JP7047669B2 - 分析用試料の調製方法、分析方法および分析用試料の調製用キット - Google Patents

分析用試料の調製方法、分析方法および分析用試料の調製用キット Download PDF

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Description

本発明は、分析用試料の調製方法、分析方法および分析用試料の調製用キットに関する。
シアル酸は生体内に数多く存在する糖である。シアル酸は、生体内においてタンパク質と結合された糖鎖にも含まれ、糖鎖の非還元末端に存在することが多い。従って、シアル酸は、このような糖タンパク質分子において分子の外側に配置され他の分子から直接認識されるため、重要な役割を担っている。シアル酸は、隣接する糖との間の結合様式（ｌｉｎｋａｇｅ ｔｙｐｅ）が異なる場合がある。例えば、ヒトのＮ－結合型糖鎖（Ｎ型糖鎖）では主にα２，３－およびα２，６－、Ｏ－結合型糖鎖（Ｏ型糖鎖）やスフィンゴ糖脂質ではこれらに加えてα２，８－およびα２，９－の結合様式が知られている。このような結合様式の違いにより、シアル酸は異なる分子から認識され、異なる役割を有し得る。
シアル酸はアセチル化等の様々な修飾を受け得るが、その中にシアル酸ラクトンの形成がある。これまでに、糖脂質のガングリオシドやミルクオリゴ糖鎖にラクトン構造が存在することが知られている（非特許文献１参照）。脳内によく発現しているポリシアル酸構造は、α２，８－やα２，９－の結合様式のシアル酸を含むが、これらはラクトン構造が形成されやすいとも言われている。バイオ医薬品、特に抗体医薬品の糖鎖にラクトン構造が含まれることも報告されている。非特許文献２では、あるバイオシミラー医薬品がラクトン構造を含む点が記載されている。
ラクトン構造を含むシアル酸とラクトン構造を含まないシアル酸とを区別し、定量的に検出する手法が確立されていない。ラクトン構造を含むシアル酸は、ラクトン構造を含まないシアル酸と比較して水分子（H2O）一個分小さいので、質量分析を用いれば区別が可能である。しかしながら、ラクトン構造はきわめて不安定であり、水中でも容易に加水分解され、酸性または塩基性条件でさらに迅速に加水分解される。従って、特に酵素的または化学的に糖鎖を切断し遊離糖鎖として分析する場合や、プロテアーゼ消化によって糖ペプチドとして分析する場合等では、分解によりラクトン構造を定量的に解析できている確証はない。
質量分析等においては、シアル酸を含有する糖鎖に対する前処理としてシアル酸の修飾が行われている。これは、負電荷を有するシアル酸のカルボキシ基をエステル化やアミド化等により中性化することで、イオン化の抑制やシアル酸の脱離等のデメリットを解消するものである。これをさらに発展させ、結合様式特異的にシアル酸を定量する方法も提案されている（特許文献１および非特許文献３参照）。しかしながら、この手法は元々ラクトン構造として存在していたシアル酸とそうではない通常のシアル酸とを区別することが出来ない。
非特許文献４では、アンモノリシスと完全メチル化とを行った後、質量分析を行うことにより、ガングリオシドのラクトンを検出している。しかし完全メチル化では糖鎖のヒドロキシ基が全てメチル化されてしまうという制約がある。
特許第６１３５７１０号公報
Riboni L, Sonnino S, Acquotti D, Malesci A, Ghidoni R, Egge H, Mingrino S, Tettamanti G. "Natural occurrence of ganglioside lactones. Isolation and characterization of GD1b inner ester from adult human brain" Journal of Biochemical Chemistry,（米国）, American Society for Biochemistry and Molecular Biology, 1986年6月25日、Volume 261, Issue 18, pp.8514-8519 Liu S, Gao W, Wang Y, He Z, Feng X, Liu BF, Liu X. "Comprehensive N-Glycan Profiling of Cetuximab Biosimilar Candidate by NP-HPLC and MALDI-MS" PLoS One,（米国）, Public Library of Science, 2017年1月10日、Volume 12, Issue 1, e0170013 Nishikaze T, Tsumoto H, Sekiya S, Iwamoto S, Miura Y, Tanaka K. "Differentiation of Sialyl Linkage Isomers by One-Pot Sialic Acid Derivatization for Mass Spectrometry-Based Glycan Profiling," Analytical Chemistry,（米国）, ACS Publications, 2017年2月21日、Volume 89, Issue 4, pp.2353-2360 Levery SB, Salyan MEK, Roberts CE, Bouchon B, Hakomori S. "Strategies for characterization of ganglioside inner esters I-Fast atom bombardment mass spectrometry" Biomedical & Environmental Mass Spectrometry,（英国）, John Wiley & Sons, 1990年5月、Volume 19, Issue 5, pp.303-310
試料に元々含まれる、ラクトン構造を含むシアル酸と、ラクトン構造を含まないシアル酸とを区別して精度よく定量する方法が必要である。
本発明の好ましい実施形態による分析用試料の調製方法は、試料に含まれる、ラクトン構造を含む糖鎖の分析を行うための分析用試料の調製方法であって、前記試料に、前記ラクトン構造を含むシアル酸と反応させるアンモニア、アミンまたはこれらの塩を第１求核剤として含む第１アミド化反応溶液を加え、前記ラクトン構造を含むシアル酸をアミド化する第１アミド化反応を行うことと、完全メチル化以外の方法で、前記第１アミド化反応でアミド化されなかったシアル酸の少なくとも一部を修飾する第２反応を行うことと、を備える。
さらに好ましい実施形態では、前記第１アミド化反応を行うために前記試料と前記第１アミド化反応溶液とを接触させる時間は３０分より短い。
さらに好ましい実施形態では、前記第１アミド化反応溶液はシアル酸と反応させる脱水縮合剤を含まない。
さらに好ましい実施形態では、前記アミンは第一級アミンである。
さらに好ましい実施形態では、前記アミンはアルキル基を含む。
さらに好ましい実施形態では、前記アルキル基は分枝を有しない。
さらに好ましい実施形態では、前記第１アミド化反応溶液のｐＨは、８．０以上である。
さらに好ましい実施形態では、前記第１アミド化反応溶液は、アミンまたはその塩を含み、前記アミンまたはその塩の濃度は０．５Ｍ以上である。
さらに好ましい実施形態では、前記第２反応は、前記試料が固相担体に結合または吸着した状態で行われる。
さらに好ましい実施形態では、前記第２反応では、前記第１アミド化反応に供した前記試料と、第２反応溶液とを接触させ、前記第２反応溶液は、前記第１アミド化反応でアミド化されなかったシアル酸と反応させるアンモニア、アミン、アルコールまたはこれらの塩を第２求核剤としてさらに含み、前記第２反応により、前記第１アミド化反応の前に前記試料に含まれていた、前記ラクトン構造を有しないシアル酸の少なくとも一部がアミド化またはエステル化され、前記第１求核剤と前記第２求核剤とは異なる。
さらに好ましい実施形態では、前記第２反応溶液は、脱水縮合剤を含む。
さらに好ましい実施形態では、前記第２反応では、前記第１アミド化反応に供した前記試料と、第２反応溶液とを接触させ、前記第２反応溶液は、エステル合成用アルキル化剤を含む。
さらに好ましい実施形態では、前記第２反応では、シアル酸の結合様式に基づいて、前記シアル酸の少なくとも一部を修飾する。
さらに好ましい実施形態では、前記第２反応では、α２，３－シアル酸、α２，８－シアル酸およびα２，９－シアル酸の少なくとも一つと、α２，６－シアル酸とを異なる修飾体で修飾する。
本発明の好ましい実施形態による分析方法は、上述の分析用試料の調製方法により分析用試料を調製することと、調製した前記分析用試料を分析することとを備える。
さらに好ましい実施形態では、調製した前記分析用試料は、質量分析およびクロマトグラフィの少なくとも一つにより分析される。
本発明の好ましい実施形態による分析用試料の調製用キットは、アンモニア、アミンおよびこれらの塩の少なくとも一つを含み、上述の分析用試料の調製方法に用いられる。
本発明によれば、試料に元々含まれる、ラクトン構造を含むシアル酸と、ラクトン構造を含まないシアル酸とを区別して精度よく定量することができる。
