JP7375816B2 - 分析用試料の調製方法、分析方法および分析用試料の調製用キット - Google Patents
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Description
本発明は、分析用試料の調製方法、分析方法および分析用試料の調製用キットに関する。
シアル酸は生体内に数多く存在する糖である。シアル酸は、生体内においてタンパク質と結合された糖鎖にも含まれ、糖鎖の非還元末端に存在することが多い。従って、シアル酸は、このような糖タンパク質分子において分子の外側に配置され他の分子から直接認識されるため、重要な役割を担っている。
シアル酸は、隣接する糖との間の結合様式（linkage type）が異なる場合がある。例えば、ヒトのＮ－結合型糖鎖（Ｎ型糖鎖）では主にα２，３－およびα２，６－の結合様式、Ｏ－結合型糖鎖（Ｏ型糖鎖）およびスフィンゴ糖脂質ではこれらに加えてα２，８－およびα２，９－の結合様式が知られている。このような結合様式の違いにより、シアル酸は異なる分子から認識され、異なる役割を有し得る。
質量分析等においては、シアル酸を含有する糖鎖に対する前処理としてシアル酸の修飾が行われている。これは、負電荷を有するシアル酸のカルボキシ基をエステル化またはアミド化等により中性化することで、イオン化の抑制およびシアル酸の脱離等のデメリットを解消するものである。シアル酸のラクトン化では、結合様式により生成されるラクトンの安定性が異なるため、この安定性の違いを利用して結合様式特異的にシアル酸の修飾および解析を行うことができる。ここで、ラクトンはきわめて不安定であり、水中でも容易に加水分解され、酸性または塩基性条件でさらに迅速に加水分解される。従って、前処理における修飾により生成されたラクトンを、アミド化により安定化させることが報告されている（特許文献１、非特許文献１参照）。ラクトンは、生体における糖鎖および抗体医薬の糖鎖等においても存在し、これらの解析を行う際にも安定化を行うことができる。また、非特許文献２に記載されたラクトンのアミノ分解による直接アミド化は、ラクトンの迅速かつ特異的なアミド修飾を行うことができ、今後の利用が期待されている。
Nishikaze T, Tsumoto H, Sekiya S, Iwamoto S, Miura Y, Tanaka K. "Differentiation of Sialyl Linkage Isomers by One-Pot Sialic Acid Derivatization for Mass Spectrometry-Based Glycan Profiling" Analytical Chemistry,（米国）, ACS Publications, 2017年2月21日、Volume 89, Issue 4, pp.2353-2360
Hanamatsu H, Nishikaze T, Miura N, Piao J, Okada K, Sekiya S, Iwamoto S, Sakamoto N, Tanaka K, Furukawa JI. "Sialic Acid Linkage Specific Derivatization of Glycosphingolipid Glycans by Ring-Opening Aminolysis of Lactones" Analytical Chemistry,（米国）, ACS Publications, 2018年11月20日、Volume 90, Issue 22, pp.13193-13199
ラクトンの加水分解を起こりにくくし、糖鎖に含まれるラクトンをより効率的にアミド化することが望ましい。
本発明の第１の態様は、糖鎖を含む試料を用意することと、前記試料に、前記糖鎖に含まれるラクトンと反応させるアンモニア、アミノ基に結合した炭素原子に１以下の炭素原子が直接結合している第一級アミン、ヒドラジン、ヒドラジン誘導体およびヒドロキシアミンならびにこれらの塩からなる群から選択される少なくとも一つの第１化合物とアルカリ化剤とを含む、ｐＨが７．７以上のアミド化反応溶液を接触させ、前記ラクトンをアミド化するアミド化反応を行うこととを備え、前記アルカリ化剤がアミンである場合、前記アルカリ化剤は、アミノ基に結合した炭素原子に２以上の炭素原子が直接結合している分岐型第一級アミン、第二級アミンおよび第三級アミンからなる群から選ばれる少なくとも一つのアミンである、分析用試料の調製方法に関する。
本発明の第２の態様は、第１の態様の分析用試料の調製方法により分析用試料を調製することと、調製した前記分析用試料を分析することとを備える分析方法に関する。
本発明の第３の態様は、第１の態様の分析用試料の調製方法、または、第２の態様の分析方法に用いられる分析用試料の調製用キットに関する。
本発明の第２の態様は、第１の態様の分析用試料の調製方法により分析用試料を調製することと、調製した前記分析用試料を分析することとを備える分析方法に関する。
本発明の第３の態様は、第１の態様の分析用試料の調製方法、または、第２の態様の分析方法に用いられる分析用試料の調製用キットに関する。
本発明によれば、糖鎖に含まれるラクトンをより効率的にアミド化することができる。
以下、図を参照して本発明を実施するための形態について説明する。発明者らは、アルカリ化剤を用いてアミド化反応を行うことにより、より効率的に糖鎖に含まれるラクトンをアミド化することができることを見出した。
－第１実施形態－
図１は、本実施形態の分析用試料の調製方法に係る分析方法の流れを示すフローチャートである。本実施形態の分析用試料の調製方法では、試料に含まれる糖鎖のシアル酸を結合様式に基づいてラクトン化した後、生成されたラクトンをアミド化する。ステップＳ１００１において、糖鎖を含む試料が用意される。
図１は、本実施形態の分析用試料の調製方法に係る分析方法の流れを示すフローチャートである。本実施形態の分析用試料の調製方法では、試料に含まれる糖鎖のシアル酸を結合様式に基づいてラクトン化した後、生成されたラクトンをアミド化する。ステップＳ１００１において、糖鎖を含む試料が用意される。
（試料について）
糖鎖を含む試料は、特に限定されず、糖鎖、遊離糖鎖、糖ペプチドおよび糖タンパク質、ならびに糖脂質からなる群から選択される少なくとも一つの分子を含むことができる。本実施形態の分析用試料の調製方法では、糖鎖に含まれるシアル酸の結合様式特異的な修飾が行われる。試料中の糖鎖は、Ｎ－結合型糖鎖やＯ－結合型糖鎖、糖脂質型糖鎖等、末端にシアル酸を有する可能性がある糖鎖を含むことが好ましい。また、試料中の糖鎖は、α２，３－シアル酸、α２，８－シアル酸およびα２，９－シアル酸の少なくとも一つを含むか、含む可能性があることがより好ましく、これに加えてα２，６－シアル酸を含むか、含む可能性があることがさらに好ましい。
糖鎖を含む試料は、特に限定されず、糖鎖、遊離糖鎖、糖ペプチドおよび糖タンパク質、ならびに糖脂質からなる群から選択される少なくとも一つの分子を含むことができる。本実施形態の分析用試料の調製方法では、糖鎖に含まれるシアル酸の結合様式特異的な修飾が行われる。試料中の糖鎖は、Ｎ－結合型糖鎖やＯ－結合型糖鎖、糖脂質型糖鎖等、末端にシアル酸を有する可能性がある糖鎖を含むことが好ましい。また、試料中の糖鎖は、α２，３－シアル酸、α２，８－シアル酸およびα２，９－シアル酸の少なくとも一つを含むか、含む可能性があることがより好ましく、これに加えてα２，６－シアル酸を含むか、含む可能性があることがさらに好ましい。
試料が遊離糖鎖を含む場合は、糖タンパク質、糖ペプチドまたは糖脂質から遊離させた糖鎖を用いることができる。当該遊離の方法としては、Ｎ‐グリコシダーゼ、Ｏ‐グリコシダーゼ、またはエンドグリコセラミダーゼなどを用いた酵素処理、ヒドラジン分解、アルカリ処理によるβ脱離等の方法を用いることができる。糖ペプチドおよび糖タンパク質のペプチド鎖からＮ‐結合型糖鎖を遊離させる場合は、ペプチド‐Ｎ‐グリコシダーゼＦ(PNGase F)、ペプチド‐Ｎ‐グリコシダーゼＡ(PNGase A)、またはエンド－β－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼ（Endo M）等による酵素処理が好適に用いられる。また、糖鎖の還元末端のピリジルアミノ化（PA化）等の修飾を適宜行うことができる。酵素処理の前に、後述する糖ペプチドまたは糖タンパク質のペプチド鎖の切断を行ってもよい。
試料が糖ペプチドまたは糖タンパク質を含む場合、後述の「糖ペプチドおよび糖タンパク質の副反応の抑制について」の部分で述べるように、ペプチド部分の副反応を抑えるための処理を適宜行うことができる。また、糖ペプチドまたは糖タンパク質のペプチド鎖のアミノ酸の残基数が多いものは、酵素的切断等により、ペプチド鎖を切断して用いることが好ましい。例えば、質量分析用の試料を調製する場合、ペプチド鎖のアミノ酸残基数は３０以下が好ましく、２０以下がより好ましく、１５以下がさらに好ましい。一方、糖鎖が結合しているペプチドの由来を明確とすることが求められる場合には、ペプチド鎖のアミノ酸残基数は２以上が好ましく、３以上がより好ましい。
糖ペプチドまたは糖タンパク質のペプチド鎖を切断する場合の消化酵素としては、トリプシン、Ｌｙｓ‐Ｃ、アルギニンエンドペプチダーゼ、キモトリプシン、ペプシン、サーモリシン、プロテイナーゼＫ、またはプロナーゼＥ等が用いられる。これらの消化酵素の２種以上を組み合わせて用いてもよい。ペプチド鎖の切断の際の条件は特に限定されず、使用する消化酵素に応じた適宜のプロトコールが採用される。この切断の前に、試料中のタンパク質およびペプチドの変性処理またはアルキル化処理が行われてもよい。変性処理またはアルキル化処理の条件は特に限定されない。また、酵素的切断では無く、化学的切断等によりペプチド鎖を切断してもよい。
ステップＳ１００１が終了したら、ステップＳ１００３に進む。
ステップＳ１００１が終了したら、ステップＳ１００３に進む。
（ラクトン化反応）
ステップＳ１００３において、試料をラクトン化のための反応溶液（以下、ラクトン化反応溶液と呼ぶ）と接触させ、糖鎖に含まれるシアル酸の少なくとも一部をラクトン化するラクトン化反応を行う（以下、ラクトン化反応と記載した場合、特に言及が無い限り、ステップＳ１００３のラクトン化反応を指す）。以下では、ラクトン化反応溶液を用いて、結合様式特異的に、シアル酸の一部をラクトン化し、シアル酸の他の一部をラクトン化とは異なる修飾をする例を説明する。しかし、このラクトン化とは異なる修飾を行わなくてもよい。ラクトン化反応において、α２，３－シアル酸、α２，８－シアル酸およびα２，９－シアル酸が好適にラクトン化される。
ステップＳ１００３において、試料をラクトン化のための反応溶液（以下、ラクトン化反応溶液と呼ぶ）と接触させ、糖鎖に含まれるシアル酸の少なくとも一部をラクトン化するラクトン化反応を行う（以下、ラクトン化反応と記載した場合、特に言及が無い限り、ステップＳ１００３のラクトン化反応を指す）。以下では、ラクトン化反応溶液を用いて、結合様式特異的に、シアル酸の一部をラクトン化し、シアル酸の他の一部をラクトン化とは異なる修飾をする例を説明する。しかし、このラクトン化とは異なる修飾を行わなくてもよい。ラクトン化反応において、α２，３－シアル酸、α２，８－シアル酸およびα２，９－シアル酸が好適にラクトン化される。
ラクトン化反応溶液は、脱水縮合剤と、アルコール、アミンまたはこれらの塩を含む第１反応剤とを含む。第１反応剤は、その少なくとも一部がシアル酸に結合することにより、エステル化またはアミド化による修飾を行うための反応剤である。第１反応剤は、例えば求核剤として機能する。シアル酸の結合様式に基づいて選択的に脱水反応またはエステル化またはアミド化による修飾反応を起こすように、脱水縮合剤ならびに第１反応剤の種類および濃度が調整される。
なお、第１反応剤による、ラクトン化とは異なる修飾を行わない場合には、ラクトン化反応溶液は、脱水縮合剤を含み、第１反応剤を含まなくてよい。
なお、第１反応剤による、ラクトン化とは異なる修飾を行わない場合には、ラクトン化反応溶液は、脱水縮合剤を含み、第１反応剤を含まなくてよい。
結合様式特異的なラクトン化について説明する。α２，３－シアル酸のカルボキシ基の分子内脱水で生じるラクトンは六員環であり、α２，６－シアル酸のカルボキシ基の分子内脱水により生じ得るラクトンは七員環となる。従って、七員環より安定な六員環を生じるα２，３－シアル酸はα２，６－シアル酸よりラクトン化されやすい。また、α２，３－シアル酸のカルボキシ基はα２，６－シアル酸のカルボキシ基に比べて立体障害が比較的大きい位置にあるため、大きな分子は、α２，６－シアル酸と比べると、α２，３－シアル酸とは反応しづらい。このようなシアル酸の結合様式による分子構造の違いに基づいて、シアル酸の結合様式により異なる修飾がされるように脱水縮合剤ならびに第１反応剤の種類および濃度が調整される。
