CN107430113A - 分析用试样的调制方法和分析方法 - Google Patents
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Abstract
本发明的分析用试样调制方法中,当分析对象物质的糖链中结合有唾液酸时,根据唾液酸的结合方式,进行会生成不同修饰体的反应。该反应中使用含有糖链的分析对象物质、含有2个碳原子的胺以及脱水缩合剂。通过质量分析等对所获得的分析用试样进行分析,由此可以识别唾液酸的结合方式。本发明的分析用试样调制方法不仅可以适用于游离糖链,还可以适用于糖肽和糖蛋白。
Description
技术领域
本发明涉及分析用试样的调制方法、以及使用所获得的分析用试样的分析方法。
背景技术
肽链上的糖链附加是翻译后修饰中最重要的工序之一。肽链上附加了糖链的糖蛋白与各种各样的生命现象息息相关。人们认为在生物体内,通过精确识别糖链的细微结构差异,可以控制细胞间的信号传递和分子识别等,并期待糖蛋白和糖肽的结构解析给生命现象的阐明和药物研发、生物标记物开发等带来巨大的贡献。
与蛋白质的天冬酰胺残基结合的N-结合型糖链具有至少1个支链,大多数在非还原末端上具有唾液酸。由于糖链非还原末端的唾液酸直接关乎分子识别,因而分析唾液酸的有无(唾液酸的数量)及其结合方式在糖蛋白和糖肽的结构解析中至关重要。
由于唾液酸带负电荷,容易产生因不稳定而分解和从糖链脱离,故而有人提出了若干在对唾液酸进行化学修饰而稳定化之后再进行分析的方法。例如,专利文献1中公开了一种将游离糖链的还原末端固定于固相载体上,使用PyAOP作为缩合剂,使用甲胺盐酸盐作为亲核试剂,将糖链非还原末端的唾液酸的羧基进行甲酰胺化的方法。另外,专利文献1中公开了通过将甲基酰胺修饰后的试样供给至质量分析以进行糖链的定量和结构分析的例子。
专利文献2中记载了,通过由在鏻盐等脱水缩合剂存在下的反应,将糖肽中存在的所有羧基进行修饰化(或除去),来抑制质量分析(离子化)时的唾液酸的脱离。另外,专利文献2中还记载了,通过将修饰后的试样供给至多阶段的质量分析,可以解析其中糖链含有唾液酸的糖肽的糖链支链结构。
质量分析是对糖链的结构解析有效的分析法,如上所述,通过对非还原末端的唾液酸进行修饰而使结构稳定化,也可以分析唾液酸的有无以及糖链的支链结构。另一方面,上述专利文献1和专利文献2中所述的方法,由于进行了与唾液酸的结合方式无关的甲酰胺化,故而无法识别唾液酸的结合方式。
作为唾液酸结合于糖链非还原末端的结合方式,主要存在α2,3-与α2,6-的结合异构。已知在生物体中,唾液酸的结合方式的不同关乎各种各样的生命现象,例如已知随着癌化,唾液酸的结合方式也产生变化。因此,即便在作为生物标记物的利用和生物医药品的质量管理等中,识别唾液酸的结合方式的差异也受到关注。
为了通过质量分析识别唾液酸的结合方式,需要进行结合方式特异的修饰,使之根据结合方式而具有不同的质量。例如,专利文献3中,有人提出了以下方法:在使用1-甲基-3-对甲苯基三氮烯(MTT)进行唾液酸的甲酯化后,定为酸性条件。该方法中记载了:在酸性条件下,由于选择性地仅将α2,3-唾液酸进行脱甲基化,故而可以识别α2,3-唾液酸与α2,6-唾液酸。
另外,也有人提出了以下方法:在脱水缩合剂的存在下,利用α2,3-唾液酸通过分子内脱水缩合而容易生成内酯环,通过质量分析来识别唾液酸的结合方式。例如,非专利文献1和非专利文献2中公开了,通过使糖链试样与脱水缩合剂存在于甲醇或乙醇中,α2,6-唾液酸被优先酯化,α2,3-唾液酸优先通过分子内脱水来生成内酯环。非专利文献3中公开了以下方法:通过糖链试样与氯化铵的反应,将α2,3-唾液酸和α2,6-唾液酸内酯化和酰胺化后,将它们完全甲基化。如果利用这些修饰方法的话,α2,3-唾液酸的修饰化合物与α2,6-唾液酸的修饰化合物具有不同的质量,故而能够通过质量分析来识别唾液酸的结合方式。
[现有技术文献]
[专利文献]
专利文献1:日本专利特开第2013-68594号公报
专利文献2:日本专利特开第2015-34712号公报
专利文献3:日本专利特开第2013-76629号公报
[非专利文献]
非专利文献1:Wheeler,S.等,Rapid Commun.Mass Spectrom.,第23卷,第303-312页(2009年)
非专利文献2:Reiding,K.等,Anal.Chem.,第86卷,第5784-5793页(2014年)
非专利文献3:Alley Jr,W.等,J.Proteome Res.,第9卷,第3062-3072页(2010年)
发明内容
[发明所要解决的课题]
上述非专利文献1或非专利文献2中公开的唾液酸的酯存在酯修饰部位容易脱落的问题。非专利文献3中公开的酰胺化合物比酯稳定。但是,非专利文献3的修饰法由于需要在温和的条件下进行酰胺化,故而反应需要时间。
另外,以往的方法中,α2,3-唾液酸的修饰反应与α2,6-唾液酸的修饰反应的特异性难说是充分的,即使是只含有α2,3-唾液酸的糖链试样,生成与将α2,6-唾液酸供给至反应的情况相同的修饰化合物的比率也高。因此,对于含有多个唾液酸的糖链试样,存在难以准确掌握α2,3-唾液酸与α2,6-唾液酸的数量等问题。
此外,上面所述的现有技术是为了识别游离糖链的α2,3-唾液酸与α2,6-唾液酸而开发的方法,迄今,还没有关于可识别糖肽的α2,3-唾液酸与α2,6-唾液酸的修饰方法的报道。糖肽由于肽部分的存在而容易诱发各种各样的副反应,故而与游离糖链相比,存在解析困难的倾向。实际上,本发明人在将非专利文献2的修饰方法应用于糖肽并进行质量分析之后,观测到许多副反应信号,这些信号使得解析难以进行(参见图9(B))。因此,期望开发一种不仅可适用于游离糖链还可适用于糖肽的方法。
[解决课题的手段]
鉴于上述情形进行了研究,结果发现:通过对含有糖链的试样进行特定的修饰化反应,在可以实现唾液酸的有无和唾液酸的数量、唾液酸结合方式的识别及其比率的定量的同时,还可以适用于糖肽。
本发明涉及对试样中包含的糖链进行分析用的分析用试样的调制方法。作为试样,优选使用含有游离糖链、糖肽的试样。本发明的分析用试样的调制方法中,当分析对象物质的糖链中结合有唾液酸时,根据唾液酸的结合方式进行会生成不同的修饰体的反应(第一反应)。
上述第一反应中,进行含有糖链的分析对象物质(糖链、糖肽等)与含有2个以上碳原子的胺及脱水缩合剂的反应。第一反应中,作为脱水缩合剂,优选使用碳二亚胺。作为胺,优选为具有支链烷基的烷基胺或其盐,优选烷基伯胺或其盐。其中,特别优选异丙基胺或其盐。
当分析对象物质的糖链中结合有唾液酸时,通过第一反应,根据唾液酸的结合方式,会生成不同的修饰体。例如,在糖链具有α2,3-唾液酸的情况下,作为修饰体,生成内酯;在糖链具有α2,6-唾液酸的情况下,作为修饰体,生成酰胺。
此外,还可以将上述第一反应后的分析对象物质再供给至另外的反应。例如,在分析对象试样包含α2,3-唾液酸的情况下,可以进行使由第一反应生成的内酯再生成另外的修饰体的第二反应。
该第二反应中,例如进行使用胺的反应。在通过第一反应由α2,3-唾液酸生成内酯的情况下,通过进行第二反应,可获得酰胺修饰体。该情况下,优选选择用于第二反应的胺,使可在第一反应中由α2,6-唾液酸生成的酰胺与可在第二反应中由来源于α2,3-唾液酸的内酯生成的酰胺具有不同的质量。另外,第二反应中,优选除了上述胺之外,还使用鏻(phosphonium)系脱水缩合剂或脲(uronium)系脱水缩合剂。
上述第一反应和第二反应可在将分析对象物质固定于固相载体上的状态下进行。
另外,本发明还涉及对通过上述方法调制的试样进行分析的试样的分析方法。作为分析方法,质量分析是有用的。
另外,本发明还可适用于肽和蛋白质。通过将上述第一反应应用于肽、蛋白质,唾液酸部位优先变化为修饰体。即,本发明的分析用试样调制方法的实施方式之一是:在分析对象物质中结合有唾液酸时,优先使唾液酸部位变化为修饰体的方法。该实施方式可以适用于肽、蛋白质中的唾液酸的有无等结构解析。由于能够识别唾液酸的有无,故而也可用于不含唾液酸的肽、蛋白质的分析。该实施方式中的分析对象试样为肽或蛋白质,优选为糖肽或糖蛋白。另外,该实施方式中,也可以使用碳原子数小于2个的胺。
[发明效果]