図１は、一実施形態に係る分析方法の流れを示すフローチャートである。 図２は、一実施形態に係る分析方法の流れを示すフローチャートである。 図３（Ａ）、３（Ｂ）および３（Ｃ）は、実施例に用いた試料に含まれる糖鎖の構造を示す概念図である。 図４は、試料に含まれる糖鎖に対しシアル酸の結合様式特異的修飾を行った後、反応生成物に対し負イオンモードで質量分析を行って得たマススペクトルである。 図５は、試料に含まれる糖鎖に対し、ラクトンのアミド化およびシアル酸の結合様式特異的修飾を行った後、反応生成物に対し負イオンモードで質量分析を行って得たマススペクトルである。 図６は、試料に含まれる糖鎖に対し、ラクトンのアミド化、ヒドラジドビーズへの結合、およびシアル酸の結合様式特異的修飾を行った後、反応生成物に対し負イオンモードで質量分析を行って得たマススペクトルである。 図７は、試料に含まれる糖鎖に対しシアル酸の結合様式非特異的修飾を行った後、反応生成物に対し負イオンモードで質量分析を行って得たマススペクトルである。 図８は、試料に含まれる糖鎖に対し、ラクトンのアミド化およびシアル酸の結合様式非特異的修飾を行った後、反応生成物に対し負イオンモードで質量分析を行って得たマススペクトルである。 図９は、試料に含まれる糖鎖に対し、ラクトンのアミド化、ヒドラジドビーズへの結合、およびシアル酸の結合様式非特異的修飾を行った後、反応生成物に対し負イオンモードで質量分析を行って得たマススペクトルである。 図１０は、α２，３－シアリルグライコペプチドから遊離した糖鎖をラクトン化反応およびアミノリシスに供した後、反応生成物に対し負イオンモードで質量分析を行って得たマススペクトルであり、（ａ）はアミノリシスの際のメチルアミン濃度が１％の場合のマススペクトルであり、（ｂ）はアミノリシスの際のメチルアミン濃度が１０％の場合のマススペクトルである。 図１１は、アミノリシスの際のメチルアミン水溶液の濃度と、アミド化される効率との関係を示すグラフである。 図１２は、アミノリシスの際のアミンの種類と、各反応生成物の生成比とを示すグラフである。 図１３は、アミノリシスの際のアミンの種類および溶媒と、各反応生成物の生成比とを示すグラフである。 図１４は、アミノリシスの際のｐＨと、各反応生成物の生成比とを示すグラフである。 図１５は、糖タンパク質フェツインから遊離した糖鎖をラクトン化反応およびアミノリシスに供した後、反応生成物に対し質量分析を行って得たマススペクトルである。 図１６は、α２，３－シアリルグライコペプチドから遊離した糖鎖をラクトン化反応に供した後、ＨＩＬＩＣ担体に結合させ、溶出の前後でアミノリシスに供した場合の、各反応生成物の生成比を示すグラフである。
以下、図を参照して本発明を実施するための形態について説明する。以下の実施形態では、試料に元々含まれていた糖鎖中のラクトンを分析するための分析用試料の調製方法が示される。発明者らは、試料に、ラクトン構造を含むシアル酸と反応させるアンモニア、アミンまたはこれらの塩を含む反応溶液を加え、試料に含まれていたラクトン構造を含むシアル酸をアミド化して定量することを見出した。
－第１実施形態－
図１は、本実施形態の分析用試料の調製方法に係る分析方法の流れを示すフローチャートである。この分析方法は、試料に元々含まれていた糖鎖中のラクトンを分析するためのものである。ステップＳ１００１において、糖鎖を含む試料が用意される。
糖鎖を含む試料は、特に限定されず、遊離糖鎖、糖ペプチドおよび糖タンパク質、ならびに糖脂質からなる群から選択される少なくとも一つの分子を含むことができる。本実施形態の分析用試料の調製方法は、糖鎖に含まれるラクトン構造を含むシアル酸の修飾に用いられ、さらにシアル酸の結合様式の分析に好適に用いられるため、試料中の糖鎖は、Ｎ－結合型糖鎖やＯ－結合型糖鎖、糖脂質型糖鎖等、末端にシアル酸を有する可能性がある糖鎖を含むことが好ましい。試料中の糖鎖は、α２，３－シアル酸、α２，８－シアル酸およびα２，９－シアル酸の少なくとも一つと、α２，６－シアル酸とを含むことがより好ましいが、これらを含むものに限定されない。
ステップＳ１００１が終了したら、ステップＳ１００３に進む。
（第１アミド化反応）
ステップＳ１００３において、試料を、ラクトン構造を含むシアル酸をアミド化するための反応溶液（以下、第１アミド化反応溶液と呼ぶ）と接触させ、試料に元々含まれていたラクトン構造を含むシアル酸をアミド化する第１アミド化反応が行われる。発明者らは、従来行われていた、加水分解によりラクトンを開環してからカルボキシ基をアミド化する技術的な常識とは全く異なり、ラクトンを迅速に直接アミド化する方法を見出した。この反応は無水条件下でも好適に行われるため、加水分解とは異なる反応であり、アミノ基とラクトンとの相互作用に基づくアミノリシスと考えられる。以下では、無水条件下でも可能な、アンモニア、アミンまたはこれらの塩によるラクトンの開環およびアミド化をアミノリシスと呼ぶ。また、試料に元々含まれていたラクトンまたはラクトン構造を、分析対象のラクトンまたはラクトン構造等と適宜呼ぶ。このアミノリシス反応は実質的に脱水縮合剤を必要としないので、ラクトン構造ではない通常のシアル酸には影響を及ぼすことなく、ラクトン化しているシアル酸のみを選択的にアミド化することが可能である。
なお、シアル酸におけるラクトン構造は、シアル酸と当該シアル酸に隣接する単糖間に形成されたものの他、シアル酸の内部に形成されたもの等を分析対象としてもよい。
第１アミド化反応後の試料から、第１アミド化反応溶液を除去するための操作が行われる。第１アミド化反応溶液を除去するための操作は、固相担体に結合させた糖鎖から遠心等により第１アミド化反応溶液を分離し、洗浄溶液を用いて洗浄したり、減圧遠心濃縮により試料を乾固させたり等、第１アミド化反応に必要な試薬の濃度が十分低くなれば適宜特に限定されない。
第１アミド化反応溶液は、アンモニア、アミンまたはこれらの塩が含まれる。第１アミド化反応溶液は、試料において元々ラクトン化されていなかったシアル酸が意図せずラクトン化されないように、脱水縮合剤を含まないか、実質的に含まないことが好ましい。あるいは、第１アミド化反応溶液は、このような不所望のラクトン化が起きないような十分に低い濃度の脱水縮合剤しか含まないことが好ましい。好ましくは、第１アミド化反応は、試料を第１アミド化反応溶液と接触させることのみにより行われ、簡便な操作で分析対象のラクトンが安定化される。
（第１アミド化反応におけるアミン）
第１アミド化反応においてアミンを用いる場合、第１アミド化反応溶液に含まれるアミンは、第一級アミンが好ましく、直鎖炭化水素基を有する第一級アミンがより好ましく、直鎖アルキル基を有する第一級アミンがさらに好ましい。第１アミド化反応溶液に含まれるアミンは、直鎖アルキル基を有する第一級アミンとしては、炭素数が１０以下の第一級アミンが好ましく、炭素数が７以下の第一級アミンがより好ましく、メチルアミン、エチルアミン、プロピルアミン、ブチルアミン、ペンチルアミンがさらに好ましく、メチルアミンが最も好ましい。第１アミド化反応溶液に含まれるアミンが分枝（以下、「分枝」は炭化水素鎖の分枝を示す）を有しない直鎖状の構造を有していたり、炭素数が少ない方が、より効率的に分析対象のラクトンがアミド化されるため好ましい。
第１アミド化反応溶液に含まれるアミンが不飽和鎖式炭化水素基を有する第一級アミンの場合、当該不飽和鎖式炭化水素基は二重結合を含むことが好ましく、当該不飽和鎖式炭化水素基はアリル（Allyl）基を含むことがより好ましく、当該アミンはアリルアミン（Allylamine）が最も好ましい。第１アミド化反応溶液に含まれるアミンはヒドロキシ基を含む第一級アミンでもよく、この場合、エタノールアミンが好ましい。第１アミド化反応溶液に含まれるアミンはアルキル基以外の様々な官能基を含んでもよい。糖鎖が第１アミド化反応の結果このような官能基を含むように修飾されることにより、当該修飾を受けた糖鎖を、質量分析だけではなく、クロマトグラフィ等によってもより分離しやすくなる。
なお、第１アミド化反応溶液は、上述のアミンの塩を含んでもよい。
（第１アミド化反応溶液の濃度）
第１アミド化反応溶液におけるアンモニア、アミンおよびこれらの塩の濃度は、０．１Ｍ（Ｍはｍｏｌ／ｌ）以上が好ましく、０．３Ｍ以上がより好ましく、０．５Ｍ以上がさらに好ましく、１．０Ｍ以上がさらに好ましく、３．０Ｍ以上が最も好ましい。好適な例として、第１アミド化反応溶液は、アンモニアまたは第一級アミン、特にメチルアミンを含み、当該アンモニア、またはメチルアミン等の第一級アミンの濃度は、０．１Ｍ以上が好ましく、０．３Ｍ以上がより好ましく、０．５Ｍ以上がさらに好ましく、１．０Ｍ以上がさらに好ましく、３．０Ｍ以上が最も好ましい。第１アミド化反応溶液のアミン等の濃度が高いほど、より確実に分析対象のラクトンのアミド化を行うことができる。
（第１アミド化反応溶液の溶媒）
第１アミド化反応溶液の溶媒は、水系溶媒でも有機溶媒でもよい。当該溶媒は、分析対象のラクトンの加水分解を防いで迅速なアミド化を確実に起こす観点から適宜水含有量が調節され、水含有量を抑える脱水操作が加えられた脱水溶媒や無水溶媒を用いることもできる。第１アミド化反応溶液の溶媒は、メタノールおよびアセトニトリル（ACN）の少なくとも一つを含むことが好ましい。
なお、第１アミド化反応溶液は水（H2O）を相当量含んでいてもよく、第１アミド化反応溶液の溶媒は水でもよい。
（第１アミド化反応溶液のｐＨ）
第１アミド化反応溶液のｐＨは、７．７以上が好ましく、８．０以上がより好ましく、８．８以上がさらに好ましく、１０．３以上が最も好ましい。第１アミド化反応溶液のｐＨが高くなると、より確実に分析対象のラクトンがアミド化されるため好ましい。
（第１アミド化反応を起こすための時間）
第１アミド化反応は、数秒～数分以内に完了する。従って、第１アミド化反応によりラクトンをアミド化するために、試料を第１アミド化反応溶液と接触させる時間（以下、反応時間と呼ぶ）は、１時間未満が好ましく、３０分未満がより好ましく、１５分未満がさらに好ましく、５分未満がさらに好ましく、１分未満が最も好ましい。好適には、試料を第１アミド化反応溶液で洗浄したり、担体等に保持されている試料に対して一時的に通液するだけでもよい。また、試料と第１アミド化反応溶液を混合し、そのまま反応時間を設けずに乾固してもよい。このように、第１アミド化反応は短時間に完了するため、不安定なラクトンが分解し糖鎖の解析における定量性が損なわれることを防ぐことができる。また、第１アミド化反応の反応時間を短く設定することで、より効率的に試料の解析を行うことができる。
（第１アミド化反応を行う相）
試料と第１アミド化反応溶液とを接触させることができれば、第１アミド化反応を起こす際の試料の状態は特に限定されないが、固相で行う場合、固相化反応の際のシアル酸のラクトン化により分析対象のラクトンを定量する精度が低下するため、第１アミド化反応は液相で行うことが好ましい。