（ラクトン化反応における脱水縮合剤）
脱水縮合剤は、カルボジイミドを含むことが好ましい。カルボジイミドを用いると、脱水縮合剤としてホスホニウム系脱水縮合剤（いわゆるBOP試薬）やウロニウム系脱水縮合剤を用いた場合に比べて、立体障害が大きい部位に存在するカルボキシ基がアミド化されにくいからである。カルボジイミドの例としては、Ｎ，Ｎ’‐ジシクロへキシルカルボジイミド(DCC)、Ｎ‐（３‐ジメチルアミノプロピル）‐Ｎ’‐エチルカルボジイミド(EDC)、Ｎ，Ｎ’‐ジイソプロピルカルボジイミド(DIC)、１‐ｔｅｒｔ‐ブチル‐３‐エチルカルボジイミド(BEC)、Ｎ，Ｎ’‐ジ‐ｔｅｒｔ‐ブチルカルボジイミド、１，３‐ジ‐ｐ‐トルイルカルボジイミド、ビス（２，６‐ジイソプロピルフェニル）カルボジイミド、ビス（トリメチルシリル）カルボジイミド、１，３‐ビス（２，２‐ジメチル‐１，３‐ジオキソラン‐４‐イルメチル）カルボジイミド(BDDC)や、これらの塩が挙げられる。
脱水縮合剤は、カルボジイミドを含むことが好ましい。カルボジイミドを用いると、脱水縮合剤としてホスホニウム系脱水縮合剤（いわゆるBOP試薬）やウロニウム系脱水縮合剤を用いた場合に比べて、立体障害が大きい部位に存在するカルボキシ基がアミド化されにくいからである。カルボジイミドの例としては、Ｎ，Ｎ’‐ジシクロへキシルカルボジイミド(DCC)、Ｎ‐（３‐ジメチルアミノプロピル）‐Ｎ’‐エチルカルボジイミド(EDC)、Ｎ，Ｎ’‐ジイソプロピルカルボジイミド(DIC)、１‐ｔｅｒｔ‐ブチル‐３‐エチルカルボジイミド(BEC)、Ｎ，Ｎ’‐ジ‐ｔｅｒｔ‐ブチルカルボジイミド、１，３‐ジ‐ｐ‐トルイルカルボジイミド、ビス（２，６‐ジイソプロピルフェニル）カルボジイミド、ビス（トリメチルシリル）カルボジイミド、１，３‐ビス（２，２‐ジメチル‐１，３‐ジオキソラン‐４‐イルメチル）カルボジイミド(BDDC)や、これらの塩が挙げられる。
（ラクトン化反応における添加剤）
脱水縮合剤による脱水縮合を促進させ、かつ副反応を抑制するために、カルボジイミドに加えて、求核性の高い添加剤を用いることが好ましい。求核性の高い添加剤としては、１‐ヒドロキシベンゾトリアゾール(HOBt)、１‐ヒドロキシ‐７‐アザ‐ベンゾトリアゾール(HOAt)、４‐（ジメチルアミノ）ピリジン(DMAP)、２‐シアノ‐２‐（ヒドロキシイミノ）酢酸エチル(Oxyma)、Ｎ‐ヒドロキシ‐スクシンイミド(HOSu)、６‐クロロ‐１‐ヒドロキシ‐ベンゾトリアゾール(Cl-HoBt)、Ｎ‐ヒドロキシ‐３，４‐ジヒドロ‐４‐オキソ‐１，２，３‐ベンゾトリアジン(HOOBt)等が好ましく用いられる。
脱水縮合剤による脱水縮合を促進させ、かつ副反応を抑制するために、カルボジイミドに加えて、求核性の高い添加剤を用いることが好ましい。求核性の高い添加剤としては、１‐ヒドロキシベンゾトリアゾール(HOBt)、１‐ヒドロキシ‐７‐アザ‐ベンゾトリアゾール(HOAt)、４‐（ジメチルアミノ）ピリジン(DMAP)、２‐シアノ‐２‐（ヒドロキシイミノ）酢酸エチル(Oxyma)、Ｎ‐ヒドロキシ‐スクシンイミド(HOSu)、６‐クロロ‐１‐ヒドロキシ‐ベンゾトリアゾール(Cl-HoBt)、Ｎ‐ヒドロキシ‐３，４‐ジヒドロ‐４‐オキソ‐１，２，３‐ベンゾトリアジン(HOOBt)等が好ましく用いられる。
（ラクトン化反応における反応剤（第１反応剤））
第１反応剤として用いられるアミンは、炭素原子を２個以上含む第一級または第二級のアルキルアミンを含むことが好ましい。第一級のアルキルアミンは、エチルアミン、プロピルアミン、イソプロピルアミン、ブチルアミン、ｓｅｃ‐ブチルアミン、ｔｅｒｔ‐ブチルアミン等が好ましい。第二級アルキルアミンは、ジメチルアミン、エチルメチルアミン、ジエチルアミン、プロピルメチルアミン、イソプロピルメチルアミン等が好ましい。α２，３－シアル酸のカルボキシ基のように立体障害が大きい部位に存在するカルボキシ基がアミド化されにくいようにする観点から、イソプロピルアミンのような分枝アルキル基を有するアミンを用いることが好ましい。ラクトン化反応溶液の第１反応剤にアミンを用いた場合、シアル酸の結合様式に基づいて、α２，６－シアル酸等の一部のシアル酸のカルボキシ基がアミド化される。
第１反応剤として用いられるアミンは、炭素原子を２個以上含む第一級または第二級のアルキルアミンを含むことが好ましい。第一級のアルキルアミンは、エチルアミン、プロピルアミン、イソプロピルアミン、ブチルアミン、ｓｅｃ‐ブチルアミン、ｔｅｒｔ‐ブチルアミン等が好ましい。第二級アルキルアミンは、ジメチルアミン、エチルメチルアミン、ジエチルアミン、プロピルメチルアミン、イソプロピルメチルアミン等が好ましい。α２，３－シアル酸のカルボキシ基のように立体障害が大きい部位に存在するカルボキシ基がアミド化されにくいようにする観点から、イソプロピルアミンのような分枝アルキル基を有するアミンを用いることが好ましい。ラクトン化反応溶液の第１反応剤にアミンを用いた場合、シアル酸の結合様式に基づいて、α２，６－シアル酸等の一部のシアル酸のカルボキシ基がアミド化される。
第１反応剤として用いられるアルコールは、特に限定されず、例えばメタノールまたはエタノール等を用いることができる。ラクトン化反応溶液の反応剤にアルコールを用いた場合、シアル酸の結合様式に基づいて、α２，６－シアル酸等の一部のシアル酸のカルボキシ基がエステル化される。
なお、第１反応剤は、上述のアミンおよびアルコールの塩を含んでもよい。
なお、第１反応剤は、上述のアミンおよびアルコールの塩を含んでもよい。
（脱水縮合剤およびアミンの濃度について）
ラクトン化反応溶液の脱水縮合剤の濃度は、例えば、１ｍＭ～５Ｍ(以下では、Ｍはｍｏｌ／Ｌを示す)が好ましく、１０ｍＭ～３Ｍがより好ましい。カルボジイミドとHOAtやHOBt等の求核性の高い添加剤とを併用する場合は、それぞれの濃度が上記範囲であることが好ましい。ラクトン化反応溶液のアミンの濃度は、０．０１～２０Ｍが好ましく、０．１Ｍ～１０Ｍがより好ましい。ラクトン化反応の際の反応温度は、－２０℃～１００℃程度が好ましく、－１０℃～５０℃がより好ましい。
ラクトン化反応溶液の脱水縮合剤の濃度は、例えば、１ｍＭ～５Ｍ(以下では、Ｍはｍｏｌ／Ｌを示す)が好ましく、１０ｍＭ～３Ｍがより好ましい。カルボジイミドとHOAtやHOBt等の求核性の高い添加剤とを併用する場合は、それぞれの濃度が上記範囲であることが好ましい。ラクトン化反応溶液のアミンの濃度は、０．０１～２０Ｍが好ましく、０．１Ｍ～１０Ｍがより好ましい。ラクトン化反応の際の反応温度は、－２０℃～１００℃程度が好ましく、－１０℃～５０℃がより好ましい。
（ラクトン化反応を行う相）
ラクトン化反応は、液相でも固相でも行うことができる。試料とラクトン化反応溶液とを接触させることができれば、ラクトン化反応を起こす際の試料の状態は特に限定されない。
ラクトン化反応は、液相でも固相でも行うことができる。試料とラクトン化反応溶液とを接触させることができれば、ラクトン化反応を起こす際の試料の状態は特に限定されない。
固相で反応を行う場合、固相担体としては、糖鎖、糖ペプチド、または糖タンパク質等を固定可能なものであれば、特に制限なく用いることができる。例えば、糖ペプチドまたは糖タンパク質を固定するためには、エポキシ基、トシル基、カルボキシ基、アミノ基等をリガンドとして有する固相担体を用いることができる。また、糖鎖を固定するためには、ヒドラジド基やアミノオキシ基等をリガンドとして有する固相担体を用いることができる。また、イオン化の効率等の観点から、糖鎖を親水性相互作用クロマトグラフィ（以下、ＨＩＬＩＣと呼ぶ）用の担体、すなわち固定相に吸着させることも好ましく、このＨＩＬＩＣ用の担体はアミド基を含むことがさらに好ましい。
試料を固相担体に固定した状態で反応を行うことにより、反応溶液の除去および脱塩精製がより容易となり、試料の調製を簡素化できる。また、固相担体を用いる場合、糖タンパク質または糖ペプチドの状態で試料を固定し、ラクトン化反応後に、PNGase F等のグリコシダーゼ等による切断を行えば、ラクトン化反応後の試料を遊離糖鎖として回収することもできる。
ラクトン化反応後の試料は、必要に応じて、公知の方法等により精製、脱塩、可溶化等の処理が行われてもよい。後述するアミド化反応の前後においても同様である。
固相担体からの試料の遊離については、後述のアミド化反応について述べる条件を採用できる。試料を固相担体に固定した状態で反応を行うことにより、ラクトン化反応後のラクトン化反応溶液の除去等が容易となり、効率よくシアル酸の修飾を行うことができる。 ステップＳ１００３が終了したら、ステップＳ１００５に進む。
（アミド化反応）
ステップＳ１００５において、試料を、反応溶液（以下、アミド化反応溶液と呼ぶ）と接触させ、ステップＳ１００３でラクトン化されたシアル酸をアミド化するアミド化反応が行われ、分析用試料が取得される。発明者らは、加水分解によりラクトンを開環してからカルボキシ基をアミド化する技術的な常識とは全く異なり、ラクトンを迅速に直接アミド化する方法を見出した。この反応は無水条件下でも好適に行われるため、加水分解とは異なる反応であり、アミノ基とラクトンとの相互作用に基づくアミノ分解（アミノリシス）と考えられる。以下では、無水条件下でも可能な、アンモニア、アミンまたはこれらの塩によるラクトンの開環およびアミド化をアミノリシスと呼ぶ。このアミノリシス反応は実質的に脱水縮合剤を必要としないので、ラクトンが形成されていない通常のシアル酸には影響を及ぼすことなく、ラクトン化しているシアル酸のみを選択的にアミド化することが可能である。以下の実施形態では、ラクトン化反応および後述の非特異的修飾反応におけるアミド化を除き、アミノリシスによりアミド化反応を行う例を説明する。
ステップＳ１００５において、試料を、反応溶液（以下、アミド化反応溶液と呼ぶ）と接触させ、ステップＳ１００３でラクトン化されたシアル酸をアミド化するアミド化反応が行われ、分析用試料が取得される。発明者らは、加水分解によりラクトンを開環してからカルボキシ基をアミド化する技術的な常識とは全く異なり、ラクトンを迅速に直接アミド化する方法を見出した。この反応は無水条件下でも好適に行われるため、加水分解とは異なる反応であり、アミノ基とラクトンとの相互作用に基づくアミノ分解（アミノリシス）と考えられる。以下では、無水条件下でも可能な、アンモニア、アミンまたはこれらの塩によるラクトンの開環およびアミド化をアミノリシスと呼ぶ。このアミノリシス反応は実質的に脱水縮合剤を必要としないので、ラクトンが形成されていない通常のシアル酸には影響を及ぼすことなく、ラクトン化しているシアル酸のみを選択的にアミド化することが可能である。以下の実施形態では、ラクトン化反応および後述の非特異的修飾反応におけるアミド化を除き、アミノリシスによりアミド化反応を行う例を説明する。
以下の実施形態において、「シアル酸に形成されているラクトン」のようにシアル酸についてのラクトンに言及する場合、シアル酸と当該シアル酸に隣接する単糖間に形成されたラクトンの他、シアル酸の内部に形成されたラクトン等も指す。
アミド化反応溶液は、アンモニア、アミンまたはこれらの塩を含む反応剤（以下、第２反応剤と呼ぶ）、および、アルカリ化剤（アルカリ化試薬）が含まれる。第２反応剤は、その少なくとも一部がシアル酸に結合することにより、アミド化による修飾を行うためのアミド化反応剤である。第２反応剤は、例えば求核剤である。アルカリ化剤は、アミド化反応溶液のｐＨを上昇させるための化合物である。好ましくは、アミド化反応は、試料をアミド化反応溶液と接触させることのみにより行われ、簡便な操作でラクトンが安定化される。
なお、アミド化反応には脱水縮合剤は必要ではないが、アミド化反応溶液に脱水縮合剤が含まれていてもよい。例えば、ステップＳ１００３で試料に加えたラクトン化反応溶液を除去しないで、アンモニア、アミンまたはこれらの塩、および、アルカリ化剤を加えることにより、アミド化反応溶液を調製してもよい。このように、アミド化反応では、簡便な操作でラクトンを安定化させ得る。アミド化反応では、試料とアミド化反応溶液とを接触させた後、試料と脱水縮合剤とを反応させる操作を行わないとして説明するが、例えば他の目的のため行ってもよい。
なお、アミド化反応には脱水縮合剤は必要ではないが、アミド化反応溶液に脱水縮合剤が含まれていてもよい。例えば、ステップＳ１００３で試料に加えたラクトン化反応溶液を除去しないで、アンモニア、アミンまたはこれらの塩、および、アルカリ化剤を加えることにより、アミド化反応溶液を調製してもよい。このように、アミド化反応では、簡便な操作でラクトンを安定化させ得る。アミド化反応では、試料とアミド化反応溶液とを接触させた後、試料と脱水縮合剤とを反応させる操作を行わないとして説明するが、例えば他の目的のため行ってもよい。