通过在含有糖链的试样中进行上述修饰化反应来分析所获得的试样,使唾液酸的结合方式的识别及其比率的定量成为可能。另外,上述修饰化反应不仅可以适用于游离糖链,还可以适用于糖肽,并可以应用于糖肽的唾液酸的结合方式的识别等。
附图说明
[图1]是唾液酸乳糖(sialyllactose)与胺盐酸盐的反应生成物的正离子质谱。(A1)是6’-唾液酸乳糖与甲胺的反应生成物,(B1)6’-唾液酸乳糖与异丙胺的反应生成物,(A2)是3’-唾液酸乳糖与甲胺的反应生成物,(B2)是3’-唾液酸乳糖与异丙胺的反应生成物。
[图2-1]是显示在37℃下进行与胺盐酸盐的反应时的修饰体的生成比率的图表。(A)是3’-唾液酸乳糖与胺的反应,(B)是6’-唾液酸乳糖与胺的反应。
[图2-2]是显示在冰浴条件中进行与胺盐酸盐的反应时的修饰体的生成比率的图表。(A)是3’-唾液酸乳糖与胺的反应,(B)是6’-唾液酸乳糖与胺的反应。
[图3]是具有2个唾液酸的双天线(bi-antenna)型的PA化糖链与胺盐酸盐的反应生成物的正离子质谱。(A1)~(A4)使用乙胺盐酸盐,(B1)~(B4)使用异丙胺盐酸盐。
[图4]是切取自胎球蛋白的游离糖链与胺的反应生成物的负离子质谱。(A)是只进行与甲胺盐酸盐的反应的情况;(B)是在与异丙胺盐酸盐进行反应之后与甲胺盐酸盐进行反应的情况。(C)是在与异丙胺盐酸盐的反应之后进行由水解引起的内酯的开环,随后进行与甲胺盐酸盐的反应的情况。
[图5]是即将切取自胎球蛋白的游离糖链固定于载体上,进行与异丙胺盐酸盐的反应和与甲胺盐酸盐的反应的反应生成物的负离子质谱。(A)是在与异丙胺盐酸盐的反应之后进行与甲胺盐酸盐的反应的情况;(B)是在与异丙胺盐酸盐的反应之后,进行由水解引起的内酯的开环,随后进行与甲胺盐酸盐的反应的情况。
[图6-1](A)是2,3-SGP与异丙胺的反应生成物的负离子质谱;(B)是2,6-SGP与异丙胺的反应生成物的负离子质谱。
[图6-2](A)是2,3-SGP与异丙胺的反应生成物的正离子质谱;(B)是2,6-SGP与异丙胺的反应生成物的正离子质谱。
[图7](A)是2,3-SGP与异丙胺的反应生成物的源内分解质谱(In-sourcedecomposition mass spectrum)(低m/z区域);(B)是2,6-SGP与异丙胺的反应生成物的源内分解质谱(低m/z区域)。
[图8](A)是2,3-SGP与甲胺的反应生成物的正离子质谱;(B)是2,6-SGP与甲胺的反应生成物的正离子质谱。
[图9](A)是2,6-SGP与异丙胺的反应生成物的正离子质谱;(B)是2,6-SGP与乙醇的反应生成物的正离子质谱。
[图10]是RNase B(核糖核酸酶B)消化物与异丙胺的反应生成物的正离子质谱。
[图11]是IgG(免疫球蛋白G)消化物与异丙胺的反应生成物的正离子质谱。
具体实施方式
本发明涉及为了通过液体色谱法或质量分析等进行的分析,对糖链和糖肽等进行修饰化,调制分析用试样的方法。
[试样的调制]
<含有糖链的试样>
本发明中,作为分析对象,使用含有游离糖链或糖肽等的糖链的试样。特别地,通过本发明的方法调制的分析用试样,由于对唾液酸的有无和唾液酸的结合方式的分析是有用的,故而作为含有糖链的试样,优选含有如N-结合型糖链或O-结合型糖链这样的,大多在非还原末端具有唾液酸的糖链的物质。
在分析对象为糖肽的情况下,肽链的氨基酸残基数量多的物质,优选通过蛋白水解酶消化等,将肽链切断为适于分析的长度使用。例如,在调制质量分析用试样的情况下,肽链的氨基酸残基数量优选为30以下,更优选为20以下,进一步优选为15以下。另一方面,在要求糖链所结合的肽的来源为明确的情况下,肽链的氨基酸残基数量优选为2以上,更优选为3以上。
通常,蛋白水解酶识别氨基酸序列,并选择性地切断特定的序列的特定结合。作为蛋白水解酶,可以使用胰蛋白酶、Lys-C、肽链内切酶、糜蛋白酶、胃蛋白酶等。另外,蛋白水解酶也可以2种以上并用。另外,也可以使用嗜热菌蛋白酶或蛋白酶K、链霉蛋白酶E这样的特异性低的蛋白水解酶。蛋白水解酶消化的条件并无特别的限定,可以采用与所使用的蛋白水解酶对应的适当的方案(protocol)。在蛋白水解酶消化之前,也可以进行试样中的蛋白质和肽的变性处理或烷基化处理。变性处理和烷基化处理的条件并无特别的限定,可以适当地采用公知条件。另外,蛋白水解酶处理也可以在对糖链进行修饰化之后进行。
在分析对象为游离糖链的情况下,作为使糖链从糖蛋白和糖肽游离出的方法,可使用如下方法:使用了糖苷酶或O-糖苷酶的糖苷酶处理、肼分解、碱处理引起的β脱离等方法。使N-结合型糖链从肽链中游离出的情况下,适宜通过肽-N-糖苷酶F(PNGase F)或肽-N-糖苷酶A(PNGase A)等进行的N-糖苷酶处理。在糖苷酶处理之前,可以进行上述蛋白水解酶消化。糖链还原末端可以进行通过吡啶基氨基化(PA化)等进行的修饰。
<脱水缩合剂和胺存在下的修饰化>
含有糖链的试样在脱水缩合剂和胺的存在下进行化学修饰,根据糖链非还原末端的唾液酸的结合方式,形成不同的修饰体。具体地,在非还原末端上具有α2,3-唾液酸的糖链优先通过脱水进行内酯化;在非还原末端上具有α2,6-唾液酸的糖链优先被酰胺化。
(脱水缩合剂)
作为脱水缩合剂,优选使用碳二亚胺。作为碳二亚胺的例子,可列举出N,N’-二环己基碳二亚胺(DCC)、N-(3-二甲基氨基丙基)-N’-乙基碳二亚胺(EDC)、N,N’-二异丙基碳二亚胺(DIC)、1-叔丁基-3-乙基碳二亚胺(BEC)、N,N’-二叔丁基碳二亚胺、1,3-二对甲苯基碳二亚胺、双(2,6-二异丙基苯基)碳二亚胺、双(三甲基甲硅烷基)碳二亚胺、1,3-双(2,2-二甲基-1,3-二氧戊环-4-基甲基)碳二亚胺(BDDC)或它们的盐。
使用碳二亚胺作为脱水缩合剂且使用胺作为亲核剂的酰胺化反应,与使用鏻系脱水缩合剂(所谓的BOP试药)或脲系脱水缩合剂的情形相比,具有空间障碍大的部位上存在的羧基难以被酰胺化的倾向。α2,3-唾液酸的羧基由于存在于空间障碍大的位置上,故而在使用碳二亚胺作为脱水缩合剂的情况下,酰胺化难以进行,容易优先产生由分子内脱水引起的内酯化。另一方面,α2,6-唾液酸的羧基即使在使用碳二亚胺作为脱水缩合剂的情况下,也容易进行酰胺化。另外,通过α2,6-唾液酸的羧基的分子内脱水而产生成的内酯是7元环,与通过α2,3-唾液酸的分子内脱水而生成的内酯相比其结构不稳定,故而α2,6-唾液酸的羧基优先被酰胺化。
为了促进脱水缩合且抑制副反应,优选除了使用碳二亚胺之外,还使用亲核性高的添加剂。作为亲核性高的添加剂,优选使用1-羟基苯并三唑(HOBt)、1-羟基-7-氮杂-苯并三唑(HOAt)、4-(二甲基氨基)吡啶(DMAP)、2-氰基-2-(羟基亚氨基)乙酸乙酯(CHA;商标名:OxymaPure)、N-羟基-琥珀酰亚胺(HOSu)、6-氯-1-羟基-苯并三唑(Cl-HOBt)、N-羟基-3,4-二氢-4-氧代-1,2,3-苯并三嗪(HOOBt)等。
(胺)
作为胺,可以使用含有2个以上碳原子的烷基伯胺或烷基仲胺。使用具有2个以上碳原子的胺的情况,与碳原子数为0的情况(氨)或碳原子数为1的情况(甲胺)相比,存在以下倾向:α2,3-唾液酸的羧基的酰胺化的进行被抑制,内酯的生成特异性变高。因此,提高了唾液酸的结合方式的识别的正确性的同时,还提高了α2,3-唾液酸与α2,6-唾液酸的存在比率等的定量性。为了促进由脱水引起的α2,3-唾液酸的内酯化和α2,6-唾液酸的酰胺化且缩短反应时间,胺的碳原子数优选为5以下,更优选为4以下。
作为优选的胺的例子,可列举出乙胺、丙胺、异丙胺、丁胺、仲丁胺、叔丁胺等烷基伯胺;二甲胺、乙基甲胺、二乙胺、丙基甲胺、异丙基甲胺等烷基仲胺;或者它们的盐。
上述胺中,使用伯胺的情况下,具有以下倾向:在缩短反应时间的同时,由α2,3-唾液酸生成内酯的生成特异性变高。另外,使用具有支链烷基的烷基胺(特别是使用异丙胺)的情况下,具有以下倾向:由α2,3-唾液酸生成内酯的生成特异性变高。
另外,即使在使用烷基不具有支链的胺的情况下,也可以通过调整脱水缩合剂的浓度或反应温度,提高内酯的生成特异性。例如,如后述实施例所详述地,通过降低第一反应的反应温度,有由α2,3-唾液酸生成内酯的生成特异性变高的倾向。另外,在提高脱水缩合剂的浓度的情况下,有由α2,3-唾液酸生成内酯的生成特异性变高的倾向。
(反应条件)