なお、試料が糖タンパク質、糖ペプチドまたは糖脂質を含む場合、第１アミド化反応の後、糖鎖を糖タンパク質、糖ペプチドまたは糖脂質から遊離させてもよい。当該遊離の方法としては、Ｎ‐グリコシダーゼやＯ‐グリコシダーゼ、エンドグリコセラミダーゼなどを用いた酵素処理、ヒドラジン分解、アルカリ処理によるβ脱離等の方法を用いることができる。糖ペプチドおよび糖タンパク質のペプチド鎖からＮ‐結合型糖鎖を遊離させる場合は、ペプチド‐Ｎ‐グリコシダーゼＦ(PNGase F)やペプチド‐Ｎ‐グリコシダーゼＡ(PNGase A)、エンド－β－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼ（Endo M）等による酵素処理が好適に用いられる。また、糖鎖の還元末端のピリジルアミノ化（PA化）等の修飾を適宜行うことができる。
試料が糖ペプチドまたは糖タンパク質を含む場合、第１アミド化反応後、後述の「糖ペプチドおよび糖タンパク質の副反応の抑制について」の部分で述べるように、ペプチド部分の副反応を抑えるための処理を適宜行うことができる。また、糖ペプチドまたは糖タンパク質のペプチド鎖のアミノ酸の残基数が多いものは、酵素的切断等により、ペプチド鎖を切断して用いることが好ましい。例えば、質量分析用の試料を調製する場合、ペプチド鎖のアミノ酸残基数は３０以下が好ましく、２０以下がより好ましく、１５以下がさらに好ましい。一方、糖鎖が結合しているペプチドの由来を明確とすることが求められる場合には、ペプチド鎖のアミノ酸残基数は２以上が好ましく、３以上がより好ましい。
糖ペプチドまたは糖タンパク質のペプチド鎖を切断する場合の消化酵素としては、トリプシン、Ｌｙｓ‐Ｃ、アルギニンエンドペプチダーゼ、キモトリプシン、ペプシン、サーモリシン、プロテイナーゼＫ、プロナーゼＥ等が用いられる。これらの消化酵素の２種以上を組み合わせて用いてもよい。ペプチド鎖の切断の際の条件は特に限定されず、使用する消化酵素に応じた適宜のプロトコールが採用される。この切断の前に、試料中のタンパク質およびペプチドの変性処理やアルキル化処理が行われてもよい。変性処理やアルキル化処理の条件は特に限定されない。また、酵素的切断では無く、化学的切断等によりペプチド鎖を切断してもよい。上述の糖鎖の遊離、副反応の抑制、またはペプチドの切断の処理は、分析対象のラクトンを所望の精度で定量できるならば、第１アミド化反応の前に行ってもよい。
ステップＳ１００３が終了したら、ステップＳ１００５に進む。
ステップＳ１００３では、分析対象のラクトンがアミド化されて安定化された。本実施形態の分析用試料の調製方法および分析方法では、ステップＳ１００３でアミド化されなかったシアル酸を、結合様式特異的に修飾し、分析対象のラクトンを含むシアル酸と区別して分析する。
（ラクトン化反応）
ステップＳ１００５において、試料をラクトン化のための反応溶液（以下、ラクトン化反応溶液と呼ぶ）と接触させ、糖鎖に含まれるシアル酸の少なくとも一部をラクトン化するラクトン化反応を行う（以下、ラクトン化反応と記載した場合、特に言及が無い限り、ステップＳ１００５のラクトン化反応を指す）。ラクトン化反応では、ラクトン化されないシアル酸の一部にラクトン化とは異なる修飾をする。ラクトン化反応において、α２，３－シアル酸、α２，８－シアル酸およびα２，９－シアル酸が好適にラクトン化される。
ラクトン化反応溶液は、脱水縮合剤と、アルコール、アミンまたはこれらの塩を含む求核剤とを含む。シアル酸の結合様式に基づいて選択的に脱水反応または求核反応を起こすように、脱水縮合剤および求核剤の種類や濃度が調整される。
α２，３－シアル酸のカルボキシ基の分子内脱水で生じるラクトンは六員環であり、α２，６－シアル酸のカルボキシ基の分子内脱水により生じ得るラクトンは七員環となる。従って、七員環より安定な六員環を生じるα２，３－シアル酸はα２，６－シアル酸よりラクトン化されやすい。また、α２，３－シアル酸のカルボキシ基はα２，６－シアル酸のカルボキシ基に比べて立体障害が比較的大きい位置にあるため、大きな分子は、α２，６－シアル酸と比べると、α２，３－シアル酸とは反応しづらい。このようなシアル酸の結合様式による分子構造の違いに基づいて、シアル酸の結合様式により異なる修飾がされるように脱水縮合剤および求核剤の種類や濃度が調整される。
ラクトン化反応溶液に含まれる求核剤（以下、第２求核剤と呼ぶ）は、第１アミド化反応溶液に含まれる求核剤（以下、第１求核剤と呼ぶ）とは異なる。本実施形態の分析用試料の調製方法で得られた分析用試料を質量分析で分析する場合、第１求核剤と第２求核剤は質量が異なるように選択される。本実施形態の分析用試料の調製方法で得られた分析用試料をクロマトグラフィで分析する場合、第１求核剤と第２求核剤とは異なる置換基を有することがクロマトグラフィで互いに分離しやすくするために好ましい。
（ラクトン化反応における脱水縮合剤）
脱水縮合剤は、カルボジイミドを含むことが好ましい。カルボジイミドを用いると、脱水縮合剤としてホスホニウム系脱水縮合剤（いわゆるBOP試薬）やウロニウム系脱水縮合剤を用いた場合に比べて、立体障害が大きい部位に存在するカルボキシ基がアミド化されにくいからである。カルボジイミドの例としては、Ｎ，Ｎ’‐ジシクロへキシルカルボジイミド(DCC)、Ｎ‐（３‐ジメチルアミノプロピル）‐Ｎ’‐エチルカルボジイミド(EDC)、Ｎ，Ｎ’‐ジイソプロピルカルボジイミド(DIC)、１‐ｔｅｒｔ‐ブチル‐３‐エチルカルボジイミド(BEC)、Ｎ，Ｎ’‐ジ‐ｔｅｒｔ‐ブチルカルボジイミド、１，３‐ジ‐ｐ‐トルイルカルボジイミド、ビス（２，６‐ジイソプロピルフェニル）カルボジイミド、ビス（トリメチルシリル）カルボジイミド、１，３‐ビス（２，２‐ジメチル‐１，３‐ジオキソラン‐４‐イルメチル）カルボジイミド(BDDC)や、これらの塩が挙げられる。
（ラクトン化反応における添加剤）
脱水縮合剤による脱水縮合を促進させ、かつ副反応を抑制するために、カルボジイミドに加えて、求核性の高い添加剤を用いることが好ましい。求核性の高い添加剤としては、１‐ヒドロキシベンゾトリアゾール(HOBt)、１‐ヒドロキシ‐７‐アザ‐ベンゾトリアゾール(HOAt)、４‐（ジメチルアミノ）ピリジン(DMAP)、２‐シアノ‐２‐（ヒドロキシイミノ）酢酸エチル(Oxyma)、Ｎ‐ヒドロキシ‐スクシンイミド(HOSu)、６‐クロロ‐１‐ヒドロキシ‐ベンゾトリアゾール(Cl-HoBt)、Ｎ‐ヒドロキシ‐３，４‐ジヒドロ‐４‐オキソ‐１，２，３‐ベンゾトリアジン(HOOBt)等が好ましく用いられる。
（ラクトン化反応における求核剤（第２求核剤））
第２求核剤として用いられるアミンは、炭素原子を２個以上含む第一級または第二級のアルキルアミンを含むことが好ましい。第一級のアルキルアミンは、エチルアミン、プロピルアミン、イソプロピルアミン、ブチルアミン、ｓｅｃ‐ブチルアミン、ｔｅｒｔ‐ブチルアミン等が好ましい。第二級アルキルアミンは、ジメチルアミン、エチルメチルアミン、ジエチルアミン、プロピルメチルアミン、イソプロピルメチルアミン等が好ましい。α２，３－シアル酸のカルボキシ基のように立体障害が大きい部位に存在するカルボキシ基がアミド化されにくいようにする観点から、イソプロピルアミンのような分枝アルキル基を有するアミンを用いることが好ましい。ラクトン化反応溶液の求核剤にアミンを用いた場合、シアル酸の結合様式に基づいて、α２，６－シアル酸等の一部のシアル酸のカルボキシ基がアミド化される。
第２求核剤として用いられるアルコールは、特に限定されず、例えばメタノールおよびエタノール等を用いることができる。ラクトン化反応溶液の求核剤にアルコールを用いた場合、シアル酸の結合様式に基づいて、α２，６－シアル酸等の一部のシアル酸のカルボキシ基がエステル化される。
なお、第２求核剤は、上述の求核剤の塩を含んでもよい。
（脱水縮合剤およびアミンの濃度について）
ラクトン化反応溶液の脱水縮合剤の濃度は、例えば、１ｍＭ～５Ｍが好ましく、１０ｍＭ～３Ｍがより好ましい。カルボジイミドとHOAtやHOBt等の求核性の高い添加剤とを併用する場合は、それぞれの濃度が上記範囲であることが好ましい。ラクトン化反応溶液のアミンの濃度は、０．０１～２０Ｍが好ましく、０．１Ｍ～１０Ｍがより好ましい。ラクトン化反応の際の反応温度は、－２０℃～１００℃程度が好ましく、－１０℃～５０℃がより好ましい。
（ラクトン化反応を行う相）
ラクトン化反応は、液相でも固相でも行うことができる。試料とラクトン化反応溶液とを接触させることができれば、ラクトン化反応を起こす際の試料の状態は特に限定されないが、第１アミド化反応に供した試料に含まれる糖鎖を固相担体に結合または吸着された状態でラクトン化反応溶液を接触させることが好ましい。
固相で反応を行う場合、固相担体としては、糖鎖、糖ペプチド、糖タンパク質等を固定可能なものであれば、特に制限なく用いることができる。例えば、糖ペプチドや糖タンパク質を固定するためには、エポキシ基、トシル基、カルボキシ基、アミノ基等をリガンドとして有する固相担体を用いることができる。また、糖鎖を固定するためには、ヒドラジド基やアミノオキシ基等をリガンドとして有する固相担体を用いることができる。また、糖鎖を親水性相互作用クロマトグラフィ（以下、ＨＩＬＩＣと呼ぶ）用の担体、すなわち固定相に吸着させることも好ましく、このＨＩＬＩＣ用の担体はアミド基を含むことがさらに好ましい。
試料を固相担体に固定した状態で反応を行うことにより、反応溶液の除去や脱塩精製がより容易となり、試料の調製を簡素化できる。また、固相担体を用いる場合、糖タンパク質や糖ペプチドの状態で試料を固定し、ラクトン化反応後に、PNGase F等のグリコシダーゼ等による切断を行えば、ラクトン化反応後の試料を遊離糖鎖として回収することもできる。
ラクトン化反応後の試料は、必要に応じて、公知の方法等により精製、脱塩、可溶化、濃縮、乾燥等の処理が行われてもよい。後述する第２アミド化反応の前後においても同様である。
固相担体からの試料の遊離については、後述の第２アミド化反応について述べる条件を採用できる。試料を固相担体に固定した状態で反応を行うことにより、ラクトン化反応後のラクトン化反応溶液の除去等が容易となり、効率よくシアル酸の修飾を行うことができる。
ステップＳ１００５が終了したら、ステップＳ１００７に進む。
（第２アミド化反応）