ラクトン化反応溶液が上記第１反応剤を含む場合、アミド化反応溶液に含まれる第２反応剤は、第１反応剤とは異なる。第２反応剤は、本実施形態の分析用試料の調製方法で得られた分析用試料を質量分析で分析する場合、第１反応剤と第２反応剤は質量が異なるように選択される。質量分析の質量分解能に応じて、得られた２種類の修飾体に対し精度よく質量分離が行われるように第１反応剤および第２反応剤が選択される。第１反応剤および第２反応剤は別の種類の物質でもよいし、安定同位体により質量を異ならせた同じ種類の物質でもよい。また、iTRAQに代表されるようなアイソバリック（isobaric）なタグでも良い。この場合、第１段階の質量分析と第２段階の質量分析の間に行われる開裂により得られるプロダクトイオンのｍ／ｚが異なるように当該タグが設計されているため、シアル酸の結合様式やラクトン体の識別はタンデム質量分析（MS/MS）等の二段階以上の質量分析により行うことができる。このように、第１反応剤および第２反応剤によりそれぞれ修飾された修飾体を２以上の段階により質量分析する際に、いずれかの段階で異なるｍ／ｚによりこれらの修飾体を分離することができればよい。本実施形態の分析用試料の調製方法で得られた分析用試料をクロマトグラフィで分析する場合、第１反応剤と第２反応剤とは異なる置換基を有することがクロマトグラフィで互いに分離しやすくするために好ましい。
（アミド化反応におけるアミン）
以下の実施形態では、「アミン」の語は、ヒドラジン、ヒドラジン誘導体およびヒドロキシアミンを含み、アンモニアおよびアンモニアの塩を含まないものとする。アミド化反応においてアミンを用いる場合、第２反応剤に含まれるアミンは、アミノ基に結合した炭素原子に１以下の炭素原子が直接結合している第一級アミン、ヒドラジン、ヒドラジン誘導体およびヒドロキシアミンならびにこれらの塩から選択される少なくとも一つの化合物である。上述のように、第一級アミンの場合、炭素鎖に分枝を有していても、アミノ基から離れた位置に分枝があればアミド化反応の効率の低下が抑えられるため好ましい。
以下の実施形態では、「アミン」の語は、ヒドラジン、ヒドラジン誘導体およびヒドロキシアミンを含み、アンモニアおよびアンモニアの塩を含まないものとする。アミド化反応においてアミンを用いる場合、第２反応剤に含まれるアミンは、アミノ基に結合した炭素原子に１以下の炭素原子が直接結合している第一級アミン、ヒドラジン、ヒドラジン誘導体およびヒドロキシアミンならびにこれらの塩から選択される少なくとも一つの化合物である。上述のように、第一級アミンの場合、炭素鎖に分枝を有していても、アミノ基から離れた位置に分枝があればアミド化反応の効率の低下が抑えられるため好ましい。
第２反応剤は、直鎖炭化水素基を有する第一級アミンがより好ましく、直鎖アルキル基を有する第一級アミンがさらに好ましい。第２反応剤は、直鎖アルキル基を有する第一級アミンとしては、炭素数が１０以下の第一級アミンが好ましく、炭素数が６以下の第一級アミン、すなわち、メチルアミン、エチルアミン、プロピルアミン、ブチルアミン、ペンチルアミンおよびヘキシルアミンがさらに好ましく、メチルアミンが最も好ましい。アミド化反応溶液に含まれるアミンが分枝（以下、「分枝」は炭化水素鎖の分枝を示す）を有しない直鎖状の構造を有していたり、炭素数が少ない方が、より効率的にラクトンがアミド化されるため好ましい。
第２反応剤に含まれるヒドラジン誘導体は、特に限定されない。以下の実施形態では、アセトヒドラジド、酢酸ヒドラジド、ベンゾヒドラジドおよび安息香酸ヒドラジド等のヒドラジドもヒドラジン誘導体に含まれ、第２反応剤として用いることができる。第２反応剤に含まれるヒドラジン誘導体は、メチルヒドラジン、エチルヒドラジン、プロピルヒドラジン、ブチルヒドラジン、フェニルヒドラジンおよびベンジルヒドラジン、ならびに、アセトヒドラジド、酢酸ヒドラジド、ベンゾヒドラジドおよび安息香酸ヒドラジドからなる群から選択される少なくとも一つの化合物とすることができる。第２反応剤としてのヒドラジンまたはその誘導体は、アミド化反応の効率を高めるまたは維持する観点から、ヒドラジンまたはメチルヒドラジンが好ましい。
第２反応剤が不飽和鎖式炭化水素基を有する第一級アミンの場合、当該不飽和鎖式炭化水素基は二重結合を含むことが好ましく、当該不飽和鎖式炭化水素基はアリル（Allyl）基を含むことがより好ましく、当該アミンはアリルアミン（Allylamine）がさらに好ましい。第２反応剤はヒドロキシ基を含む第一級アミンでもよく、この場合、エタノールアミンが好ましい。アミド化反応溶液に含まれるアミンはアルキル基以外の様々な官能基を含んでもよい。糖鎖がアミド化反応の結果このような官能基を含むように修飾されることにより、当該修飾を受けた糖鎖を、質量分析だけではなく、クロマトグラフィ等によってもより分離しやすくなる。
第２反応剤は、アンモニア、および第２反応剤として上述したアミンの塩とすることができる。安定同位体等の質量等の性質が変化した化合物および、機能が変化するように特定の修飾がされた化合物は、塩の状態で販売または流通していることが多い。従って、第２反応剤としてこれらの塩を用いることで、分析法をより柔軟または適切に選択できる。また、塩を用いるとアミド化反応溶液のｐＨを高くしづらい場合があるが、本実施形態の分析用試料の調製方法では、アルカリ化剤を用いるため、このデメリットも解消することができる。
第２反応剤に含まれるアンモニアまたはアミンの塩としては、アンモニアまたはアミンの無機酸塩または有機酸塩が挙げられ、炭酸塩、塩酸塩、硝酸塩、硫酸塩、リン酸塩またはメタンスルホン酸塩のような無機塩が好ましく、炭酸塩、塩酸塩および硝酸塩がより好ましく、塩酸塩がさらに好ましい。直鎖炭化水素基を有する第一級アミンの塩酸塩としては、メチルアミン塩酸塩、エチルアミン塩酸塩、プロピルアミン塩酸塩、ブチルアミン塩酸塩、ペンチルアミン塩酸塩がより好ましく、メチルアミン塩酸塩がさらに好ましい。 なお、第２反応剤が塩でない場合でも、アルカリ化剤によりｐＨを上昇させることで、より効率的にアミド化を行うことができる。
（アミド化反応におけるアルカリ化剤について）
アミド化反応溶液に含まれるアルカリ化剤は、アミド化反応溶液のｐＨを上昇させる化合物であれば、特に限定されない。しかし、アルカリ化剤がアミンである場合、第２反応剤と同様にアミド化反応によりアルカリ化剤がシアル酸に結合してしまう可能性がある。この場合、後述する質量分析またはクロマトグラフィの際にマススペクトルまたはクロマトグラムのピークが分裂してしまうため好ましくない。従って、アルカリ化剤がアミンである場合、第２反応剤よりもシアル酸に結合しにくいことが好ましい。例えば、アルカリ化剤に含まれるアミンは第２反応剤よりも立体障害の大きいアミンとすることができる。この観点から、アルカリ化剤がアミンである場合、アルカリ化剤は、アミノ基に結合した炭素原子に２以上の炭素原子が直接結合している分岐型第一級アミン、第二級アミンおよび第三級アミンからなる群から選ばれる少なくとも一つのアミンである。ここでも、「分岐型」とは炭素鎖が分枝を有することを示す。
アミド化反応溶液に含まれるアルカリ化剤は、アミド化反応溶液のｐＨを上昇させる化合物であれば、特に限定されない。しかし、アルカリ化剤がアミンである場合、第２反応剤と同様にアミド化反応によりアルカリ化剤がシアル酸に結合してしまう可能性がある。この場合、後述する質量分析またはクロマトグラフィの際にマススペクトルまたはクロマトグラムのピークが分裂してしまうため好ましくない。従って、アルカリ化剤がアミンである場合、第２反応剤よりもシアル酸に結合しにくいことが好ましい。例えば、アルカリ化剤に含まれるアミンは第２反応剤よりも立体障害の大きいアミンとすることができる。この観点から、アルカリ化剤がアミンである場合、アルカリ化剤は、アミノ基に結合した炭素原子に２以上の炭素原子が直接結合している分岐型第一級アミン、第二級アミンおよび第三級アミンからなる群から選ばれる少なくとも一つのアミンである。ここでも、「分岐型」とは炭素鎖が分枝を有することを示す。
上記分岐型第一級アミンの例は、イソプロピルアミン、セカンダリーブチルアミン（sec-ブチルアミン）、ターシャリーブチルアミン（tert-ブチルアミン）、２－ヘキサンアミンまたは１，３－ジメチルアミラミンを含むことができる。上記分岐型第一級アミンは、入手の容易さ、取扱いの簡便さ、溶解性、反応性または水溶性等の観点から、炭素数が３～７の分子が好ましく、イソプロピルアミン、sec-ブチルアミンまたはtert-ブチルアミンがより好ましい。アルカリ化剤は、１種類の第一級アミンを含んでもよいし、任意の割合で２種類以上の第一級アミンを含んでもよい。
アルカリ化剤に含まれる第二級アミンは、ジアルキルアミン、第二級環状アルキルアミンまたは二級芳香族アミンとすることができる。ジアルキルアミンは、総炭素数が１～１０であることが好ましく、１～６であることがより好ましく、例えば、ジメチルアミン、ジエチルアミンまたはジブチルアミンとすることができる。第二級環状アルキルアミンは、総炭素数が１～１０であることが好ましく、４～１０であることがより好ましく、例えば、ピペリジンや2,2,6,6-テトラメチルピペリジンとすることができる。モルホリンのように、環状構造の一部に炭素や水素以外の原子が使われていてもよい。二級芳香族アミンは、総炭素数が７～２０であることが好ましく、７～１５であることがより好ましく、例えば、メチルアニリン、フェニルメチルアミンまたはジフェニルアミンとすることができる。第二級アミンは、入手の容易さ、取扱いの簡便さ、溶解性、反応性または水溶性等の観点から、ジアルキルアミンが好ましく、ジメチルアミン、ジエチルアミンまたはジブチルアミンがより好ましい。アルカリ化剤は、１種類の第二級アミンを含んでもよいし、任意の割合で２種類以上の第二級アミンを含んでもよい。
アルカリ化剤に含まれる第三級アミンは、トリアルキルアミン、第三級環状アルキルアミン、または三級芳香族アミンとすることができる。トリアルキルアミンは、総炭素数が１～１０であることが好ましく、１～６であることがより好ましく、例えば、トリメチルアミン、トリエチルアミンまたはトリブチルアミンとすることができる。第三級環状アルキルアミンは、総炭素数が１～１０であることが好ましく、４～１０であることがより好ましく、例えば、N-メチルピペリジンとすることができる。N-メチルモルホリンのように、環状構造の一部に炭素や水素以外の原子が使われていてもよい。三級芳香族アミンは、総炭素数が８～２０であることが好ましく、８～１５であることがより好ましく、例えば、ジメチルアニリン、ジフェニルメチルアミンまたはトリフェニルアミンとすることができる。第三級アミンは、入手の容易さ、取扱いの簡便さ、溶解性、反応性または水溶性等の観点から、トリアルキルアミンまたはＮ－メチルモルホリンが好ましく、トリメチルアミン、トリエチルアミンまたはトリブチルアミンがより好ましい。アルカリ化剤は、１種類の第三級アミンを含んでもよいし、任意の割合で２種類以上の第二級アミンを含んでもよい。
一例として、アルカリ化剤は、第四級アンモニウムカチオン、第三級アミン、第二級アミンおよびアミノ基に結合した炭素原子に２以上の炭素原子が直接結合している第一級アミン、アルカリ金属の水酸化物、アルカリ土類金属の水酸化物およびテトラアルキルアンモニウムの水酸化物、グアニジンおよびグアニジン誘導体、ならびにこれらの塩、ならびに、アルカリ緩衝液からなる群から選択される少なくとも一つを含むことができる。
アルカリ化剤に含まれる第四級アンモニウムカチオンは、特に限定されないが、例えば、テトラアルキルアンモニウムカチオン、テトラアルキルホスホニウムカチオン、イミダゾリウムカチオン、ピラゾリウムカチオン、ピリジニウムカチオンまたはピリミジニウムカチオンとすることができる。アルカリ化剤は、１種類の第四級アンモニウムカチオンを含んでもよいし、任意の割合で２種類以上の第四級アンモニウムカチオンを含んでもよい。
アルカリ化剤に含まれる水酸化物は、アルカリ金属の水酸化物、アルカリ土類金属の水酸化物、またはテトラアルキルアンモニウムの水酸化物であれば、特に限定されない。アルカリ金属の水酸化物としては、水酸化カルシウム（Ｃａ（ＯＨ）２）、水酸化リチウム（ＬｉＯＨ）、水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）、水酸化カリウム（ＫＯＨ）、水酸化ルビジウム（ＲｂＯＨ）、および水酸化セシウム（ＣｓＯＨ）からなる群から選択される少なくとも１種を好適に使用することができる。アルカリ土類金属の水酸化物としては、水酸化ストロンチウム（Ｓｒ（ＯＨ）２）、水酸化バリウム（Ｂａ（ＯＨ）２）、水酸化ユウロピウム（ＩＩ）（Ｅｕ（ＯＨ）２）、および水酸化タリウム（Ｉ）（ＴｌＯＨ）からなる群から選択される少なくとも１種を好適に使用することができる。テトラアルキルアンモニウムの水酸化物としては、水酸化テトラメチルアンモニウム（Ｎ（ＣＨ３）４ＯＨ）、および水酸化テトラエチルアンモニウム（Ｎ（Ｃ２Ｈ５）４ＯＨ）からなる群から選択される少なくとも１種を好適に使用することができる。アルカリ化剤は、１種類の水酸化物を含んでもよいし、任意の割合で２種類以上の水酸化物を含んでもよい。