通过使上述含糖链试样、脱水缩合剂和胺反应,糖链的唾液酸经化学修饰,根据唾液酸的结合方式,生成不同的修饰体。反应既可以在液相中实施也可以在固相中实施。在液相中进行反应的情况下,优选在二甲基亚砜(DMSO)或二甲基甲酰胺(DMF)等非水系溶剂中进行反应。通过在非水溶剂中进行反应,具有抑制副反应的倾向。因此,本发明的方法不仅可以适用于游离糖链,也适用于糖肽和糖蛋白等。
液相反应中各成分的浓度并无特别限定,可以根据脱水缩合剂或胺的种类等适当决定。脱水缩合剂的浓度例如优选为1mM~5M,更优选为10mM~3M。在并用碳二亚胺与HOAt或HOBt等亲核性高的添加剂的情况下,优选各自的浓度为上述范围。胺的浓度优选为0.01M~20M,更优选为0.1M~10M。反应温度优选为-20℃~100℃左右,更优选为-10℃~50℃。如果降低反应温度,存在由α2,3-唾液酸生成内酯的生成特异性变高的倾向。另一方面,如果反应温度过低,则反应速度降低,且未反应成分变得容易残留。因此,优选根据胺的种类等,调整反应温度或时间,以使生成特异性变高且未反应成分的残留量变少。
反应时间只要根据试样或试药的浓度、反应温度等决定即可。本发明的方法与以往公知的方法相比,由于可以在短时间内进行修饰化,故而即使反应时间为1小时左右,也可以调制可识别唾液酸的结合方式的试样。
在固相中进行反应的情况下,作为固相载体,只要可以固定糖链、糖肽、糖蛋白等分析对象物质即可,可以无特别限定地使用。例如,为了固定糖肽或糖蛋白,可以利用具有环氧基、甲苯磺酰基、羧基、氨基等作为配位体的固相载体。另外,为了固定糖链,可以利用具有酰肼基或氨基氧基等作为配位体的固相载体。
在使脱水缩合剂和胺对固定于固相载体的分析对象物质起作用而进行化学修饰之后,只要通过化学方法或酶反应等使试样从载体中游离出回收即可。例如,既可以通过PNGaseF或胰蛋白酶,将固定在载体上的糖蛋白或糖肽进行酶切断回收,也可以通过弱酸性溶液,使结合在具有酰肼基的固相载体上的糖链游离并回收。
通过在分析对象物质固定于固相载体上的状态下进行反应,反应试剂的除去和脱盐精制变得更容易,可以简化试样的调制。另外,使用固相载体的情况下,在以糖蛋白或糖肽的状态下固定分析对象物质,只要在与胺和脱水缩合剂的反应之后,进行由PNGaseF等引发的酶反应,也可以将反应后的试样作为游离糖链回收。
由通过脱水缩合剂与胺引起的反应后的试样根据需要,也可以进行精制、脱盐、可溶化、浓缩、干燥等处理。这些处理可以利用公知方法进行。
(通过修饰体的分析进行的唾液酸结合方式的识别)
如上所述,通过在脱水缩合剂和具有2个以上碳原子的胺的存在下使含糖链试样发生反应,α2,3-唾液酸选择性地生成因分子内脱水引起的内酯,α2,6-唾液酸选择性地被酰胺化。据此,具有α2,3-唾液酸的糖链与具有α2,6-唾液酸的糖链被修饰化为具有不同官能团的化合物。因此,通过液体色谱法(LC),可以分离两者,并识别唾液酸的结合方式。
另外,来自α2,3-唾液酸的内酯修饰体与来自α2,6-唾液酸的酰胺修饰体具有不同的分子量。例如,使用乙胺的情况下,酰胺修饰体一方的分子量比内酯修饰体的分子量大45;使用异丙胺的情况下,酰胺修饰体一方的分子量比内酯修饰体的分子量大59。像这样地,通过在分子量相同的结合异构体中进行上述修饰反应,由于可获得分子量不同的修饰体,故而可以通过质量分析分离两者,识别唾液酸的结合方式。
另外,通过LC-MS之类的色谱法与质量分析组合而成的分析,也可以识别唾液酸结合方式。例如,LC-MS中,即使通过LC无法达成各结合异构体的完全分离,也可以进行质量区别,故而可以更正确地定量。
<内酯修饰体的进一步修饰(第二反应)>
在由与脱水缩合剂和胺的反应引起的修饰化之后,也可以进一步进行另外的反应(第二反应)。已知,通过α2,3-唾液酸糖链的分子内脱水生成的内酯修饰体不稳定,如果溶解于水中则50个小时则分解(例如,Wheeler,SF等,Rapid Commun.Mass Spectrometry,23(2009)303-312)。如果在质量分析中使用液体基质,则有时会出现测定前内酯一部分开环,定量性受损的情形。
通过第二反应,可以使由来自α2,3-唾液酸的内酯进一步生成另外的修饰体,使结构稳定化。由内酯生成的另外的修饰体,只要与来自α2,6-唾液酸的酰胺修饰体具有不同的质量就无特别的限定。其中,考虑到可以与内酯修饰体的反应性高,几乎可以完全生成另外的修饰体方面,优选使用了胺的酰胺化。
作为第二反应中使用的胺,如果使用与先前进行的修饰化(第一反应)时不同的分子量的胺,可获得与通过第一反应生成的来自α2,6-唾液酸的酰胺修饰体质量不同的酰胺修饰体。另外,第一反应或第二反应中的任一方中,如果使用被同位素标记的胺,则即使在第一反应与第二反应中使用相同结构或结构异构的胺的情况下,也可获得质量不同的酰胺修饰体。
第二反应中使用的胺只要与第一反应中使用的胺的质量不同就无特别的限定。从提高反应的简便性、定量性的角度考虑,优选使用与来自α2,3-唾液酸的内酯的反应性高的胺。开环酰胺化通过胺对内酯的羰基的亲核反应发生。来自α2,3-唾液酸的内酯的羰基由于存在于空间障碍大的部位上,故而为了提高胺对羰基的亲核反应效率,优选使用分子体积小的胺。因此,内酯的开环酰胺化中使用的胺优选为氨或碳原子数为5个以下的烷基胺、或者它们的盐。
作为第二反应中使用的优选的胺的例子,可列举出铵盐、甲胺、乙胺、丙胺、异丙胺、丁胺、仲丁胺、叔丁胺等烷基伯胺;二甲胺、乙基甲胺、二乙胺、丙基甲胺、异丙基甲胺等烷基仲胺;或者它们的盐。烷基胺的碳原子数优选为4以下,更优选为3以下。上述胺中,优选烷基伯胺或其盐,更优选直链烷基伯胺或其盐,特别优选甲胺或乙胺或者它们的盐。
优选地,在脱水缩合剂的存在下进行内酯的酰胺化。作为脱水缩合剂,优选即使对存在于空间障碍大的部位上的羰基也显示出高反应效率的脱水缩合剂,优选鏻系脱水缩合剂或脲系脱水缩合剂。
作为鏻系脱水缩合剂,可列举出(苯并三唑-1-基氧基)三-(二甲基氨基)鏻六氟磷酸盐(BOP)、苯并三唑-1-基氧基三(吡咯烷基)鏻六氟磷酸盐(PyBOP)、溴代三(二甲基氨基)鏻六氟磷酸盐(BroP)、溴代三(吡咯烷基)鏻六氟磷酸盐(PyBroP)、(7-氮杂苯并三唑-1-基氧基)三(吡咯烷基)鏻六氟磷酸盐(PyAOP)、氯-三-吡咯烷基鏻六氟磷酸盐(PyCloP)等。这些统称为“BOP试剂”,即使对存在于空间障碍大的部位中的羧基也带来高反应效率。因此,即使对如α2,3-唾液酸的羧基或来自α2,3-唾液酸的内酯的羰基之类的空间障碍大的部位,也可以高反应速率地进行酰胺化。
作为脲系脱水缩合剂,可列举出(1-氰基-2-乙氧基-2-氧代亚乙基氨基氧基)二甲基氨基-吗啉-碳鎓六氟磷酸盐(COMU)、2-(1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3六氟磷酸盐(HBTU)、2-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-1,1,3,3六氟磷酸盐(HATU)、2-(1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲四氟硼酸盐(TBTU)、2-(5-降冰片烯-2,3-二羧基酰亚胺)-1,1,3,3-四甲基脲四氟硼酸盐(TNTU)、O-(N-琥珀酰亚胺基(succinimidyl))-1,1,3,3-四甲基脲四氟硼酸盐(TSTU)等。这些脲盐中,特别优选COMU。
上述之中,从提高内酯的酰胺化效率的角度考虑,优选使用鏻系脱水缩合剂。另外,为了加速反应,优选以整个反应体系计,添加N-甲基吗啉等碱至0.01~80重量%左右的浓度。通过添加上述浓度范围的碱于反应体系中,在提高反应效率的同时,还可以抑制副反应、其它的试剂的析出等。在反应体系中含有N-甲基吗啉作为碱的情况下,其浓度优选为1~50重量%,更优选为10~40重量%,进一步优选为15~30重量%。酰胺化的条件(反应温度和反应时间等)并无特别限定,可以直接适用以往公知的唾液酸的酰胺化的条件。
作为第二反应中使用的胺,由于反应性高和副反应少,而特别优选甲胺盐酸盐。其中,如果使用甲胺盐酸盐与PyAOP和N-甲基吗啉,由于可以将内酯大致完全地变换为甲基酰胺,故而定量性的高度分析变为可能。