ステップＳ１００７において、試料を、反応溶液（以下、第２アミド化反応溶液と呼ぶ）と接触させ、ステップＳ１００５でラクトン化されたシアル酸をアミド化する第２アミド化反応が行われ、分析用試料が取得される。
第２アミド化反応溶液の組成、ｐＨおよび反応時間は、第１アミド化反応と同様の条件から選択される。
なお、第２アミド化反応には脱水縮合剤は必要ではないが、第２アミド化反応溶液に脱水縮合剤が含まれていてもよい。例えば、ステップＳ１００５で試料に加えたラクトン化反応溶液を除去しないで、アンモニア、アミンまたはこれらの塩を加えることにより、第２アミド化反応溶液を調製してもよい。このように、第２アミド化反応では、簡便な操作で生成されたラクトンを安定化させ得る。
第２アミド化反応溶液に含まれる求核剤（第３求核剤と呼ぶ）は、上述の第１求核剤および第２求核剤の両方と異なる。本実施形態の分析用試料の調製方法で得られた分析用試料を質量分析で分析する場合、第１求核剤、第２求核剤および第３求核剤は全て異なる質量を有するように選択される。質量分析の質量分解能に応じて、得られた修飾体に対し精度よく質量分離が行われるように第１求核剤、第２求核剤および第３求核剤が選択される。第１求核剤、第２求核剤および第３求核剤は別の物質でもよいし、安定同位体により質量を異ならせた同じ物質でもよい。また、iTRAQに代表されるようなアイソバリック（isobaric）なタグでも良い。この場合、第１段階の質量分析と第２段階の質量分析の間に行われる開裂により得られるプロダクトイオンのｍ／ｚが異なるように当該タグが設計されているため、シアル酸の結合様式やラクトン体の識別はタンデム質量分析（MS/MS）により行うことができる。このように、第１求核剤、第２求核剤および第３求核剤によりそれぞれ修飾された修飾体を２以上の段階により質量分析する際に、いずれかの段階で異なるｍ／ｚによりこれらの修飾体を分離することができればよい。本実施形態の分析用試料の調製方法で得られた分析用試料をクロマトグラフィで分析する場合、第１求核剤、第２求核剤および第３求核剤は異なる置換基を有することがクロマトグラフィで互いに分離しやすくするために好ましい。
（第２アミド化反応を行う相）
第２アミド化反応は、液相でも固相でも実施できる。試料を固相に固定した状態で第２アミド化反応が行われる場合、ラクトン化反応に供した試料を固相に固定した状態を維持して、第２アミド化反応を行ってもよい。また、試料をラクトン化反応に供した後、固相に固定して第２アミド化反応を行ってもよい。
固相で第２アミド化反応を行う場合、固相担体としては、ラクトン化反応に関して上述したものと同様のものを使用できる。固相担体への試料の固定については、ラクトン化反応に関して上述した条件を用いることができる。第２アミド化反応を固相で行う場合、固相担体に固定された試料に、第２アミド化反応溶液を作用させてアミド化を行った後は、化学的手法や酵素反応等により、担体から試料を遊離させて回収すればよい。例えば、担体に固定された糖タンパク質や糖ペプチドを、PNGase F等のグリコシダーゼやトリプシン等の消化酵素により酵素的に切断し回収してもよく、ヒドラジド基を有する固相担体に結合している糖鎖を、弱酸性溶液により遊離させて回収してもよい。ＨＩＬＩＣでは、アセトニトリル等を溶媒とした第２アミド化反応溶液により第２アミド化反応を行い、水等の水系溶液により試料を溶出することができる。
上述した調製方法により、試料に元々含まれていたラクトン構造を有するシアル酸は第１アミド化反応において第１求核剤により修飾される。α２，６－シアル酸等のラクトン化されにくい結合様式のシアル酸はラクトン化反応において第２求核剤により修飾される。α２，３－、α２，８－およびα２，９－シアル酸等のラクトン化されやすい結合様式のシアル酸であって、試料において元々ラクトン構造を有しないものはラクトン化反応においてラクトン化され、第２アミド化反応において第３求核剤により修飾される。
ステップＳ１００７が終了したら、ステップＳ１００９に進む。
ステップＳ１００９において、試料を質量分析およびクロマトグラフィの少なくとも一つにより分析する。上述の第１アミド化反応、ラクトン化反応および第２アミド化反応により、各反応でラクトン化以外の修飾を受けた糖鎖はそれぞれ質量が異なっている。従って、質量分析によりこれらの糖鎖を、分析対象のラクトン構造の有無およびシアル酸の結合様式に基づいて分離することができる。
質量分析におけるイオン化の方法は特に限定されず、マトリックス支援レーザ脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）法、エレクトロスプレー（ＥＳＩ）法、ナノエレクトロスプレーイオン化（ｎａｎｏ－ＬＳＩ）法等を用いることができる。イオン化の方法は特にＭＡＬＤＩ法が好ましい。質量分析におけるイオン化では、正イオンモードおよび負イオンモードのいずれを用いてもよい。質量分析は、多段階で行ってもよく、これによりシアル酸の結合様式以外の糖鎖の構造や、ペプチド鎖の構造を好適に解析することができる。
クロマトグラフィで分析を行う場合、液体クロマトグラフィが好ましい。液体クロマトグラフィに用いるカラムは特に限定されず、Ｃ３０、Ｃ１８、Ｃ８、Ｃ４等の疎水性逆相カラムやカーボンカラム、ＨＩＬＩＣ用の順相カラムなどを適宜用いることができる。液体クロマトグラフィを行った後、質量分析により測定を行うことが複数回の分離により精密に試料中の成分の分析を行う上で好ましい。この場合、液体クロマトグラフからの溶出液をオンライン制御で質量分析計において直接ＥＳＩ等によりイオン化することがより好ましい。
質量分析またはクロマトグラフィにより得られたデータが解析され、試料に元々含まれていたラクトン構造を含むシアル酸の定量等が行われる。分析対象のラクトン構造を含むシアル酸を有する糖鎖の強度、シアル酸を含む糖鎖のうち分析対象のラクトン構造を含むシアル酸を有するものの割合、またはα２，３－シアル酸を含む糖鎖のうち、分析対象のラクトン構造を含むα２，３－シアル酸を有するものの割合等を算出することができる。α２，８－シアル酸、α２，９－シアル酸についても同様である。質量分析またはクロマトグラフィにより得られたデータの解析方法は特に限定されない。
ステップＳ１００９が終了したら、処理を終了する。
（糖ペプチドおよび糖タンパク質の副反応の抑制について）
糖ペプチドまたは糖タンパク質に第１アミド化反応溶液、ラクトン化反応溶液および第２アミド化反応溶液を加え、上述のようにシアル酸を修飾した場合、糖ペプチドまたは糖タンパク質に含まれるアミノ酸の側鎖や、主鎖の末端にあるアミノ基やカルボキシ基との間で分子内脱水縮合等の副反応が起こる場合がある。この場合、分析対象の糖鎖に対応するマススペクトルのピークが分かれてしまい、解析が難しくなってしまう問題があった。
発明者らは、ペプチド部分の副反応は主にアミノ基の存在に由来することを明らかにし、シアル酸修飾の前にアミノ基を化学修飾などで先にブロックしておくことで、シアル酸修飾時にペプチド部分の副反応を抑制出来ることを明らかにした。詳細は、以下の文献を参照されたい：Takashi Nishikaze, Sadanori Sekiya, Shinichi Iwamoto, Koichi Tanaka. “A Universal Approach to linkage-Specific Derivatization for Sialic Acids on Glycopeptides,” Journal of The American Society for Mass Spectrometry, 2017年6月, Volume 28, Issue 1 Supplement, ポスター番号MP091。本実施形態に係るラクトン化反応等による修飾もこれと同様に糖ペプチドおよび糖タンパク質に用いることができる。例えば、糖ペプチドまたは糖タンパク質に対してジメチルアミド化やグアニジル化などのアミノ基をブロックする反応を行い、ラクトン化反応および第２アミド化反応を行う。このとき、シアル酸の結合様式に応じてラクトンを形成させる手法を用いれば、シアル酸の結合様式を識別することもできる。
なお、糖ぺプチドの中にはアミノ酸配列に基づく特性上副反応を生じ難いものがある。例えば、ＩｇＧのＦｃ領域をトリプシン等の消化酵素により消化することによって生成した糖ペプチドは、リジンを有さず、Ｎ末端のアミノ基も脱水縮合剤の存在下で速やかに環化脱水してピログル化する。その結果、アミノ基が存在しなくなるので、ジメチルアミド化やグアニジル化など事前のアミノ基のブロッキングは必要ない。このような糖ペプチドに関しては、アミノ基のブロッキングを行わずに第１アミド化反応、ラクトン化反応および第２アミド化反応を行うことにより解析に足るマススペクトルを得ることが可能となる。
（分析用試料の調製用キットについて）
本実施形態の分析用試料の調製方法に好適に用いられる分析用試料の調製用キット（以下、調製用キットと呼ぶ）が提供される。調製用キットは、第１アミド化反応における第１求核剤を含む溶液を含めばその内容は特に限定されず、試薬や、試薬以外の質量分析に用いられる任意の消耗品を含むことができる。調製用キットを用いて分析用試料を調整することにより、より効率的に分析用試料を調整することができる。
－第２実施形態－
第２実施形態の分析用試料の調製方法は、第１実施形態の分析用試料の調製方法と同様の流れで行われるが、第１アミド化反応に供した試料に対し、シアル酸の結合様式を区別せずに、言い換えればシアル酸の結合様式について非特異的に、シアル酸の修飾を行う反応（以下、非特異的修飾反応と呼ぶ）を行う点が第１実施形態と異なっている。
図２は、本実施形態の分析用試料の調製方法に係る分析方法の流れを示すフローチャートである。ステップＳ２００１およびＳ２００３は、上述の実施形態におけるステップＳ１００１およびＳ１００３と同様であるため説明を省略する。ステップＳ２００３が終了したら、ステップＳ２００５に進む。
ステップＳ２００５において、第１アミド化反応に供した試料を、非特異的修飾反応のための反応溶液（以下、非特異的修飾反応溶液と呼ぶ）と接触させ、第１アミド化反応の前に試料に含まれていた、ラクトン構造を有しないシアル酸を修飾する非特異的修飾反応を行う。非特異的修飾反応では、シアル酸の結合様式に関係なく、試料に含まれる各シアル酸が修飾され、分析用試料が得られる。