アルカリ化剤に含まれるグアニジン誘導体は、特に限定されないが、例えば１，１，３，３‐テトラメチルグアニジンまたは１，１，３，３‐テトラエチルグアニジンとすることができる。アルカリ化剤は、１種類のグアニジン誘導体を含んでもよいし、任意の割合で２種類以上のグアニジン誘導体を含んでもよい。
アルカリ化剤に含まれる、上記分岐型第一級アミン、第二級アミンの塩、第三級アミンの塩、グアジニン及びグアジニン誘導体の塩としては、無機酸塩または有機酸塩が挙げられ、炭酸塩、塩酸塩、硝酸塩、硫酸塩、リン酸塩またはメタンスルホン酸塩のような無機塩が好ましい。
アルカリ化剤に含まれるアルカリ緩衝液の種類は特に限定されないが、例えばTris緩衝液、Good緩衝液、ホウ酸塩緩衝液、および炭酸塩緩衝液からなる群から選択される少なくとも一つとすることができる。
なお、以下の実施形態において、「試料にアミド化反応溶液を加える」または「試料とアミド化反応溶液とを接触させる」等と記載した際は、以下の第１および第２のいずれの場合も含むものとする。第１の場合は、第２反応剤を含む溶液と、アルカリ化剤を含む溶液とを別々に調製し、いずれかを先にして順々に両溶液を試料に加えて混合する場合である。第２の場合は、第２反応剤とアルカリ化剤とを含むアミド化反応溶液を調製し、試料に加える場合である。上述のラクトン化反応溶液でも同様である。
（アミド化反応溶液の濃度）
アミド化反応溶液における第２反応剤の濃度は、特に限定されないが、０．１Ｍ（Ｍはｍｏｌ／ｌ）以上が好ましく、０．３Ｍ以上がより好ましく、０．５Ｍ以上がさらに好ましく、１．０Ｍ以上がさらに好ましく、３．０Ｍ以上が最も好ましい。好適な例として、アミド化反応溶液は、アンモニアまたは上記第一級アミン、特にメチルアミンを含み、当該アンモニア、またはメチルアミン等の上記第一級アミンの濃度は、０．１Ｍ以上が好ましく、０．３Ｍ以上がより好ましく、０．５Ｍ以上がさらに好ましく、１．０Ｍ以上が一層好ましく、３．０Ｍ以上が最も好ましい。アミド化反応溶液における第２反応剤の濃度が高いほど、より確実にラクトンのアミド化を行うことができる。アミド化反応溶液のアルカリ化剤の濃度は、アミド化反応溶液のｐＨを所望の値以上にすることができ、アルカリ化剤が第２反応剤と異なる修飾体としてシアル酸に結合することで分析の精度に悪影響を与えたりすることがなければ特に限定されない。一例をあげると、アルカリ化剤、特にtert-ブチルアミンの濃度は、アミド化を効率よく起こす観点から、体積／体積％で０．１０％以上が好ましく、０．３０％以上がより好ましく、１％以上がさらに好ましく、３％以上がより一層好ましい。アルカリ化剤の濃度は、特にtert-ブチルアミンの濃度は、適宜８０％以下、６０％以下等にすることができる。
アミド化反応溶液における第２反応剤の濃度は、特に限定されないが、０．１Ｍ（Ｍはｍｏｌ／ｌ）以上が好ましく、０．３Ｍ以上がより好ましく、０．５Ｍ以上がさらに好ましく、１．０Ｍ以上がさらに好ましく、３．０Ｍ以上が最も好ましい。好適な例として、アミド化反応溶液は、アンモニアまたは上記第一級アミン、特にメチルアミンを含み、当該アンモニア、またはメチルアミン等の上記第一級アミンの濃度は、０．１Ｍ以上が好ましく、０．３Ｍ以上がより好ましく、０．５Ｍ以上がさらに好ましく、１．０Ｍ以上が一層好ましく、３．０Ｍ以上が最も好ましい。アミド化反応溶液における第２反応剤の濃度が高いほど、より確実にラクトンのアミド化を行うことができる。アミド化反応溶液のアルカリ化剤の濃度は、アミド化反応溶液のｐＨを所望の値以上にすることができ、アルカリ化剤が第２反応剤と異なる修飾体としてシアル酸に結合することで分析の精度に悪影響を与えたりすることがなければ特に限定されない。一例をあげると、アルカリ化剤、特にtert-ブチルアミンの濃度は、アミド化を効率よく起こす観点から、体積／体積％で０．１０％以上が好ましく、０．３０％以上がより好ましく、１％以上がさらに好ましく、３％以上がより一層好ましい。アルカリ化剤の濃度は、特にtert-ブチルアミンの濃度は、適宜８０％以下、６０％以下等にすることができる。
（アミド化反応溶液の溶媒）
アミド化反応溶液の溶媒は、アミド化を確実に起こす観点から水系溶媒または水系溶媒と有機溶媒の混合溶媒が好ましい。アミド化反応溶液の溶媒は、例えば、水、メタノール、エタノール、ジメチルスルホキシド(DMSO)またはアセトニトリル水溶液とすることができる。
アミド化反応溶液の溶媒は、アミド化を確実に起こす観点から水系溶媒または水系溶媒と有機溶媒の混合溶媒が好ましい。アミド化反応溶液の溶媒は、例えば、水、メタノール、エタノール、ジメチルスルホキシド(DMSO)またはアセトニトリル水溶液とすることができる。
（アミド化反応溶液のｐＨ）
アミド化反応溶液のｐＨは、７．７以上である。アミド化反応溶液のｐＨは、８．０以上が好ましく、８．８以上がより好ましく、１０．３以上がさらに好ましい。アミド化反応溶液のｐＨが高くなると、加水分解等の副反応が抑制されたり、様々な第２反応剤を用いてより確実にラクトンがアミド化されるため好ましい。
アミド化反応溶液のｐＨは、７．７以上である。アミド化反応溶液のｐＨは、８．０以上が好ましく、８．８以上がより好ましく、１０．３以上がさらに好ましい。アミド化反応溶液のｐＨが高くなると、加水分解等の副反応が抑制されたり、様々な第２反応剤を用いてより確実にラクトンがアミド化されるため好ましい。
（アミド化反応を起こすための時間）
アミド化反応は、数秒～数分以内に完了する。従って、アミド化反応によりラクトンをアミド化するために、試料をアミド化反応溶液と接触させる時間（以下、反応時間と呼ぶ）は、１時間未満が好ましく、３０分未満がより好ましく、１５分未満がさらに好ましく、５分未満がさらに好ましく、１分未満が最も好ましい。好適には、試料をアミド化反応溶液で洗浄したり、担体等に保持されている試料に対して一時的に通液するだけでもよい。試料とアミド化反応溶液とが接触する時間は、特に限定されないが、反応を十分完了させる等の観点から適宜０．１秒以上または１秒以上等とすることができる。また、試料とアミド化反応溶液を混合し、そのまま反応時間を設けずに乾固してもよい。このように、アミド化反応は短時間に完了するため、不安定なラクトンが分解し糖鎖の解析における定量性が損なわれることを抑制することができる。また、アミド化反応の反応時間を短く設定することで、より効率的に試料の解析を行うことができる。
アミド化反応は、数秒～数分以内に完了する。従って、アミド化反応によりラクトンをアミド化するために、試料をアミド化反応溶液と接触させる時間（以下、反応時間と呼ぶ）は、１時間未満が好ましく、３０分未満がより好ましく、１５分未満がさらに好ましく、５分未満がさらに好ましく、１分未満が最も好ましい。好適には、試料をアミド化反応溶液で洗浄したり、担体等に保持されている試料に対して一時的に通液するだけでもよい。試料とアミド化反応溶液とが接触する時間は、特に限定されないが、反応を十分完了させる等の観点から適宜０．１秒以上または１秒以上等とすることができる。また、試料とアミド化反応溶液を混合し、そのまま反応時間を設けずに乾固してもよい。このように、アミド化反応は短時間に完了するため、不安定なラクトンが分解し糖鎖の解析における定量性が損なわれることを抑制することができる。また、アミド化反応の反応時間を短く設定することで、より効率的に試料の解析を行うことができる。
（アミド化反応を行う相）
試料とアミド化反応溶液とを接触させることができれば、アミド化反応を起こす際の試料の状態は特に限定されず、固相でも液相でもよい。液相でアミド化反応を行う場合、上述したようにラクトン化反応後の溶液を残したまま試料にアミド化反応溶液を加えてもよいし、ラクトン化反応後に精製、脱塩、可溶化等の公知の前処理を行ってもよい。固相に固定した状態でアミド化反応が行われる場合、固相でラクトン化反応に供した試料を、固相に固定した状態を維持して、アミド化反応を行ってもよい。また、試料をラクトン化反応に供した後、固相に固定してアミド化反応を行ってもよい。
試料とアミド化反応溶液とを接触させることができれば、アミド化反応を起こす際の試料の状態は特に限定されず、固相でも液相でもよい。液相でアミド化反応を行う場合、上述したようにラクトン化反応後の溶液を残したまま試料にアミド化反応溶液を加えてもよいし、ラクトン化反応後に精製、脱塩、可溶化等の公知の前処理を行ってもよい。固相に固定した状態でアミド化反応が行われる場合、固相でラクトン化反応に供した試料を、固相に固定した状態を維持して、アミド化反応を行ってもよい。また、試料をラクトン化反応に供した後、固相に固定してアミド化反応を行ってもよい。
固相でアミド化反応を行う場合、固相担体としては、ラクトン化反応に関して上述したものと同様のものを使用できる。固相担体への試料の固定については、ラクトン化反応に関して上述した条件を用いることができる。アミド化反応を固相で行う場合、固相担体に固定された試料に、アミド化反応溶液を作用させてアミド化を行った後は、化学的手法または酵素反応等により、担体から試料を遊離させて回収すればよい。例えば、担体に固定された糖タンパク質や糖ペプチドを、PNGase F等のグリコシダーゼやトリプシン等の消化酵素により酵素的に切断し回収してもよく、ヒドラジド基を有する固相担体に結合している糖鎖を、弱酸性溶液により遊離させて回収してもよい。ＨＩＬＩＣでは、アセトニトリル等を溶媒としたアミド化反応溶液によりアミド化反応を行い、水等の水系溶液により試料を溶出することができる。
上述した調製方法により得られた分析用試料では、ラクトン化反応溶液に第１反応剤を含めた場合、α２，６－シアル酸等のラクトン化されにくい結合様式のシアル酸はラクトン化反応において第１反応剤により修飾される。α２，３－、α２，８－およびα２，９－シアル酸等のラクトン化されやすい結合様式のシアル酸はラクトン化反応においてラクトン化され、アミド化反応において第２反応剤により修飾される。
ステップＳ１００５が終了したら、ステップＳ１００７に進む。
ステップＳ１００５が終了したら、ステップＳ１００７に進む。
ステップＳ１００７において、分析用試料を質量分析およびクロマトグラフィの少なくとも一つにより分析する。
上述のラクトン化反応およびアミド化反応により、各反応で修飾を受けた糖鎖はそれぞれ質量が異なっている。従って、質量分析によりこれらの糖鎖を、シアル酸の結合様式に基づいて分離することができる。
質量分析におけるイオン化の方法は特に限定されず、マトリックス支援レーザ脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）法、エレクトロスプレー（ＥＳＩ）法、ナノエレクトロスプレーイオン化（ｎａｎｏ－ＥＳＩ）法等を用いることができる。イオン化の方法は特にＭＡＬＤＩ法が好ましい。質量分析におけるイオン化では、正イオンモードおよび負イオンモードのいずれを用いてもよい。質量分析は、シングル質量分析でも多段階で行ってもよく、これによりシアル酸の結合様式以外の糖鎖の構造や、ペプチド鎖の構造を好適に解析することができる。質量分析計としては、四重極型、イオントラップ型および飛行時間型等の任意の質量分析器を少なくとも一つ以上組み合わせて用いることができる。イオンの解離またはイオンへの原子若しくは原子団の付加等も適宜行うことができる。
クロマトグラフィで分析を行う場合、液体クロマトグラフィが好ましい。液体クロマトグラフィに用いるカラムは特に限定されず、Ｃ３０、Ｃ１８、Ｃ８、Ｃ４等の疎水性逆相カラムまたはカーボンカラム、ＨＩＬＩＣ用の順相カラムなどを適宜用いることができる。液体クロマトグラフィを行った後、質量分析により測定を行うことが複数回の分離により精密に試料中の成分の分析を行う上で好ましい。この場合、液体クロマトグラフ－質量分析計（ＬＣ－ＭＳ）により、液体クロマトグラフからの溶出液をオンライン制御で質量分析計において直接ＥＳＩ等によりイオン化することがより好ましい。
質量分析またはクロマトグラフィにより得られたデータが解析され、試料に含まれていた糖鎖におけるシアル酸の解析等が行われる。このデータ解析では、シアル酸の結合様式を含む糖鎖の構造の推定等を行うことができる。質量分析またはクロマトグラフィにより得られたデータの解析方法は特に限定されない。
ステップＳ１００７が終了したら、処理を終了する。
ステップＳ１００７が終了したら、処理を終了する。
（糖ペプチドおよび糖タンパク質の副反応の抑制について）
糖ペプチドまたは糖タンパク質にラクトン化反応溶液およびアミド化反応溶液を加え、上述のようにシアル酸を修飾した場合、糖ペプチドまたは糖タンパク質に含まれるアミノ酸の側鎖、主鎖の末端にあるアミノ基およびカルボキシ基の間で分子内脱水縮合等の副反応が起こる場合がある。この場合、分析対象の糖鎖に対応するマススペクトルのピークが分かれてしまい、解析が難しくなってしまう問題があった。
