JP7363359B2 - 分析用試料の調製方法、分析方法および分析用試料の調製用キット - Google Patents
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Description
本発明の第2の態様は、第1の態様の分析用試料の調製方法により試料を調製することと、調製した前記分析用試料の分析を行うこととを備える分析方法に関する。
本発明の第3の態様は、第1の態様の分析用試料の調製方法に用いられる分析用試料の調製用キットに関する。
図1は、本実施形態の分析用試料の調製方法に係る分析方法の流れを示すフローチャートである。本実施形態の分析用試料の調製方法では、試料に含まれる糖鎖のシアル酸をエステル化した後、エステル化されたシアル酸を結合様式特異的にアミド化する。ステップS1001において、糖鎖を含む試料が用意される。
糖鎖を含む試料は、特に限定されず、糖鎖、糖ペプチドおよび糖タンパク質、ならびに糖脂質からなる群から選択される少なくとも一つの分子を含むことができる。ペプチドおよび糖ペプチドは、2以上50未満のアミノ酸からなるペプチド主鎖を備えるとし、タンパク質および糖タンパク質は、50以上のアミノ酸からなるペプチド主鎖を備えるとすることができる。しかし、慣例的な例外もあり、ペプチドとタンパク質の範囲の境界および糖ペプチドおよび糖タンパク質の範囲の境界はこれに限定されない。本実施形態の分析用試料の調製方法では、糖鎖に含まれるシアル酸の結合様式特異的な修飾が行われる。試料中の糖鎖は、N-結合型糖鎖(N型糖鎖)若しくはO-結合型糖鎖(O型糖鎖)、または糖脂質型糖鎖等、末端または末端以外の位置にシアル酸を有する可能性がある糖鎖を含むことが好ましい。また、試料中の糖鎖は、α2,3-シアル酸、α2,8-シアル酸およびα2,9-シアル酸の少なくとも一つを含むか、含む可能性があることがより好ましく、これに加えてα2,6-シアル酸を含むか、含む可能性があることがさらに好ましい。
ステップS1001が終了したら、ステップS1003に進む。
ステップS1003において、試料をエステル化のための反応溶液(以下、エステル化反応溶液と呼ぶ)と接触させ、糖鎖に含まれるシアル酸の少なくとも一部をエステル化するエステル化反応を行う(以下、エステル化反応と記載した場合、特に言及が無い限り、ステップS1003のエステル化反応を指す)。エステル化反応は、糖鎖に含まれるシアル酸を、ラクトン化以外のエステル化に供する反応である。しかし、エステル化反応において、一部のシアル酸についてラクトン化以外のエステル化が起きれば、他の一部のシアル酸がラクトン化されることも妨げない。以下の実施形態において、「ラクトン化以外のエステル化」とは、エステル化反応溶液の成分の一部がシアル酸のカルボン酸に結合し、カルボン酸エステルを形成することを指す。すなわち、エステル化反応溶液の成分の一部がカルボン酸エステルを示す-COORのRの部分に導入されることに相当する。エステル化反応では、結合様式非特異的に糖鎖に含まれるシアル酸をエステル化することが好ましい。エステル化反応では、α2,3-シアル酸、α2,6-シアル酸、α2,8-シアル酸およびα2,9-シアル酸のカルボキシ基が好適にエステル化される。
エステル化反応溶液がアルコールを含む場合、エステル化反応溶液はさらに、縮合剤を含むことが好ましく、縮合剤に加えさらに添加剤を含むことがより好ましい。エステル化反応溶液は、メタノールまたはエタノール等のアルコールと、塩酸等の酸とを含むようにしてもよい。
エステル化反応溶液に含まれるエステル化剤は、特に限定されないが、エステル化剤のうち、アルキル化剤が好ましく、メチル化剤、エチル化剤、イソプロピル化剤等のプロピル化剤、tert-ブチル化剤等のブチル化剤、またはベンジル化剤がより好ましく、メチル化剤またはエチル化剤がさらに好ましい。
エステル化反応では、少なくともα2,3-シアル酸,α2,8-シアル酸およびα2,9-シアル酸の少なくとも一つがエステル化されるように用いるアルコールまたはエステル化剤等の濃度が調整されることが好ましい。結合様式特異的に修飾を行う観点からは、α2,6-シアル酸をエステル化するように用いるアルコールまたはエステル化剤等の濃度が調整されることが好ましい。また、試料における糖鎖の全てのシアル酸がエステル化されても結合様式特異的な修飾を行うことができるため、エステル化反応溶液における、アルコール、縮合剤若しくは添加剤、またはエステル化剤の濃度は、他の面で支障がない限り、高めに設定することができる。
エステル化反応は、液相でも固相でも行うことができる。試料とエステル化反応溶液とを接触させることができれば、エステル化反応を起こす際の試料の状態は特に限定されない。
ステップS1003が終了したら、ステップS1005に進む。