在上述第一反应后、第二反应中的酰胺化之前,也可以进行来自α2,3-唾液酸的内酯的开环反应。如上所述,已知,通过α2,3-唾液酸糖链的分子内脱水而生成的内酯修饰体也可以在水中水解。因此,如果将使用脱水缩合剂和胺的第一反应后的试样溶解于水中(或者在水中溶出),直接地通过随时间的推移内酯水解,来开环。
为了促进内酯的开环,优选使用酸或碱。特别地,由于内酯容易通过碱进行水解,优选使用碱。另外,在内酯的开环之后进行酰胺化时,优选残存的碱不产生酰胺化的阻碍和副反应。作为碱,如果使用与开环后的酰胺化中使用的胺相同的胺,则可以排除由于开环反应的残留碱而产生的上述问题。另外,酰胺化时优选使用盐酸盐,而作为用于促进内酯开环的碱,优选使用不形成盐的胺。
通过在第二反应中、于酰胺化之前进行内酯的开环,空间障碍降低,且胺向唾液酸的羰基的接近变得容易。因此,通过在酰胺化之前进行开环,酰胺化的反应效率得以提高,残留内酯减少,故而分析的定量性进一步被提高。
上述酰胺化以及由酰胺化前水解引起的内酯的开环反应也可以在固相中进行。在将分析对象物质固定于固相的状态下进行第一反应的情况下,也可以维持第一反应后的分析对象物质固定于固相的状态,进行第二反应。另外,也可以将第一反应后的分析对象物质固定于固相,进行第二反应。作为固相载体,可使用同第一反应所涉及的上述物质同样的物质。关于试样向固相载体的固定和游离,可以采用第一反应所涉及的上述条件。
[试样的分析]
通过将通过上述方法调制后的分析用试样供给至液体色谱法(LC)和质量分析,可获得唾液酸的结合方式的识别、结合方式的比率、唾液酸的有无等信息。
例如,LC分析中,来自α2,3-唾液酸的内酯与来自α2,6-唾液酸的酰胺被检测出不同的峰值,据此,可以识别α2,3-唾液酸糖链与α2,6-唾液酸糖链。另外,以峰面积为指标,可以定量其比率。
另外,由于来自α2,3-唾液酸的内酯与来自α2,6-唾液酸的酰胺具有不同的质量,故而在质量分析中,可以在不同的m/z上检测出信号。进一步地,在通过第二反应进行内酯的酰胺化的情况下,由于在第二反应中经酰胺化的来自α2,3-唾液酸的酰胺与在第一反应中经酰胺化的来自α2,6-唾液酸的酰胺是通过与分子量不同的胺的反应而获得的,故而两者在质量分析中,可以在不同的m/z上检测出信号。
质量分析中,m/z的值也可以基于峰强度(峰高、峰面积等)进行糖链的定量和糖链的结构分析。质量分析的离子化法,可列举出基质辅助激光解吸离子化(MALDI)法、电喷雾离子化(ESI)法和纳米电喷雾离子化(nano-ESI)法等。特别地,MALDI法是适宜的。通过本发明的方法获得的分析用试样无论是正离子模式还是负离子模式,均可以识别唾液酸的结合方式。
另外,还可以将通过LC作为分离峰而被检出的试样供给至质量分析。在通过LC进行试样分离的情况下,也可以使用具备LC的LC-MS作为质量分析的前段,将来自LC的溶出液直接离子化,以供分析。另外,还可以将来自LC的溶出液一次性分离取出,以供质量分析。LC的柱并无特别限定,可以适当选用肽分析中通常使用的C30、C18、C8、C4等疏水柱、亲水性亲和色谱用的载体等。
质量分析也可以MS2以上的多阶段进行。通过进行MS2以上的多阶段质量分析,还可以进行除唾液酸的结合方式以外的糖链的结构和糖链所结合的肽部分的结构的解析。糖链和糖肽的结构解析也可以通过使用了光谱数据的数据库检索等进行。
[对肽和蛋白质的应用]
如上所述,本发明的方法不仅可以应用于游离糖链,还可以应用于肽和蛋白质。在将本发明的调制方法应用于糖肽和糖蛋白的情况下,不仅可以进行唾液酸的结合方式的识别,还可以识别唾液酸的有无等。
如上述专利文献2(日本专利特开第2015-34712号公报)中所述,在以往的唾液酸的修饰化法中,不仅唾液酸的羧基被酰胺化,肽C末端的羧基、酸性氨基酸残基(谷氨酸和天冬氨酸)的羧基等也被酰胺化。因此,在不进行结构解析的情况下,难以知道糖链的羧基与唾液酸的羧基中的哪一个被酰胺化。另外,在以往的修饰化法中,通过肽部分的N末端的氨基与谷氨酸残基侧链的脱水酰胺化(焦谷氨化(pyro-Glu化)),有时会产生肽部分的质量变化。
与此相对,关于使用胺和脱水缩合剂的上述第一反应,除了难以产生副反应、适用于糖肽之外,肽的羧基还难以被酰胺化,具有唾液酸的羧基被选择性地修饰(酰胺化或内酯化)的倾向。因此,在试样不具有唾液酸的情况(还包括不具有糖链的情况)下,修饰反应几乎不会发生,在质量分析中,观测到具有与修饰反应前相同的m/z的峰。试样具有α2,6-唾液酸的情况下,观察到由酰胺化引起的分子量的增加。另外,试样具有α2,3-唾液酸的情况下,观察到由脱水引起的分子量的减少。因此,除了对唾液酸的结合方式的识别有用之外,还对唾液酸有无的判别有用。即,本发明的分析用试样调制方法也对糖链上未结合有唾液酸的试样(唾液酸的有无为未知的试样)的分析有用。
进一步地,由于在反应前后肽部分的质量未发生变化,故而分析结果的解析和与数据库的对照核查是容易的。另外,由于肽部分难以反应,C末端和酸性氨基酸残基的羧基未被修饰化而残存,故而即使对于进行第一反应后的肽和蛋白质也可以适当地进行酶反应。例如,即使在使用如Glu-C和Asp-N这样地酸性氨基酸残基参与的蛋白水解酶的情况下,也可以适当地进行蛋白水解酶消化。因此,也可以在对糖蛋白进行第一反应之后,进行酶反应,将所获得的糖链和糖肽供给至分析。
此外,在以往的修饰化法中,由于不仅是唾液酸的羧基被修饰,肽C末端的羧基和酸性氨基酸残基的羧基也被修饰,故而负离子模式质量分析中的离子化效率低,解析变为困难或变为不可能的情况较多。与此相对,在上述第一反应中,由于几乎不发生肽部分的修饰化,肽C末端和酸性氨基酸残基的羧基残存,故而试样容易负离子化。因此,即使是负离子模式质量分析,也可实现灵敏度高的分析,也可以通过负离子模式质量分析对难以正离子化的肽进行分析。如后述的实施例所示,关于通过本发明的方法进行修饰化后的糖肽,即使通过正离子模式或负离子模式中任一项的质量分析,也可实现唾液酸的结合方式的识别。
另外,根据脱水缩合剂存在下的糖肽与胺的反应条件,有时会出现肽的羧基的一部分或全部被酰胺化的情形。在这种情况下,如果使用含有2个以上碳原子的胺,由于糖链部分的α2,3-唾液酸被选择性地内酯化,糖链部分的α2,6-唾液酸被选择性地酰胺化,故而通过两者结合方式的差异而产生质量差,能够识别唾液酸的结合方式。
如上所述,由于通过将第一反应应用于肽和蛋白质,唾液酸部位优先变化为修饰体,故而可以适用于肽和蛋白质中的唾液酸的有无等的结构解析。即,本发明的分析用试样调制方法的实施方式之一是:在唾液酸结合于分析对象物质时,优先使唾液酸部位变化为修饰体的方法。该实施方式中使用的分析对象试样为肽或蛋白质,优选为糖肽或糖蛋白。
肽和蛋白质试样的第一反应可以在与糖链试样相同的条件下实施。即,在液相中进行反应的情况下,只要使脱水缩合剂和胺在DMSO或DMF等非水系溶剂中进行反应即可。通过该反应,糖链的唾液酸优先被化学修饰。如上所述,也可以在使肽或蛋白质结合于固相载体的状态下,使脱水缩合剂和胺发生作用。肽或蛋白质与固相载体例如可以介由N末端、C末端、SH基等进行固定。
在将肽或蛋白质供给至第一反应的情况下,脱水缩合剂和胺优选使用上述物。另外,以识别唾液酸的结合方式为目的,可以如前所述地使用含有2个以上碳原子的胺,但是在没有必要识别唾液酸的结合方式的情况下,也可以使用碳原子数小于2的胺(即,铵盐、甲胺或其盐等胺)。在仅解析唾液酸的有无的情况下,由于无需根据唾液酸的结合方式而生成不同的修饰体,故而即使在使用碳原子数小于2的胺的情况下,也可以达成其目的。另一方面,在使用碳原子数为2以上的胺的情况下,除了可以分析唾液酸的有无之外,在试样为含有唾液酸的糖蛋白或糖肽时,唾液酸的结合方式的识别、其存在比等也可以同时进行分析。
实施例
以下,列举实施例,具体地说明本发明,但本发明并不限于下述实施例。另外,以下,%的记载只要无特别说明,均表示重量%。
[实施例1]唾液酸乳糖的修饰化
实施例1中,使用3’-唾液酸乳糖作为具有α2,3-唾液酸的游离糖链试样,使用6’-唾液酸乳糖作为具有α2,6-唾液酸的游离糖链试样,对由胺的种类和反应条件所带来的修饰化的影响进行研究。
(糖链试样的调制)
分别将3’-唾液酸乳糖和6’-唾液酸乳糖(均购自东京化成)溶解于水中后,进行分注,通过离心浓缩(SpeedVac)除去溶剂,使其干燥。