糖ペプチドまたは糖タンパク質にラクトン化反応溶液およびアミド化反応溶液を加え、上述のようにシアル酸を修飾した場合、糖ペプチドまたは糖タンパク質に含まれるアミノ酸の側鎖、主鎖の末端にあるアミノ基およびカルボキシ基の間で分子内脱水縮合等の副反応が起こる場合がある。この場合、分析対象の糖鎖に対応するマススペクトルのピークが分かれてしまい、解析が難しくなってしまう問題があった。
発明者らは、ペプチド部分の副反応は主にアミノ基の存在に由来することを明らかにし、シアル酸修飾の前にアミノ基を化学修飾などで先にブロックしておくことで、シアル酸修飾時にペプチド部分の副反応を抑制出来ることを明らかにした。詳細は、以下の文献を参照されたい：Takashi Nishikaze, Sadanori Sekiya, Shinichi Iwamoto, Koichi Tanaka. “A Universal Approach to linkage-Specific Derivatization for Sialic Acids on Glycopeptides,” Journal of The American Society for Mass Spectrometry, 2017年6月, Volume 28, Issue 1 Supplement, ポスター番号MP091。本実施形態に係るラクトン化反応等による修飾もこれと同様に糖ペプチドおよび糖タンパク質に用いることができる。例えば、糖ペプチドまたは糖タンパク質に対してジメチルラベル化またはグアニジル化などのアミノ基をブロックする反応を行い、ラクトン化反応およびアミド化反応を行う。このとき、シアル酸の結合様式に応じてラクトンを形成させる手法を用いれば、シアル酸の結合様式を識別することもできる。
なお、糖ぺプチドの中にはアミノ酸配列に基づく特性上副反応を生じ難いものがある。例えば、ＩｇＧのＦｃ領域をトリプシン等の消化酵素により消化することによって生成した糖ペプチドは、リジンを有さず、Ｎ末端のアミノ基も脱水縮合剤の存在下で速やかに環化脱水してピログルタミル化する。その結果、アミノ基が存在しなくなるので、ジメチルアミド化またはグアニジル化など事前のアミノ基のブロッキングは必要ない。このような糖ペプチドに関しては、アミノ基のブロッキングを行わずにラクトン化反応およびアミド化反応を行うことにより解析に足るマススペクトルを得ることが可能となる。
（分析用試料の調製用キットについて）
本実施形態の分析用試料の調製方法に好適に用いられる分析用試料の調製用キット（以下、調製用キットと呼ぶ）が提供される。調製用キットは、試薬若しくは、試薬以外の質量分析に用いられる任意の消耗品または、本実施形態における分析用試料を調製するためのプロトコル若しくは当該プロトコルが記載されているＷｅｂサイトのＵＲＬ等が記載された文書を含むことができる。例えば、調製用キットは、アミド化反応におけるアルカリ化剤またはアルカリ化剤を含む溶液を含むことができる。調製用キットを用いて分析用試料を調製することにより、より効率的に分析用試料を調製することができる。
本実施形態の分析用試料の調製方法に好適に用いられる分析用試料の調製用キット（以下、調製用キットと呼ぶ）が提供される。調製用キットは、試薬若しくは、試薬以外の質量分析に用いられる任意の消耗品または、本実施形態における分析用試料を調製するためのプロトコル若しくは当該プロトコルが記載されているＷｅｂサイトのＵＲＬ等が記載された文書を含むことができる。例えば、調製用キットは、アミド化反応におけるアルカリ化剤またはアルカリ化剤を含む溶液を含むことができる。調製用キットを用いて分析用試料を調製することにより、より効率的に分析用試料を調製することができる。
－第２実施形態－
第２実施形態の分析用試料の調製方法は、第１実施形態の分析用試料の調製方法と同様のアミド化反応が行われるが、ラクトン化反応を行わず、試料に元々含まれていたラクトンをアミド化反応によりアミド化する点が第１実施形態と異なっている。
第２実施形態の分析用試料の調製方法は、第１実施形態の分析用試料の調製方法と同様のアミド化反応が行われるが、ラクトン化反応を行わず、試料に元々含まれていたラクトンをアミド化反応によりアミド化する点が第１実施形態と異なっている。
（試料について）
試料は、特に限定されず、上述の第１実施形態と同様の試料を用いることができる。糖脂質のガングリオシドおよびミルクオリゴ糖鎖にラクトンが存在することが知られている。脳内によく発現しているポリシアル酸構造は、α２，８－やα２，９－の結合様式のシアル酸を含むが、これらはラクトンが形成されやすいとも言われている。バイオ医薬品、特に抗体医薬品の糖鎖にラクトンが含まれることが知られている。例えば、このような試料において存在するラクトンを定量したり、あるいはラクトンが存在するか未知の試料に対してラクトンが存在するか否かを調べるために、本実施形態の分析用試料の調製方法を用いることができる。
試料は、特に限定されず、上述の第１実施形態と同様の試料を用いることができる。糖脂質のガングリオシドおよびミルクオリゴ糖鎖にラクトンが存在することが知られている。脳内によく発現しているポリシアル酸構造は、α２，８－やα２，９－の結合様式のシアル酸を含むが、これらはラクトンが形成されやすいとも言われている。バイオ医薬品、特に抗体医薬品の糖鎖にラクトンが含まれることが知られている。例えば、このような試料において存在するラクトンを定量したり、あるいはラクトンが存在するか未知の試料に対してラクトンが存在するか否かを調べるために、本実施形態の分析用試料の調製方法を用いることができる。
図２は、本実施形態の分析用試料の調製方法に係る分析方法の流れを示すフローチャートである。ステップＳ２００１は、上述の実施形態におけるステップＳ１００１と同様であるため説明を省略する。ステップＳ２００１が終了したら、ステップＳ２００３に進む。
ステップＳ２００３において、試料を、アミド化反応溶液と接触させ、試料に元々含まれていたシアル酸をアミド化するアミド化反応が行われ、分析用試料が取得される。アミド化反応は、上述の実施形態と同様のアミド化反応溶液を用い、同様の条件で行うことができる。ステップＳ２００３が終了したら、ステップＳ２００５に進む。ステップＳ２００５は、上述の実施形態におけるステップＳ１００７と同様であるため説明を省略する。
なお、ステップＳ２００３でアミド化反応を行った後、上述の実施形態におけるラクトン化反応およびさらなるアミド化反応を行ってもよい。ラクトン化反応の前に行ったアミド化反応を第１アミド化反応、ラクトン化反応の後に行ったアミド化反応を第２アミド化反応と呼ぶ。第１アミド化反応、ラクトン化反応および第２アミド化反応において、シアル酸と結合させる反応剤の種類を異ならせることが好ましい。この場合、試料に元々含まれていたラクトンと、試料で元々ラクトン化されていなかったα２，３－シアル酸、α２，８－シアル酸およびα２，９－シアル酸と、α２，６－シアル酸とを異なる修飾体により修飾することができる。これにより、試料に元々含まれていたシアル酸ラクトンの解析を行うことができる他、結合様式特異的なシアル酸の解析を行うことができる。
あるいは、ステップＳ２００３でアミド化反応を行った後、結合様式非特異的にシアル酸をアミド化またはエステル化する反応（以下、非特異的修飾反応と呼ぶ）を行ってもよい。この場合、アミド化反応に供した試料を、非特異的修飾反応のための反応溶液（以下、非特異的修飾反応溶液と呼ぶ）と接触させ、ステップＳ２００３のアミド化反応の前に試料に含まれていた、ラクトンが形成されていないシアル酸が修飾される。非特異的修飾反応では、シアル酸の結合様式に関係なく、試料に含まれるアミド化されていない各シアル酸が修飾され、分析用試料が得られる。
非特異的修飾反応溶液は、脱水縮合剤と、アルコール、アンモニア、アミンまたはこれらの塩を含む第３反応剤とを含む。第３反応剤は、その少なくとも一部が結合様式非特異的にシアル酸と結合することによりシアル酸のエステル化またはアミド化の修飾を行うための反応剤である。第３反応剤は、例えば求核剤として機能する。第３反応剤は、第２反応剤および第３反応剤による修飾で得られた修飾体が、上述のように質量分析またはクロマトグラフィで区別されて検出されるように選択される。非特異的修飾反応における脱水縮合剤は、上述の特許文献１の第二反応で用いられるホスホニウム系脱水縮合剤またはウロニウム系脱水縮合剤を用いることができる。非特異的修飾反応における第３反応剤は、上述の特許文献１の「第二反応」で用いられるアミンまたは、メタノール若しくはエタノール等のアルコールを用いることができる。また、非特異的エステル化反応として１－メチル－３－ｐ－トリルトリアゼン（1-Methyl-3-p-tolyltriazene）や１－エチル－３－ｐ－トリルトリアゼン（1-Ethyl-3-p-tolyltriazene）のようなエステル化剤を用いることもできる。このようなエステル化剤を用いる場合は脱水縮合剤は必要ではない。
なお、非特異的修飾反応では、ステップＳ２００３のアミド化反応での修飾とは異なる修飾を糖鎖に含まれるシアル酸に行うことができれば、反応の種類または反応溶液の組成等は特に特に限定されない。
なお、非特異的修飾反応では、ステップＳ２００３のアミド化反応での修飾とは異なる修飾を糖鎖に含まれるシアル酸に行うことができれば、反応の種類または反応溶液の組成等は特に特に限定されない。
（態様）
上述した複数の例示的な実施形態またはその変形は、以下の態様の具体例であることが当業者により理解される。
上述した複数の例示的な実施形態またはその変形は、以下の態様の具体例であることが当業者により理解される。
（第１項）一態様に係る分析用試料の調製方法は、糖鎖を含む試料を用意することと、前記試料を、前記糖鎖に含まれるラクトンと反応させるアンモニア、アミノ基に結合した炭素原子に１以下の炭素原子が直接結合している第一級アミン、ヒドラジン、ヒドラジン誘導体およびヒドロキシアミンならびにこれらの塩からなる群から選択される少なくとも一つの第１化合物とアルカリ化剤とを含む、ｐＨが７．７以上のアミド化反応溶液と接触させ、前記ラクトンをアミド化するアミド化反応を行うこととを備え、前記アルカリ化剤がアミンである場合、前記アルカリ化剤は、アミノ基に結合した炭素原子に２以上の炭素原子が直接結合している分岐型第一級アミン、第二級アミンおよび第三級アミンからなる群から選ばれる少なくとも一つのアミンである。これにより、糖鎖に含まれるラクトンをより効率的にアミド化することができる。
（第２項）他の一態様に係る分析用試料の調製方法では、第１項に記載の分析用試料の調製方法において、前記アルカリ化剤は、第四級アンモニウムカチオン、第三級アミン、第二級アミンおよびアミノ基に結合した炭素原子に２以上の炭素原子が直接結合している分岐型第一級アミン、アルカリ金属の水酸化物、アルカリ土類金属の水酸化物およびテトラアルキルアンモニウムの水酸化物、グアニジンおよびグアニジン誘導体、ならびにこれらの塩、ならびにアルカリ緩衝液からなる群から選択される少なくとも一つの化合物を含み、前記アルカリ緩衝液は、Tris緩衝液、Good緩衝液、ホウ酸緩衝液および炭酸塩緩衝液からなる群から選択される少なくとも一つである。これにより、より確実にアミド化反応溶液のｐＨを上昇させ、糖鎖に含まれるラクトンをアミド化することができる。
（第３項）他の一態様に係る分析用試料の調製方法では、第１項または第２項に記載の分析用試料の調製方法において、前記第１化合物は、アンモニア、アミン、ヒドロキシアミン、ヒドラジンおよびヒドラジン誘導体から選択される少なくとも一つの化合物の炭酸塩、塩酸塩、硝酸塩、硫酸塩、リン酸塩またはメタンスルホン酸塩である。これにより、分析法をより柔軟または適切に選択できる。
（第４項）他の一態様に係る分析用試料の調製方法では、第１項から第３項までのいずれかに記載の分析用試料の調製方法において、前記アミド化反応は、前記試料を前記アミド化反応溶液と接触させることのみにより行われる。これにより、簡便に分析用試料の調製を行うことができる。
（第５項）他の一態様に係る分析用試料の調製方法では、第１項から第４項までのいずれかに記載の分析用試料の調製方法において、前記アミド化反応溶液は前記ラクトンと反応させる脱水縮合剤を含まない。これにより、より簡便にアミド化反応溶液を調製することができる。
（第６項）他の一態様に係る分析用試料の調製方法では、第１項から第５項までのいずれかに記載の分析用試料の調製方法において、前記アミド化反応では、前記試料と前記アミド化反応溶液とを接触させた後、前記試料と脱水縮合剤とを反応させる操作を行わない。これにより、分析用試料の調製の際の工程を減らすことができ、より簡便に当該調製を行うことができる。
（第７項）他の一態様に係る分析用試料の調製方法では、第１項から第６項までのいずれかに記載の分析用試料の調製方法において、前記アミド化反応を行うために前記試料と前記アミド化反応溶液とを接触させる時間は３０分より短い。これにより、より短時間で効率的に分析用試料を調製することができる。
