CN114127553B - 分析用试样的制备方法、分析方法和分析用试样的制备用试剂盒 - Google Patents

分析用试样的制备方法、分析方法和分析用试样的制备用试剂盒 Download PDF

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Abstract

分析用试样的制备方法具备：使试样与pH为7.7以上的酰胺化反应溶液接触，进行使内酯发生酰胺化的酰胺化反应，所述酰胺化反应溶液包含第一化合物和碱化剂，所述第一化合物为选自由与糖链所含的内酯发生反应的氨、在与氨基键合的碳原子上直接键合有1个以下碳原子的伯胺、肼、肼衍生物、羟胺和它们的盐组成的组中的至少一种，碱化剂为胺时，碱化剂为选自由在与氨基键合的碳原子上直接键合有2个以上碳原子的支化型伯胺、仲胺和叔胺组成的组中的至少一种胺。

Description

分析用试样的制备方法、分析方法和分析用试样的制备用试 剂盒
技术领域
本发明涉及分析用试样的制备方法、分析方法和分析用试样的制备用试剂盒。
背景技术
唾液酸是在生物体内大量存在的糖。唾液酸在生物体内也包含在与蛋白质结合的糖链中，多存在于糖链的非还原末端。因此，唾液酸由于在这种糖蛋白分子中配置在分子的外侧、可被其他分子直接识别，因此具有重要的作用。
唾液酸与邻接的糖之间的连接方式(linkage type)有时会不同。例如，已知人的N-连接型糖链(N型糖链)主要是α2,3-和α2,6-的连接方式，O-连接型糖链(O型糖链)和鞘糖脂在前述连接方式的基础上还有α2,8-和α2,9-的连接方式。根据这种连接方式的区别，唾液酸可以被不同的分子识别、具有不同的作用。
质谱分析等中，作为针对含有唾液酸的糖链的前处理，进行唾液酸的修饰。其将具有负电荷的唾液酸的羧基通过酯化或酰胺化等而中性化，从而克服抑制电离和唾液酸脱离等缺点。关于唾液酸的内酯化，根据连接方式而生成的内酯的稳定性不同，因此能够利用该稳定性的差异，连接方式特异性地进行唾液酸的修饰和解析。此处，内酯极不稳定，在水中也容易水解，在酸性或碱性条件下更迅速地水解。因此，报告了将通过前处理中的修饰而生成的内酯利用酰胺化进行稳定化(参照专利文献1、非专利文献1)。在生物体中的糖链和抗体药物的糖链等中也存在内酯，在进行这些解析时也能够进行稳定化。另外，非专利文献2中记载的内酯的由氨基分解实现的直接酰胺化能够进行内酯的迅速且特异的酰胺修饰，可期待今后的利用。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本专利第6135710号公报
非专利文献
非专利文献1：Nishikaze T,Tsumoto H,Sekiya S,Iwamoto S,Miura Y,TanakaK."Differentiation of Sialyl Linkage Isomers by One-Pot Sialic AcidDerivatization for Mass Spectrometry-Based Glycan Profiling"AnalyticalChemistry,(美国),ACS Publications,2017年2月21日、Volume 89,Issue 4,pp.2353-2360
非专利文献2：Hanamatsu H,Nishikaze T,Miura N,Piao J,Okada K,Sekiya S,Iwamoto S,Sakamoto N,Tanaka K,Furukawa JI."Sialic Acid Linkage SpecificDerivatization of Glycosphingolipid Glycans by Ring-Opening Aminolysis ofLactones"Analytical Chemistry,(美国),ACS Publications,2018年11月20日、Volume90,Issue 22,pp.13193-13199
发明内容
发明要解决的问题
期望难以使内酯发生水解，使糖链所含的内酯更有效地进行酰胺化。
用于解决问题的方案
本发明的第一方式涉及一种分析用试样的制备方法，其具备如下工序：准备包含糖链的试样；以及，使前述试样与pH为7.7以上的酰胺化反应溶液接触，进行使内酯发生酰胺化的酰胺化反应，所述酰胺化反应溶液包含第一化合物和碱化剂，所述第一化合物为选自由与前述糖链所含的前述内酯发生反应的氨、在与氨基键合的碳原子上直接键合有1个以下碳原子的伯胺、肼、肼衍生物、羟胺和它们的盐组成的组中的至少一种，前述碱化剂为胺时，前述碱化剂为选自由在与氨基键合的碳原子上直接键合有2个以上碳原子的支化型伯胺、仲胺和叔胺组成的组中的至少一种胺。
本发明的第二方式涉及一种分析方法，其具备如下工序：通过第一方式的分析用试样的制备方法来制备分析用试样；以及，对所制备的前述分析用试样进行分析。
本发明的第三方式涉及一种分析用试样的制备用试剂盒，其用于第一方式的分析用试样的制备方法或第二方式的分析方法。
发明的效果
根据本发明，能够使糖链所含的内酯更有效地酰胺化。
附图说明
图1是表示一个实施方式所述的分析方法的流程的流程图。
图2是表示一个实施方式所述的分析方法的流程的流程图。
图3是表示实施例中生成的糖链的结构的概念图。
图4是包含与图3中示出的糖链对应的峰的质谱。
图5是表示在珠上进行的酰胺化反应时的叔丁基胺的浓度和经酰胺化的唾液酸的比例的图。
图6是表示在珠上进行的酰胺化反应时的碱化剂的种类和经酰胺化的唾液酸的比例的图。
图7是表示在珠上且酸性条件下进行的酰胺化反应时的溶液的组成和经酰胺化的唾液酸的比例的图。
图8是表示在珠上进行的酰胺化反应时的甲胺盐酸盐的浓度和经酰胺化的唾液酸的比例的图。
图9是表示在珠上进行的酰胺化反应时的溶剂的种类和经酰胺化的唾液酸的比例的图。
图10是表示在液相中进行的酰胺化反应时的碱化剂的种类和经酰胺化的唾液酸的比例的图。
图11是对分析用试样进行质谱分析而得到的质谱，所述分析用试样如下获得：使用叔丁基胺作为碱剂，使用未经稳定同位素标记的乙胺盐酸盐(上段)和经稳定同位素标记的乙胺盐酸盐(下段)，进行酰胺化反应。
图12是表示对分析用试样进行质谱分析而得到的质谱中的、与A3(左侧)和A3F(右侧)对应的峰的放大图，所述分析用试样是将使用未经同位素标记的乙胺盐酸盐和经稳定同位素标记的乙胺盐酸盐进行酰胺化反应而得到的糖链混合而得到的。
具体实施方式
以下，参照附图对本具体实施方式进行说明。本发明人等发现：通过使用碱化剂进行酰胺化反应，从而能够更有效地使糖链所含的内酯进行酰胺化。
-第一实施方式-
图1是示出本实施方式的分析用试样的制备方法所述的分析方法的流程的流程图。本实施方式的分析用试样的制备方法中，将试样所含的糖链的唾液酸根据连接方式进行内酯化后，将所生成的内酯进行酰胺化。在步骤S1001中，准备包含糖链的试样。
(关于试样)
包含糖链的试样没有特别限定，可以包含选自由糖链、游离糖链、糖肽、糖蛋白和糖脂组成的组中的至少一种分子。本实施方式的分析用试样的制备方法中，进行糖链所含的唾液酸的连接方式特异性的修饰。试样中的糖链优选包含N-连接型糖链、O-连接型糖链、糖脂型糖链等有可能在末端具有唾液酸的糖链。另外，试样中的糖链更优选包含或有可能包含α2,3-唾液酸、α2,8-唾液酸和α2,9-唾液酸中的至少一者，进一步优选在此基础上包含或有可能包含α2,6-唾液酸。
试样包含游离糖链的情况下，可以使用自糖蛋白、糖肽或糖脂游离的糖链。作为该游离的方法，可以采用使用N-糖苷酶、O-糖苷酶、或鞘糖脂内切糖苷酶(Endoglycoceramidase)等的酶处理、肼分解、基于碱处理的β脱离等方法。使N-连接型糖链自糖肽和糖蛋白的肽链游离的情况下，可适宜使用利用肽-N-糖苷酶F(PNGase F)、肽-N-糖苷酶A(PNGase A)、或内切-β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶(Endo M)等的酶处理。另外，可以适宜进行糖链的还原末端的吡啶氨基化(PA化)等修饰。在酶处理前，也可以进行后述的糖肽或糖蛋白的肽链的断裂。
