在与分析对象的糖链对应的质谱的峰发生分裂、解析变难的问题。
发明人等弄清了肽部分的副反应主要来源于氨基的存在，并弄清了通过在修饰唾液酸前先以化学修饰等对氨基进行封闭，可以在修饰唾液酸时抑制肽部分的副反应。具体可参见以下文献：Takashi Nishikaze,Sadanori Sekiya,Shinichi Iwamoto,KoichiTanaka.“A Universal Approach to linkage-Specific Derivatization for SialicAcids on Glycopeptides,”Journal of The American Society for MassSpectrometry,2017年6月,Volume 28,Issue 1Supplement,海报编号MP091。本实施方式的分析用试样的制备方法也可以与其同样地用于糖肽和糖蛋白。即，对于糖肽或糖蛋白，进行二甲酰胺化、胍基化等对氨基进行封闭的反应，接着进行内酯化反应和酰胺化反应。此时，如果使用根据唾液酸的连接方式来形成内酯的方法，则也可以识别唾液酸的连接方式。
需要说明的是，糖肽中有在由氨基酸序列带来的特性方面不易发生副反应的糖肽。例如通过利用胰蛋白酶等消化酶来消化IgG的Fc区域而生成的糖肽不具有赖氨酸，N末端的氨基也在脱水缩合剂的存在下迅速环化脱水而进行焦谷氨酸化(pyroglu化)。其结果，氨基不再存在，因此不需要二甲酰胺化、胍基化等事先的氨基的封闭。关于这种糖肽，通过在不进行氨基的封闭的情况下进行内酯化反应和酰胺化反应，可以得到满足解析的质谱。
(关于分析用试样的制备用试剂盒)
提供适宜在本实施方式的分析用试样的制备方法中使用的分析用试样的制备用试剂盒(以下称为制备用试剂盒)。制备用试剂盒只要包含上述酰胺化反应后的反应溶液的pH调节所使用的酸性溶液，则其内容没有特别限定，可以含有试剂、除试剂以外的质谱分析中使用的任意的消耗品。通过使用制备用试剂盒制备分析用试样，可以更高效地制备分析用试样。
根据上述实施方式，得到如下的作用效果。
(1)本实施方式的分析用试样的制备方法具备：使试样与碱性的反应溶液接触，进行使糖链中所含的内酯结构酰胺化的酰胺化反应；在供于酰胺化反应后的反应溶液中添加酸性溶液；以及，使用HILIC用载体对添加酸性溶液后的反应溶液中所含的试样进行纯化。由此，对于供于酰胺化反应和HILIC后的试样，试样的回收率提高，污染物减少，能够精度良好地分析。
(2)本实施方式的分析用试样的制备方法具备：在酰胺化反应前，进行使糖链中所含的唾液酸的至少一部分内酯化的内酯化反应。由此，能够使用酰胺化反应，迅速地修饰通过内酯化反应而进行了内酯化的唾液酸。
(3)本实施方式的分析用试样的制备方法中，内酯化反应通过使包含脱水缩合剂的内酯化反应溶液与试样接触来进行。由此，能够区分容易内酯化的唾液酸与难以内酯化的唾液酸并进行修饰。
(4)本实施方式的分析用试样的制备方法中，酰胺化反应中使用的反应溶液包含氨或胺，内酯化反应溶液还包含与糖链中所含的唾液酸反应的第1亲核试剂，第1亲核试剂不同于酰胺化反应中使用的反应溶液中所含的氨或胺，内酯化反应中在试样中添加内酯化反应溶液，根据唾液酸的连接方式使唾液酸的一部分内酯化，使第1亲核试剂的至少一部分结合于唾液酸的另一部分。由此，根据质量等的不同，能够区分唾液酸的连接方式并进行分析。
(5)本实施方式的分析用试样的制备方法中，酸性溶液为包含0.2重量％以上的三氟乙酸(TFA)的溶液。由此，利用TFA为可溶于有机溶剂的强酸这样的特性，能够可靠且高效地调整酰胺化反应后的反应溶液的pH。