(与胺的反应)
将各种胺的盐酸盐(氯化铵盐、甲胺盐酸盐、乙胺盐酸盐、二甲胺盐酸盐、丙胺盐酸盐、异丙胺盐酸盐和丁胺盐酸盐)溶解于DMSO中后所得物(胺盐酸盐浓度:1M~4M),分别添加10μL至糖链试样中。接着,作为脱水缩合剂,分别添加10μL的将二异丙基碳二亚胺(DIC)和1-羟基苯并三唑(HOBt)溶解于DMSO中使其浓度变为500mM的所得物,在室温下搅拌2分钟后,在37℃下反应1小时。反应后的溶液中,添加120μL的93.3%乙腈(ACN)、0.13%三氟乙酸(TFA)溶液,进行稀释。
(反应物的精制)
作为精制用的载体,使用棉花亲水相互作用液相色谱微尖(cotton HILIC microtip)。首先,将棉花填塞于200μL尖端的前端。通过移液,重复进行3次的200μL的水的吸取与排出,进行洗净。接着,重复进行3次的60μL的99%ACN、0.1%TFA溶液的吸取与排出,进行平衡化。在稀释后的反应溶液中移液10次,使反应溶液中的糖链吸附于棉花中。接着,重复进行3次的150μL的99%ACN、0.1%TFA溶液的吸取与排出,进行洗净。最后,在水20μL中移液5次,使糖链溶出到水中。
(质量分析)
将溶出到水中的试样1μL滴落到聚焦板上,作为基质,添加0.5μL的溶解于50%ACN中的10mg/mL的2,5-二羟基苯甲酸(DHB)、1mM的NaCl。干燥后,滴下0.2μL的乙醇使其再结晶。通过MALDI-QIT-TOF-MS(AXIMA-Resonance,Shimadzu/Kratos),以正离子模式,对该试样进行质量分析。
6’-唾液酸乳糖与甲胺反应所得的试样的质谱如图1(A1)所示,6’-唾液酸乳糖与异丙胺反应所得的试样的质谱如图1(B1)所示。3’-唾液酸乳糖与甲胺反应所得的试样的质谱如图1(A2)所示,3’-唾液酸乳糖与异丙胺反应所得的试样的质谱如图1(B2)所示。
(分析结果)
关于使具有α2,6-唾液酸的6’-唾液酸乳糖在脱水缩合剂存在下与甲胺反应所得的试样,在m/z 669处具有正离子质谱峰(图1(A1)),几乎100%甲酰胺化。此外,关于使6’-唾液酸乳糖在脱水缩合剂存在下与异丙胺反应所得的试样,在m/z 697处具有正离子质谱峰(图1(B1)),几乎100%异丙酰胺化。
关于使具有α2,3-唾液酸的3’-唾液酸乳糖在脱水缩合剂存在下与胺反应所得的试样,在与异丙胺的反应中,在m/z 638处具有正离子质谱峰(图1(B2)),几乎100%通过脱水被内酯化。另一方面,在与甲胺的反应中,除了可以确认到m/z 638的内酯化修饰体的峰之外,还可以确认到m/z 669的甲酰胺化修饰体的峰(图1(A2))。根据这些结果可知,在使非还原末端上具有α2,3-唾液酸的糖链在脱水缩合剂的存在下与胺反应的情况下,由脱水引起的内酯化与由胺的亲核反应引起的酰胺化产生竞争,根据胺的种类,修饰体的生成比不同。
由3’-唾液酸乳糖与胺的反应产生的修饰体的生成比如图2-1(A)所示。由6’-唾液酸乳糖与胺的反应产生的修饰体的生成比如图2-1(B)所示。如图2-1(B)所示,6’-唾液酸乳糖无论使用何种胺均几乎100%酰胺化,而3’-唾液酸乳糖则根据胺的种类而引起内酯化与酰胺化的比率不同。可知:在使用氨或甲胺时,内酯化的比率小于80%,而在使用碳原子数为2以上的胺(乙胺、二甲胺、丙胺、异丙胺和丁胺)时,内酯化的比率高,选择性优异。特别是,可知,在使用具有支链烷基的异丙胺的情况下,内酯化的比率为95%以上,反应特异性高。
[实施例2]反应条件的研究
实施例2中,与实施例1同样地使用唾液酸乳糖作为试样,在脱水缩合剂的存在下,与胺进行反应。变更反应时的胺盐酸盐的浓度、脱水缩合剂的浓度和温度,研究反应条件对修饰化的影响。
(胺浓度的研究)
除了使用异丙胺盐酸盐作为胺盐酸盐、使反应时的异丙胺盐酸盐的浓度在0.5M~4.5M(DMSO溶液调制时的浓度1M~9M)的范围内变化之外,其余与上述实施例1相同地,在脱水缩合剂(DIC和HOBt)的存在下,进行唾液酸乳糖与胺的反应。精制各反应溶液,与实施例1相同地在正离子模式下进行质量分析。无论是何种试样,其反应特异性均与实施例1相同,与胺浓度无关,3’-唾液酸乳糖以95%以上的效率形成内酯,6’-唾液酸乳糖几乎100%异丙酰胺化。
(脱水缩合剂浓度的研究)
除了使用异丙胺盐酸盐作为胺盐酸盐、分别使反应时的脱水缩合剂(DIC和HOBt)的浓度在50mM~250mM(溶液调制时的浓度100mM~500mM)范围内变化之外,其余与上述实施例1同样地,在脱水缩合剂的存在下,进行唾液酸乳糖与胺的反应。精制各反应溶液,与实施例1相同地在正离子模式下进行质量分析。无论是何种试样,其反应特异性均与实施例1相同,与胺浓度无关,3’-唾液酸乳糖以95%以上的效率形成内酯,6’-唾液酸乳糖几乎100%异丙酰胺化。
(脱水缩合剂的种类的研究)
虽然使用异丙胺盐酸盐作为胺盐酸盐,使用二环己基碳二亚胺(DCC)代替DIC作为脱水缩合剂,以DCC与HOBt的组合进行反应,但是反应特异性上未发现变化,3’-唾液酸乳糖以95%以上的效率形成内酯,6’-唾液酸乳糖几乎100%异丙酰胺化。此外,虽然使用1-羟基-7-氮杂苯并三唑(HOAt)代替HOBt,使用2-氰基-2-(羟基亚氨基)乙酸乙酯(OxymaPure),或者4-(二甲基氨基)吡啶(DMAP),与DIC或DCC组合而进行反应,但是反应特异性上未发现变化。
(反应温度的研究)
使用异丙胺盐酸盐作为胺盐酸盐,分别将反应时的胺盐酸盐浓度调整至2M(DMSO溶液调制时的浓度4M)、反应时的脱水缩合剂(DIC和HOBt)的浓度调整至500mM(DMSO溶液调制时的浓度1M),将胺盐酸盐和脱水缩合剂添加到糖链试样中后,在冰浴条件下(约0℃)反应2小时。除此以外,与实施例1同样地,精制反应溶液,在正离子模式下进行质量分析。6’-唾液酸乳糖与实施例1同样地几乎100%异丙酰胺化。另一方面,3’-唾液酸乳糖的内酯生成特异性(内酯相对酰胺化修饰体与内酯的合计的比值)约为99%,显示出比实施例1高的特异性。
使用甲胺盐酸盐、乙胺盐酸盐、二甲胺盐酸盐、丙胺盐酸盐和丁胺盐酸盐代替异丙胺盐酸盐作为胺盐酸盐,与上述相同地在冰浴条件下反应2小时后,精制反应溶液,在正离子模式下进行质量分析。
由在冰浴条件下的3’-唾液酸乳糖与胺的反应产生的修饰体的生成比如图2-2(A)所示。由在冰浴条件下的6’-唾液酸乳糖与胺的反应产生的修饰体的生成比如图2-2(B)所示。
根据图2-1(A)与图2-2(A)的对比可以确认,通过在脱水缩合剂存在下,在低温下进行3’-唾液酸乳糖与胺的反应,从而内酯生成特异性提高,特别是在使用碳原子数为2以上的胺的情况下,获得98%左右或者其以上的高特异性。另外,由于在冰浴条件下的反应的反应速度低,故而如图2-2所示,从反应开始,2个小时的情况下,可以确认到2~9%左右的未反应成分。可认为,如果通过反应时间的延长、胺或脱水缩合剂的浓度上升等来加快反应速度,可以减少未反应成分。
[实施例3]具有多种唾液酸的支链糖链的修饰化
实施例3中,使用4种具有2个结合方式已知的唾液酸的双天线型的吡啶基氨基(PA)化糖链作为试样,与实施例1同样地,在脱水缩合剂(DIC和HOBt)的存在下,进行由与胺盐酸盐的反应引起的修饰化,精制反应溶液后,在正离子模式下进行质量分析。
使用乙胺盐酸盐作为胺盐酸盐来进行修饰化的试样的正离子质谱如图3(A1)~(A4)所示。此外,使用异丙胺盐酸盐作为胺盐酸盐来进行修饰化的试样的正离子质谱如图3(B1)~(B4)所示。
进行修饰化前的4种糖链均可以在相同的m/z处观测到峰。与此相对,如果使用胺盐酸盐使其反应,则根据分子内存在的唾液酸的结合方式与其数目,观测到具有不同m/z的峰。具体地,使用乙胺盐酸盐时,在2个唾液酸同时为α2,3-唾液酸的情况下,两者均被内酯化,在m/z 2288处观测到峰(图3(A1));在各具有一个α2,3-唾液酸与α2,6-唾液酸的情况下,一个唾液酸被内酯化,而另一个唾液酸被乙基酰胺化,在m/z2333处观测到峰(图3(A2)和(A3));在2个唾液酸同时为α2,6-唾液酸的情况下,两者均被乙基酰胺化,在m/z2378处观测到峰(图3(A4))。使用异丙胺盐酸盐时,在2个唾液酸均被内酯化的情况下,与使用乙胺盐酸盐的情况同样地,在m/z 2288处观测到峰(图3(B1));在一个唾液酸被内酯化而另一个唾液酸被异丙酰胺化的情况下,在m/z 2347处观测到峰(图3(B2)和(B3));在2个唾液酸均被异丙酰胺化的情况下,在m/z 2406出观测到峰(图3(B4))。