（第８項）他の一態様に係る分析用試料の調製方法では、第１項から第７項までのいずれかに記載の分析用試料の調製方法において、前記第１化合物は、直鎖炭化水素基を含む。これにより、第１化合物により、より確実にシアル酸を修飾することができる。
（第９項）他の一態様に係る分析用試料の調製方法では、第８項に記載の分析用試料の調製方法において、前記直鎖炭化水素基はアルキル基である。第１化合物により、さらに確実にシアル酸を修飾することができる。
（第１０項）他の一態様に係る分析用試料の調製方法では、第９項に記載の分析用試料の調製方法において、前記直鎖炭化水素基の炭素数は１から６までのいずれかである。これにより、第１化合物により、より一層確実にシアル酸を修飾することができる。
（第１１項）他の一態様に係る分析用試料の調製方法では、第１項から第１０項までのいずれかに記載の分析用試料の調製方法において、前記ラクトンは、前記糖鎖のシアル酸に形成されている。これにより、不安定で解析しづらいシアル酸のラクトンを正確に解析することができる。
（第１２項）他の一態様に係る分析用試料の調製方法では、第１項から第１０項までのいずれかに記載の分析用試料の調製方法において、前記ラクトンは、前記糖鎖のα２，３－シアル酸、α２，８－シアル酸およびα２，９－シアル酸の少なくとも一つに形成されている。これにより、試料に元々含まれていたシアル酸ラクトンまたはシアル酸の結合様式特異的な解析等を行うことができる。
（第１３項）他の一態様に係る分析用試料の調製方法では、第１１項または第１２項に記載の分析用試料の調製方法において、用意された前記試料を、前記シアル酸と反応させる脱水縮合剤を含むラクトン化反応溶液と接触させ、前記シアル酸の少なくとも一部をラクトン化することをさらに備える。これにより、ラクトンの安定性に基づいて、シアル酸の一部と他の一部とを区別して解析することができる。
（第１４項）他の一態様に係る分析用試料の調製方法では、第１３項に記載の分析用試料の調製方法において、前記ラクトン化反応溶液は、前記糖鎖に含まれる前記シアル酸と結合させる反応剤をさらに含み、前記反応剤は、前記第１化合物とは質量が異なり、前記試料を前記ラクトン化反応溶液と接触させ、前記シアル酸の結合様式に基づいて、前記シアル酸の一部をラクトン化し、前記シアル酸の他の一部に前記反応剤の少なくとも一部を結合させる。これにより、シアル酸の結合様式に基づいて、シアル酸の一部と他の一部とを区別して解析することができる。
（第１５項）他の一態様に係る分析用試料の調製方法では、第１４項に記載の分析用試料の調製方法において、前記試料を前記ラクトン化反応溶液と接触させ、α２，３－シアル酸、α２，８－シアル酸、またはα２，９－シアル酸をラクトン化し、α２，６－シアル酸に前記反応剤の一部を結合させる。これにより、α２，３－シアル酸、α２，８－シアル酸、およびα２，９－シアル酸とα２，６－シアル酸とを区別して解析することができる。
（第１６項）一態様に係る分析方法は、第１項から第１５項までのいずれかに記載の分析用試料の調製方法により試料を調製することと、調製した前記試料を分析することとを備える。これにより、糖鎖に含まれるラクトンをより効率的にアミド化することができる。
（第１７項）他の一態様に係る分析用試料の調製方法では、第１６項に記載の分析用試料の調製方法において、調製した前記試料は、質量分析およびクロマトグラフィの少なくとも一つにより分析される。これにより、分析用試料の調製の際に行った修飾に基づいて、糖鎖を分離して解析することができる。
（第１８項）一態様に係る分析用試料の調製用キットは、第１項から第１５項までのいずれかに記載の分析用試料の調製方法、または、第１６項または第１７項に記載の分析方法に用いられる。これにより、効率よく分析用試料を調製することができる。
本発明は上記実施形態の内容に限定されるものではない。本発明の技術的思想の範囲内で考えられるその他の態様も本発明の範囲内に含まれる。
以下に、本実施形態に係る実施例を示すが、本発明は下記の実施例に限定されるものではない。なお、以下において、％の記載は特に言及が無い限り体積／体積％を示す。
（実施例１～５および比較例）
＜評価用糖鎖試料の作成＞
以下の方法によりα2,3-シアル酸を二つ含む糖鎖A2 glycan (33A2)を作成した。1 nmol/μＬのα2,3-シアリルグリコペプチド（α2,3-SGP; 伏見製薬所）を20 μＬ含むチューブに対して、PNGase F(SIGMA)を2.5 U分加え37℃でo/n(オーバーナイト、以下同様)インキュベーションすることでＮ型糖鎖A2 glycan (33A2)を遊離した。遊離した糖鎖はStage Tip Carbonで脱塩処理した。
＜評価用糖鎖試料の作成＞
以下の方法によりα2,3-シアル酸を二つ含む糖鎖A2 glycan (33A2)を作成した。1 nmol/μＬのα2,3-シアリルグリコペプチド（α2,3-SGP; 伏見製薬所）を20 μＬ含むチューブに対して、PNGase F(SIGMA)を2.5 U分加え37℃でo/n(オーバーナイト、以下同様)インキュベーションすることでＮ型糖鎖A2 glycan (33A2)を遊離した。遊離した糖鎖はStage Tip Carbonで脱塩処理した。
脱塩処理した糖鎖を適当な水に再溶解したものを試料とした。ビーズ上(On-beads)でアミド化反応等を行う場合は、この試料をそのままビーズと反応させた。チューブ内での液相中での(in-solution)反応として実験を行う場合は、エッペンドルフチューブに分注し、さらにSpeedVac(Thermo Fisher Scientific)で溶媒を除いたものを試料とした。
図３は、以下の実施例で用いた試料における糖鎖の構造と、想定される構造の変化とを模式的に示す図である。糖鎖33A2は、N-アセチル-D-グルコサミン（GlcNAc）およびマンノース（Man）からなる基本型の構造と、2つの側鎖とを備える。2つの側鎖にはそれぞれGlcNAc、ガラクトース（Gal）およびシアル酸（Neu5Ac）が結合されている。非還元末端にあるα2,3-シアル酸と当該シアル酸が結合しているガラクトースとの結合部分には、ラクトンが形成されており、この点を二重線Ｂ１で示した。糖鎖33A2はラクトン化反応溶液を用いた結合様式特異的なシアル酸の修飾によりラクトン化する（矢印Ａ１）。このラクトンが加水分解されると元のシアル酸構造に戻る（矢印Ａ２）。このラクトンはアミノリシスにより直接アミド化することができる（矢印Ａ３）。
＜以下の各実施例での基本的な反応条件＞
以下の実施例１～５および比較例では、アミノリシスを行ってもアミド化されず、一部ラクトンのまま残る場合がある。しかしながら、ラクトンは不安定であるために、実験結果の定量性に影響を与える可能性がある。従って、以下の実験では、アミノリシス(一次アミノリシスと呼ぶ)としてアミド化反応を行った後、一次アミノリシスで用いたアミンとは別のアミンを含むアミド化反応溶液でもう一度アミノリシス(二次アミノリシス)した。これにより、一次アミノリシスで反応しなかったラクトンを、一次アミノリシスで生成するアミドとは異なるアミドに変換することで定量評価した。以下では、一次アミノリシスにはメチルアミン塩酸塩、二次アミノリシスにはエチルアミンを用いた。このため、マススペクトルにおいて、メチルアミド化された糖鎖に対応するピークは一次アミノリシスでアミド化された糖鎖に対応するピーク、エチルアミド化されたピークは一次アミノリシス後にラクトンのまま残っていた糖鎖に対応するピークと読み替えて定量評価できる。
以下の実施例１～５および比較例では、アミノリシスを行ってもアミド化されず、一部ラクトンのまま残る場合がある。しかしながら、ラクトンは不安定であるために、実験結果の定量性に影響を与える可能性がある。従って、以下の実験では、アミノリシス(一次アミノリシスと呼ぶ)としてアミド化反応を行った後、一次アミノリシスで用いたアミンとは別のアミンを含むアミド化反応溶液でもう一度アミノリシス(二次アミノリシス)した。これにより、一次アミノリシスで反応しなかったラクトンを、一次アミノリシスで生成するアミドとは異なるアミドに変換することで定量評価した。以下では、一次アミノリシスにはメチルアミン塩酸塩、二次アミノリシスにはエチルアミンを用いた。このため、マススペクトルにおいて、メチルアミド化された糖鎖に対応するピークは一次アミノリシスでアミド化された糖鎖に対応するピーク、エチルアミド化されたピークは一次アミノリシス後にラクトンのまま残っていた糖鎖に対応するピークと読み替えて定量評価できる。
＜ビーズ上でアミノリシスを行う場合の基本的な反応条件＞
糖鎖を含む試料をヒドラジドビーズ（住友ベークライト社製、BlotGlycoの標準プロトコルに準ずる）に吸着させ、余剰ヒドラジド基のキャッピングを行った。その後、シアル酸結合様式特異的に修飾を行うラクトン化反応溶液（2M イソプロピルアミン(iPA)塩酸塩, 500mM EDC-HCl, 500mM HOBt）を試料に加えて、１時間撹拌することでα2,3-シアル酸をラクトン化した（この際、α2,6-シアル酸が存在していればイソプロピルアミド化される）。続いて、ビーズを200 μＬのメタノール(MeOH)で3回洗浄し、一次アミノリシス溶液100 μＬ（成分は以下の各実施例で異なり得るためその都度記載する）をビーズに加えて軽く攪拌し、遠心して一次アミノリシス溶液を除去した。次にビーズを順次MeOH（200 μＬ x 3）、H2O（200 μＬ x 3）及びMeOH（200 μＬ x 3）で洗い、二次アミノリシス溶液である17.5% エチルアミン水溶液を加え、軽く攪拌した後は遠心して溶液を除去した。さらにビーズをH2O（200 μＬ x 3）で洗い、BlotGlycoの標準プロトコルに準じて糖鎖をビーズから遊離した後、後述する質量分析による測定を行った。
糖鎖を含む試料をヒドラジドビーズ（住友ベークライト社製、BlotGlycoの標準プロトコルに準ずる）に吸着させ、余剰ヒドラジド基のキャッピングを行った。その後、シアル酸結合様式特異的に修飾を行うラクトン化反応溶液（2M イソプロピルアミン(iPA)塩酸塩, 500mM EDC-HCl, 500mM HOBt）を試料に加えて、１時間撹拌することでα2,3-シアル酸をラクトン化した（この際、α2,6-シアル酸が存在していればイソプロピルアミド化される）。続いて、ビーズを200 μＬのメタノール(MeOH)で3回洗浄し、一次アミノリシス溶液100 μＬ（成分は以下の各実施例で異なり得るためその都度記載する）をビーズに加えて軽く攪拌し、遠心して一次アミノリシス溶液を除去した。次にビーズを順次MeOH（200 μＬ x 3）、H2O（200 μＬ x 3）及びMeOH（200 μＬ x 3）で洗い、二次アミノリシス溶液である17.5% エチルアミン水溶液を加え、軽く攪拌した後は遠心して溶液を除去した。さらにビーズをH2O（200 μＬ x 3）で洗い、BlotGlycoの標準プロトコルに準じて糖鎖をビーズから遊離した後、後述する質量分析による測定を行った。
＜液相でアミノリシスを行う場合の基本的な反応条件＞
乾固された糖鎖を含む試料を含むチューブに、上記のシアル酸結合様式特異的な修飾を行うラクトン化反応溶液20 μＬを加えて、１時間撹拌しながら、α2,3-シアル酸をラクトン化した。その後、3Mのメチルアミン塩酸塩水溶液からなる一次アミノリシス溶液を20 μＬ加え、ボルテックスにより均一に混合した。その後、アルカリ化剤としての塩基を5 μＬ加えてボルテックスにより均一に混合した。次いで、2.5% トリフルオロ酢酸（TFA） を含むアセトニトリル（ACN）を加えてpHを中性付近に戻し、GL Science社製のGL-Tip Amideを用いてHILICモードでアミド精製し、余剰試薬を除いた後、溶出された糖鎖をSpeedVacで乾固した。その後、残存しているラクトンをアミド化するために17.5% エチルアミン水溶液を加えて二次アミノリシスを行い、SpeedVacで乾固し、後述する質量分析による測定を行った。
乾固された糖鎖を含む試料を含むチューブに、上記のシアル酸結合様式特異的な修飾を行うラクトン化反応溶液20 μＬを加えて、１時間撹拌しながら、α2,3-シアル酸をラクトン化した。その後、3Mのメチルアミン塩酸塩水溶液からなる一次アミノリシス溶液を20 μＬ加え、ボルテックスにより均一に混合した。その後、アルカリ化剤としての塩基を5 μＬ加えてボルテックスにより均一に混合した。次いで、2.5% トリフルオロ酢酸（TFA） を含むアセトニトリル（ACN）を加えてpHを中性付近に戻し、GL Science社製のGL-Tip Amideを用いてHILICモードでアミド精製し、余剰試薬を除いた後、溶出された糖鎖をSpeedVacで乾固した。その後、残存しているラクトンをアミド化するために17.5% エチルアミン水溶液を加えて二次アミノリシスを行い、SpeedVacで乾固し、後述する質量分析による測定を行った。
