CN111537598B - 一种提高纳喷雾负离子信噪比的添加剂及使用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种提高纳喷雾负离子信噪比的添加剂及使用方法，涉及质谱检测技术领域，能够显著提高待测生物分子的信噪比和主峰带的电荷数；该添加剂为异丁胺水溶液，使用不同浓度的该添加剂进行质谱检测时，所检测出的水溶液体系肌红蛋白信噪比为1.9×103‑3.5×104，主峰带有电荷数为14‑到20‑；有机溶液体系肌红蛋白信噪比为5.4×102‑1.4×103，主峰带的电荷数为13‑到15‑；所检出的细胞色素c或胰岛素的信噪比为1.7×102‑1.6×104，主峰带有电荷数为6‑到10‑。本发明提供的技术方案适用于生物分子质谱检测的过程中。
Description
【技术领域】
本发明涉及质谱检测技术领域，尤其涉及一种提高纳喷雾负离子信噪比的添加剂及使用方法。
【背景技术】
近年来，质谱(mass spectrometry，MS)在诸多领域中发展为一个重要的检测分析技术，例如：蛋白质组学、代谢组学、食品科学和环境科学等。特别是蛋白质组学，电喷雾电离质谱已经成为最有效的检测分析技术之一。在基于质谱的蛋白质组学分析中有两种截然不同的策略，一个是自上而下蛋白质组学，另一个是自下而上蛋白质组学。在蛋白质组学检测分析中，自上而下蛋白质组学比自下而上蛋白质组学对蛋白质结构和构象信息更具有优势，并且自上而下蛋白质组学所需要的前处理也更加简单。例如，在利用自上而下蛋白质组学中检测单个蛋白质的时候可以发现多个″proteoforms″的存在。但是，如果使用自下而上蛋白质组学的话，需要在前处理中将单个蛋白质酶解成多肽，这样可能会导致某些关键信息的丢失。尤其是当面对复杂的蛋白质样品是，自下而上蛋白质组学中的不确定性和局限性会极大的影响实验结果和重现。最后，尽管自上而下蛋白质组学还存在许多技术上的挑战，但是它已经被视为综合分析蛋白质组学的首选方法。
电喷雾离子源(ESI)的正离子模式一直是最主要的选择，是因为在ESI过程中喷针尖端处施加高电场来促进电喷雾的形成，但是喷针尖端的直径较小并且过高的电场容易造成放电现象。这会导致不稳定的离子电流和灵敏度的降低。而在负离子模式下，喷针尖端的材质就带有强负电位，这更加有利于喷针尖端处的电子发射，更容易形成放电现象。所以负离子模式比正离子模式更难获得稳定的电喷雾。1992年，Richard D.Smith和他的团队研究在负离子模式下ESI蛋白质和多肽的过程。他们发现在溶液中添加氨水(NH3·H2O)有利于蛋白质和多肽的检测和去质子化离子峰的形成。在大多数情况下，氨水(NH3·H2O)被用作添加剂以改善在负离子模式下ESI蛋白质检测结果。然而，氨水的使用并不能保证ESI的最佳性能。
因此，有必要研究一种提高纳喷雾负离子信噪比的添加剂及使用方法来应对现有技术的不足，以解决或减轻上述一个或多个问题。
【发明内容】
有鉴于此，本发明提供了一种提高纳喷雾负离子信噪比的添加剂及使用方法，能够显著提高待测生物分子的信噪比和主峰带的电荷数。
一方面，本发明提供一种提高纳喷雾负离子信噪比的添加剂，用于生物分子的电喷雾电离质谱检测，与待测样品溶液混合后注入纳喷针进行工作，其特征在于，所述添加剂包括异丁胺。
如上所述的方面和任一可能的实现方式，进一步提供一种实现方式，所述添加剂为异丁胺溶液，所述异丁胺溶液的溶剂为超纯水。
如上所述的方面和任一可能的实现方式，进一步提供一种实现方式，所述异丁胺在待检测样品溶液中的浓度为200-1100mM，其中所述浓度均为最终待测样品溶液中添加剂的浓度。
如上所述的方面和任一可能的实现方式，进一步提供一种实现方式，所述异丁胺在待检测样品溶液中的浓度为400-500mM。
另一方面，本发明提供一种提高纳喷雾负离子信噪比的添加剂的使用方法，其特征在于，所述使用方法的步骤包括：
S1、制备蛋白质的待测样品溶液；
S2、将如上任一所述的添加剂加入到待测样品溶液中，充分混合并注入纳喷针中；
S3、将纳喷针置于质谱入口处，在高电场作用下形成电喷雾，检出高信噪比的蛋白质质谱图。
如上所述的方面和任一可能的实现方式，进一步提供一种实现方式，所述待测样品溶液为肌红蛋白水溶液时，所检测出的信噪比为1.9×103-3.5×104，肌红蛋白主峰带有的电荷数为14-到20-。