试样包含糖肽或糖蛋白的情况下，如后述的“关于糖肽和糖蛋白的副反应的抑制”的部分所述，可以适宜进行用于抑制肽部分的副反应的处理。另外，肽链的氨基酸的残基数多的糖肽或糖蛋白优选通过酶的切断等来将肽链切断而使用。例如制备质谱分析用的试样的情况下，肽链的氨基酸残基数优选为30以下，更优选为20以下，进一步优选为15以下。另一方面，在要求明确糖链所连接的肽的来源的情况下，肽链的氨基酸残基数优选为2以上，更优选为3以上。
作为将糖肽或糖蛋白的肽链切断时的消化酶，可使用胰蛋白酶、Lys-C、精氨酸内肽酶、胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、蛋白酶K、或链霉蛋白酶E等。可以将这些消化酶中的2种以上组合使用。切断肽链时的条件没有特别限定，可采用与所使用的消化酶相应的适当规程。在该切断前，可以进行试样中的蛋白质和肽的改性处理或烷基化处理。改性处理或烷基化处理的条件没有特别限定。可以通过化学切断等而非酶切断来将肽链切断。
步骤S1001结束后，进入步骤S1003。
(内酯化反应)
在步骤S1003中，使试样与用于内酯化的反应溶液(以下称为内酯化反应溶液)接触，进行使糖链所含的至少一部分唾液酸发生内酯化的内酯化反应(以下，记载内酯化反应时，只要没有特别提及，则是指步骤S1003的内酯化反应)。以下，说明使用内酯化反应溶液，连接方式特异地对唾液酸的一部分进行内酯化，并对唾液酸的另一部分进行与内酯化不同的修饰的例子。但是，也可以不进行与该内酯化不同的修饰。在内酯化反应中，α2,3-唾液酸、α2,8-唾液酸和α2,9-唾液酸被适当地内酯化。
内酯化反应溶液包含脱水缩合剂和第一反应剂，所述第一反应剂包含醇、胺或它们的盐。第一反应剂是用于通过其至少一部分键合于唾液酸而基于酯化或酰胺化进行修饰的反应剂。第一反应剂例如作为亲核剂而发挥功能。调整脱水缩合剂和第一反应剂的种类和浓度，用以根据唾液酸的连接方式而选择性地发生脱水反应或者基于酯化或酰胺化的修饰反应。
需要说明的是，未进行基于第一反应剂的与内酯化不同的修饰时，内酯化反应溶液可以包含脱水缩合剂，但不含第一反应剂。
针对连接方式特异性的内酯化进行说明。通过α2,3-唾液酸的羧基的分子内脱水而生成的内酯为六元环，通过α2,6-唾液酸的羧基的分子内脱水而生成的内酯为七元环。因此，生成比七元环更稳定的六元环的α2,3-唾液酸与α2,6-唾液酸相比更容易被内酯化。另外，α2,3-唾液酸的羧基与α2,6-唾液酸的羧基相比位于立构位阻较大的位置，因此，若与α2,6-唾液酸相比，则大分子更难以与α2,3-唾液酸发生反应。根据这种由唾液酸的连接方式导致的分子结构的差异，调整脱水缩合剂和第一反应剂的种类和浓度，用以进行因唾液酸的连接方式而异的修饰。
(内酯化反应中的脱水缩合剂)
脱水缩合剂优选包含碳二亚胺。这是因为：若使用碳二亚胺，则与使用磷鎓系脱水缩合剂(所谓的BOP试剂)、脲阳离子系脱水缩合剂作为脱水缩合剂的情况相比，在立构位阻大的部位存在的羧基更难发生酰胺化。作为碳二亚胺的例子，可列举出N,N’-二环己基碳二亚胺(DCC)、N-(3-二甲基氨基丙基)-N’-乙基碳二亚胺(EDC)、N,N’-二异丙基碳二亚胺(DIC)、1-叔丁基-3-乙基碳二亚胺(BEC)、N,N’-二叔丁基碳二亚胺、1,3-二对甲苯甲酰基碳二亚胺、双(2,6-二异丙基苯基)碳二亚胺、双(三甲基甲硅烷基)碳二亚胺、1,3-双(2,2-二甲基-1,3-二氧戊环-4-基甲基)碳二亚胺(BDDC)、它们的盐。
(内酯化反应中的添加剂)
为了促进基于脱水缩合剂的脱水缩合且抑制副反应，优选在使用碳二亚胺的基础上还使用亲核性高的添加剂。作为亲核性高的添加剂，优选使用1-羟基苯并三唑(HOBt)、1-羟基-7-氮杂-苯并三唑(HOAt)、4-(二甲基氨基)吡啶(DMAP)、2-氰基-2-(羟基亚氨基)乙酸乙酯(Oxyma)、N-羟基-琥珀酰亚胺(HOSu)、6-氯-1-羟基-苯并三唑(Cl-HoBt)、N-羟基-3,4-二氢-4-氧代-1,2,3-苯并三嗪(HOOBt)等。
(内酯化反应中的反应剂(第一反应剂))
作为第一反应剂使用的胺优选包含含有2个以上碳原子的伯烷基胺或仲烷基胺。伯烷基胺优选为乙胺、丙胺、异丙胺、丁胺、仲丁胺、叔丁胺等。仲烷基胺优选为二甲胺、乙基甲基胺、二乙胺、丙基甲基胺、异丙基甲基胺等。从使α2,3-唾液酸的羧基那样地存在于立构位阻大的部位的羧基难以被酰胺化的观点出发，优选使用异丙胺那样的具有支链烷基的胺。内酯化反应溶液的第一反应剂使用胺时，根据唾液酸的连接方式，α2,6-唾液酸等一部分唾液酸的羧基发生酰胺化。
作为第一反应剂使用的醇没有特别限定，例如，可以使用甲醇或乙醇等。内酯化反应溶液的反应剂使用醇时，根据唾液酸的连接方式，α2,6-唾液酸等一部分唾液酸的羧基发生酯化。
需要说明的是，第一反应剂可以包含上述胺和醇的盐。
(关于脱水缩合剂和胺的浓度)
内酯化反应溶液的脱水缩合剂的浓度例如优选为1mM～5M(以下，M表示mol/L)，更优选为10mM～3M。将碳二亚胺与HOAt、HOBt等亲核性高的添加剂组合使用时，各自的浓度优选为上述范围。内酯化反应溶液的胺浓度优选为0.01～20M，更优选为0.1M～10M。内酯化反应时的反应温度优选为-20℃～100℃左右，更优选为-10℃～50℃。
(进行内酯化反应的相)
内酯化反应可以在液相中进行，也可以在固相中进行。只要能够使试样与内酯化反应溶液接触，发生内酯化反应时的试样状态就没有特别限定。
在固相中进行反应的情况下，作为固相载体，只要能够固定糖链、糖肽或糖蛋白等，就可以没有特别限制地使用。例如，为了固定糖肽或糖蛋白，可以使用具有环氧基、甲苯磺酰基、羧基、氨基等作为配体的固相载体。另外，为了固定糖链，可以使用具有酰肼基、氨基氧基等作为配体的固相载体。另外，从电离的效率等观点出发，也优选使糖链吸附于亲水性相互作用色谱(以下称为HILIC)用的载体、即固定相，进一步优选该HILIC用的载体包含酰胺基。
通过在将试样固定于固相载体的状态下进行反应，从而反应溶液的去除和脱盐纯化变得更容易，能够简化试样的制备。另外，使用固相载体时，如果能够在糖蛋白或糖肽的状态下将试样固定，并在内酯化反应后利用PNGase F等糖苷酶等进行切断，则也可以以游离糖链的形式回收内酯化反应后的试样。
内酯化反应后的试样可根据需要通过公知方法等来进行纯化、脱盐、可溶化等处理。在后述酰胺化反应的前后也相同。
关于试样自固相载体的游离，可以采用后述针对酰胺化反应而说明的条件。通过在将试样固定于固相载体的状态下进行反应，从而内酯化反应后的内酯化反应溶液的去除等变得容易，能够高效地进行唾液酸的修饰。在步骤S1003结束后，推进至步骤S1005。
(酰胺化反应)
在步骤S1005中，进行下述酰胺化反应：使试样与反应溶液(以下称为酰胺化反应溶液)接触，使在步骤S1003中进行了内酯化的唾液酸发生酰胺化，由此获得分析用试样。与通过水解使内酯开环后再将羧基进行酰胺化的技术常识完全不同，本发明人等发现了将内酯迅速且直接酰胺化的方法。可以认为：该反应在无水条件下也可适宜进行，因此是与水解不同的反应，其是基于氨基与内酯的相互作用的氨基分解(氨基分解)。以下，将在无水条件下也能够实现且由氨、胺或它们的盐实现的内酯的开环和酰胺化称为氨基分解。该氨基分解反应实质上不需要脱水缩合剂，因此，不对未形成内酯的通常的唾液酸造成影响，能够选择性地仅使已经内酯化的唾液酸发生酰胺化。在以下的实施方式中，说明将内酯化反应和后述非特异性修饰反应中的酰胺化去除而通过氨基分解进行酰胺化反应的例子。
以下的实施方式中，如“唾液酸中形成的内酯”那样地提及与唾液酸有关的内酯时，除了是指在唾液酸与邻接于该唾液酸的单糖间形成的内酯之外，还是指在唾液酸的内部形成的内酯等。