(6)本实施方式的分析方法具备：通过本实施方式的分析用试样的制备方法来制备分析用试样；以及对所制备的分析用试样进行分析。由此，使用HILIC用柱的纯化中的试样的回收率提高，污染物减少，能够精度良好地解析糖链。
(7)本实施方式的分析方法中，所制备的分析用试样可以利用质谱分析和色谱中的至少一者来进行分析。由此，根据连接方式特异性地产生的质量差、对利用色谱的分离的影响，能够区分唾液酸的连接方式并解析糖链。
(8)本实施方式的分析用试样的制备用试剂盒具备酸性溶液。由此，能够迅速地获取、准备酰胺化反应后且导入HILIC用柱前的试样。
如下的变形也处于本发明的范围内，可以与上述实施方式组合。以下的变形例中，关于表示与上述实施方式同样的结构、功能的部位等，用同一符号进行参照，适当省略说明。
(变形例1)
上述实施方式中，对于通过内酯化反应进行了内酯化的唾液酸，通过酰胺化反应进行了酰胺化。但是，只要在进行酰胺化反应后，使用HILIC用载体使试样纯化，则酰胺化反应前的处理没有特别限定。例如，可以进行酰胺化反应而不进行内酯化反应，检测试样中原本包含的内酯化的唾液酸。另外，也可以以对唾液酸的连接方式为非特异性的方式进行内酯化反应。
本发明不限定于上述实施方式的内容。在本发明的技术构思的范围内想到的其它方式也包括在本发明的范围内。
实施例
以下给出本实施方式的实施例，但本发明并不限定于下述的实施例。需要说明的是，在下文中，％的记载在没有特别提及的情况下表示重量％。
(比较例1：使用酸性糖链进行的比较例)
<内酯化反应和酰胺化反应>
作为试样，准备由增田化学工业购买的PA化糖链PA059(图2的(A)中示出结构)。PA059为包含2个α2,3-唾液酸的2链糖链，以下称为PAm059。将试样在200fmol Eppendorf管内干固，然后添加包含异丙胺的20μL的内酯化反应溶液(2M异丙胺盐酸盐、500mM EDC-HCl、500mM HOBt)，边以2000rpm搅拌边反应1小时(由此，α2,6-唾液酸转变为异丙基酰胺、α2,3-唾液酸转变为内酯体。PAm059的2个唾液酸为α2,3-唾液酸，因此被内酯化)。内酯化反应后，在反应溶液中添加20μL的20％甲胺水溶液，用涡旋混合器搅拌来进行酰胺化反应(由此，内酯化的α2,3-唾液酸通过氨解而被甲基酰胺化)。
<利用HILIC用柱的纯化>
在酰胺化反应后的反应溶液中添加140μL的CAN进行稀释后，使用作为离心用前处理用柱的HILIC Tip(GL-Tip Amide,GL Science特殊订购品、填充有与该公司的InertsilAmide分析柱相同的载体(以下简称为Inertsil Amide))来去除过量试剂。Inertsil Amide为在硅胶上化学修饰酰胺基(氨基甲酰基)而成的载体，用于HPLC时的推荐pH为2～7.5。将用ACN稀释的上述反应溶液添加到GL-Tip Amide，以4000xg离心，从而进行液体流通，使糖链吸附于载体。然后，用90％ACN 0.1％TFA溶液100μL进行2次液体流通来洗涤，用20μL H2O进行2次、用20μL 90％ACN 0.1％TFA溶液进行1次液体流通来使糖链洗脱，将洗脱液用SpeedVac(Thermo Fisher Scientific)干固。然后，将使干固的试样再溶解而成的溶液在Stage Tip Carbon中进行液体流通，来进行脱盐操作。Stage Tip Carbon是将EmporeDisk-Carbon(3M制造)切成直径约1mm并装入200μL的吸头而得的碳柱。
<质谱分析>