非特異的修飾反応溶液は、脱水縮合剤と、アルコール、アンモニア、アミンまたはこれらの塩を含む求核剤とを含む。
非特異的修飾反応溶液に含まれる求核剤（以下、第４求核剤と呼ぶ）は、第１アミド化反応溶液に含まれる第１求核剤とは異なる。本実施形態の分析用試料の調製方法で得られた分析用試料を質量分析で分析する場合、第１求核剤と第４求核剤は質量が異なるように選択される。質量分析の質量分解能に応じて、得られた修飾体が精度よく質量分離が行われるように第１求核剤および第４求核剤が選択される。上述のように第１求核剤および第４求核剤は別の物質でもよいし、安定同位体やアイソバリックなタグ等により質量を異ならせた同じ物質でもよい。本実施形態の分析用試料の調製方法で得られた分析用試料をクロマトグラフィで分析する場合、第１求核剤と第４求核剤とは異なる置換基を有することがクロマトグラフィで互いに分離しやすくするために好ましい。
（非特異的修飾反応における脱水縮合剤）
脱水縮合剤としては、立体障害が大きい部位に存在するカルボキシ基に対しても、高い反応効率を示すものが好ましく、ホスホニウム系脱水縮合剤や、ウロニウム系脱水縮合剤が好ましい。
ホスホニウム系脱水縮合剤としては、（ベンゾトリアゾール‐１‐イルオキシ）トリス‐（ジメチルアミノ）ホスホニウム(BOP)、ベンゾトリアゾール‐１‐イルオキシトリス（ピロリジノ）ホスホニウムヘキサフルオロフォスフェイト(PyBOP)、ブロモトリス(ジメチルアミノ)ホスホニウムヘキサフルオロホスフフェイト(BroP)、ブロモトリス（ピロリジノ）ホスホニウムヘキサフルオロフォスフェイト(PyBroP)、（７‐アザベンゾトリアゾール‐１‐イルオキシ）トリス（ピロリジノ）ホスホニウムヘキサフルオロフォスフェイト(PyAOP)、クロロ‐トリス‐ピロリジノホスホニウムヘキサフルオロフォスフェイト(PyCloP)等が挙げられる。これらは、「ＢＯＰ試薬」と総称されるものであり、立体障害が大きい部位に存在するカルボキシ基に対しても、高い反応効率をもたらす。そのため、α２，３‐シアル酸のカルボキシ基のように、立体障害が大きい部位に対しても、高い反応効率でアミド化を行うことができる。
ウロニウム系脱水縮合剤としては、（１‐シアノ‐２‐エトキシ‐２‐オキソエチリデンアミノオキシ）ジメチルアミノ‐モルホリノ‐カルベニウムヘキサフルオロリン酸塩(COMU)、２‐（１Ｈ‐ベンゾトリアゾール‐１‐イル）‐１，１，３，３ヘキサフルオロフォスフェイト(HBTU)、２‐（７‐アザベンゾトリアゾール‐１‐イル）‐１，１，３，３ヘキサフルオロフォスフェイト(HATU)、２‐（１Ｈ‐ベンゾトリアゾール‐１‐イル）‐１，１，３，３‐テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレイト(TBTU)、２‐（５‐ノルボルネン‐２，３‐ジカルボキシイミド）‐１，１，３，３‐テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレイト(TNTU)、Ｏ‐（Ｎ‐スクシミジル）‐１，１，３，３‐テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレイト(TSTU)等が挙げられる。これらのウロニウム塩の中では、COMUが特に好ましい。
上記の中でも、ラクトンのアミド化効率を高める観点からは、ホスホニウム系脱水縮合剤が好ましく用いられる。また、反応を加速させるために、N-メチルモルホリン等の塩基を、反応系全体に対して０．０１～８０重量％程度の濃度となるように加えることが望ましい。反応系に上記濃度範囲の塩基を加えることにより、反応効率が向上するとともに、副反応や他の試薬の析出等を抑制できる。反応系中に塩基としてN-メチルモルホリンが含まれる場合、その濃度は１～５０重量％が好ましい。アミド化の条件（反応温度や反応時間等）は特に限定されず、公知のシアル酸のアミド化の条件等をそのまま適用できる。
（ラクトン化反応における求核剤（第４求核剤））
α２，３‐シアル酸のカルボキシ基は立体障害が大きい部位に存在するため、求核反応効率を高めるためには、求核剤として用いられるアミンとして分子体積の小さいアミンを用いることが好ましい。非特異的修飾反応に用いられる好ましいアミンの例としては、メチルアミン、エチルアミン、プロピルアミン、イソプロピルアミン、ブチルアミン、ｓｅｃ‐ブチルアミン、ｔｅｒｔ‐ブチルアミン等の第一級アルキルアミン；ジメチルアミン、エチルメチルアミン、ジエチルアミン、プロピルメチルアミン、イソプロピルメチルアミン等の第二級アルキルアミンが挙げられる。アルキルアミンの炭素数は５以下が好ましく、３以下がより好ましい。上記アミンの中でも、第一級アルキルアミンが好ましく、第一級直鎖アルキルアミンがより好ましく、メチルアミンまたはエチルアミンが特に好ましい。
非特異的修飾反応に用いられる求核剤としては、反応性の高さおよび副反応の少なさから、メチルアミン塩酸塩またはエチルアミン塩酸塩が特に好ましい。中でも、メチルアミン塩酸塩またはエチルアミン塩酸塩を、PyAOPおよびＮ‐メチルモルホリンと共に用いることがさらに好ましい。
求核剤としてアルコールを用いる場合は、特に限定されず、例えばメタノールおよびエタノール等を用いることができる。非特異的修飾反応溶液の求核剤にアルコールを用いた場合、シアル酸のカルボキシ基がエステル化される。
なお、第４求核剤は、上述の求核剤の塩を含んでもよい。また、脱水縮合剤を用いずに非特異的修飾反応を行ってもよい。例えば、DMSOを溶媒とした溶液中でエステル合成用アルキル化剤であるヨードメタンを反応させることでシアル酸のカルボキシ基をメチルエステル化することができる。詳細は、パウエルらの論文（Powell, A. K.; Harvey, D. J. Rapid Commun. Mass Spectrom. 1996, 10 (9), 1027-1032）を参照されたい。他の例として、エステル合成用アルキル化剤であるMTT試薬を用いたメチルエステル化を利用してもよい。詳細は、三浦らの文献（Miura, Y.; Shinohara, Y.; Furukawa, J.; Nagahori, N.; Nishimura, S.-I. Chem. Eur. J. 2007, 13 (17), 4797-4804）を参照されたい。これらのエステル合成用アルキル化剤を用いた非特異的修飾反応は、固相および液相のいずれの相でも行うことができる。
（脱水縮合剤およびアミンの濃度について）
非特異的修飾反応溶液の脱水縮合剤の濃度は、例えば、１ｍＭ～５Ｍが好ましく、１０ｍＭ～３Ｍがより好ましい。非特異的修飾反応溶液のアミンの濃度は、０．０１～２０Ｍが好ましく、０．１Ｍ～１０Ｍがより好ましい。
（非特異的修飾反応を行う相）
非特異的修飾反応は、上述のラクトン化反応と同様、液相でも固相でも実施できる。
固相で非特異的修飾反応を行う場合、固相担体としては、ラクトン化反応に関して上述したものと同様のものを使用できる。固相担体への試料の固定については、ラクトン化反応に関して上述した条件を用いることができる。固相担体からの試料の遊離については、第２アミド化反応について上述した条件を採用できる。試料を固相担体に固定した状態で反応を行うことにより、非特異的修飾反応後の非特異的修飾反応溶液の除去や脱塩精製等が容易となり、効率よくシアル酸の修飾を行うことができる。
上述した調製方法により、試料に元々含まれていたラクトン構造を有するシアル酸は第１アミド化反応において第１求核剤により修飾される。試料に元々含まれていたラクトン構造を有しないシアル酸は非特異的修飾反応において第４求核剤により修飾される。
ステップＳ２００５が終了したら、ステップＳ２００７に進む。ステップＳ２００７は、上述の実施形態におけるステップＳ１００７と同様であるため説明を省略する。
上述の第１および第２実施形態では、試料に元々含まれていたラクトン構造を含むシアル酸をアミド化した後、他のシアル酸に対しアミド化またはエステル化により修飾を行ったが、完全メチル化以外の方法でシアル酸を修飾するのであれば、その方法は特に限定されない。完全メチル化では糖鎖の全てのヒドロキシ基がメチル化されてしまうが、本発明ではこのような制約がなく、行う分析に適した修飾を適宜行うことができる。
本発明は上記実施形態の内容に限定されるものではない。本発明の技術的思想の範囲内で考えられるその他の態様も本発明の範囲内に含まれる。
以下に、本実施形態に係る実施例を示すが、本発明は下記の実施例に限定されるものではない。なお、以下において、％の記載は特に言及が無い限り重量％を示す。
＜評価用糖鎖試料の作成＞
上述の実施形態の分析用試料の調製方法を評価するため、濃度が既知のシアル酸ラクトンを含む糖鎖試料を作成した。作成した糖鎖試料は、以下のLacA2、33A2および66A2を等モルずつ含む。
LacA2: ラクトン化されたα２，３－シアル酸を2つ含むA2型糖鎖（A2 glycan）
33A2: ラクトン化されていないα２，３－シアル酸を2つ含むA2 glycan
66A2: α２，６－シアル酸を2つ含むA2 glycan
各糖鎖試料の構造
図３（Ａ）は、LacA2の糖鎖の構造を模式的に示す概念図である。LacA2は、N-アセチル-D-グルコサミン（GlcNAc）およびマンノース（Man）からなる基本型の構造と、2つの側鎖とを備える。2つの側鎖にはそれぞれGlcNAc、ガラクトース（Gal）およびシアル酸（NeuNAc）が結合されている。非還元末端にあるα２，３－シアル酸と当該シアル酸が結合しているガラクトースとの結合部分には、ラクトン構造が形成されており、この点を二重線Ｂ１で示した。シアル酸の結合様式がα２，３－であることは、シアル酸を、当該シアル酸が結合するガラクトースに対して左下に図示することにより表した。
図３（Ｂ）は、33A2の糖鎖の構造を模式的に示す概念図である。33A2は、LacA2と同様の構造を備えるが、ラクトン構造が形成されていない点がLacA2とは異なる。