酰胺化反应溶液包含反应剂(以下称为第二反应剂)和碱化剂(碱化试剂)，所述反应剂包含氨、胺或它们的盐。第二反应剂是用于通过其至少一部分键合于唾液酸而基于酰胺化进行修饰的酰胺化反应剂。第二反应剂例如为亲核剂。碱化剂是用于使酰胺化反应溶液的pH上升的化合物。酰胺化反应优选仅通过使试样与酰胺化反应溶液接触来进行，通过简便的操作而使内酯稳定化。
需要说明的是，酰胺化反应不需要脱水缩合剂，但酰胺化反应溶液可以包含脱水缩合剂。例如，通过添加氨、胺或它们的盐、以及碱化剂，而不去除在步骤S1003中向试样中添加的内酯化反应溶液，也可以制备酰胺化反应溶液。像这样，在酰胺化反应中，能够通过简便的操作使内酯稳定化。在酰胺化反应中，说明了使试样与酰胺化反应溶液接触后，不进行使试样与脱水缩合剂反应的操作，但例如也可以出于其它目的来进行。
内酯化反应溶液包含上述第一反应剂时，酰胺化反应溶液中包含的第二反应剂与第一反应剂不同。在通过质谱分析对通过本实施方式的分析用试样的制备方法而得到的分析用试样进行分析时，以第一反应剂与第二反应剂的质量不同的方式选择第二反应剂。根据质谱分析的质量分辨率，以能够对所得的两种修饰体高精度地进行质量分离的方式选择第一反应剂和第二反应剂。第一反应剂和第二反应剂可以是不同种类的物质，也可以是因稳定同位素而使质量不同的相同种类的物质。另外，还可以是以iTRAQ为代表那样的同质异位(isobaric)的标记物(tag)。此时，由于以通过在第一阶段的质谱分析与第二阶段的质谱分析之间进行的开裂而得到的产物离子的m/z不同的方式设计了该标记物，因此，唾液酸的连接方式、内酯体的识别可通过串联质谱分析(MS/MS)等二阶段以上的质谱分析来进行。像这样，通过两个以上的阶段对利用第一反应剂和第二反应剂分别进行了修饰的修饰体进行质谱分析时，只要能够在任意阶段中通过不同的m/z来分离这些修饰体即可。利用色谱对通过本实施方式的分析用试样的制备方法而得到的分析用试样进行分析时，第一反应剂和第二反应剂具有不同的取代基时，容易利用色谱进行彼此分离，故而优选。
(酰胺化反应中的胺)
以下的实施方式中，“胺”这一术语包含肼、肼衍生物和羟胺，不含氨和氨的盐。在酰胺化反应中使用胺时，第二反应剂中包含的胺为选自在与氨基键合的碳原子上直接键合有1个以下碳原子的伯胺、肼、肼衍生物、羟胺和它们的盐中的至少一种化合物。如上所述，在伯胺的情况下，即便在碳链上具有支链，只要在远离氨基的位置具有支链，就可以抑制酰胺化反应效率的降低，故而优选。
第二反应剂更优选为具有直链烃基的伯胺，进一步优选为具有直链烷基的伯胺。第二反应剂中，作为具有直链烷基的伯胺，优选碳原子数为10以下的伯胺，进一步优选碳原子数为6以下的伯胺、即甲胺、乙胺、丙胺、丁胺、戊胺和己胺，最优选为甲胺。酰胺化反应溶液中包含的胺具有不带支链(以下，“支链”表示烃链的支链)的直链状结构或者碳原子数少时，内酯会更有效地酰胺化，故而优选。
第二反应剂中包含的肼衍生物没有特别限定。以下的实施方式中，乙酰肼、乙酸酰肼、苯并酰肼和苯甲酸酰肼等酰肼也包括在肼衍生物中，可用作第二反应剂。第二反应剂中包含的肼衍生物可以设为选自由甲基肼、乙基肼、丙基肼、丁基肼、苯基肼、苄基肼、以及乙酰肼、乙酸酰肼、苯并酰肼和苯甲酸酰肼组成的组中的至少一种化合物。从提高或维持酰胺化反应的效率的观点出发，作为第二反应剂的肼或其衍生物优选为肼或甲基肼。
第二反应剂为具有不饱和链式烃基的伯胺时，该不饱和链式烃基优选包含双键，该不饱和链式烃基更优选包含烯丙基(Allyl)，该胺进一步优选为烯丙胺(Allylamine)。第二反应剂可以是包含羟基的伯胺，此时，优选为乙醇胺。酰胺化反应溶液中包含的胺可以包含除烷基之外的各种官能团。糖链发生酰胺化反应的结果是，通过以包含这种官能团的方式进行修饰，受到该修饰的糖链不仅更容易通过质谱分析来分离，还更容易通过色谱等来分离。
第二反应剂可以设为氨和作为第二反应剂在上文记载的胺的盐。稳定同位素等的质量等性质发生了变化的化合物和以功能发生变化的方式进行了特定修饰的化合物在盐的状态下销售或流通的情况较多。因此，通过使用它们的盐作为第二反应剂，从而能够更灵活或适当地选择分析法。另外，若使用盐，则有时难以提高酰胺化反应溶液的pH，但本实施方式的分析用试样的制备方法中使用碱化剂，因此，也能够克服该缺点。
作为第二反应剂中包含的氨或胺的盐，可列举出氨或胺的无机酸盐或有机酸盐，优选为碳酸盐、盐酸盐、硝酸盐、硫酸盐、磷酸盐或甲磺酸盐那样的无机盐，更优选为碳酸盐、盐酸盐和硝酸盐，进一步优选为盐酸盐。作为具有直链烃基的伯胺的盐酸盐，更优选为甲胺盐酸盐、乙胺盐酸盐、丙胺盐酸盐、丁胺盐酸盐、戊胺盐酸盐，进一步优选为甲胺盐酸盐。需要说明的是，即便在第二反应剂不是盐的情况下，通过利用碱化剂使pH上升，也能够更有效地进行酰胺化。
(关于酰胺化反应中的碱化剂)
酰胺化反应溶液中包含的碱化剂只要是使酰胺化反应溶液的pH上升的化合物，就没有特别限定。但是，在碱化剂为胺的情况下，与第二反应剂同样地存在碱化剂因酰胺化反应而键合于唾液酸的可能性。此时，在后述质谱分析或色谱时，质谱或色谱的峰会分裂，故不优选。因此，在碱化剂为胺的情况下，优选与第二反应剂相比难以键合于唾液酸。例如，碱化剂中包含的胺可以设为与第二反应剂相比立构位阻更大的胺。从该观点出发，在碱化剂为胺的情况下，碱化剂为选自由在与氨基键合的碳原子上直接键合有2个以上碳原子的支化型伯胺、仲胺和叔胺组成的组中的至少一种胺。此处，“支化型”表示碳链具有支链。
上述支化型伯胺的例子可以包含异丙胺、仲丁胺(仲丁基胺)、叔丁胺(叔丁基胺)、2-己烷胺或1,3-二甲基戊胺。从获取容易度、处理简便度、溶解性、反应性或水溶性等观点出发，上述支化型伯胺优选碳原子数为3～7的分子，更优选为异丙胺、仲丁胺或叔丁胺。碱化剂可以包含1种伯胺，也可以以任意比例包含2种以上的伯胺。
碱化剂中包含的仲胺可以设为二烷基胺、环状烷基仲胺或芳香族仲胺。二烷基胺的总碳原子数优选为1～10、更优选为1～6，可以设为例如二甲胺、二乙胺或二丁胺。环状烷基仲胺的总碳原子数优选为1～10、更优选为4～10，可以设为例如哌啶、2,2,6,6-四甲基哌啶。可以如吗啉那样在环状结构的一部分使用除碳、氢之外的原子。芳香族仲胺的总碳原子数优选为7～20、更优选为7～15，可以设为例如甲基苯胺、苯基甲胺或二苯基胺。从获取容易度、处理简便度、溶解性、反应性或水溶性等观点出发，仲胺优选为二烷基胺，更优选为二甲胺、二乙胺或二丁胺。碱化剂可以包含1种仲胺，也可以以任意比例包含2种以上的仲胺。
碱化剂所含的叔胺可以设为三烷基胺、环状烷基叔胺或芳香族叔胺。三烷基胺的总碳原子数优选为1～10、更优选为1～6，可以设为例如三甲胺、三乙胺或三丁胺。环状烷基叔胺的总碳原子数优选为1～10、更优选为4～10，可以设为例如N-甲基哌啶。可以如N-甲基吗啉那样在环状结构的一部分使用除碳、氢之外的原子。芳香族叔胺的总碳原子数优选为8～20、更优选为8～15，可以设为例如二甲基苯胺、二苯基甲胺或三苯基胺。从获取容易度、处理简便度、溶解性、反应性或水溶性等观点出发，叔胺优选为三烷基胺或N-甲基吗啉，更优选为三甲胺、三乙胺或三丁胺。碱化剂可以包含1种叔胺，也可以以任意比例包含2种以上的仲胺。
作为一例，碱化剂可以包含选自由季铵阳离子、叔胺、仲胺、在与氨基键合的碳原子上直接键合有2个以上碳原子的伯胺、碱金属的氢氧化物、碱土金属的氢氧化物、四烷基铵的氢氧化物、胍、胍衍生物、它们的盐、以及碱缓冲液组成的组中的至少一种。
碱化剂所含的季铵阳离子没有特别限定，可以设为例如四烷基铵阳离子、四烷基磷鎓阳离子、咪唑鎓阳离子、吡唑鎓阳离子、吡啶鎓阳离子或嘧啶鎓阳离子。碱化剂可以包含1种季铵阳离子，也可以以任意比例包含2种以上的季铵阳离子。