在来自Stage Tip Carbon的洗脱液中添加作为内标的4链中性糖链的PA004(Takara Bio、图2的(B)中示出结构)200fmol，与试样一起干固。然后，将试样再溶解于5μL的水，将其中1μL滴加于μFocus MALDI plate 700μm(Hudson Surface Technologies)。在滴加的试样中添加包含2mM的磷酸二氢铵的3AQ/CA(3-氨基喹啉/对香豆酸)基质溶液0.75μL，将各个板加热至75℃来去除残留溶剂。然后，使用飞行时间质谱仪(AXIMA-Resonance,Shimadzu/Kratos)，通过MALDI进行电离，以负离子模式进行测定。
图3为比较例1中通过质谱分析所得到的质谱图。本条件下，内标(I.S.)的PA化中性糖链以磷酸加合体的形态发生负电离。试样中所含的PAm059也被酰胺化，因此同样地以磷酸加合体的形态电离。m/z 2423.9的峰对应于甲基酰胺化的PAm059的磷酸加合体，可知在一系列的处理中唾液酸通过甲基酰胺化而被中性化。然而，在m/z 2000以下等的低m/z区域中较强地观测到被认为源自污染物的信号，因此比较例的制备方法缺乏实用性。另外，s/n(信噪比)也差，推测这也是污染物的影响。
(实施例1：使用中性糖链进行的实施例)
比较例1的实验体系中无法准确评价试样的回收率。因此，使用不因内酯的形成或氨解而发生变化的PA化中性糖链来进行评价。对于从HILIC用柱洗脱出的洗脱液，添加作为内标(I.S.)的PA011(Takara Bio、图2的(C)中示出结构)，以与内标的相对强度评价回收率。
<内酯化反应和酰胺化反应>
将作为试样的4链糖链的PA004(Takara Bio)在100fmol Eppendorf管内干固。接着，添加上述内酯化反应溶液20μL，边搅拌边反应1小时后，添加作为酰胺化反应溶液的20％甲胺水溶液20μL，用涡旋混合器搅拌而形成氨解发生的条件。
<利用HILIC用柱的纯化>
在用HILIC Tip纯化前进行稀释时，在分成3份的试样中逐个添加各140μL的(a)ACN、(b)包含4％TFA的ACN、(c)包含5％TFA的CAN。用pH试纸调查稀释后的pH，结果(a)为12以上、(b)为8左右、(c)为3左右。将该溶液用HILIC Tip纯化后，用Stage Tip Carbon脱盐处理，用SpeedVac干固。
<质谱分析>
然后，再溶解于5μL的水，将其中1μL滴加于μFocus MALDI plate 700μm(HudsonSurface Technologies)。在滴加的试样中添加包含2mM的磷酸二氢铵的3AQ/CA基质溶液0.75μL，将各个板加热至75℃来去除残留溶剂。然后，使用飞行时间质谱仪(AXIMA-Resonance,Shimadzu/Kratos)，通过MALDI进行电离，以负离子模式进行测定。
图4为实施例1中通过质谱分析所得到的质谱图。本条件下，PA化中性糖链以磷酸加合体的形态发生负电离。将使用HILIC用柱的纯化后的PA004与PA011的相对强度比代入到事先得到的标准曲线中来评价回收率。用于得到标准曲线的测定中，对于一定量的PA011(100fmol)添加稀释系列的PA004(25fmol,50fmol,100fmol,200fmol)，暂时干固后，在不利用HILIC用柱进行纯化的情况下通过与上述方法同样的测定方法获取负离子质谱图。由PA004与PA011的相对强度比得到标准曲线。
图4的上部的质谱图所对应的(a)的情况下，在m/z 2000以下等的低分子量区域中较强地观测到被认为源自污染物的信号。但是，图4的中部和下部的质谱图所分别对应的(b)和(c)的情况下(利用酸性溶液进行了pH调节(淬灭)的情况下)，未观测到(a)那样的污染信号。关于试样的回收率，(a)为40％左右，而(b)和(c)分别算出为67％和70％，可知回收率自身也通过进行淬灭而得以改善。需要说明的是，该回收率为在淬灭后的HILIC纯化的基础上经过碳纯化后的回收率，进而考虑到处理了200fmol这样的微量糖链，其为充分优异的值。即，可知通过进行淬灭而抑制来自HILIC载体的污染，纯化后的回收率也得以改善。