図３（Ｃ）は、66A2の糖鎖の構造を模式的に示す概念図である。66A2は、33A2と同様の構造を備えるが、非還元末端にα２，３－シアル酸ではなくα２，６－シアル酸が存在する点が33A2とは異なる。シアル酸の結合様式がα２，６－であることは、シアル酸を、当該シアル酸が結合するガラクトースの左上に図示することにより表した。
各糖鎖（A2 glycan）の作成
α２，３－シアリルグリコペプチド（SGP）およびα２，６－SGP（伏見製薬所）からPNGase F（SIGMA）を用いてA2型糖鎖を遊離した。α２，３－SGPおよびα２，６－SGP 1nmol/μＬを20μＬ含むチューブに対して、PNFase F 0.25U/μＬを10μＬ加え、タッピングと遠心を行い、37℃、オーバーナイトでインキュベーションした。
遊離した糖鎖はStageTip Carbonで脱塩処理した。Stage Tip Carbonは、エムポアディスクカーボン（３Ｍ製）を、直径約1mmに切り抜き、200μＬのチップに詰めたカーボンカラムである。Stage Tip Carbonに100μＬのACNを加えた後、遠心により排出した。その後、80% アセトニトリル（ACN） 0.1% トリフルオロ酢酸（TFA）溶液、および水を用い、同様の操作を順に行い、カラム担体の洗浄と平衡化を行った。その後、酵素反応溶液をカラムに加え、遠心により溶液を排出した。さらに0.1% TFA溶液150μＬを加えた後、遠心により排出することを3回繰り返し、洗浄を行った。最後に、20μＬの60% ACN 0.1% TFA溶液を加え、遠心により排出することを2回繰り返し、糖鎖を溶出させた。2回分の溶出液を合わせて、SpeedVac（サーモフィッシャーサイエンティフィック）により溶媒を除き乾固させた。乾固したら各試料に200μＬのH2Oを入れて再溶解し、100pmol/μＬとした。一部を10倍希釈し、10pmol/μＬとした。
LacA2, 33A2および66A2の等モル混合物の作成
33A2 20pmol をチューブ内に配置し乾固させ、結合様式特異的な修飾を行うためのイソプロピルアミン（iPA）を含むラクトン化反応溶液（2M iPA-HCl, 500mM EDC-HCl, 500mM HOBt,溶媒:DMSO）を20μＬ加え、2000rpmで攪拌しながら常温で一時間反応させた。この条件では、33A2は完全にラクトン化される。反応溶液にACNを120μＬ加えて希釈し、合計で140μＬにしてアミド精製に供した。
アミド精製を以下のように行った。アミドチップ（ジーエルサイエンス）に100μＬのH2Oを加えた後、遠心により排出した。その後、90% ACNを用い、同様の操作を順に行った。その後、ACNにより希釈された上記反応溶液をアミドチップに加え、遠心により溶液を排出した。さらに90% ACN 150μＬを加えた後、遠心により排出することを2回繰り返し、洗浄を行った。最後に、20μＬのH2Oを加え、遠心により排出することを2回繰り返し、糖鎖を溶出させた。2回分の溶出液を合わせて、SpeedVacにより溶媒を除き乾固させた。
アミド精製後の試料を全量33A2および66A2がそれぞれ20pmol入ったチューブに移した。これにより、LacA2、33A2および66A2が略等モルずつ入った評価用糖鎖試料が得られ、SpeedVacで乾固させた。
（比較例１）
＜シアル酸の修飾＞
比較例１では、第１アミド化を行わずに、シアル酸の結合様式特異的アミド化を行った。LacA2、33A2および66A2が等モルずつ含まれる評価用糖鎖試料に上記ラクトン化反応溶液を20μＬ加え、2000rpmで攪拌しながら常温で１時間反応させた。その後、第２アミド化反応溶液として35% エチルアミン水溶液を20μＬ加えてボルテックスミキサーにより攪拌した。その後、得られた反応溶液にTFAを含むACN溶液を160μＬ加え、合計で200μＬにした後アミド精製に供した。
アミド精製を以下のように行った。アミドチップ（ジーエルサイエンス）に100μＬのH2Oを加えた後、遠心により排出した。その後、90% ACN 0.1% TFA溶液を用い、同様の操作を行った。その後、TFAを含むACN溶液により希釈された上記反応溶液をアミドチップに加え、遠心により溶液を排出した。さらに90% ACN 150μＬを加えた後、遠心により排出することを2回繰り返し、洗浄を行った。最後に、20μＬのH2Oを加え、遠心により排出することを2回繰り返し、糖鎖を溶出させた。2回分の溶出液を合わせて、SpeedVacにより溶媒を除き乾固させた。
次にアミド精製に供した試料をカーボン精製に供した。自作したStage Tip Carbonに50μＬのACNを加えた後、遠心により排出した。その後、80% ACN 0.1% TFA溶液、およびH2Oを用い、同様の操作を順に行い、カラム担体の洗浄と平衡化を行った。その後、試料を0.1% TFA 20μＬに再溶解したものをカラムに加え、遠心により溶液を排出した。さらに0.1% TFA 50μＬを加えた後、遠心により排出することを3回繰り返し、洗浄を行った。最後に、10μＬの60% ACN 0.1% TFA溶液を加え、遠心により排出することを2回繰り返し、糖鎖を溶出させた。2回分の溶出液を合わせて、SpeedVacにより溶媒を除き乾固させた。
＜質量分析＞
乾固させた糖鎖を10μＬのH2Oによく再溶解させた。再溶解により得られた溶液0.5 μＬをμフォーカスプレート（Hudson Surface Technology）（以下単にプレートと呼ぶ）に滴下した。マトリックスとして50% ACNに溶解させた100mM 3-アミノキノリン/p-クマル酸（3AQ/CA）, 2mM リン酸二水素アンモニウム（ADP）を0.5μＬ加え、プレートごとヒートブロック上で75℃、1.5時間反応させ3AQによる糖鎖の還元末端のラベル化を行った。反応終了後、プレートを室温まで戻し、MALDI-QIT-TOF-MS （AXIMA-Resonance（Shimadzu/Kratos）） を用い負イオンモードで飛行時間型の質量分析を行った。
得られたマススペクトルを図４に示す。m/z 2527.9のピークはシアル酸がイソプロピルアミド化されたものに相当し、66A2に対応するピークである。m/z 2499.9はシアル酸がエチルアミド化されたものに相当し、LacA2と33A2が両方ともエチルアミド化され、共に等しいm/zを有する物質として検出されたと解釈できる。従って、本比較例の方法では、試料に元々含まれていたラクトン構造を含む糖鎖と、ラクトン構造を含まない糖鎖とを区別できていない。
（実施例１－１）
＜シアル酸の修飾＞
実施例１－１では、試料を第１アミド化反応に供した後、結合様式特異的アミド化（ラクトン化反応および第２アミド化反応）を行った。LacA2、33A2および66A2が等モルずつ含まれている評価用糖鎖試料に第１アミド化反応溶液として10% メチルアミン水溶液を20μＬ加え、よく攪拌し再溶解させた。再溶解により得られた溶液をSpeedVacで乾固し溶媒を除いた。乾固された試料に上記ラクトン化反応溶液を20μＬ加え、2000rpmで攪拌しながら常温で１時間反応させた。得られた反応溶液に第２アミド化反応溶液として35% エチルアミン水溶液を20μＬ加えてボルテックスミキサーにより攪拌した。反応溶液にTFAを含むACN溶液を160μＬ加え、合計で200μＬとしてアミド精製、カーボン精製および質量分析に供した。アミド精製、カーボン精製および質量分析は比較例１と同様に行った。
得られたマススペクトルを図５に示す。m/z 2527.9のピークはシアル酸がイソプロピルアミド化されたものに相当し、66A2に対応するピークである。m/z 2499.9のピークはシアル酸がエチルアミド化されたものに相当し、33A2に対応するピークである。m/z 2471.9のピークはシアル酸がメチルアミド化されたものに相当し、LacA2に対応するピークである。このように、ラクトンを予めアミド化してからシアル酸結合様式特異的修飾を行うことで、試料において元々ラクトン化されていたα２，３－シアル酸、元々ラクトン化されていなかったα２，３－シアル酸、およびα２，６－シアル酸に対してそれぞれ質量の異なる修飾体を形成することができ、質量分析でそれぞれのピークを識別することが出来る。
（実施例１－２）
＜シアル酸の修飾＞
実施例１－２では、試料を第１アミド化反応に供した後、試料を固相担体に結合させ、固相担体上で結合様式特異的アミド化（ラクトン化反応および第２アミド化反応）を行った。LacA2、33A2および66A2が等モルずつ含まれている評価用糖鎖試料に第１アミド化反応溶液として10% メチルアミン水溶液を20μＬ加え、よく攪拌し再溶解させた。再溶解により得られた溶液をSpeedVacで乾固し溶媒を除いた。得られた試料を20μＬのH2Oに再溶解し、ヒドラジド基をリガンドとして有する固相担体（糖鎖精製キットBlotGlyco（住友ベークライト）に含まれるもの、以下同様）に結合させた。糖鎖の結合は、BlotGlycoの標準プロトコールに準じて行った。糖鎖が結合した後の担体を、200μＬのDMSOで3回洗浄した。その後、担体に100μＬの上記ラクトン化反応溶液を加え、700rpmで攪拌しながら１時間反応させた。遠心により液体を除去した後200μＬのメタノールで3回洗浄を行った。洗浄後の担体に第２アミド化反応溶液として18％ エチルアミン水溶液を100μＬ加え、軽く攪拌したあと遠心で溶媒を除き、200μＬのH2Oで3回洗浄した。BlotGlycoの標準プロトコールに準じて糖鎖試料を担体から遊離させ、SpeedVacで乾固させた。乾固させた試料をカーボン精製および質量分析に供した。カーボン精製および質量分析は比較例１と同様に行った。
得られたマススペクトルを図６に示す。実施例１－１と同じく、LacA2、33A2および66A2が全て異なるm/zのピークに対応するものとして観測されており、区別できていることが分かる。このように、上述の第１実施形態における反応の一部を固相担体に結合した状態で行っても、良好な結果を得ることができた。
（比較例２）
＜シアル酸の修飾＞