碱化剂所含的氢氧化物只要是碱金属的氢氧化物、碱土金属的氢氧化物或四烷基铵的氢氧化物，就没有特别限定。作为碱金属的氢氧化物，可适合地使用选自由氢氧化钙(Ca(OH)2)、氢氧化锂(LiOH)、氢氧化钠(NaOH)、氢氧化钾(KOH)、氢氧化铷(RbOH)和氢氧化铯(CsOH)组成的组中的至少1种。作为碱土金属的氢氧化物，可适合地使用选自由氢氧化锶(Sr(OH)2)、氢氧化钡(Ba(OH)2)、氢氧化铕(II)(Eu(OH)2)和氢氧化铊(I)(TlOH)组成的组中的至少1种。作为四烷基铵的氢氧化物，可适合地使用选自由氢氧化四甲基铵(N(CH3)4OH)和氢氧化四乙基铵(N(C2H5)4OH)组成的组中的至少1种。碱化剂可以包含1种氢氧化物，也可以以任意比例包含2种以上的氢氧化物。
碱化剂所含的胍衍生物没有特别限定，可以设为例如1,1,3,3-四甲基胍或1,1,3,3-四乙基胍。碱化剂可以包含1种胍衍生物，也可以以任意比例包含2种以上的胍衍生物。
作为碱化剂所含的上述支化型伯胺、仲胺的盐、叔胺的盐、胍和胍衍生物的盐，可列举出无机酸盐或有机酸盐，优选为碳酸盐、盐酸盐、硝酸盐、硫酸盐、磷酸盐或甲磺酸盐那样的无机盐。
碱化剂所含的碱缓冲液的种类没有特别限定，可以设为例如选自由Tris缓冲液、Good缓冲液、硼酸盐缓冲液和碳酸盐缓冲液组成的组中的至少一种。
需要说明的是，以下的实施方式中，记作“向试样中添加酰胺化反应溶液”或者“使试样与酰胺化反应溶液接触”等时，还包括以下的第一和第二的任意情况。第一情况是分别制备包含第二反应剂的溶液和包含碱化剂的溶液，以任意溶液为先，依次向试样中添加两种溶液并混合的情况。第二情况是制备包含第二反应剂和碱化剂的酰胺化反应溶液，并添加至试样中的情况。上述内酯化反应溶液也相同。
(酰胺化反应溶液的浓度)
酰胺化反应溶液中的第二反应剂的浓度没有特别限定，优选为0.1M(M为mol/l)以上，更优选为0.3M以上，进一步优选为0.5M以上，进一步优选为1.0M以上，最优选为3.0M以上。作为适合例，酰胺化反应溶液包含氨或上述伯胺、尤其是甲胺，该氨或甲胺等上述伯胺的浓度优选为0.1M以上，更优选为0.3M以上，进一步优选为0.5M以上，进一步优选为1.0M以上，最优选为3.0M以上。酰胺化反应溶液中的第二反应剂的浓度越高，则越能够更可靠地进行内酯的酰胺化。关于酰胺化反应溶液的碱化剂的浓度，只要能够使酰胺化反应溶液的pH为期望的值以上，因碱化剂作为与第二反应剂不同的修饰体而键合于唾液酸从而不对分析精度造成不良影响，就没有特别限定。若列举出一例，从高效地发生酰胺化的观点出发，碱化剂、尤其是叔丁胺的浓度以体积/体积％计优选为0.10％以上，更优选为0.30％以上，进一步优选为1％以上，进一步优选为3％以上。碱化剂的浓度、尤其是叔丁胺的浓度可适合地设为80％以下、60％以下等。
(酰胺化反应溶液的溶剂)
从可靠地发生酰胺化的观点出发，酰胺化反应溶液的溶剂优选为水系溶剂或者水系溶剂与有机溶剂的混合溶剂。酰胺化反应溶液的溶剂可以设为例如水、甲醇、乙醇、二甲基亚砜(DMSO)或乙腈水溶液。
(酰胺化反应溶液的pH)
酰胺化反应溶液的pH为7.7以上。酰胺化反应溶液的pH优选为8.0以上，更优选为8.8以上，进一步优选为10.3以上。若酰胺化反应溶液的pH变高，则水解等副反应受到抑制，或者使用各种第二反应剂更可靠地使内酯发生酰胺化，故而优选。
(用于发生酰胺化反应的时间)
酰胺化反应在数秒～数分钟以内完成。因此，为了通过酰胺化反应而使内酯发生酰胺化，使试样与酰胺化反应溶液接触的时间(以下称为反应时间)优选小于1小时、更优选小于30分钟、进一步优选小于15分钟、进一步优选小于5分钟、最优选小于1分钟。适宜的是：可以将试样用酰胺化反应溶液清洗、或仅对保持于载体等的试样暂时通液。试样与酰胺化反应溶液接触的时间没有特别限定，从使反应充分完成等观点出发，可以适宜设为0.1秒以上或1秒以上等。另外，也可以将试样与酰胺化反应溶液混合并直接干固，而不设置反应时间。像这样，酰胺化反应在短时间内完成，因此，能够抑制不稳定的内酯发生分解而损害糖链解析中的定量性。另外，通过将酰胺化反应的反应时间设定得较短，从而能够更有效地进行试样的解析。
(进行酰胺化反应的相)
只要能够使试样与酰胺化反应溶液接触，则发生酰胺化反应时的试样的状态没有特别限定，可以为固相也可以为液相。在液相中进行酰胺化反应的情况下，可以如上所述在残留内酯化反应后的溶液的状态下在试样中添加酰胺化反应溶液，也可以在内酯化反应后进行纯化、脱盐、增溶等公知的前处理。在固定于固相的状态下进行酰胺化反应的情况下，可以将在固相中供于内酯化反应的试样维持固定于固相的状态并进行酰胺化反应。另外，也可以在将试样供于内酯化反应后，固定于固相并进行酰胺化反应。
在固相中进行酰胺化反应的情况下，作为固相载体，可以使用与关于内酯化反应在上文中说明的固相载体同样的固相载体。关于试样向固相载体上的固定，可以使用关于内酯化反应在上文中说明的条件。在固相中进行酰胺化反应的情况下，使固定于固相载体的试样与酰胺化反应溶液发生作用而进行酰胺化后，通过化学方法或酶反应等使试样从载体游离并回收即可。例如，可以利用PNGase F等糖苷酶或胰蛋白酶等消化酶将固定于载体的糖蛋白、糖肽进行酶切断并回收，可以利用弱酸性溶液使键合于具有酰肼基的固相载体的糖链游离并回收。HILIC中，可以利用以乙腈等作为溶剂的酰胺化反应溶液进行酰胺化反应，用水等水系溶液将试样洗脱。
关于通过上述制备方法而得到的分析用试样，在内酯化反应溶液包含第一反应剂的情况下，α2,6-唾液酸等难以被内酯化的连接方式的唾液酸在内酯化反应中因第一反应剂而被修饰。α2,3-唾液酸、α2,8-唾液酸和α2,9-唾液酸等容易被内酯化的连接方式的唾液酸在内酯化反应中发生内酯化，在酰胺化反应中因第二反应剂而被修饰。
在步骤S1005结束后，推进至步骤S1007。
在步骤S1007中，利用质谱分析和色谱中的至少一者对分析用试样进行分析。
因上述内酯化反应和酰胺化反应而使在各反应中受到修饰的糖链各自的质量不同。因此，可通过质谱分析根据唾液酸的连接方式来分离这些糖链。
质谱分析中的电离方法没有特别限定，可以使用基质辅助激光解吸附电离(MALDI)法、电喷雾(ESI)法、纳米电喷雾电离(nano-ESI)法等。电离方法特别优选为MALDI法。在质谱分析中的电离中，可以使用正离子模式和负离子模式中的任意者。质谱分析可以是单次质谱分析，也可以分多个阶段来进行，由此能够适合地解析除唾液酸的连接方式之外的糖链的结构、肽链的结构。作为质谱分析仪，可以组合使用至少一个以上的四级杆型、离子阱型和飞行时间型等任意的质谱分析器。也可以适当地进行离子的离解或者原子或原子团向离子的加合等。
利用色谱进行分析时，优选为液相色谱。液相色谱中使用的柱没有特别限定，可以适当使用C30、C18、C8、C4等疏水性反相柱或碳柱、HILIC用的正相柱等。在进行液相层析后通过质谱分析进行测定对于通过多次分离而精密地进行试样中的成分分析而言是优选的。此时，更优选利用液相色谱-质谱分析仪(LC-MS)，通过在线控制在质谱分析仪中直接利用ESI等将来自液相色谱的溶出液进行电离。
解析通过质谱分析或色谱得到的数据，进行试样所包含的糖链中的唾液酸的解析等。该数据解析中，可以进行包括唾液酸的连接方式的糖链的结构的推定等。通过质谱分析或色谱所得到的数据的解析方法没有特别限定。
在步骤S1007结束后，结束处理。
(关于糖肽和糖蛋白的副反应的抑制)
在糖肽或糖蛋白中添加内酯化反应溶液和酰胺化反应溶液，如上所述修饰唾液酸的情况下，有时在位于糖肽或糖蛋白所包含的氨基酸的侧链、主链的末端的氨基和羧基之间发生分子内脱水缩合等副反应。此时，存在与分析对象的糖链对应的质谱的峰分散而难以解析的问题。