(比较例2：利用不同酰胺载体的纯化的比较)
作为比较例2，示出如下例子：在使用与比较例1和实施例1中使用的酰胺载体不同的酰胺载体来进行纯化的情况下，也观测到与污染物对应的信号。通过与实施例1中的(a)(无淬灭的条件)同样的方法，将使用包含Inertsil Amide载体的吸头(柱A)的情况作为HILIC用柱与使用包含InertSustain Amide载体(GL Science)的吸头(柱B)作为HILIC用柱的情况进行比较。InertSustain Amide为在硅胶上化学修饰酰胺基(氨基甲酰基)而成的载体，用于HPLC时的推荐pH为2～8.5。
图5为比较例2中通过质谱分析所得到的质谱图。利用柱A的回收率约为40％、利用柱B的回收率为70％。然而，柱B的情况下也在m/z 2000以下等的低m/z区域中观测到虽然图案不同但与污染物对应的信号，进一步强烈地暗示了若导入从推荐pH偏离的pH的溶液则HILIC用载体受到损伤。

Claims (10)

1.一种分析用试样的制备方法，其用于进行试样中所含的糖链的分析，所述分析用试样的制备方法具备：
使所述试样与碱性的反应溶液接触，来进行使所述糖链中所含的内酯结构酰胺化的酰胺化反应；
在所述酰胺化反应后的所述反应溶液中添加酸性溶液；以及
使用亲水相互作用色谱用的载体，对添加所述酸性溶液后的所述反应溶液中所含的所述试样进行纯化，
添加所述酸性溶液后的所述反应溶液的pH为10以下，
所述制备方法具备：在所述酰胺化反应前，进行使所述糖链中所含的唾液酸的至少一部分内酯化的内酯化反应，
所述内酯结构是通过内酯化反应而内酯化的唾液酸所含的内酯结构。
2.根据权利要求1所述的分析用试样的制备方法，其中，所述酰胺化反应以液相进行。
3.根据权利要求1所述的分析用试样的制备方法，其中，所述内酯化反应通过使包含脱水缩合剂的内酯化反应溶液与所述试样接触来进行。
4.根据权利要求3所述的分析用试样的制备方法，其中，所述酰胺化反应中使用的所述反应溶液包含氨或胺，
所述内酯化反应溶液还包含与所述糖链中所含的所述唾液酸反应的亲核试剂，
所述亲核试剂不同于所述酰胺化反应中使用的所述反应溶液中所含的氨或胺，
所述内酯化反应中，在所述试样中添加所述内酯化反应溶液，根据所述唾液酸的连接方式，使所述唾液酸的一部分内酯化，使所述亲核试剂的至少一部分结合于所述唾液酸的另一部分。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的分析用试样的制备方法，其中，所述内酯化反应中，选自由α2,3-唾液酸、α2,8-唾液酸和α2,9-唾液酸组成的组中的至少一种所述唾液酸被内酯化。
6.根据权利要求4所述的分析用试样的制备方法，其中，所述内酯化反应中，在所述试样中添加所述内酯化反应溶液，使α2,3-唾液酸内酯化，使所述亲核试剂的一部分结合于α2,6-唾液酸。
7.根据权利要求1～4中任一项所述的分析用试样的制备方法，其中，所述酸性溶液为包含0.2重量％以上的三氟乙酸的溶液。
8.一种分析方法，其具备：
通过权利要求1～7中任一项的分析用试样的制备方法来制备分析用试样；以及
对所制备的所述分析用试样进行分析。
9.根据权利要求8所述的分析方法，其中，所制备的所述分析用试样利用质谱分析和色谱中的至少一者来进行分析。
10.一种分析用试样的制备用试剂盒用于权利要求1～7中任一项所述的分析用试样的制备方法的用途，所述试剂盒具备酸性溶液。
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