如上所述的方面和任一可能的实现方式，进一步提供一种实现方式，所述肌红蛋白水溶液的浓度为10μM。
如上所述的方面和任一可能的实现方式，进一步提供一种实现方式，所述待测样品溶液为肌红蛋白有机溶液时，所检出的信噪比为5.4×102-1.4×103，肌红蛋白主峰带有的电荷数为13-到15-。
如上所述的方面和任一可能的实现方式，进一步提供一种实现方式，所述肌红蛋白有机溶液的溶剂为甲醇水或乙腈水，浓度为10μM。
如上所述的方面和任一可能的实现方式，进一步提供一种实现方式，所述待测样品溶液为细胞色素c溶液或胰岛素溶液时，所检出的信噪比为1.7×102-1.6×104，主峰带有的电荷数为6-到10-。
与现有技术相比，本发明可以获得包括以下技术效果：
(1)更高的信号强度，待测生物分子的信号强度得到了增强(1-2个数量级)。
(2)更高的信噪比，所得待测生物分子的质谱图具有更高的信噪比(1-2个数量级)。
(3)适用于多个溶剂体系，在不同的溶剂体系中，尤其是在水溶液体系中，待测生物分子的信噪比有极大的提高。
当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有技术效果。
【附图说明】
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
图1是本发明一个实施例提供的使用添加剂时的装置结构图；
图2(a)-(d)是本发明一个实施例提供的不同浓度的异丁胺(i-BL)作为添加剂时肌红蛋白(holo-Mb)的检测结果的质谱图；
图3(a)-(h)是本发明一个实施例提供的在有机溶剂体系中不同浓度的异丁胺(i-BL)作为添加剂时肌红蛋白(holo-Mb)的检测结果的质谱图；
图4(a)-(d)是本发明一个实施例提供的400mM浓度的异丁胺(i-BL)作为添加剂时细胞色素c(Cyt c)和胰岛素(Ins)的检测结果的质谱图。
其中，图中：
1、高压电源；2、纳喷针；3、电极；4、待测样品溶液；5、质谱进样口。
【具体实施方式】
为了更好的理解本发明的技术方案，下面结合附图对本发明实施例进行详细描述。
应当明确，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
在本发明实施例中使用的术语是仅仅出于描述特定实施例的目的，而非旨在限制本发明。在本发明实施例和所附权利要求书中所使用的单数形式的″一种″、″所述″和″该″也旨在包括多数形式，除非上下文清楚地表示其他含义。
针对现有技术中的缺点和不足，本发明的目的在于提供一种方便、实用，且在负离子模式下能够影响纳喷雾信噪比的添加剂。在一定的浓度下，可以显著的提高纳喷雾信噪比。
本发明提供的一种提高纳喷雾负离子信噪比的添加剂及使用方法，采用纳喷雾离子源对蛋白质溶液进行离子化操作，蛋白质溶液中添加有异丁胺。
本发明提供的提高纳喷雾负离子信噪比的添加剂制备及使用方法，该方法包括以下步骤：
步骤1：将一定量的异丁胺纯品(分子量约为73)加入超纯水中，充分溶解，制成适宜浓度的异丁胺添加剂溶液；
步骤2：将肌红蛋白纯品(分子量约为16.7kDa)、细胞色素c纯品(分子量约为16.7kDa)和胰岛素纯品(分子量约为5.6kDa)分别溶解于超纯水、甲醇水(1∶1，v/v)和乙腈水(1∶1，v/v)中，得到不同体系不同溶质的浓度为10μM待测样品溶液；
步骤3：采用移液枪在上述待测样品溶液中加入适量异丁胺添加剂溶液，充分溶解，使最终待测样本溶液中异丁胺的浓度达到200-1100mM，通过注射器注入纳喷针(nano-tip)中，并放置在质谱入口处。最后在高电场的作用，形成电喷雾并完成检测。此时可以检出质谱图为高信噪比的蛋白质的谱图。
需要说明的是，在设备精度达到要求的情况下，也可将异丁胺纯品直接加入到待测样本溶液中，目前低量程移液枪的精度不够，若直接采用该设备将纯品异丁胺加入到待测样本溶液中，会造成异丁胺浓度的较大误差，进而影响检测结果。先制备成异丁胺水溶液，就是为了减少误差。
如图1所示，其电喷雾装置与普通Nano-ESI一样，不做任何改动；在蛋白质待测溶液中添加200-1100mM(mM即10-3mol/L)异丁胺。
下面通过具体的实施例验证基于强酸盐的提高蛋白质分子电喷雾电荷数方法的检测效果。