根据这些结果可知,通过本发明的方法,可以实现糖链的唾液酸的数目和结合方式的识别。另外,在使用乙胺盐酸盐时,即使是仅具有α2,3-唾液酸的糖链,也可以在来自乙基酰胺化修饰体的m/z 2333处观测到峰(图3(A1));即使是只具有一个α2,3-唾液酸的糖链,也可以在m/z 2338处观测到峰(图3(A2)和(A3)),一部分的α2,3-唾液酸被乙基酰胺化。与此相对,在使用异丙胺盐酸盐时,因为由唾液酸的结合方式引起的反应特异性高,故而即使任意一种糖链试样,也都大致观测到1个信号(图3(B1)~(B4))。根据这些结果可知,即使糖链的种类不同,也保持了由上述实施例1或实施例2中进行研究的胺的种类等而引起的生成特异性。
[实施例4]从糖蛋白切取出的糖链的修饰化
实施例4中,进行从含有大量的α2,3-唾液酸糖链胎球蛋白中切取出的游离糖链的修饰化。
(从糖蛋白中切取和精制糖链)
将糖蛋白(胎球蛋白)溶解于20mM碳酸氢铵、10mM DTT、0.02%SDS中,在100℃下处理3分钟,使之变性还原。然后,冷却至室温,添加PNGase F,在37℃下孵育一夜,使糖链游离。次日,在100℃下进行3分钟热处理,通过使PNGase F失活,从而使酶反应停止。
使用碳柱,将通过酶反应切取出的糖链进行脱盐精制。作为碳柱,使用将EmporeDisk碳(3M制造)剪下直径约1mm、填塞到200μL的尖端中所得的Stage Tip Carbon。在将100μL的ACN添加到Stage Tip Carbon中后,通过离心排出。然后,使用1M NaOH、1M HCl、水、60%ACN、0.1%TFA溶液、和水,依次进行同样的操作,进行柱载体的洗净与平衡化。然后,将酶反应溶液加入柱中,通过离心来排出溶液。在进一步添加200μL的水之后,重复3次通过离心进行的排出,进行洗净。最后,添加20μL的60%ACN、0.1%TFA溶液,重复2次通过离心进行的排出,使糖链溶出。合并2次分的溶出液,通过SpeedVac,除去溶剂,使之干燥固化。
<比较例4-1:甲酰胺化>
在经干燥固化的试样中,添加10μL的溶解于DMSO中的4M甲胺盐酸盐。接着,添加10μL的溶解于30%N-甲基吗啉(NMM)中的250mM PyAOP,在室温下搅拌1小时。在反应后的溶液中,添加120μL的93.3%ACN、0.13%TFA溶液。然后,使用GL-Tip Amide,同与异丙胺的反应后同样地进行精制和溶出,通过SpeedVac使溶出液干燥固化。
使经干燥固化的试样再次溶解于10μL的水中,将1μL滴落在聚焦板上,作为基质,添加0.5μL的溶解于50%ACN中的100mM 3AQ/CA、2mM硫酸铵后,使之在75℃的微量恒温仪(Heat Block)中反应1.5小时,进行由3AQ引起的糖链的还原末端的标记化。反应结束后,将板冷却至室温,通过MALDI-QIT-TOF-MS(AXIMA-Resonance,Shimadzu/Kratos),在负离子模式下进行质量分析。质谱如图4(A)所示。
<实施例4-1:使用异丙胺进行内酯化后的甲酰胺化>
(与异丙胺的反应)
使用DIC和HOBt作为脱水缩合剂,使用异丙胺盐酸盐作为胺盐酸盐,与实施例1同样地进行糖链的修饰化后,在反应后的溶液中,添加120μL的93.3%ACN、0.13%TFA溶液进行稀释。
作为精制用的载体,使用GL-Tip Amide(GL科学制造)。首先,在GL-TipAmide中添加100μ的水,重复进行3次离心排出,进行洗净。接着,添加100μL的90%ACN、0.1%TFA溶液,重复进行3次离心排出,进行平衡化。接着,添加全部质量的稀释过的反应溶液,使糖链吸附在载体上,离心。接着,添加200μL的90%ACN、0.1%TFA,重复进行3次离心排出,进行洗净。最后,添加10μL的水,重复2次通过离心进行的排出,使糖链溶出。合并2次分量的溶出液,通过SpeedVac,除去溶剂,使之干燥固化。
(甲酰胺化)
在经干燥固化的试样中,添加10μL的溶解于DMSO中的4M甲胺盐酸盐。接着,添加10μL的溶解于60%N-甲基吗啉(NMM)中的100mM PyAOP,在室温下搅拌1小时。进一步地,添加5μL的溶解于30%NMM/DMSO中的500mM PyAOP,在室温下搅拌1小时。在反应后的溶液中,添加120μL的93.3%ACN、0.13%TFA溶液。然后,使用GL-Tip Amide,同与异丙胺的反应后同样地进行精制和溶出,通过SpeedVac使溶出液干燥固化。
(质量分析)
使经干燥固化的试样再次溶解于10μL的水中,将1μL滴落到聚焦板上,与上述比较例4-1同样地,在负离子模式下进行质量分析。质谱如图4(B)所示。
(分析结果)
在使用PyAOP的只进行甲酰胺化的比较例4-1中,无法区别唾液酸的结合方式,只观测到对应于唾液酸数目的信号。另一方面,在实施例4-1(作为脱水缩合剂的DIC和HOBt的存在下,进行与异丙胺盐酸盐的反应,然后在PyAOP的存在下,进行与甲胺盐酸盐的反应)中,根据唾液酸的结合方式与唾液酸数目,在不同的m/z上观测到峰。这些表明,生成了经异丙酰胺化的糖链与经甲酰胺化的糖链、进一步地在一分子中具有其两者的糖链。根据该结果可知,通过衍生物化,不仅可实现唾液酸的结合方式的识别,还可实现各糖链的比率的相对定量。
另外,图4(B)中的X/Y中,X表示α2,3-唾液酸的数目,Y表示α2,6-唾液酸的数目(图4(C)和图5中也相同)。例如,来自三天线型的具有3个唾液酸的糖链的峰在m/z3200附近被观测到,3个唾液酸均是α2,3-唾液酸者(3/0)显示出最小的m/z,3个唾液酸均是α2,6-唾液酸者(0/3)显示出最大的m/z。
异丙酰胺化体与内酯化体的质量差为59Da,与此相对地,在进行与异丙胺的反应作为第一反应之后、进行与甲胺的反应作为第二反应的实施例(图4(B))中,α2,3-唾液酸糖链的修饰体与α2,6-唾液酸糖链修饰体的m/z的差为28(例如,双天线型的2/0与1/1的m/z的差为28,双天线型的2/0与0/2的m/z的差为56)。该28Da的差由于等于异丙基与甲基的差(=乙烯:C2H4),故而可知α2,3-唾液酸糖链在通过与异丙胺的反应进行内酯化后,通过在PyAOP存在下的与甲胺的反应,内酯开环,甲酰胺化。另一方面,可知α2,6-唾液酸糖链在通过与异丙胺的反应异丙酰胺化后,不在PyAOP存在下与甲胺反应,不由异丙酰胺修饰体产生变化(也可参见后述的实施例4-4)。
根据其结果可知,使糖链在脱水缩合剂的存在下与胺反应,将α2,3-唾液酸糖链内酯化、α2,6-唾液酸糖链酰胺化后,进一步地通过与另外的胺反应作为第二反应,来自α2,3-唾液酸糖链的内酯开环酰胺化,生成具有与来自α2,6-唾液酸糖链的酰胺修饰体不同分子量的酰胺修饰体,通过质量分析可以识别糖链的结合方式。此外,图4(B)中可知,由于几乎未观测到来自于内酯的信号,故而通过该方法,内酯可以高反应率地被酰胺化。
<实施例4-2:由内酯的水解引起的开环后的甲酰胺化>
与上述实施例4-1同样地,使用DIC、HOBt和异丙胺盐酸盐,进行糖链的修饰化,以及使用GL-Tip Amide进行精制,获得20μL的溶出液。
(内酯的开环和甲酰胺化)
在20μL的溶出液中,添加5μL的4.0%甲胺水溶液,进行搅拌之后,在室温下静置10分钟,进行由内酯的水解引起的开环。然后,通过SpeedVac,除去溶剂,使之干燥固化。在进行在碱环境下的内酯的开环之后,与上述实施例4-1同样地,通过在NMM和PyAOP的存在下进行搅拌,进行甲酰胺化,进行精制和试样的干燥固化。
(质量分析)
使经干燥固化的试样再次溶解于10μL的水中,与实施例4-1同样地,在负离子模式下进行质量分析。质谱如图4(C)所示。
(分析结果)