＜質量分析の条件＞
質量分析による測定は全てオンターゲット(on-target)3AQラベル化により行った。乾固した糖鎖は10 μＬの水によく再溶解した。0.5 μＬをμフォーカスプレート（Hudson Surface Technology）に滴下し、マトリックスとして50% ACNに溶解させた100mM 3AQ/CA(3-アミノキノリン/p-クマル酸)および2mM ADP (リン酸二水素アンモニウム)を0.5 μＬ加え、上記プレートごと75℃のヒートブロック上で1.5時間反応させた(3AQで糖鎖の還元末端がラベル化される)。反応終了後、プレートを室温まで戻し、MALDI-QIT-TOF-MS (AXIMA-Resonance, Shimadzu/Kratos)を用い、負イオンモードで測定した。
質量分析による測定は全てオンターゲット(on-target)3AQラベル化により行った。乾固した糖鎖は10 μＬの水によく再溶解した。0.5 μＬをμフォーカスプレート（Hudson Surface Technology）に滴下し、マトリックスとして50% ACNに溶解させた100mM 3AQ/CA(3-アミノキノリン/p-クマル酸)および2mM ADP (リン酸二水素アンモニウム)を0.5 μＬ加え、上記プレートごと75℃のヒートブロック上で1.5時間反応させた(3AQで糖鎖の還元末端がラベル化される)。反応終了後、プレートを室温まで戻し、MALDI-QIT-TOF-MS (AXIMA-Resonance, Shimadzu/Kratos)を用い、負イオンモードで測定した。
＜データ解析における評価法＞
図４は、一次アミノリシス反応を行った後に、修飾されていない状態(COOH)、アミド化された状態(Amide)、ラクトン化された状態(Lactone)のいずれかの状態のシアル酸を含む33A2に二次アミノリシスを行った後の試料のマススペクトルの一例を示す図である。横軸はm/z（質量電荷比に対応）、縦軸は相対的な検出量を示す。
図４は、一次アミノリシス反応を行った後に、修飾されていない状態(COOH)、アミド化された状態(Amide)、ラクトン化された状態(Lactone)のいずれかの状態のシアル酸を含む33A2に二次アミノリシスを行った後の試料のマススペクトルの一例を示す図である。横軸はm/z（質量電荷比に対応）、縦軸は相対的な検出量を示す。
評価に用いた試料である33A2はシアル酸を二つ含んでいるため、結合様式特異的修飾（iPA化）によってまずラクトン化するが、その後の一次アミノリシス後にはそれぞれが加水分解したカルボン酸型（COOH）、アミノリシスしたアミド型(Amide)、ラクトンのまま残っていたラクトン型(Lactone)を取りうるので、その組み合わせによりマススペクトルにおいていくつかのピークが検出されうる。ここでは、アミノリシスの後にラクトンのまま残っているシアル酸の量を正確に評価するために、エチルアミンを用いてもう一度アミノリシス(二次アミノリシス)してエチルアミドに変換している。この二次アミノリシスの条件は、ラクトンが完全にエチルアミド化する条件である為、エチルアミド化体をラクトン体と読みかえることが出来る。加水分解が起こらず、ラクトンが一次アミノリシスによって100%メチルアミド化体に変換できると、m/z 2471.9のみにピークが得られる。
COOH体、Amide体およびLactone体の割合の評価は、一分子にシアル酸が二つ含まれることを考慮し、それぞれのピークの相対強度をマススペクトルから読み取り、COOH体、Amide体およびLactone体のそれぞれのピーク強度を算出し、全体を100%としてノーマライズした。
（実施例１）
＜アルカリ化剤としてのtert-ブチルアミン濃度の検討（ビーズ上）＞
上述した、ビーズ上でアミノリシスを行う基本的反応条件に従って実験を行った。一次アミノリシスのためのアミド化反応溶液としてtert-ブチルアミンを0～50％含む3Mのメチルアミン塩酸塩を用いた。ここで、tert-ブチルアミンがアルカリ化剤、3Mメチルアミン塩酸塩がアミド化において修飾体を構成する物質（第２反応剤）である。
＜アルカリ化剤としてのtert-ブチルアミン濃度の検討（ビーズ上）＞
上述した、ビーズ上でアミノリシスを行う基本的反応条件に従って実験を行った。一次アミノリシスのためのアミド化反応溶液としてtert-ブチルアミンを0～50％含む3Mのメチルアミン塩酸塩を用いた。ここで、tert-ブチルアミンがアルカリ化剤、3Mメチルアミン塩酸塩がアミド化において修飾体を構成する物質（第２反応剤）である。
図５は、本実施例のアミド化反応の際のtert-ブチルアミンの濃度（体積／体積％）と、アミド化されたシアル酸の割合とを示すグラフである。tert-ブチルアミンを含まない場合は、アミノリシスが確認されたものの、シアル酸のほとんどがラクトン化体のままであり一部が加水分解していた。少量でもtert-ブチルアミンを添加するとアミノリシスが起きるようになり、tert-ブチルアミンの濃度が10％程度でほぼ100%メチルアミド化が起こるようになった。これにより、アミンの塩酸塩を用いた場合に、別の塩基でアミド化反応溶液のｐＨを上昇させることでアミノリシスを促進できることが判明した。
（実施例２）
＜アルカリ化剤の種類の検討（ビーズ上）＞
上述した、ビーズ上でアミノリシスを行う基本的反応条件に従って実験を行った。一次アミノリシスを行うためのアミド化反応溶液として、10％または1Mの各種アルカリ化剤(10％ アンモニア水、10％ イソプロピルアミン(iPA)、10％ tert-ブチルアミン(t-BA)、10％ ジメチルアミン(DMA)、10％ トリメチルアミン(TMA)、10％ メチルモルフォリン(NMM)、10％ テトラメチルグアニジン(TMG)、1M 水酸化ナトリウム溶液(NaOH))のいずれかを含む3Mのメチルアミン塩酸塩溶液を用いた。
＜アルカリ化剤の種類の検討（ビーズ上）＞
上述した、ビーズ上でアミノリシスを行う基本的反応条件に従って実験を行った。一次アミノリシスを行うためのアミド化反応溶液として、10％または1Mの各種アルカリ化剤(10％ アンモニア水、10％ イソプロピルアミン(iPA)、10％ tert-ブチルアミン(t-BA)、10％ ジメチルアミン(DMA)、10％ トリメチルアミン(TMA)、10％ メチルモルフォリン(NMM)、10％ テトラメチルグアニジン(TMG)、1M 水酸化ナトリウム溶液(NaOH))のいずれかを含む3Mのメチルアミン塩酸塩溶液を用いた。
図６は、本実施例のアミド化反応の際のアルカリ化剤の種類と、アミド化されたシアル酸の割合を示すグラフである。図６から、アルカリ化剤としてどの塩基を用いた場合でもアミノリシスを起こすことができ、アルカリ化剤の種類に関係なくアミノリシスを促進できることがわかる。
（比較例）
＜酸条件でのアミノリシスの検討（ビーズ上）＞
上述した、ビーズ上でアミノリシスを行う基本的反応条件に従って実験を行った。一次アミノリシスを行うためのアミド化反応溶液として、塩基ではなく酸(0.1％または2％ トリフルオロ酢酸(TFA))を含む3M メチルアミン塩酸塩(MA-HCl)溶液を用いた。
＜酸条件でのアミノリシスの検討（ビーズ上）＞
上述した、ビーズ上でアミノリシスを行う基本的反応条件に従って実験を行った。一次アミノリシスを行うためのアミド化反応溶液として、塩基ではなく酸(0.1％または2％ トリフルオロ酢酸(TFA))を含む3M メチルアミン塩酸塩(MA-HCl)溶液を用いた。
図７は、本比較例のアミド化反応の際の溶液の組成と、アミド化されたシアル酸の割合を示すグラフである。図７から、塩基の代わりにトリフルオロ酢酸を添加してアミド化反応溶液のｐＨを下げた条件では、酸を加えない場合と結果が一致しており、3M MA-HClと高い濃度のアミン塩酸塩を用いても全くアミノリシスが進行しないことが判明した。
（実施例３）
＜第２反応剤としてのアミン塩酸塩濃度の検討（ビーズ上）＞
上述した、ビーズ上でアミノリシスを行う基本的反応条件に従って実験を行った。一次アミノリシスを行うためのアミド化反応溶液として10％のtert-ブチルアミンを含む10mM～3Mのメチルアミン塩酸塩溶液を用いた。
＜第２反応剤としてのアミン塩酸塩濃度の検討（ビーズ上）＞
上述した、ビーズ上でアミノリシスを行う基本的反応条件に従って実験を行った。一次アミノリシスを行うためのアミド化反応溶液として10％のtert-ブチルアミンを含む10mM～3Mのメチルアミン塩酸塩溶液を用いた。
図８は、本実施例のアミド化反応の際のメチルアミン塩酸塩の濃度と、アミド化されたシアル酸の割合を示すグラフである。図８より、アミノリシスと加水分解が競合して起こるが、アミン塩酸塩側の濃度は高い方が好ましいことが判明した。
（実施例４）
＜溶媒の検討（ビーズ上）＞
上述した、ビーズ上でアミノリシスを行う基本的反応条件に従って実験を行った。一次アミノリシスを行うためのアミド化反応溶液として10％のtert-ブチルアミン(t-BA)と100mMのメチルアミン塩酸塩を含む各種溶液（溶媒：水(H2O)、メタノール(MeOH)、エタノール(EtOH)、ジメチルスルホキシド(DMSO)、80% アセトニトリル(ACN)水溶液）を用いた。
＜溶媒の検討（ビーズ上）＞
上述した、ビーズ上でアミノリシスを行う基本的反応条件に従って実験を行った。一次アミノリシスを行うためのアミド化反応溶液として10％のtert-ブチルアミン(t-BA)と100mMのメチルアミン塩酸塩を含む各種溶液（溶媒：水(H2O)、メタノール(MeOH)、エタノール(EtOH)、ジメチルスルホキシド(DMSO)、80% アセトニトリル(ACN)水溶液）を用いた。
図９は、本実施例のアミド化反応の際の溶媒の種類と、アミド化されたシアル酸の割合を示すグラフである。図９からアミノリシスを効率的に起こす観点からは水溶媒が好ましいが、一部有機溶媒が混じっていても問題なくアミノリシスが進行することが判明した。
（実施例５）
＜アルカリ化剤の種類の検討（液相）＞
上述した、液相でアミノリシスを行う場合の基本的な反応条件に従って実験を行った。アミド化反応溶液に含まれるアルカリ化剤としてtert-ブチルアミン(t-BA)、50% ジメチルアミン水溶液(DMA)、28％トリメチルアミン水溶液(TMA)、テトラメチルグアジニジン(TMG)または1M 水酸化ナトリウム(NaOH)水溶液を用いた。
＜アルカリ化剤の種類の検討（液相）＞
上述した、液相でアミノリシスを行う場合の基本的な反応条件に従って実験を行った。アミド化反応溶液に含まれるアルカリ化剤としてtert-ブチルアミン(t-BA)、50% ジメチルアミン水溶液(DMA)、28％トリメチルアミン水溶液(TMA)、テトラメチルグアジニジン(TMG)または1M 水酸化ナトリウム(NaOH)水溶液を用いた。
図１０は、本実施例のアミド化反応の際のアルカリ化剤の種類と、アミド化されたシアル酸の割合を示すグラフである。図１０から、液相中で(In-solution)アミド化反応を行ったときも、アルカリ化剤を加えない場合はアミノリシスが起きたシアル酸は一定程度の割合に留まったが、アルカリ化剤を加えることでアミノリシスを促進できることが判明した。
なお、ラクトン化されたシアル酸を有する糖鎖に対して、第２反応剤を含む溶液とアルカリ化剤を含む溶液を加える順序も検討した。その結果、第２反応剤を含む溶液を加えてからアルカリ化剤を含む溶液を加えてもよく、第２反応剤を含む溶液とアルカリ化剤を含む溶液とを混合して当該糖鎖に加えても上記と同等の結果が得られた。
（実施例６）
＜安定同位体標識アミン塩酸塩を用いたアミノリシスの検討＞
ヒト血清由来α-anti-trypsin (AAT)から、PNGase Fを用いてN型糖鎖を切り出した。切り出したN型糖鎖は、住友ベークライト社製BlotGlycoのプロトコルに従ってヒドラジドビーズに結合させた。その後、BlotGlycoのプロトコルに従って余剰ヒドラジド基のキャッピングまで行った。ビーズ上の糖鎖に対して、シアル酸の結合様式特異的に修飾を行うラクトン化反応溶液（2M イソプロピルアミン(iPA)塩酸塩, 500mM EDC-HCl, 500mM HOBt）を100 μＬビーズに加え、一時間800rpmで緩く攪拌しながらα2,6-シアル酸をイソプロピルアミド化、α2,3-シアル酸をラクトン化した。その後、ビーズをMeOH 200μＬで三回洗浄し、次いでアルカリ化剤として10％のtert-ブチルアミンを添加した、エチルアミン塩酸塩（EtNH2-HCl）溶液もしくは安定同位体標識されたエチルアミン塩酸塩（EtNH2-d5-HCl、いずれも濃度3M）溶液 100μＬをビーズに加えて軽く攪拌し、遠心してこのアミド化反応溶液を除去した。さらに、MeOH 200 μＬで三回、水200μＬで三回ビーズを洗浄し、その後はBlotGlycoプロトコルに順じてMALDI-MS用高感度ラベル化を行い、糖鎖を回収し、2,5-ジヒドロキシ安息香酸を用いて正イオンモードにてマススペクトルを取得した。ここで、MALDI-MSは、MALDIによりイオン化を行う質量分析を指す。