本发明人等明确了肽部分的副反应主要源于氨基的存在，并明确了：通过在唾液酸修饰之前通过化学修饰等预先封闭氨基，从而能够在唾液酸修饰时抑制肽部分的副反应。详情请参照以下的文献：Takashi Nishikaze,Sadanori Sekiya,Shinichi Iwamoto,Koichi Tanaka.“A Universal Approach to linkage-Specific Derivatization forSialic Acids on Glycopeptides,”Journal of The American Society for MassSpectrometry,2017年6月,Volume 28,Issue 1Supplement,宣传编号MP091。本实施方式所述的基于内酯化反应等的修饰也可与其同样地用于糖肽和糖蛋白。例如，对糖肽或糖蛋白进行二甲基标记化或胍基化等封闭氨基的反应，进行内酯化反应和酰胺化反应。此时，如果根据唾液酸的连接方式的不同而使用形成内酯的方法，则也可以识别唾液酸的连接方式。
需要说明的是，糖肽中存在根据氨基酸序列而在特性方面难以发生副反应的物质。例如，通过利用胰蛋白酶等消化酶将IgG的Fc区域消化而生成的糖肽不具有赖氨酸，N末端的氨基也在脱水缩合剂的存在下迅速发生环化脱水，从而焦谷氨酰化。其结果，因不存在氨基而无需二甲基酰胺化或胍基化等事先的氨基的封闭。关于这种糖肽，通过不进行氨基的封闭而进行内酯化反应和酰胺化反应，从而能够得到足以进行解析的质谱。
(关于分析用试样的制备用试剂盒)
可提供对于本实施方式的分析用试样的制备方法而言适合使用的分析用试样的制备用试剂盒(以下称为制备用试剂盒)。制备用试剂盒可以包含试剂、或者除试剂之外的可用于质谱分析的任意消耗品、或者记载有用于制备本实施方式中的分析用试样的规程或记有该规程的Web网页的URL等的文件。例如，制备用试剂盒可以包含酰胺化反应中的碱化剂或含有碱化剂的溶液。通过使用制备用试剂盒来制备分析用试样，从而能够更有效地制备分析用试样。
-第二实施方式-
第二实施方式的分析用试样的制备方法中，进行与第一实施方式的分析用试样的制备方法相同的酰胺化反应，但不进行内酯化反应而通过酰胺化反应将试样中原本包含的内酯而发生酰胺化这一点与第一实施方式不同。
(关于试样)
试样没有特别限定，可以使用与上述第一实施方式相同的试样。已知在糖脂的神经节苷脂和乳低聚糖链中存在内酯。在脑内经常发现的聚唾液酸结构包含α2,8-连接方式、α2,9-连接方式的唾液酸，但据称它们容易形成内酯。已知生物药品、尤其是抗体药品的糖链中包含内酯。例如，为了对这种试样中存在的内酯进行定量、或者调查是否存在内酯或对未知试样调查是否存在内酯，可以使用本实施方式的分析用试样的制备方法。
图2是表示本实施方式的分析用试样的制备方法所述的分析方法的流程的流程图。步骤S2001与上述实施方式中的步骤S1001相同，因此省略说明。在步骤S2001结束后，推进至步骤S2003。
在步骤S2003中，使试样与酰胺化反应溶液接触，进行使试样中原本包含的唾液酸发生酰胺化的酰胺化反应，获取分析用试样。酰胺化反应可以使用与上述实施方式相同的酰胺化反应溶液，利用相同的条件来进行。在步骤S2003结束后，推进至步骤S2005。步骤S2005与上述实施方式中的步骤S1007相同，因此省略说明。
需要说明的是，在步骤S2003中进行酰胺化反应后，也可以进行上述实施方式中的内酯化反应和进一步的酰胺化反应。将在内酯化反应之前进行的酰胺化反应称为第一酰胺化反应，将在内酯化反应之后进行的酰胺化反应称为第二酰胺化反应。优选使第一酰胺化反应、内酯化反应和第二酰胺化反应中的与唾液酸发生键合的反应剂的种类不同。此时，可以利用不同的修饰体来修饰下述物质：试样中原本包含的内酯；试样中原本未被内酯化的α2,3-唾液酸、α2,8-唾液酸和α2,9-唾液酸；以及α2,6-唾液酸。由此，除了可进行试样中原本包含的唾液酸内酯的解析之外，还可进行连接方式特异性的唾液酸的解析。
或者，也可以在步骤S2003中进行酰胺化反应后，连接方式非特异性地进行使唾液酸发生酰胺化或酯化的反应(以下称为非特异的修饰反应)。此时，使供于酰胺化反应的试样与用于非特异性修饰反应的反应溶液(以下称为非特异性修饰反应溶液)接触，来修饰在步骤S2003的酰胺化反应之前就包含在试样中的未形成内酯的唾液酸。在非特异性修饰反应中，与唾液酸的连接方式无关，试样中包含的未经酰胺化的各唾液酸被修饰，从而得到分析用试样。
非特异性修饰反应溶液包含脱水缩合剂，且包含含有醇、氨、胺或它们的盐的第三反应剂。第三反应剂是用于其至少一部分通过连接方式非特异性地与唾液酸键合而进行唾液酸的酯化或酰胺化的修饰的反应剂。第三反应剂例如作为亲核剂而发挥功能。第三反应剂以通过基于第二反应剂和第三反应剂的修饰而得到的修饰体如上所述可利用质谱分析或色谱加以区分并检测出的方式进行选择。非特异性修饰反应中的脱水缩合剂可以使用在上述专利文献1的第二反应中使用的磷鎓系脱水缩合剂或脲阳离子系脱水缩合剂。非特异性修饰反应中的第三反应剂可以使用上述专利文献1的“第二反应”中使用的胺、或者甲醇或乙醇等醇。另外，作为非特异性酯化反应，也可以使用1-甲基-3-对甲苯基三氮烯(1-Methyl-3-p-tolyltriazene)、1-乙基-3-对甲苯基三氮烯(1-Ethyl-3-p-tolyltriazene)之类的酯化剂。使用这种酯化剂时，不需要脱水缩合剂。
需要说明的是，在非特异性修饰反应中，如果能够对糖链所含的唾液酸进行与步骤S2003的酰胺化反应中的修饰不同的修饰，则反应种类或反应溶液的组成等没有特别限定。
(方式)
本领域技术人员理解上述多个示例性的实施方式或其变形为以下的方式的具体例。
(第1项)一个方式所述的分析用试样的制备方法具备如下工序：准备包含糖链的试样；以及，使前述试样与pH为7.7以上的酰胺化反应溶液接触，进行使前述内酯发生酰胺化的酰胺化反应，所述酰胺化反应溶液包含第一化合物和碱化剂，所述第一化合物为选自由与前述糖链所含的内酯发生反应的氨、在与氨基键合的碳原子上直接键合有1个以下碳原子的伯胺、肼、肼衍生物和羟胺和它们的盐组成的组中的至少一种，前述碱化剂为胺时，前述碱化剂为选自由在与氨基键合的碳原子上直接键合有2个以上碳原子的支化型伯胺、仲胺和叔胺组成的组中的至少一种胺。由此，能够使糖链所含的内酯更有效地酰胺化。
(第2项)另一个方式所述的分析用试样的制备方法中，在第1项所述的分析用试样的制备方法中，前述碱化剂包含选自由季铵阳离子、叔胺、仲胺、在与氨基键合的碳原子上直接键合有2个以上碳原子的支化型伯胺、碱金属的氢氧化物、碱土金属的氢氧化物、四烷基铵的氢氧化物、胍、胍衍生物、它们的盐、以及碱缓冲液组成的组中的至少一种化合物，前述碱缓冲液为选自由Tris缓冲液、Good缓冲液、硼酸缓冲液和碳酸盐缓冲液组成的组中的至少一种。由此，能够更可靠使酰胺化反应溶液的pH上升，能够使糖链所含的内酯发生酰胺化。
(第3项)另一个方式所述的分析用试样的制备方法中，在第1项或第2项所述的分析用试样的制备方法中，前述第一化合物为选自氨、胺、羟胺、肼和肼衍生物中的至少一种化合物的碳酸盐、盐酸盐、硝酸盐、硫酸盐、磷酸盐或甲磺酸盐。由此，能够更灵活或适当地选择分析法。
(第4项)另一个方式所述的分析用试样的制备方法中，在第1项～第3项中任一项所述的分析用试样的制备方法中，前述酰胺化反应仅通过使前述试样与前述酰胺化反应溶液接触来进行。由此，能够简便地进行分析用试样的制备。
(第5项)另一个方式所述的分析用试样的制备方法中，在第1项～第4项中任一项所述的分析用试样的制备方法中，前述酰胺化反应溶液不含与前述内酯发生反应的脱水缩合剂。由此，能够更简便地制备酰胺化反应溶液。
(第6项)另一个方式所述的分析用试样的制备方法中，在第1项～第5项中任一项所述的分析用试样的制备方法中，前述酰胺化反应中，在使前述试样与前述酰胺化反应溶液接触后，不进行使前述试样与脱水缩合剂发生反应的操作。由此，能够减少分析用试样的制备时的工序，能够更简便地进行该制备。
(第7项)另一个方式所述的分析用试样的制备方法中，在第1项～第6项中任一项所述的分析用试样的制备方法中，为了进行前述酰胺化反应而使前述试样与前述酰胺化反应溶液接触的时间短于30分钟。由此，能够在更短时间内有效地制备分析用试样。