图4(C)的质谱虽然与图4(B)类似,但是相比于图4(B),其所观测到的信号减少。即使将内酯的开环反应中使用的甲胺水溶液的浓度从4.0%(反应溶液中的甲胺浓度:0.8%)变更为40%(反应溶液中的甲胺浓度:8%)的情况,也可以获得与图4(C)几乎同样的质谱,与图4(B)相比,其峰的数目减少。可知,其是由来自内酯的信号完全消失所带来的结果,在由脱水缩合剂和异丙胺引起的内酯化(第一反应)与第二反应中的甲酰胺化之间,通过进行由水解引起的内酯开环(即,通过水解恢复到内酯化前的状态的反应),α2,3-唾液酸糖链的甲酰胺化的反应效率上升,可以提高定量性等分析精度。
将甲胺水溶液的浓度变更为0.4%(反应溶液中的甲胺浓度:0.08%)的情况下的质谱相比于图4(B),其来自内酯的峰强度虽然减少,但是并未完全消失。可以说是,通过延长反应时间,能够完全将内酯水解,但从效率的角度考虑,内酯开环时的胺浓度优选为0.1%以上。
<实施例4-3:固定在固相载体上的糖链试样的修饰化>
使通过酶反应切取出的来自胎球蛋白的糖链结合在具有酰肼基为配体的固相载体(BlotGlyco住友电木制造)上。糖链的结合按照BlotGlyco的标准方案进行。
(与异丙胺盐酸盐的反应和与甲胺盐酸盐的反应)
使用200μL的DMSO,将结合糖链后的载体进行3次洗净。添加100μL的异丙酰胺化反应溶液(2M异丙胺盐酸盐、250mM DIC、250mM HOBt),使用吸液管轻微混合后,在37℃下使之反应1.5小时。通过离心除去液体后,使用200μL的DMSO进行3次洗净。随后,添加100μL的甲酰胺化反应溶液(2M甲胺盐酸盐、50mM PyAOP、30%NMM),在室温下搅拌1小时。进一步地,追加5μL的PyAOP溶液(500mM PyAOP、30%NMM),在室温下搅拌30分钟。然后,分别使用200μL的DMSO、200μL的甲醇、和200μL的水,各进行3次洗净。然后,按照标准方案,使反应后的糖链试样从载体中游离出,以Stage Tip Carbon进行脱盐精制,通过SpeedVac使之干燥固化。
(质量分析)
使经干燥固化的试样再次溶解于10μL的水中,与实施例4-1同样地,在负离子模式下进行质量分析。质谱如图5(A)所示。
(分析结果)
由于图5(A)的光谱与图4(B)的光谱几乎相同,故而可知,即使在已将糖链固定在固相载体上的状态下,也可与在液相状态下进行反应的情况相同地实施修饰化。
<实施例4-4:在固定于固相载体的状态下的内酯开环步骤的追加>
与上述实施例4-3同样地,使来自胎球蛋白的糖链结合于固相载体上,进行使用异丙酰胺化反应溶液的反应和通过DMSO的洗净。然后,通过使用200μL的1%甲胺水溶液进行3次洗净,实施碱环境下的内酯开环。然后,与上述实施例4-3同样地,使用甲酰胺化反应溶液,进行酰胺化,对从固相载体上游离出的试样进行精制,进行负离子模式质量分析。质谱如图5(B)所示。
(分析结果)
图5(B)的光谱与图4(C)的光谱类似,与图5(A)相比,其所观测到的信号的数目减少。根据该结果可知,即使是在将糖链固定在固相上的状态下,通过在内酯化(第一反应)与第二反应中的甲酰胺化之间,进行由水解引起的内酯开环,也可提高α2,3-唾液酸糖链的甲酰胺化的反应效率。此外,还已知,由于没有在图5(A)与图5(B)中观察到整体信号强度上发生变化,故而即使在为了内酯开环而进行通过胺的洗净的情况下,也不会产生由于pH的上升而导致的载体的腙的开裂,可以维持糖链固定在载体上的状态。
<实施例4-5>
作为糖蛋白,代替胎球蛋白,以α2,6-唾液酸糖链为主成分的转铁蛋白为对象,通过使用PNGase F的酶反应切取糖链。与上述实施例4-1~4-3同样地,进行与异丙胺盐酸盐的反应后,进行与甲胺盐酸盐的反应,进行负离子模式质量分析。
使用从转铁蛋白切取出的糖链,不论是在与实施例4-1同样地在液相下进行反应的情况下,还是与实施例4-3同样地在糖链固定在载体上的固相状态下进行反应的情况下,在质谱中,都只能观测到唾液酸糖链的异丙酰胺化修饰体的峰。与实施例4-2同样地,即使是在使用异丙胺盐酸盐的反应与使用甲胺盐酸盐的反应之间于甲胺水溶液中静置的情况下,也只能观测到异丙酰胺化修饰体的峰。这表示,通过使用DIC和HOBt作为脱水缩合剂与异丙胺盐酸盐反应,几乎所有的α2,6-唾液酸被异丙酰胺化,即使在其后添加PyAOP和甲胺,异丙酰胺修饰体也不反应。
[实施例5]唾液酸糖肽的修饰化
在实施例5中,使用唾液酸糖肽(SGP)作为糖肽,进行糖肽的修饰化。
<实施例5-1:由异丙胺引起的唾液酸糖肽的修饰化>
(糖肽的修饰化和精制)
分别将2,3-SGP和2,6-SGP(均为株式会社伏见制药所的糖肽标准品;2865.8Da)溶解于水中,各分注100pmol,通过SpeedVac除去溶剂。在其中,添加10μL的4M异丙胺盐酸盐的DMSO溶液之后,添加10μL的100mM DIC、100mM HOBt的DMSO溶液,在室温下搅拌2分钟之后,在37℃下使之反应1小时。在反应后的溶液中,添加120μL的93.3%ACN、0.13%TFA溶液,进行稀释。然后,与实施例1同样地,使用棉花亲水相互作用液相色谱微尖(cotton HILICmicrotip)进行精制,使糖链溶出于水中。
(质量分析)
将溶出于水中的试样1μL滴落在聚焦板上,添加0.5μL的溶解于50%ACN中的10mg/mL2’,4’,6’-三羟基苯乙酮一水合物(THAP)作为基质。通过MALDI-QIT-TOF-MS(AXIMA-Resonance,Shimadzu/Kratos),在负离子模式下进行质量分析。2,3-SGP的反应物的负离子质谱如图6-1(A)所示。2,6-SGP的反应物的负离子质谱如图6-1(B)所示。
将基质变更为溶解于50%ACN中的10mg/mL的2,5-二羟基苯甲酸(DHB)、0.1mM亚甲基二膦酸(MDPNA),在正离子模式下进行质量分析。2,3-SGP的反应物的正离子质谱如图6-2(A)所示。2,6-SGP的反应物的正离子质谱如图6-2(B)所示。
(分析结果)
在2,3-SGP的反应物的负离子质谱(图6-1(A))中,在m/z 2827处观测到峰;在2,6-SGP的反应物的负离子质谱(图6-1(B))中,在m/z 2945处观测到峰。由于两者的m/z的差为相当于2个异丙胺的118,故而可知,在2,3-SGP中,2个唾液酸均被内酯修饰化,在2,6-SGP中,2个唾液酸均被异丙酰胺修饰化。根据这些结果可知,本发明的方法不仅对游离糖链有用,还对糖肽上的糖链的唾液酸的结合方式的识别和定量有用。
在2,3-SGP的反应物的正离子质谱(图6-2(A))中,在m/z 2829处观测到峰;在2,6-SGP的反应物的正离子质谱(图6-2(B))中,在m/z 2947处观测到峰。与负离子质谱的情况同样地,两者的m/z的差也为118。另外,在2,3-SGP的反应物的正离子质谱中,确认到m/z2847([MH]++18)的峰,虽然认为在离子化时2个内酯中任一方通过水解开环,但是其强度与[MH]+的峰相比十分低。此外,在2,6-SGP的反应物的正离子质谱中,m/z 2929([MH]+-18)和m/z 2988([MH]++41)处也确认到峰,前者是异丙酰胺修饰体的脱水化物,后者是肽C末端的羧基异丙酰胺化后的物质,均能够被识别。
根据这些结果可知,本发明的修饰化法可以适用于糖肽的正离子模式质量分析、负离子模式质量分析中的任一者,无论通过正离子模式和负离子模式中的任一者,均可以识别糖链的唾液酸的结合方式。
另外,关于本实施例的质谱中的峰的m/z的值与修饰化前的唾液酸糖肽的m/z的差,无论是正离子和负离子中的任一者,2个唾液酸通过脱水被内酯化的情况(图6-1(A)和图6-2(A))均为-36,2个唾液酸被异丙酰胺化的情况(图6-1(B)和图6-2(B))均为+82。根据这些结果可知,即使在脱水缩合剂的存在下进行与胺盐酸盐的反应,肽的C末端的羧基也几乎没有被修饰化。
<实施例5-2:通过源内分解质量分析进行的修饰部位的确认>
在上述实施例5-1中,出于确认通过异丙胺被修饰化后的部位为糖链的唾液酸部分、肽部分没有被修饰化的目的,进行糖肽的分解离子测定。具体地,通过提高正离子模式质量分析时的激光强度,促进源内分解,使之生成分解离子,确认低m/z区域的片段(fragment)。2,3-SGP的反应物的源内分解质谱如图7(A)所示,2,6-SGP的反应物的源内分解质谱如图7(B)所示。