实施例1：异丁胺用于提高纳喷雾负离子信噪比的效果
本实例中将肌红蛋白纯品(分子量约为16.7kDa)溶解于超纯水中得到浓度为10μM待测样品溶液。在待测样品溶液中添加不同浓度的异丁胺，并对其检出结果进行对比。
肌红蛋白(holo-Mb)是在质谱研究中常用的蛋白质，当暴露在碱性环境中，肌红蛋白会发生短暂的变性，然后失去血红素基团并变为脱辅基肌红蛋白(apo-Mb)。图2是添加不同浓度异丁胺后肌红蛋白的检出结果质谱图。为了更好的说明所选择的添加剂对纳喷雾负离子模式下信噪比的提高，因此，选择检出肌红蛋白质谱图中最大丰度的电荷峰进行信噪比的计算，具体的计算方式如下：对质量范围在m/z＝1720-1740的噪音信号取平均值，得到目标信号峰左端噪音的平均值；对质量范围在m/z＝1780-1800的噪音信号取平均值，得到目标信号峰右端噪音的平均值。对左、右两端噪音进行平均，得到整体噪音的平均值。将目标信号峰的信号强度除以整体噪音的平均值，得到最终的S/N。我们可以发现随着添加异丁胺浓度的提高，负离子模式下纳喷雾检出肌红蛋白的信噪比是不断提高的，从1.9×103提高到3.5×104(图2(a)、(b)和(c))。并且肌红蛋白主峰带有电荷数也是持续变大的，从14-到20-，在质谱技术中通过电喷雾形成高电荷数的蛋白质是有利于提高质谱检测时的灵敏度的，这也有利于提高纳喷雾检出的信噪比。在图2(d)中，此时肌红蛋白待测溶液中添加500mM异丁胺，其检出结果的信噪比却降低，变为了4.8×103。
从上述结果可以看出，以异丁胺作为添加剂，本发明的方法能够获得负离子模式下高信噪比的质谱图，在较低浓度(200-400mM)的范围内就可以显著提高蛋白质的信噪比，其中400mM异丁胺的效果最好。
实施例2：有机溶剂中异丁胺对信噪比的提升效果
通常，在质谱分析中样品溶液溶剂的选择除了纯水溶液之外，有机溶剂也是常常被使用的。本发明选择了两种常见的有机溶剂体系，甲醇水(1∶1，v/v)和乙腈水(1∶1，v/v)。分别向10μM肌红蛋白待测样品溶液中加入不同浓度的异丁胺，并根据检出结果进行对比。为了讨论的方便，信噪比的计算与前面的保持一致。图3(a)、(b)、(c)和(d)中是不同浓度的异丁胺添加进10μM肌红蛋白甲醇水待测样品中的检出质谱图。可以发现当添加的异丁胺浓度从200-400mM的过程中，检出肌红蛋白的信噪比不断提高，从5.4×102到1.4×103。同时，肌红蛋白主峰带有的电荷数也在不断变大，从13-到15-(图3(a)、(b)和(c))。但是，当添加的异丁胺浓度增加到500mM时，检出肌红蛋白的信噪比却降低了，变为8.9×102。
从上述的结果中可以发现，在甲醇水体系中，以异丁胺作为添加剂，本发明的方法能够获得负离子模式下高信噪比的质谱图，在较低浓度(200-400mM)的范围内就可以显著提高蛋白质的信噪比，其中400mM异丁胺的效果最好。
同样，在乙腈水体系中，添加异丁胺可以提高纳喷雾负离子信噪比。相关的检出质谱图如图3(e)、(f)、(d)和(h)所示。
实施例3：不同蛋白质的检测效果
除了向肌红蛋白溶液中添加异丁胺可以提高负离子模式下纳喷雾的信噪比，向细胞色素c和胰岛素样品溶液中添加异丁胺可以使得检出质谱图的信噪比得到显著的提高。细胞色素c纯品(分子量约为16.7kDa)和胰岛素纯品(分子量约为5.6kDa)溶解于超纯水中得到浓度为10μM待测样品溶液。相关结果质谱图如图3所示。其中，细胞色素c的计算方式如下：对质量范围在m/z＝1720-1740的噪音信号取平均值，得到目标信号峰左端噪音的平均值；对质量范围在m/z＝1780-1800的噪音信号取平均值，得到目标信号峰右端噪音的平均值。对左、右两端噪音进行平均，得到整体噪音的平均值。将目标信号峰的信号强度除以整体噪音的平均值，得到最终的S/N。胰岛素的计算方式如下：对质量范围在m/z＝1120-1140的噪音信号取平均值，得到目标信号峰左端噪音的平均值；对质量范围在m/z＝1170-1190的噪音信号取平均值，得到目标信号峰右端噪音的平均值。对左、右两端噪音进行平均，得到整体噪音的平均值。将目标信号峰的信号强度除以整体噪音的平均值，得到最终的S/N。