比較例２では、第１アミド化を行わずに、シアル酸の結合様式非特異的アミド化（非特異的修飾反応）を行った。LacA2、33A2および66A2が等モルずつ含まれる評価用糖鎖試料に非特異的修飾反応溶液（500mM エチルアミン塩酸塩, 50mM PyAOP, 3% N-メチルモルホリン,溶媒:DMSO）を20μＬ加え、2000rpmで攪拌しながら常温で１時間反応させた。反応溶液にACN とTFAを加え、合計200μＬにしてアミド精製、カーボン精製および質量分析に供した。アミド精製、カーボン精製および質量分析は比較例１と同様に行った。
得られたマススペクトルを図７に示す。m/z 2499.9のピークはシアル酸がエチルアミド化されたものに相当し、LacA2、33A2および66A2全てがエチルアミド化された状態でこのピークにおいて重複して観測されている。ここではシアル酸結合様式非特異的修飾を採用しているのでα２，３－シアル酸とα２，６－シアル酸とを識別することはできないことに加え、試料に元々含まれていたラクトンにも同様の修飾がなされる。従って、LacA2、33A2および66A2の全てが同じm/zを有する物質となりこれらを識別することはできない。
（実施例２－１）
＜シアル酸の修飾＞
実施例２－１では、試料を第１アミド化反応に供した後、結合様式非特異的アミド化（非特異的修飾反応）を行った。LacA2、33A2および66A2が等モルずつ含まれている評価用糖鎖試料に第１アミド化反応溶液として10% メチルアミン水溶液を20μＬ加え、よく攪拌し再溶解させた。再溶解により得られた溶液をSpeedVacで乾固し溶媒を除いた。乾固させた試料に上記非特異的修飾反応溶液を20μＬ加え、2000rpmで攪拌しながら常温で１時間反応させた。反応溶液にACNとTFAとを加え、合計200μＬにしてアミド精製、カーボン精製および質量分析に供した。
得られたマススペクトルを図８に示す。m/z 2499.9のピークはシアル酸がエチルアミド化されたものに相当し、33A2および66A2に対応するピークである。m/z 2471.9のピークはシアル酸がメチルアミド化されたものに相当し、LacA2に対応するピークである。このように、ラクトンを予めアミド化してからシアル酸結合様式非特異的修飾を行うことで、試料において元々ラクトン化されていたシアル酸とラクトン化されていなかったシアル酸に対してそれぞれ質量の異なる修飾体を形成することができ、質量分析でそれぞれのピークを識別することが出来る。
（実施例２－２）
＜シアル酸の修飾＞
実施例２－２では、試料を第１アミド化反応に供した後、試料を固相担体に結合させ、固相担体上で結合様式非特異的アミド化（非特異的修飾反応）を行った。LacA2、33A2および66A2が等モルずつ含まれている評価用糖鎖試料に第１アミド化反応溶液として10% メチルアミン水溶液を20μＬ加え、よく攪拌し再溶解させた。再溶解により得られた溶液をSpeedVacで乾固し溶媒を除いた。試料を20μＬのH2Oに再溶解し、ヒドラジド基をリガンドとして有する上述の固相担体（BlotGlyco）に結合させた。糖鎖の結合は、BlotGlycoの標準プロトコールに準じて行った。糖鎖が結合した後の担体を、200μＬのDMSOで3回洗浄した後、洗浄後の担体に100μＬの上記非特異的修飾反応溶液を加え、700rpmで攪拌しながら１時間反応させた。遠心により液体を除去した後、担体に対し200μＬのメタノールで3回洗浄を行い、さらに200μＬのH2Oで3回洗浄した。その後、BlotGlycoの標準プロトコールに準じて反応後の糖鎖試料を担体から遊離させ、SpeedVacで乾固させた。乾固させた試料をカーボン精製および質量分析に供した。カーボン精製および質量分析は比較例１と同様に行った。
得られたマススペクトルを図９に示す。実施例２－１と同じく、LacA2に対応するピークと、33A2および66A2に対応するピークとは異なるm/zのピークとして観測されており、区別できていることが分かる。このように、上述の第２実施形態における反応の一部を固相担体に結合した状態で行っても、良好な結果を得ることができた。
＜アミノリシスについての検討＞
以下の実施例は、上述の実施形態の分析用試料の調製方法のように、試料に元々含まれていたラクトンを修飾するものではないが、アミンを含む溶液により糖鎖のシアル酸に形成されたラクトンのアミノリシスが起こる点を示すものである。以下の記載において、「ラクトン化反応」および「アミド化反応」は、それぞれ上述の実施形態の「ラクトン化反応」および「第２アミド化反応」に対応する。「アミド化反応溶液」は、上述の実施形態における第１アミド化反応溶液または第２アミド化反応溶液と同様の条件から選択されたものである。
＜アミド化反応におけるアミンの濃度の検討＞
試料としてα２，３－シアル酸が結合されたα２，３－ＳＧＰからPNGase Fにより糖鎖を切り出して遊離させたものを用いた。シアリルグライコペプチドは、数残基のペプチドに糖鎖が結合されたものである。試料はヒドラジド基をリガンドとして有するビーズからなる固相担体（BlotGlyco; 住友ベークライト）に結合させた。糖鎖の固相担体への結合は、糖鎖精製キットBlotGlycoの標準プロトコールに準じて行った。
糖鎖が結合した後の担体を、２００μＬのDMSOで3回洗浄した。その後、イソプロピルアミンを含む１００μＬのラクトン化反応溶液（2M イソプロピルアミン塩酸塩、500mM EDC-HCl、500mM HOBt）を加え、800rpmで軽く攪拌しながら一時間反応させた。（これにより、α２，６－シアル酸はイソプロピルアミドに、α２，３－シアル酸はラクトン体に変換される。）遠心により反応溶液を除去した後、２００μＬのメタノールで1回洗浄を行った。その後、２００μＬのメチルアミン水溶液（濃度0.1%～10%）で3回洗浄することでラクトンのアミド化反応を行った。次いで２００μＬのメタノールで2回、および２００μＬの水で3回洗浄を行った。その後、標準プロトコールに準じた方法で反応後の糖鎖試料を担体から遊離させ、Stage Tip Carbonで脱塩精製を行い、遠心濃縮（SpeedVac）により乾固させた。乾固した試料を１０μＬの水に再溶解させ、１μＬをフォーカスプレートに滴下し、マトリックスとして50% アセトニトリル（ACN）に溶解させた100mM 3AQ/CA、2mM硫酸アンモニウムを０．５μＬ加えた後、７５℃のヒートブロック上で1.5時間反応させ、3AQによる糖鎖の還元末端のラベル化を行った。反応終了後、プレートを室温まで冷却し、MALDI-QIT-TOF-MS (AXIMA-Resonance, Shimadzu/Kratos) により、負イオンモードで飛行時間型の質量分析を行った。
図１０は、1%(a)及び10%(b)のメチルアミン水溶液をアミド化反応溶液としてアミノリシスを起こした場合のマススペクトルを示す図である。試料であるα２，３－ＳＧＰから遊離させた３３Ａ２（図３（Ｂ）に相当）は、上述のラクトン化反応溶液によって分子内脱水縮合しラクトン体に変換させた（図３（Ａ）に相当）。ここでは、その後、脱水縮合剤は用いずにメチルアミン溶液でヒドラジドビーズを洗浄しているだけだが、もともとラクトンであった構造がメチルアミド化していることがわかる（m/z 2471.9のピークに相当）。m/z 2360.9に観測されるピークは一箇所メチルアミンが結合することなくカルボキシ基になっているものである。このピークはラクトンのアミノリシスではなく加水分解が起こった糖鎖に対応すると推測される。10%メチルアミン水溶液を用いたアミド化反応では、この加水分解に由来するピークはさらに小さくなり、ほぼ完全にアミノリシスのみが起きていた。
図１１は、アミド化反応溶液におけるメチルアミンの濃度に対する、マススペクトル上のピークのシグナル強度から算出した、加水分解が起きたシアル酸とアミノリシスが起きたシアル酸との割合（アミノリシス効率）を示すグラフである。メチルアミン溶液の濃度が1%の場合でも十分なアミノリシスが起こっているが、より高濃度のメチルアミンを含むアミド化反応溶液を用いることでアミノリシスをさらに効率よく起こせていることが分かる。
＜アミド化反応におけるアミンの種類の検討＞
図１２は、アミン濃度についての上記検討と略同じ条件で、アミド化反応溶液としてそれぞれ3Mのアンモニア水またはアルキルアミン水溶液（メチルアミンの場合、10％濃度に相当）を用いてアミド化反応を行った際の生成比を示すグラフである。
図１２の結果を見ると、アンモニアおよび分枝を持たない第一級アルキルアミンの場合、効率よくアミノリシスを起こせているが、イソプロピルアミン、tert-ブチルアミンなど分枝を持ったアルキルアミンはアミノリシス効率が低く、加水分解（-COOH生成）が優位であった。また、アミド化反応溶液に第三級アミンを用いた場合はもとより脱水縮合剤下でも反応しないため、加水分解のみが起こっているが、第二級アミンを用いた場合もあまり反応せず、加水分解が優位に起こった。また、アリルアミンとエタノールアミンについてはアミノリシスが優位に起こった。従って、少なくとも炭化水素鎖部分に分枝を持たない第一級アミンであれば他の官能基が含まれていてもよく、二重結合やヒドロキシ基が含まれていても良いことがわかった。以上から、アミノリシスを起こすためには炭素鎖に分枝を持たない第一級アミンが特に適することが分かる。
＜アミド化反応における溶媒の検討＞
図１３は、上記検討と略同じ条件で、アミド化反応溶液として90% ACNに溶解した1.2Mメチルアミン、メタノールに溶解した3Mメチルアミン、または、ACNに溶解した3M エタノールアミン等を用いた場合の生成比を示すグラフである。
図１３の結果を見ると、いずれの場合も高い割合でアミノリシスが起こっており、アミド化された糖鎖に対応するピークが優位に観測された。水を実質的に含まない状態であるメタノールやACNに溶解したアミンでも問題なくアミド化が起こったことから、ラクトンが一時的に加水分解してからアミド化しているわけではなく、アミンが直接ラクトンに作用することによりアミド化するアミノリシスが起こっていることが強く示唆された。水を実質的に含まない条件では、加水分解がより抑えられ、水溶媒では5%程度のシアル酸で加水分解が起こってしまうエタノールアミンをアミド化反応溶液に用いた場合でもほぼ完全にアミド化された。
＜アミド化反応におけるｐＨの検討＞