2,3-SGP的反应物和2,6-SGP的反应物均可以在低m/z区域中观测到m/z 863.5的清晰信号,在两者之间没有看到分解离子的m/z的差。m/z 863.5的峰是GlcNAc一残基附加在肽上的离子,是容易作为糖肽的分解离子被观测到的片段。如图6-2所示,2,3-SGP的反应物与2,6-SGP的反应物的m/z的差为118,如图7所示,两者的肽部分的m/z中不存在差值,故而可知肽部分几乎未被修饰。
另外,在图7(A)和(B)中,虽然检测出来自于肽C末端的羧基通过异丙胺被酰胺化的片段的m/z 904.5的信号,但是其强度不足肽部分未被修饰的m/z 863.5的信号强度的3%。根据这些结果可知,当在脱水缩合剂的存在下进行糖肽与胺盐酸盐的反应时,肽的C末端的羧基几乎未被修饰化,糖链的唾液酸部分被选择性地修饰化。
<比较例5-1:由甲胺引起的唾液酸糖肽的修饰化>
分别将2,3-SGP和2,6-SGP溶解于水中,各分注100pmol,通过SpeedVac除去溶剂。在其中,添加10μL的溶解于DMSO中的4M甲胺盐酸盐。接着,添加10μL的溶解于30%NMM中的250mM PyAOP,在室温下搅拌1小时。与上述实施例5-1同样地,进行反应物的精制,在正离子模式下进行质量分析。2,3-SGP的反应物的质谱如图8(A)所示,2,6-SGP的反应物的质谱如图8(B)所示。
在2,3-SGP和2,6-SGP与甲胺的反应物的质谱中,均在m/z 2904处检测出峰,未看到对应于唾液酸的结合方式的m/z的差。该峰的m/z比修饰化前的唾液酸糖肽的m/z大39,相当于唾液酸糖肽中包含的3个羧基被甲酰胺修饰化之物。
以与实施例5-2同样的方法,实施2,3-SGP和2,6-SGP与甲胺的反应物的源内分解质量分析之后(数据未图示),在低m/z区域中,在相比于肽上附加了GlcNAc一残基的离子大13的m/z 876.5处确认到明确的信号,可知生成了在肽部分的1处位置(C末端的羧基)被甲酰胺化的片段。另一方面,几乎未观测到m/z 863.5的信号。
根据这些结果可以说,在唾液酸糖肽与甲胺的反应中,与唾液酸的结合方式无关,2个唾液酸部分与肽部分C末端的计3个羧基全部被甲酰胺化,唾液酸的结合方式的识别困难。
<比较例5-2:由乙醇引起的唾液酸糖肽的修饰化>
通过Reiding,K.et al.,Anal.Chem.,vol.86,pp.5784-5793(2014)(上述非专利文献2)中所述的方法,在添加有1-乙基-3-(3-(二甲基氨基)丙基)碳二亚胺(EDC)和HOBt作为脱水缩合剂的乙醇中,进行2,6-SGP的修饰化,与实施例5-1同样地在正离子模式下进行质量分析。由乙醇引起的2,6-SGP的修饰化物的质谱如图9(B)所示。另外,为了对比,图9(A)中显示了由异丙胺引起的2,6-SGP的修饰化物(上述实施例5-1)的质谱。
由乙醇引起的修饰化试样的质谱(图9(B))中,在假定的乙基酯修饰化物的m/z2394处,并未观测到信号,而观测到许多副反应信号。根据该结果可知,唾液酸的酯修饰化虽然可以在游离糖链的分析中利用,但是应用于糖肽的分析却是困难的。
[实施例6]不含唾液酸的糖肽与胺的反应
在实施例6中,为了确认在脱水缩合剂存在下的糖肽与异丙胺的反应中,糖链的唾液酸部位被选择性地修饰化,肽部分几乎不反应(上述实施例5的结果),而使用不含唾液酸的糖肽进行验证。使用RNase B的消化物和IgG的消化物作为糖肽。
(糖肽试样的调制)
分别将RNase B和IgG(均购自SIGMA),在6M尿酸、20mM碳酸氢铵和5mM三(2-羧乙基)膦盐酸盐(TCEP)的存在下,在室温下处理45分钟,进行变性和还原。接着,在10mM碘乙酰胺(IAA)的存在下,在室温遮光条件下使之反应45分钟,进行烷基化之后,添加DTT以使浓度变为10mM,在室温遮光条件下使之反应45分钟,将剩余的IAA惰性化。然后,添加胰蛋白酶,在37℃下通宵孵育,进行蛋白水解酶消化。消化后,使用碳柱进行脱盐,通过SpeedVac使之干燥固化。
(与异丙胺的反应和质量分析)
(反应物的精制和质量分析)
在与上述实施例5-1同样的条件下,使所获得的胰蛋白酶消化物(糖肽)与异丙胺在脱水缩合剂的存在下反应,进行反应物的精制,在正离子模式下进行质量分析。RNase B消化物的反应物的质谱如图10所示,IgG的反应物的质谱(扩大图)如图11所示。
(RNase B碎片反应物的分析结果)
RNase B不具有唾液酸,是附加有高甘露糖型的糖链的糖蛋白。RNase B的胰蛋白酶消化中,生成序列SRNLTK的精氨酸C末端未被消化的错误交联肽段(Miss Cribbage;ミスクリベッジ),如图10所示,可以确认到2种肽碎片(NLTK和SRNLTK)。此外,分别在这些肽碎片中,存在5种高甘露糖型的糖型(甘露糖数目:5~9),这些糖型以162Da间隔被观测到。
在本实施例中,在与实施例5-1同样的条件(即,2,3-SGP的2个唾液酸均被内酯修饰化,2,6-SGP的2个唾液酸均被异丙酰胺修饰化的条件)下进行反应,与反应前的RNase B碎片相同的m/z处上观测到信号。这是由于,RNase B碎片不含有唾液酸。此外,在图10中,虽然也观测到比反应前的RNase B碎片的m/z大41的信号([MH]++41:肽的C末端被异丙酰胺(iPA)修饰化后者),但其信号强度为肽的C末端未反应者的([MH]+)的10%左右。
(IgG碎片反应物的分析结果)
图11的质谱,包含来自于不含唾液酸的2种糖肽(来自IgG的亚类,肽部分的氨基酸序列的一部分不同)的信号,与反应前的IgG碎片相同的m/z 2602和2634处观测到强信号。此外,图11中,虽然也观测到比反应前的IgG碎片的m/z大41的信号,但是其信号强度是相比于肽的C末端未反应者的20%左右或其以下。
如实施例5所示,当糖肽的糖链中存在唾液酸时,由于唾液酸优先被修饰化,故而几乎未观测到具有与反应前的m/z的信号。另一方面,如实施例6所示,当糖肽的糖链中不存在唾液酸时,与肽部分的酸性氨基酸的有无无关,以高强度观测到具有与反应前相同的m/z的信号。根据这些结果可知,通过将本发明的方法应用于糖肽,在能够解析唾液酸的有无的同时,当试样包含唾液酸时,还能够实现其结合方式的识别。
Claims (13)
1.分析用试样的调制方法,其调制用于分析试样中包含的糖链的分析用试样,其特征在于,
当分析对象物质的糖链中结合有唾液酸时,根据唾液酸的结合方式进行会生成不同修饰体的第一反应,
在所述第一反应中,使含有糖链的分析对象物质、含有2个以上碳原子的胺和脱水缩合剂反应。
2.根据权利要求1所述的分析用试样的调制方法,其特征在于,所述脱水缩合剂含有碳二亚胺。
3.根据权利要求1或2所述的分析用试样的调制方法,其特征在于,所述胺为具有支链烷基的烷基胺或其盐。
4.根据权利要求1~3中任一项所述的分析用试样的调制方法,其特征在于,所述胺为烷基伯胺或其盐。
5.根据权利要求1~4中任一项所述的分析用试样的调制方法,其特征在于,所述胺为异丙胺或其盐。
6.根据权利要求1~5中任一项所述的分析用试样的调制方法,其特征在于,在所述分析对象物质固定于固相载体的状态下,进行所述第一反应。
7.根据权利要求1~6中任一项所述的分析用试样的调制方法,其特征在于,
具有将所述第一反应后的分析对象物质再供给至第二反应的步骤,
所述第二反应是当存在通过所述第一反应而由所述分析对象物质生成的内酯时由所述内酯生成另外的修饰体的反应。
8.根据权利要求7所述的分析用试样的调制方法,其特征在于,
所述第二反应是由所述内酯生成酰胺的反应,
选择用于所述第二反应的胺,使可在所述第一反应中由α2,6-唾液酸生成的酰胺与可在所述第二反应中由内酯生成的酰胺具有不同的质量。
9.根据权利要求8所述的分析用试样的调制方法,其特征在于,在所述第二反应中,除了使用胺之外,还使用鏻系脱水缩合剂或脲系脱水缩合剂。
10.根据权利要求7~9中任一项所述的分析用试样的调制方法,其特征在于,在所述第一反应后的分析对象物质固定于固相载体的状态下,进行所述第二反应。
11.根据权利要求1~10中任一项所述的分析用试样的调制方法,其特征在于,所述分析对象物质为糖肽或糖蛋白。
12.分析方法,其特征在于,通过权利要求1~11中任一项所述的方法调制试样,并分析调制后的试样。
13.根据权利要求12所述的分析方法,其特征在于,所述分析为质量分析。
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