＜安定同位体標識アミン塩酸塩を用いたアミノリシスの検討＞
ヒト血清由来α-anti-trypsin (AAT)から、PNGase Fを用いてN型糖鎖を切り出した。切り出したN型糖鎖は、住友ベークライト社製BlotGlycoのプロトコルに従ってヒドラジドビーズに結合させた。その後、BlotGlycoのプロトコルに従って余剰ヒドラジド基のキャッピングまで行った。ビーズ上の糖鎖に対して、シアル酸の結合様式特異的に修飾を行うラクトン化反応溶液（2M イソプロピルアミン(iPA)塩酸塩, 500mM EDC-HCl, 500mM HOBt）を100 μＬビーズに加え、一時間800rpmで緩く攪拌しながらα2,6-シアル酸をイソプロピルアミド化、α2,3-シアル酸をラクトン化した。その後、ビーズをMeOH 200μＬで三回洗浄し、次いでアルカリ化剤として10％のtert-ブチルアミンを添加した、エチルアミン塩酸塩（EtNH2-HCl）溶液もしくは安定同位体標識されたエチルアミン塩酸塩（EtNH2-d5-HCl、いずれも濃度3M）溶液 100μＬをビーズに加えて軽く攪拌し、遠心してこのアミド化反応溶液を除去した。さらに、MeOH 200 μＬで三回、水200μＬで三回ビーズを洗浄し、その後はBlotGlycoプロトコルに順じてMALDI-MS用高感度ラベル化を行い、糖鎖を回収し、2,5-ジヒドロキシ安息香酸を用いて正イオンモードにてマススペクトルを取得した。ここで、MALDI-MSは、MALDIによりイオン化を行う質量分析を指す。
図１１は、本実施例で得られたマススペクトルを示す図である。横軸はm/z、縦軸は検出された際の強度を示す。図１１において、上段は、安定同位体標識されていないエチルアミン塩酸塩を用いてアミド化反応を行った場合のマススペクトルであり、下段は、安定同位体標識されたエチルアミン塩酸塩を用いてアミド化反応を行った場合のマススペクトルである。上段および下段において、左側のマススペクトルの拡大図を右側に示した（矢印Ａ１１）。m/z 2735.8に観測されているピークはA2型糖鎖でα2,6-シアル酸が二つ付加したものであり、これらはシアル酸結合様式特異的修飾の時点でイソプロピルアミドに変換されるため、後のアミノリシスには反応せず、安定同位体標識されたエチルアミン塩酸塩EtNH2-d5-HClを用いても同一のm/zに観測された。一方で、安定同位体標識されていないエチルアミン塩酸塩EtNH2-HClを用いた場合に観測される3419.4のピークはα2,3-シアル酸ひとつとα2,6-シアル酸を二つ含む三本鎖A3型の糖鎖であるが、安定同位体標識されたエチルアミン塩酸塩EtNH2-d5-HClを用いた場合に5Daのシフトが観測された（m/z 3565.5から3570.5）。これらの結果は、通常塩酸塩でしか入手できないような同位体標識された第一級アミンでも、アルカリ化剤を用いてpHを強制的に上げることでアミノリシスを促進することが出来ることを示している。
（実施例７）
実施例６と同様の方法で、同位体標識されていないエチルアミン塩酸塩および安定同位体標識されているエチルアミン塩酸塩のそれぞれを用いて修飾した糖鎖を等量で混合し、質量分析用試料を調製した。調製された質量分析用試料を、実施例６と同様の方法で質量分析した。
実施例６と同様の方法で、同位体標識されていないエチルアミン塩酸塩および安定同位体標識されているエチルアミン塩酸塩のそれぞれを用いて修飾した糖鎖を等量で混合し、質量分析用試料を調製した。調製された質量分析用試料を、実施例６と同様の方法で質量分析した。
図１２は、本実施例で得られたマススペクトルの拡大図である。図１２では、AATに含まれる代表的なα2,3-シアル酸含有三本鎖糖鎖であるA3（図の左側）およびA3F（図の右側）に対応するピークを示した。A3およびA3F のピークは安定同位体標識によりそれぞれ5Daシフトして観測されるが、等量で混合した場合イオン強度はほぼ同等であることが判明した。これは、アミノリシス後に安定同位体標識の有無によりイオン化効率が変わらないことを意味しており、安定同位体標識されたアミン塩酸塩を用いた場合でも、pHを強制的に上げてアミノリシスを促進することで、比較質量分析解析への応用が可能であることを示している。
次の優先権基礎出願（１）および本明細書で参照した文献（２）の開示内容は引用文としてここに組み込まれる。
（１）日本国特願２０１９－１３０１８８号（２０１９年７月１２日出願）
（２）Takashi Nishikaze, Sadanori Sekiya, Shinichi Iwamoto, Koichi Tanaka. “A Universal Approach to linkage-Specific Derivatization for Sialic Acids on Glycopeptides,” Journal of The American Society for Mass Spectrometry, 2017年6月, Volume 28, Issue 1 Supplement, ポスター番号MP091
（１）日本国特願２０１９－１３０１８８号（２０１９年７月１２日出願）
（２）Takashi Nishikaze, Sadanori Sekiya, Shinichi Iwamoto, Koichi Tanaka. “A Universal Approach to linkage-Specific Derivatization for Sialic Acids on Glycopeptides,” Journal of The American Society for Mass Spectrometry, 2017年6月, Volume 28, Issue 1 Supplement, ポスター番号MP091
Claims (18)
- 糖鎖を含む試料を用意することと、
前記試料を、前記糖鎖に含まれるラクトンと反応させるアンモニア、アミノ基に結合した炭素原子に１以下の炭素原子が直接結合している第一級アミン、ヒドラジン、ヒドラジン誘導体およびヒドロキシアミンならびにこれらの塩からなる群から選択される少なくとも一つの第１化合物とアルカリ化剤とを含む、ｐＨが７．７以上のアミド化反応溶液と接触させ、前記ラクトンをアミド化するアミド化反応を行うこととを備え、
前記アルカリ化剤は、第四級アンモニウムカチオン、第三級アミン、第二級アミンおよびアミノ基に結合した炭素原子に２以上の炭素原子が直接結合している分岐型第一級アミン、アルカリ金属の水酸化物、アルカリ土類金属の水酸化物およびテトラアルキルアンモニウムの水酸化物、グアニジンおよびグアニジン誘導体、ならびにこれらの塩、ならびにアルカリ緩衝液からなる群から選択される少なくとも一つの化合物を含み、
前記アルカリ緩衝液は、Tris緩衝液、Good緩衝液、ホウ酸緩衝液および炭酸塩緩衝液からなる群から選択される少なくとも一つである、分析用試料の調製方法。 - 糖鎖を含む試料を用意することと、
前記試料を、前記糖鎖に含まれるラクトンと反応させるアンモニア、アミノ基に結合した炭素原子に１以下の炭素原子が直接結合している第一級アミン、ヒドラジン、ヒドラジン誘導体およびヒドロキシアミンならびにこれらの塩からなる群から選択される少なくとも一つの第１化合物とアルカリ化剤とを含む、ｐＨが７．７以上のアミド化反応溶液と接触させ、前記ラクトンをアミド化するアミド化反応を行うこととを備え、
前記アルカリ化剤がアミンである場合、前記アルカリ化剤は、アミノ基に結合した炭素原子に２以上の炭素原子が直接結合している分岐型第一級アミン、第二級アミンおよび第三級アミンからなる群から選ばれる少なくとも一つのアミンであり、
前記アミド化反応溶液が前記ラクトンと反応させる脱水縮合剤を含まない、分析用試料の調製方法。 - 請求項２に記載の分析用試料の調製方法において、
前記アルカリ化剤は、第四級アンモニウムカチオン、第三級アミン、第二級アミンおよびアミノ基に結合した炭素原子に２以上の炭素原子が直接結合している分岐型第一級アミン、アルカリ金属の水酸化物、アルカリ土類金属の水酸化物およびテトラアルキルアンモニウムの水酸化物、グアニジンおよびグアニジン誘導体、ならびにこれらの塩、ならびにアルカリ緩衝液からなる群から選択される少なくとも一つの化合物を含み、
前記アルカリ緩衝液は、Tris緩衝液、Good緩衝液、ホウ酸緩衝液および炭酸塩緩衝液からなる群から選択される少なくとも一つである、分析用試料の調製方法。 - 請求項１から３までのいずれか一項に記載の分析用試料の調製方法において、
前記第１化合物は、アンモニア、アミン、ヒドロキシアミン、ヒドラジンおよびヒドラジン誘導体から選択される少なくとも一つの化合物の炭酸塩、塩酸塩、硝酸塩、硫酸塩、リン酸塩またはメタンスルホン酸塩である、分析用試料の調製方法。 - 請求項１から３までのいずれか一項に記載の分析用試料の調製方法において、
前記アミド化反応は、前記試料を前記アミド化反応溶液と接触させることのみにより行われる分析用試料の調製方法。 - 請求項１から３までのいずれか一項に記載の分析用試料の調製方法において、
前記アミド化反応では、前記試料を前記アミド化反応溶液と接触させた後、前記試料と脱水縮合剤とを反応させる操作を行わない、分析用試料の調製方法。 - 請求項１から３までのいずれか一項に記載の分析用試料の調製方法において、
前記アミド化反応を行うために前記試料と前記アミド化反応溶液とを接触させる時間は３０分より短い、分析用試料の調製方法。 - 請求項１から３までのいずれか一項に記載の分析用試料の調製方法において、
前記第１化合物は、直鎖炭化水素基を含む、分析用試料の調製方法。 - 請求項８に記載の分析用試料の調製方法において、
前記直鎖炭化水素基はアルキル基である、分析用試料の調製方法。 - 請求項９に記載の分析用試料の調製方法において、
前記直鎖炭化水素基の炭素数は１から６までのいずれかである、分析用試料の調製方法。 - 請求項１から３までのいずれか一項に記載の分析用試料の調製方法において、
前記ラクトンは、前記糖鎖のシアル酸に形成されている、分析用試料の調製方法。 - 請求項１１に記載の分析用試料の調製方法において、
前記ラクトンは、前記糖鎖のα２，３－シアル酸、α２，８－シアル酸およびα２，９－シアル酸の少なくとも一つに形成されている、分析用試料の調製方法。 - 請求項１１に記載の分析用試料の調製方法において、
用意された前記試料を、前記シアル酸と反応させる脱水縮合剤を含むラクトン化反応溶液と接触させ、前記シアル酸の少なくとも一部をラクトン化することをさらに備える、分析用試料の調製方法。 - 請求項１３に記載の分析用試料の調製方法において、
前記ラクトン化反応溶液は、前記糖鎖に含まれる前記シアル酸と結合させる反応剤をさらに含み、
前記反応剤は、前記第１化合物とは質量が異なり、
前記試料を前記ラクトン化反応溶液と接触させ、前記シアル酸の結合様式に基づいて、前記シアル酸の一部をラクトン化し、前記シアル酸の他の一部に前記反応剤の少なくとも一部を結合させる、分析用試料の調製方法。 - 請求項１４に記載の分析用試料の調製方法において、
前記試料を前記ラクトン化反応溶液と接触させ、α２，３－シアル酸、α２，８－シアル酸、またはα２，９－シアル酸をラクトン化し、α２，６－シアル酸に前記反応剤の一部を結合させる、分析用試料の調製方法。 - 請求項１から１５までのいずれか一項に記載の分析用試料の調製方法により分析用試料を調製することと、
調製した前記分析用試料を分析することとを備える分析方法。 - 請求項１６に記載の分析方法において、
調製した前記試料は、質量分析およびクロマトグラフィの少なくとも一つにより分析される分析方法。 - 請求項１から１５までのいずれか一項に記載の分析用試料の調製方法、または、請求項１６または１７に記載の分析方法に用いられる調製用キットであって、
アンモニア、アミノ基に結合した炭素原子に１以下の炭素原子が直接結合している第一級アミン、ヒドラジン、ヒドラジン誘導体およびヒドロキシアミンならびにこれらの塩からなる群から選択される少なくとも一つの第１化合物とアルカリ化剤とを含む、ｐＨが７．７以上のアミド化反応溶液を備え、
前記アルカリ化剤が、第四級アンモニウムカチオン、第三級アミン、第二級アミンおよびアミノ基に結合した炭素原子に２以上の炭素原子が直接結合している分岐型第一級アミン、アルカリ金属の水酸化物、アルカリ土類金属の水酸化物およびテトラアルキルアンモニウムの水酸化物、グアニジンおよびグアニジン誘導体、ならびにこれらの塩、ならびにアルカリ緩衝液からなる群から選択される少なくとも一つの化合物を含み、
前記アルカリ緩衝液は、Tris緩衝液、Good緩衝液、ホウ酸緩衝液および炭酸塩緩衝液からなる群から選択される少なくとも一つである、調製用キット。
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