对于细胞色素c的检出结果而言，异丁胺的添加不仅仅使得检出质谱图的信噪比得到显著的提高。并且在质谱图中可以发现，细胞色素c的主峰带有的电荷数也得到提高(图4(a)和(b))。这有利于提高质谱检测的灵敏度。同样，当待测的样品变为胰岛素的时，添加氨水获得的信噪比为38(图4(c))。当添加的添加剂变为异丁胺时，获得胰岛素的信噪比提高到1.7×102。
以上对本申请实施例所提供的一种提高纳喷雾负离子信噪比的添加剂及使用方法，进行了详细介绍。以上实施例的说明只是用于帮助理解本申请的方法及其核心思想；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本申请的思想，在具体实施方式及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本申请的限制。
如在说明书及权利要求书当中使用了某些词汇来指称特定组件。本领域技术人员应可理解，硬件制造商可能会用不同名词来称呼同一个组件。本说明书及权利要求书并不以名称的差异来作为区分组件的方式，而是以组件在功能上的差异来作为区分的准则。如在通篇说明书及权利要求书当中所提及的″包含″、″包括″为一开放式用语，故应解释成″包含/包括但不限定于″。″大致″是指在可接收的误差范围内，本领域技术人员能够在一定误差范围内解决所述技术问题，基本达到所述技术效果。说明书后续描述为实施本申请的较佳实施方式，然所述描述乃以说明本申请的一般原则为目的，并非用以限定本申请的范围。本申请的保护范围当视所附权利要求书所界定者为准。
还需要说明的是，术语″包括″、″包含″或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的商品或者系统不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种商品或者系统所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句″包括一个......″限定的要素，并不排除在包括所述要素的商品或者系统中还存在另外的相同要素。
应当理解，本文中使用的术语″和/或″仅仅是一种描述关联对象的关联关系，表示可以存在三种关系，例如，A和/或B，可以表示：单独存在A，同时存在A和B，单独存在B这三种情况。另外，本文中字符″/″，一般表示前后关联对象是一种″或″的关系。
上述说明示出并描述了本申请的若干优选实施例，但如前所述，应当理解本申请并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述申请构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离本申请的精神和范围，则都应在本申请所附权利要求书的保护范围内。
Claims (1)
1.一种提高纳喷雾负离子信噪比的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
S1、制备蛋白质的待测样品溶液；
S2、制备添加剂并加入到待测样品溶液中，充分混合后注入纳喷针中；
S3、将纳喷针置于质谱入口处，在高电场作用下形成电喷雾，检出高信噪比的蛋白质质谱图；
所述S2中的添加剂用于生物分子的电喷雾电离质谱检测，与待测样品溶液混合后注入纳喷针进行工作，所述添加剂包括异丁胺；
所述添加剂为异丁胺溶液，所述异丁胺溶液的溶剂为超纯水；
所述异丁胺溶液的制备过程为：将异丁胺纯品加入超纯水中，充分溶解；
所述异丁胺在待测样品溶液中的浓度为200-500mM；
所述待测样品溶液为肌红蛋白水溶液、肌红蛋白有机溶液、细胞色素c溶液或胰岛素溶液；
所述待测样品溶液为肌红蛋白水溶液时，所检测出的信噪比为1.9×103-3.5×104，肌红蛋白主峰带有的电荷数为14-～20-，所述肌红蛋白水溶液的浓度为10μM；
所述待测样品溶液为肌红蛋白有机溶液时，所检出的信噪比为5.4×102-1.4×103，肌红蛋白主峰带有的电荷数为13-～15-；所述肌红蛋白有机溶液的溶剂为甲醇水或乙腈水，浓度为10μM；
所述待测样品溶液为细胞色素c溶液或胰岛素溶液时，所检出的信噪比为1.7×102-1.6×104，主峰带有的电荷数为6-～10-。
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