(第8项)另一个方式所述的分析用试样的制备方法中，在第1项～第7项中任一项所述的分析用试样的制备方法中，前述第一化合物包含直链烃基。由此，能够利用第一化合物更可靠地修饰唾液酸。
(第9项)另一个方式所述的分析用试样的制备方法中，在第8项所述的分析用试样的制备方法中，前述直链烃基为烷基。能够利用第一化合物进一步可靠地修饰唾液酸。
(第10项)另一个方式所述的分析用试样的制备方法中，在第9项所述的分析用试样的制备方法中，前述直链烃基的碳原子数为1～6中的任一者。由此，能够利用第一化合物更进一步可靠地修饰唾液酸。
(第11项)另一个方式所述的分析用试样的制备方法中，在第1项～第10项中任一项所述的分析用试样的制备方法中，前述内酯形成于前述糖链的唾液酸。由此，能够准确地解析不稳定且难以解析的唾液酸的内酯。
(第12项)另一个方式所述的分析用试样的制备方法中，在第1项～第10项中任一项所述的分析用试样的制备方法中，前述内酯形成于前述糖链的α2,3-唾液酸、α2,8-唾液酸和α2,9-唾液酸中的至少一者。由此，能够进行试样中原本包含的唾液酸内酯或唾液酸的连接方式特异性解析等。
(第13项)另一个方式所述的分析用试样的制备方法中，在第11项或第12项所述的分析用试样的制备方法中，还具备如下工序：使所准备的前述试样与包含与前述唾液酸发生反应的脱水缩合剂的内酯化反应溶液接触，将前述唾液酸的至少一部分进行内酯化。由此，能够根据内酯的稳定性来区分唾液酸的一部分和另一部分，并进行解析。
(第14项)另一个方式所述的分析用试样的制备方法中，在第13项所述的分析用试样的制备方法中，前述内酯化反应溶液还包含与前述糖链所含的前述唾液酸发生键合的反应剂，前述反应剂的质量与前述第一化合物不同，使前述试样与前述内酯化反应溶液接触，根据前述唾液酸的连接方式，将前述唾液酸的一部分进行内酯化，使前述反应剂的至少一部分键合于前述唾液酸的另一部分。由此，能够根据唾液酸的连接方式来区分唾液酸的一部分和另一部分，并进行解析。
(第15项)另一个方式所述的分析用试样的制备方法中，在第14项所述的分析用试样的制备方法中，使前述试样与前述内酯化反应溶液接触，将α2,3-唾液酸、α2,8-唾液酸或α2,9-唾液酸进行内酯化，使前述反应剂的一部分键合于α2,6-唾液酸。由此，能够将α2,3-唾液酸、α2,8-唾液酸、α2,9-唾液酸与α2,6-唾液酸加以区别，并进行解析。
(第16项)一个方式所述的分析方法具备如下工序：通过第1项～第15项中任一项所述的分析用试样的制备方法来制备试样；以及，对所制备的前述试样进行分析。由此，能够使糖链所含的内酯更有效地酰胺化。
(第17项)另一个方式所述的分析用试样的制备方法中，在第16项所述的分析用试样的制备方法中，所制备的前述试样利用质谱分析和色谱中的至少一者进行分析。由此，能够根据在分析用试样的制备时进行的修饰来分离糖链，并进行解析。
(第18项)一个方式所述的分析用试样的制备用试剂盒用于第1项～第15项中任一项所述的分析用试样的制备方法、或者第16项或第17项所述的分析方法。由此，能够高效地制备分析用试样。
本发明不限定于上述实施方式的内容。在本发明的发明构思范围内想到的其它方式也包括在本发明的范围内。
实施例
以下示出本实施方式的实施例，但本发明不限定于下述实施例。需要说明的是，以下，％的记载在没有特别提及的情况下是指体积/体积％。
(实施例1～5和比较例)
<评价用糖链试样的制作>
通过下述方法来制作包含两个α2,3-唾液酸的糖链A2 glycan(33A2)。对于包含1nmol/μL的α2,3-唾液酸糖肽(α2,3-SGP；伏见制药所)20μL的管，添加2.5U的PNGase F(SIGMA)，以37℃进行o/n(整夜、以下相同)培养，由此游离出N型糖链A2 glycan(33A2)。所游离的糖链用Stage Tip Carbon进行脱盐处理。
将经脱盐处理的糖链再次溶解于适当的水，将由此得到的物质作为试样。在珠上(On-beads)进行酰胺化反应等时，使该试样直接与珠发生反应。作为在管内的液相中的(in-solution)反应而进行实验时，分注至微量离心管中，进一步用SpeedVac(ThermoFisher Scientific公司)去除溶剂，将由此得到的物质作为试样。
图3是示意性地示出下述实施例所使用的试样中的糖链的结构与设想结构的变化的图。糖链33A2具备由N-乙酰基-D-葡糖胺(GlcNAc)和甘露糖(Man)形成的基本型结构、以及两个侧链。在两个侧链上分别键合有GlcNAc、半乳糖(Gal)和唾液酸(Neu5Ac)。在非还原末端处存在的α2,3-唾液酸与该唾液酸所连接的半乳糖之间的连接部分形成有内酯，用二重线B1表示该点。糖链33A2通过使用了内酯化反应溶液的连接方式特异性唾液酸的修饰来发生内酯化(箭头A1)。若该内酯发生水解，则恢复至原本的唾液酸结构(箭头A2)。该内酯可通过氨基分解而直接发生酰胺化(箭头A3)。
<以下的各实施例中的基本反应条件>
以下的实施例1～5和比较例中，有时即便进行氨基分解也不发生酰胺化，一部分以内酯状态残留。然而，由于内酯不稳定，因此，有可能对实验结果的定量性造成影响。因此，在以下的实验中，在作为氨基分解(称为一次氨基分解)而进行酰胺化反应后，用包含与一次氨基分解中使用的胺不同的胺的酰胺化反应溶液再进行一次氨基分解(二次氨基分解)。由此，通过将在一次氨基分解中未发生反应的内酯转换成与在一次氨基分解中生成的酰胺不同的酰胺来进行定量评价。以下，一次氨基分解中使用甲胺盐酸盐，二次氨基分解中使用乙胺。因此，在质谱中，与经甲基酰胺化的糖链对应的峰可视作与在一次氨基分解中进行了酰胺化的糖链对应的峰，经乙基酰胺化的峰可视作与在一次氨基分解后以内酯状态残留的糖链对应的峰，并进行定量评价。
<在珠上进行氨基分解时的基本反应条件>
使包含糖链的试样吸附至酰肼珠(住友bakelite公司制、基于BlotGlyco的标准规程)，进行多余酰肼基的封端(capping)。其后，向试样中添加唾液酸连接方式特异地进行修饰的内酯化反应溶液(2M异丙胺(iPA)盐酸盐、500mM EDC-HCl、500mM HOBt)，并搅拌1小时，由此对α2,3-唾液酸进行内酯化(此时，如果存在α2,6-唾液酸，则被异丙基酰胺化)。接着，将珠用200μL的甲醇(MeOH)清洗3次，向珠中添加一次氨基分解溶液100μL(成分在以下的各实施例中可能不同，因此分别记载)并轻轻搅拌，进行离心而去除一次氨基分解溶液。接着，将珠依次用MeOH(200μL×3)、H2O(200μL×3)和MeOH(200μL×3)进行清洗，添加作为二次氨基分解溶液的17.5％乙胺水溶液，轻轻搅拌后，进行离心而去除溶液。进而，将珠用H2O(200μL×3)清洗，按照BlotGlyco的标准规程，使糖链自珠游离后，利用后述质谱分析来进行测定。
<在液相中进行氨基分解时的基本反应条件>
向包含已干固的含有糖链的试样的管中添加进行上述唾液酸连接方式特异性修饰的内酯化反应溶液20μL，边搅拌1小时边对α2,3-唾液酸进行内酯化。其后，添加包含3M甲胺盐酸盐水溶液的一次氨基分解溶液20μL，利用涡流进行均匀混合。其后，添加作为碱化剂的碱5μL，利用涡流进行均匀混合。接着，添加包含2.5％三氟乙酸(TFA)的乙腈(ACN)，使pH恢复至中性附近，使用GL Science公司制的GL-Tip Amide，通过HILIC模式进行酰胺纯化，去除多余的试剂后，将已溶出的糖链用SpeedVac进行干固。其后，为了使残留的内酯发生酰胺化而添加17.5％的乙胺水溶液，进行二次氨基分解，用SpeedVac进行干固，利用后述质谱分析进行测定。
<质谱分析条件>
基于质谱分析的测定全部通过精准(on-target)3AQ标记化来进行。已干固的糖链充分再溶解于10μL的水中。将0.5μL滴加至μ聚焦板(Hudson Surface Technology)上，作为基质，添加溶解于50％CAN的100mM 3AQ/CA(3-氨基喹啉/对香豆酸)和2mM ADP(磷酸二氢铵)0.5μL，对于上述的每个板，在75℃的加热块上使其反应1.5小时(用3AQ对糖链的还原末端进行了标记化)。在反应结束后，将板恢复至室温，使用MALDI-QIT-TOF-MS(AXIMA-Resonance,Shimadzu/Kratos)，通过负离子模式进行测定。