図１４は、上記検討と略同じ条件で、アミド化反応溶液として3M メチルアミン水溶液と 3M メチルアミン塩酸塩水溶液を任意の割合で混合した溶液を用いた場合の生成比を示すグラフである。図１４の”MA”はメチルアミン水溶液、”MA-HCl”はメチルアミン塩酸塩水溶液をそれぞれ示す。
本検討では、試料にアミド化反応溶液を加えた後でも一部の条件ではα２，３－シアル酸がラクトンを有したまま残ることが想定された。従って、不安定なラクトンをより定量的に評価するため、試料にアミド化反応溶液を加えアミド化反応を行った後、２００μＬのH2Oで2回、２００μＬのACNで2回洗浄し、その後ACNに溶解した3M エタノールアミンを含むアミド化反応溶液でもう一度アミド化反応を行った。この二段階で行ったアミド化反応の条件下では、第一段階のアミド化反応でアミド化したもの（メチルアミド化体で検出）、加水分解したもの（-COOHで検出）、およびラクトンのまま残っていたもの（エタノールアミンとのアミド化体で検出）が明確に区別できる。なお、本検討でのアミド化反応はこれまでのように２００μＬのアミド化反応溶液で3回洗浄するのではなく、１００μＬのアミド化反応溶液を加えて2分間700rpmで攪拌することで行った。
図１４の結果を見ると、アミド化反応溶液を加えなかった場合（”without aminolysis”）や3Mメチルアミン塩酸塩溶液（pH 4.7）をアミド化反応溶液とした場合、アミノリシスはほとんど起こらず、シアル酸は実質的に全てラクトンのままであった。アミド化反応溶液を調製する際のメチルアミン溶液の割合を増やしてpHを上げると、シアル酸は徐々に加水分解とアミノリシスが起きるようになり、シアル酸はpH 8.8で90%程度アミド化し、pH 10.3以上のアミド化反応溶液では実質的に全てアミド化された。
＜ｆｅｔｕｉｎ（フェツイン）から遊離した糖鎖を試料としたアミド化反応の検討＞
糖タンパク質のフェツインを、20mM 重炭酸アンモニウム、10mM DTT, 0.02% SDSに溶解し、１００℃で3分間処理して、変性・還元させた。その後、室温に冷却し、PNGase Fを加えて、３７℃でオーバーナイトでインキュベーションし、糖鎖を遊離させた。翌日、１００℃で3分間熱処理を行い、PNGase Fを失活させることにより酵素反応を停止させた。
遊離した糖鎖は上記検討と同じようにヒドラジドビーズへの結合とイソプロピルアミンを含むラクトン化反応溶液を用いた結合様式特異的修飾を行い、次いで10%メチルアミン水溶液によるアミド化反応を行った。ビーズからの溶出や質量分析での検出は上記検討と同様の方法で行われた。
図１５は、フェツインから遊離した糖鎖のマススペクトルである。各ピークに対応して示された数字は、左側の数字がピークに対応する分子が含むα２，３－シアル酸の数を示し、右側の数字が当該分子が含むα２，６－シアル酸の数を示す。加水分解による生成物や未反応体は検出されず、ラクトン化されたシアル酸が効率よくメチルアミド化されていることが分かる。このマススペクトルと特許文献１や非特許文献３で報告されたマススペクトルとを比較すると、脱水縮合剤を用いたアミド化反応を行わなくても、アミノリシスによりラクトンが効率よく直接メチルアミド化されていることがわかる。
＜ＨＩＬＩＣ担体上でのアミド化反応の検討＞
α２，３－ＳＧＰを20mM 重炭酸アンモニウムに溶解し、PNGase Fを加えて３７℃で終夜インキュベーションすることで糖鎖を遊離させた。翌日、１００℃で3分間熱処理を行い、PNGase Fを失活させることにより酵素反応を停止させた。その後、StageTip Carbonにて脱塩処理を行い、SpeedVacによりエッペンドルフチューブ内に乾固させた。
その後、２０μＬのイソプロピルアミンを含むラクトン化反応溶液（2M イソプロピルアミン塩酸塩、500mM EDC-HCl、500mM HOBt）を加え、2000rpmで攪拌しながら一時間反応させた。この後、１２０μＬ ACNで希釈し、アミドチップ (GL science) に加え4000xgで遠心することで通液し糖鎖をアミド基を含むＨＩＬＩＣ用の担体に吸着させた。その後、２０～２００μＬの90% ACN 4% メチルアミン溶液をアミド化反応溶液として通液しアミド化反応を行った。さらに90% ACN 0.1% TFA １００μＬを2回通液させることで洗浄し、最後に２０μＬ H2Oを2回通液して糖鎖を溶出させ、溶出液をSpeedVacで乾固した。その後、さらにStage Tip Carbonで脱塩操作を行い、上記検討のようにオンターゲット3AQ化を行い、質量分析を行った。
図１６の(a)~(d)は、各アミド化反応溶液の量と、生成比を示すグラフである。(a)~(d)の全ての場合においてほぼ完全にアミノリシスが進行していることが確認された。アミド化反応溶液を２０μＬまで減らした状態では、担体がアミド化反応溶液に触れている時間は長くとも数十秒程度と考えられ、アミノリシスの反応は極めて迅速に起こっていることが示唆される。
＜ＨＩＬＩＣを用いた精製後のアミド化反応の検討＞
上記検討と同様の操作によりα２，３－ＳＧＰから糖鎖を切りだして遊離させ、当該糖鎖にイソプロピルアミンを含むラクトン化反応溶液を加え反応させ、ACNを加えて希釈しHILIC担体上に吸着させた。その後、90% ACN 0.1% TFA溶液１００μＬを2回通液させることで洗浄し、最後にH2O ２０μＬを2回通液して糖鎖を溶出させた。ここに、40%メチルアミン水溶液６．７μＬを加え終濃度10%となるメチルアミンのアミド化反応溶液とし、軽く攪拌したあと室温で2分間静置してアミド化反応を行った。その後、SpeedVacにより溶媒を除き、さらにStage Tip Carbonで脱塩操作を行い、上記検討のようにオンターゲット3ＡＱ化を用いて質量分析を行った。
結果は図１６(e) に示した。試料中のラクトンは概ねメチルアミド化されているが、加水分解による生成物も検出された。これは、HILIC担体によってイソプロピルアミンを含むラクトン化反応溶液が取り除かれた後、担体を洗浄するプロセスにおいてラクトンが一部加水分解していたためと解釈できる。従って、HILIC担体から溶出された試料にアミド化反応溶液を加えても良いが、実質的に全てのラクトンにアミノリシスを起こし、反応効率を最大化する観点からは、試料をHILIC担体に吸着させた状態でアミド化反応溶液を加えることが好ましい。

Claims (12)

  1. 試料に含まれる、ラクトン構造を含む糖鎖の分析を行うための分析用試料の調製方法であって、
    前記試料に、前記ラクトン構造を含むシアル酸と反応させるアンモニア、アミンまたはこれらの塩を第１求核剤として含み、シアル酸と反応させる脱水縮合剤を含まない第１アミド化反応溶液を加え、前記ラクトン構造を含むシアル酸をアミド化する第１アミド化反応を行うことと、
    完全メチル化以外の方法で、前記第１アミド化反応でアミド化されなかったシアル酸の少なくとも一部を修飾する第２反応を行うことと、
    を備え、
    前記アミンは、アルキル基又はアリル基を含む第一級アミンであり、且つ該アミンの濃度は０．３М以上であり、
    前記第１アミド化反応溶液のｐＨは、８．０以上であり、
    前記第２反応では、前記第１アミド化反応に供した前記試料と、第２反応溶液とを接触させ、
    前記第２反応溶液は、前記第１アミド化反応でアミド化されなかったシアル酸と反応させるアンモニア、アミン、アルコールまたはこれらの塩を第２求核剤としてさらに含み、
    前記第２反応により、前記第１アミド化反応の前に前記試料に含まれていた、前記ラクトン構造を有しないシアル酸の少なくとも一部がアミド化またはエステル化され、
    前記第１求核剤と前記第２求核剤とが異なる、分析用試料の調製方法。
  2. 請求項１に記載の分析用試料の調製方法において、
    前記第１アミド化反応を行うために前記試料と前記第１アミド化反応溶液とを接触させる時間は３０分より短い、分析用試料の調製方法。
  3. 請求項１又は２に記載の分析用試料の調製方法において、
    前記アルキル基は分枝を有しない、分析用試料の調製方法。
  4. 請求項１から３までのいずれか一項に記載の分析用試料の調製方法において、
    前記第１アミド化反応溶液は、アミンまたはその塩を含み、
    前記アミンまたはその塩の濃度は０．５Ｍ以上である、分析用試料の調製方法。
  5. 請求項１から４までのいずれか一項に記載の分析用試料の調製方法において、
    前記第２反応は、前記試料が固相担体に結合または吸着した状態で行われる、分析用試料の調製方法。
  6. 請求項１から５までのいずれか一項に記載の分析用試料の調製方法において、
    前記第２反応溶液は、脱水縮合剤を含む分析用試料の調製方法。
  7. 請求項１から６までのいずれか一項に記載の分析用試料の調製方法において、
    前記第２反応溶液は、エステル合成用アルキル化剤を含む、分析用試料の調製方法。
  8. 請求項１から７までのいずれか一項に記載の分析用試料の調製方法において、
    前記第２反応では、シアル酸の結合様式に基づいて、前記シアル酸の少なくとも一部を修飾する、分析用試料の調製方法。
  9. 請求項８に記載の分析用試料の調製方法において、
    前記第２反応では、α２，３－シアル酸、α２，８－シアル酸およびα２，９－シアル酸の少なくとも一つと、α２，６－シアル酸とを異なる修飾体に修飾する、分析用試料の調製方法。
  10. 請求項１から９までのいずれか一項の分析用試料の調製方法により分析用試料を調製することと、
    調製した前記分析用試料を分析することと
    を備える分析方法。
  11. 請求項１０に記載の分析方法において、
    調製した前記分析用試料は、質量分析およびクロマトグラフィの少なくとも一つにより分析される分析方法。
  12. アンモニア、アミンおよびこれらの塩の少なくとも一つを含み、
    請求項１から９までのいずれか一項に記載の分析用試料の調製方法に用いられる、分析用試料の調製用キット。
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