<数据解析中的评价方法>
图4是示出对包含在进行一次氨基分解反应后未经修饰的状态(COOH)、经酰胺化的状态(Amide)、经内酯化的状态(Lactone)中的任意状态的唾液酸的33A2进行二次氨基分解后的试样的质谱的一例的图。横轴表示m/z(对应于质荷比)，纵轴表示相对检测量。
评价所使用的试样、即33A2包含两个唾液酸，因此，首先通过连接方式特异性修饰(iPA化)而发生内酯化，在其后的一次氨基分解后可以获得分别水解而得的羧酸型(COOH)、氨基分解而得的酰胺型(Amide)、以内酯的状态残留的内酯型(Lactone)，因此，因其组合而能够在质谱中检测到若干个峰。此处，为了准确地评价在氨基分解后以内酯的状态残留的唾液酸的量，使用乙胺再一次进行氨基分解(二次氨基分解)而转化成乙基酰胺。该二次氨基分解的条件是内酯完全发生乙基酰胺化的条件，因此，可以将乙基酰胺化体视作内酯体。若不发生水解而内酯能够通过一次氨基分解而100％转换成甲基酰胺化体，则仅在m/z2471.9处得到峰。
COOH体、Amide体和Lactone体的比例的评价中，考虑到一分子包含两个唾液酸而由质谱读取各个峰的相对强度，算出COOH体、Amide体和Lactone体各自的峰强度，将整体设为100％来进行标准化。
(实施例1)
<作为碱化剂的叔丁基胺浓度的研究(珠上)>
按照上述在珠上进行氨基分解的基本反应条件来进行实验。作为用于一次氨基分解的酰胺化反应溶液，使用包含0～50％叔丁基胺的3M甲胺盐酸盐。此处，叔丁基胺为碱化剂，3M甲胺盐酸盐是在酰胺化中构成修饰体的物质(第二反应剂)。
图5是表示本实施例的酰胺化反应时的叔丁基胺的浓度(体积/体积％)与经酰胺化的唾液酸的比例的图。在不含叔丁基胺的情况下，虽然确认到氨基分解，但唾液酸绝大部分还是内酯化体的状态，一部分发生了水解。添加即便是少量的叔丁基胺时也发生氨基分解，在叔丁基胺的浓度为10％左右时，几乎100％发生甲基酰胺化。由此可明确：使用胺的盐酸盐时，通过利用其它碱而使酰胺化反应溶液的pH上升，从而能够促进氨基分解。
(实施例2)
<碱化剂的种类的研究(珠上)>
按照上述在珠上进行氨基分解的基本反应条件来进行实验。作为用于进行一次氨基分解的酰胺化反应溶液，使用包含10％或1M的各种碱化剂(10％氨水、10％异丙胺(iPA)、10％叔丁基胺(t-BA)、10％二甲胺(DMA)、10％三甲胺(TMA)、10％甲基吗啉(NMM)、10％四甲基胍(TMG)、1M氢氧化钠溶液(NaOH))中的任一者的3M甲胺盐酸盐溶液。
图6是表示本实施例的酰胺化反应时的碱化剂的种类和经酰胺化的唾液酸的比例的图。由图6可知：在使用任意碱作为碱化剂的情况下均能够发生氨基分解，与碱化剂的种类无关，均能够促进氨基分解。
(比较例)
<酸条件下的氨基分解的研究(珠上)>
按照上述在珠上进行氨基分解的基本反应条件来进行实验。作为用于进行一次氨基分解的酰胺化反应溶液，使用包含酸(0.1％或2％三氟乙酸(TFA))而非碱的3M甲胺盐酸盐(MA-HCl)溶液。
图7是示出本比较例的酰胺化反应时的溶液的组成和经酰胺化的唾液酸的比例的图。由图7可明确：在添加三氟乙酸代替碱来降低酰胺化反应溶液的pH的条件下，与未添加酸的情况的结果一致，即便使用3M MA-HCl这一高浓度的胺盐酸盐，也完全不发生氨基分解。
(实施例3)
<作为第二反应剂的胺盐酸盐浓度的研究(珠上)>
按照上述在珠上进行氨基分解的基本反应条件来进行实验。作为用于进行一次氨基分解的酰胺化反应溶液，使用包含10％叔丁基胺的10mM～3M甲胺盐酸盐溶液。
图8是示出本实施例的酰胺化反应时的甲胺盐酸盐的浓度和经酰胺化的唾液酸的比例的图。由图8可明确：氨基分解与水解产生竞争，胺盐酸盐侧的浓度高是优选的。
(实施例4)
<溶剂的研究(珠上)>
按照上述在珠上进行氨基分解的基本反应条件来进行实验。作为用于进行一次氨基分解的酰胺化反应溶液，使用包含10％叔丁基胺(t-BA)和100mM甲胺盐酸盐的各种溶液(溶剂：水(H2O)、甲醇(MeOH)、乙醇(EtOH)、二甲基亚砜(DMSO)、80％乙腈(ACN)水溶液)。
图9是示出本实施例的酰胺化反应时的溶剂的种类和经酰胺化的唾液酸的比例的图。由图9可明确：从有效地发生氨基分解的观点出发，水溶剂是优选的，但即便混合有一部分的有机溶剂，也可无问题地进行氨基分解。
(实施例5)
<碱化剂的种类的研究(液相)>
按照上述在液相中进行氨基分解时的基本反应条件来进行实验。作为酰胺化反应溶液中包含的碱化剂，使用叔丁基胺(t-BA)、50％二甲胺水溶液(DMA)、28％三甲胺水溶液(TMA)、四甲基胍(TMG)或1M氢氧化钠(NaOH)水溶液。
图10是示出本实施例的酰胺化反应时的碱化剂的种类和经酰胺化的唾液酸的比例的图。由图10可明确：在液相中进行(In-solution)酰胺化反应时，在未添加碱化剂的情况下也发生氨基分解的唾液酸停留在一定程度的比例，但通过添加碱化剂，能够促进氨基分解。
需要说明的是，还研究了向具有经内酯化的唾液酸的糖链中添加包含第二反应剂的溶液和包含碱化剂的溶液的顺序。其结果，可以在添加包含第二反应剂的溶液后再添加包含碱化剂的溶液，将包含第二反应剂的溶液与包含碱化剂的溶液混合并添加至该糖链中，也能够得到与上述同等的结果。
(实施例6)
<使用了稳定同位素标记胺盐酸盐的氨基分解的研究>
使用PNGase F，从源自人血清的α-anti-trypsin(AAT)中切出N型糖链。按照住友bakelite公司制的BlotGlyco的规程，使所切出的N型糖链键合于酰肼珠。其后，按照BlotGlyco的规程，进行至多余的酰肼基的封端为止。对于珠上的糖链，将唾液酸的连接方式特异性地进行修饰的内酯化反应溶液(2M异丙胺(iPA)盐酸盐、500mM EDC-HCl、500mMHOBt)添加至100μL珠中，边以800rpm缓慢搅拌1小时，边对α2,6-唾液酸进行异丙基酰胺化，并对α2,3-唾液酸进行内酯化。其后，将珠用MeOH 200μL清洗三次，接着，将添加有10％叔丁基胺作为碱化剂的乙胺盐酸盐(EtNH2-HCl)溶液或者经稳定同位素标记的乙胺盐酸盐(EtNH2-d5-HCl、浓度均为3M)溶液100μL添加至珠中，轻轻搅拌，进行离心而去除该酰胺化反应溶液。进而，将珠用200μL MeOH清洗三次，并用200μL水清洗三次，其后，按照BlotGlyco规程进行MALDI-MS用高灵敏度标记化，回收糖链，使用2,5-二羟基苯甲酸，通过正离子模式来获取质谱。此处，MALDI-MS是指通过MALDI进行电离的质谱分析。
图11是示出本实施例中得到的质谱的图。横轴表示m/z，纵轴表示检测时的强度。在图11中，上段是使用未经稳定同位素标记的乙胺盐酸盐进行酰胺化反应时的质谱，下段是使用经稳定同位素标记的乙胺盐酸盐进行酰胺化反应时的质谱。在上段和下段中，将左侧的质谱的放大图示于右侧(箭头A11)。在m/z 2735.8处观测到的峰是在A2型糖链上附加两个α2,6-唾液酸而得的，它们在唾液酸连接方式特异性修饰的时刻被转化成异丙基酰胺，因此，在随后的氨基分解中不发生反应，即便使用经稳定同位素标记的乙胺盐酸盐EtNH2-d5-HCl，也在相同的m/z处观测到。另一方面，使用未经稳定同位素标记的乙胺盐酸盐EtNH2-HCl时观测到的3419.4的峰是包含一个α2,3-唾液酸和两个α2,6-唾液酸的三条链的A3型糖链，但使用经稳定同位素标记的乙胺盐酸盐EtNH2-d5-HCl时，观测到5Da的位移(从m/z 3565.5变为3570.5)。这些结果表示：即便是通常仅能够利用盐酸盐获取那样的经同位素标记的伯胺，通过使用碱化剂强制地提高pH，也能够促进氨基分解。
(实施例7)
利用与实施例6相同的方法，将分别使用未经同位素标记的乙胺盐酸盐和经稳定同位素标记的乙胺盐酸盐进行了修饰的糖链等量混合，制备质谱分析用试样。利用与实施例6相同的方法，对所制备的质谱分析用试样进行质谱分析。
图12是本实施例中得到的质谱的放大图。图12中示出与AAT所含的代表性的含有α2,3-唾液酸的三条链糖链、即A3(图的左侧)和A3F(图的右侧)对应的峰。可明确：观测到通过稳定同位素标记，A3和A3F的峰分别位移5Da，但等量混合时，离子强度几乎同等。这意味着：在氨基分解后，电离效率不会因稳定同位素标记的有无而发生变化，其表示即便在使用经稳定同位素标记的胺盐酸盐的情况下，通过强制性地提高pH来促进氨基分解，也能够应用于比较质谱分析解析。
以下的优先权基础申请(1)和本说明书中参考的文献(2)的公开内容作为引用文献而援引至此。
(1)日本特愿2019-130188号(2019年7月12日申请)
(2)Takashi Nishikaze,Sadanori Sekiya,Shinichi Iwamoto,Koichi Tanaka.“A Universal Approach to linkage-Specific Derivatization for Sialic Acids onGlycopeptides,”Journal of The American Society for Mass Spectrometry,2017年6月,Volume 28,Issue 1Supplement,宣传编号MP091。

Claims (25)

1.一种分析用试样的制备方法，其具备如下工序：
准备包含糖链的试样；以及
使所述试样与pH为7.7以上的酰胺化反应溶液接触，进行使内酯发生酰胺化的酰胺化反应，所述酰胺化反应溶液包含第一化合物和碱化剂，所述第一化合物为选自由与所述糖链所含的所述内酯发生反应的氨、在与氨基键合的碳原子上直接键合有1个以下碳原子的伯胺、肼、肼衍生物、羟胺和它们的盐组成的组中的至少一种，
所述碱化剂包含选自由季铵阳离子、叔胺、仲胺、在与氨基键合的碳原子上直接键合有2个以上碳原子的支化型伯胺、碱金属的氢氧化物、碱土金属的氢氧化物、四烷基铵的氢氧化物、胍、胍衍生物、它们的盐、以及碱缓冲液组成的组中的至少一种化合物，
所述碱缓冲液为选自由Tris缓冲液、Good缓冲液、硼酸缓冲液和碳酸盐缓冲液组成的组中的至少一种；
其中，所述内酯形成于所述糖链的α2,3-唾液酸、α2,8-唾液酸和α2,9-唾液酸中的至少一者。
2.根据权利要求1所述的分析用试样的制备方法，其中，
所述第一化合物为选自氨、胺、羟胺、肼和肼衍生物中的至少一种化合物的碳酸盐、盐酸盐、硝酸盐、硫酸盐、磷酸盐或甲磺酸盐。
3.根据权利要求1所述的分析用试样的制备方法，其中，
所述酰胺化反应仅通过使所述试样与所述酰胺化反应溶液接触来进行。
4.根据权利要求1所述的分析用试样的制备方法，其中，
所述酰胺化反应中，在使所述试样与所述酰胺化反应溶液接触后，不进行使所述试样与脱水缩合剂发生反应的操作。
5.根据权利要求1所述的分析用试样的制备方法，其中，
为了进行所述酰胺化反应而使所述试样与所述酰胺化反应溶液接触的时间短于30分钟。
6.根据权利要求1所述的分析用试样的制备方法，其中，
所述第一化合物包含直链烃基。
7.根据权利要求6所述的分析用试样的制备方法，其中，
所述直链烃基为烷基。
8.根据权利要求7所述的分析用试样的制备方法，其中，
所述直链烃基的碳原子数为1～6中的任一者。
9.根据权利要求1所述的分析用试样的制备方法，其还具备如下工序：
使所准备的所述试样与包含与所述唾液酸发生反应的脱水缩合剂的内酯化反应溶液接触，将所述唾液酸的至少一部分进行内酯化。
10.根据权利要求9所述的分析用试样的制备方法，其中，
所述内酯化反应溶液还包含与所述糖链所含的所述唾液酸发生键合的反应剂，
所述反应剂的质量与所述第一化合物不同，
使所述试样与所述内酯化反应溶液接触，根据所述唾液酸的连接方式，将所述唾液酸的一部分进行内酯化，使所述反应剂的至少一部分键合于所述唾液酸的另一部分。
11.根据权利要求10所述的分析用试样的制备方法，其中，
使所述试样与所述内酯化反应溶液接触，将α2,3-唾液酸、α2,8-唾液酸或α2,9-唾液酸进行内酯化，使所述反应剂的一部分键合于α2,6-唾液酸。
12.一种分析用试样的制备方法，其具备如下工序：
准备包含糖链的试样；以及
使所述试样与pH为7.7以上的酰胺化反应溶液接触，进行使内酯发生酰胺化的酰胺化反应，所述酰胺化反应溶液包含第一化合物和碱化剂，所述第一化合物为选自由与所述糖链所含的所述内酯发生反应的氨、在与氨基键合的碳原子上直接键合有1个以下碳原子的伯胺、肼、肼衍生物、羟胺和它们的盐组成的组中的至少一种，
所述碱化剂为胺时，所述碱化剂为选自由在与氨基键合的碳原子上直接键合有2个以上碳原子的支化型伯胺、仲胺和叔胺组成的组中的至少一种胺，
所述酰胺化反应溶液不含与所述内酯发生反应的脱水缩合剂；
其中，所述内酯形成于所述糖链的α2,3-唾液酸、α2,8-唾液酸和α2,9-唾液酸中的至少一者。
13.根据权利要求12所述的分析用试样的制备方法，其中，
所述碱化剂包含选自由季铵阳离子、叔胺、仲胺、在与氨基键合的碳原子上直接键合有2个以上碳原子的支化型伯胺、碱金属的氢氧化物、碱土金属的氢氧化物、四烷基铵的氢氧化物、胍、胍衍生物、它们的盐、以及碱缓冲液组成的组中的至少一种化合物，
所述碱缓冲液为选自由Tris缓冲液、Good缓冲液、硼酸缓冲液和碳酸盐缓冲液组成的组中的至少一种。
14.根据权利要求12或13所述的分析用试样的制备方法，其中，
所述第一化合物为选自氨、胺、羟胺、肼和肼衍生物中的至少一种化合物的碳酸盐、盐酸盐、硝酸盐、硫酸盐、磷酸盐或甲磺酸盐。
15.根据权利要求12或13所述的分析用试样的制备方法，其中，
所述酰胺化反应仅通过使所述试样与所述酰胺化反应溶液接触来进行。
16.根据权利要求12或13所述的分析用试样的制备方法，其中，
所述酰胺化反应中，在使所述试样与所述酰胺化反应溶液接触后，不进行使所述试样与脱水缩合剂发生反应的操作。
17.根据权利要求12或13所述的分析用试样的制备方法，其中，
为了进行所述酰胺化反应而使所述试样与所述酰胺化反应溶液接触的时间短于30分钟。
18.根据权利要求12或13所述的分析用试样的制备方法，其中，
所述第一化合物包含直链烃基。
19.根据权利要求18所述的分析用试样的制备方法，其中，
所述直链烃基为烷基。
20.根据权利要求19所述的分析用试样的制备方法，其中，
所述直链烃基的碳原子数为1～6中的任一者。
21.根据权利要求12或13所述的分析用试样的制备方法，其还具备如下工序：
使所准备的所述试样与包含与所述唾液酸发生反应的脱水缩合剂的内酯化反应溶液接触，将所述唾液酸的至少一部分进行内酯化。
22.根据权利要求21所述的分析用试样的制备方法，其中，
所述内酯化反应溶液还包含与所述糖链所含的所述唾液酸发生键合的反应剂，
所述反应剂的质量与所述第一化合物不同，
使所述试样与所述内酯化反应溶液接触，根据所述唾液酸的连接方式，将所述唾液酸的一部分进行内酯化，使所述反应剂的至少一部分键合于所述唾液酸的另一部分。
23.根据权利要求22所述的分析用试样的制备方法，其中，
使所述试样与所述内酯化反应溶液接触，将α2,3-唾液酸、α2,8-唾液酸或α2,9-唾液酸进行内酯化，使所述反应剂的一部分键合于α2,6-唾液酸。
24.一种分析方法，其具备如下工序：
通过权利要求1～23中任一项所述的分析用试样的制备方法来制备分析用试样；以及
对所制备的所述分析用试样进行分析。
25.根据权利要求24所述的分析方法，其中，
所制备的所述试样利用质谱分析和色谱中的至少一者进行分析。
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