ステップS1005において、試料を、反応溶液(以下、アミド化反応溶液と呼ぶ)と接触させ、ステップS1003のエステル化により修飾されているシアル酸をアミド化するアミド化反応(以下、アミド化反応と記載した場合、特に言及が無い限り、ステップS1005のアミド化反応を指す)が行われる。アミド化反応では、ステップS1003でエステル化されたシアル酸のエステル化修飾がアミド化修飾に変換(以下、適宜エステルアミド変換と呼ぶ)される。アミド化反応では、α2,3-シアル酸、α2,8-シアル酸およびα2,9-シアル酸の少なくとも一つ、特にα2,3-シアル酸およびα2,8-シアル酸の少なくとも一つがアミド化される。
なお、アミド化反応には脱水縮合剤は必要ではなく含まれなくてよいが、アミド化反応溶液に脱水縮合剤が含まれていてもよい。例えば、ステップS1003で試料に加えたエステル化反応溶液を除去しないで、アンモニア、アミンまたはこれらの塩を試料に加えることにより、アミド化反応溶液を調製してもよい。このように、アミド化反応は、簡便な操作で行うことができる。あるいは、ステップS1003で試料に加えたエステル化反応溶液を除去するための操作の後、試料をアミド化反応溶液と接触させることのみによりアミド化反応が行われる。また、アミド化反応では、試料とアミド化反応溶液とを接触させた後、試料と脱水縮合剤とを反応させる操作を行わないようにできるが、例えば他の目的のため行ってもよい。
表1
α2,6-x2 α2,6-+α2,3- α2,3-x2
Neu5Ac x2 0 +13 +26
Neu5Ac + Neu5Gc +16 +29 +42
Neu5Gc x2 +32 +45 +58
表2
α2,6-x2 α2,6-+α2,3- α2,3-x2
Neu5Ac x2 0 +27 +54
Neu5Ac + Neu5Gc +16 +43 +70
Neu5Gc x2 +32 +59 +86
この場合、ピークは好適に分離される。シアル酸を3以上含む糖鎖でも同様である。このように、試料に含まれる糖鎖の複雑性に応じてエステル化とアミド化の組み合わせは適宜選択できる。
以下の実施形態では、「アミン」の語は、ヒドラジン、ヒドラジン誘導体およびヒドロキシアミンを含み、アンモニアおよびアンモニアの塩を含まないものとする。アミド化反応においてアミンを用いる場合、アミド化反応剤に含まれるアミンは、第一級アミン、ヒドラジン、ヒドラジン誘導体およびヒドロキシアミンならびにこれらの塩から選択される少なくとも一つの化合物であることが好ましい。α2,3-シアル酸等のカルボキシ基はα2,6-シアル酸のカルボキシ基に比べて立体障害が比較的大きい位置にあるため、第一級アミンは、他のアミンと比べ、α2,3-シアル酸等と選択的に反応しやすいと考えられる。
アミド化反応溶液における、メチルアミンまたはエチルアミン等のアミド化反応剤の濃度は、重量/体積%で、0.01%以上が好ましく、0.1%以上がより好ましく、1%以上がさらに好ましい。アミド化反応溶液におけるアミド化反応剤の濃度が高いほど、より確実にエステル化されたシアル酸のアミド化を行うことができる。アミド化反応溶液における、メチルアミンまたはエチルアミン等のアミド化反応剤の濃度は、重量/体積%で、40%未満が好ましく、20%未満がより好ましい。これにより、高濃度による意図しない反応を抑制したり、α2.6‐シアル酸をアミド化することを抑制し結合様式特異的な修飾を容易にすることができる。
アミド化反応溶液の溶媒は、アミド化を確実に起こす観点から水系溶媒、有機溶媒または水系溶媒と有機溶媒の混合溶媒が好ましい。アミド化反応溶液の溶媒は、例えば、水、メタノール若しくはエタノール等のアルコール、ジメチルスルホキシド(DMSO)またはアセトニトリルまたはこれらの混合液とすることができる。結合様式特異的にα2,6-シアル酸と他のシアル酸を修飾する場合には、α2,6-シアル酸のアミド化を抑制する観点から、アミド化反応溶液の溶媒は、有機溶媒を含むことが好ましい。
アミド化反応溶液のpHは、7.7以上である。アミド化反応溶液のpHは、8.0以上が好ましく、8.8以上がより好ましく、10.3以上がさらに好ましい。アミド化反応溶液のpHが高くなると、加水分解等の副反応が抑制されたり、様々なアミド化反応剤を用いてより確実にエステル化されたシアル酸がアミド化されるため好ましい。
アミド化反応は、数秒~数分以内に完了する。従って、アミド化反応によりエステル化されたシアル酸をアミド化するために、試料をアミド化反応溶液と接触させる時間(以下、反応時間と呼ぶ)は、1時間未満が好ましく、30分未満がより好ましく、15分未満がさらに好ましく、5分未満がさらに好ましく、1分未満が最も好ましい。好適には、試料をアミド化反応溶液で洗浄したり、担体等に保持されている試料に対して一時的に通液するだけでもよい。試料とアミド化反応溶液とが接触する時間は、特に限定されないが、反応を十分完了させる等の観点から適宜0.1秒以上または1秒以上等とすることができる。また、試料とアミド化反応溶液を混合し、そのまま反応時間を設けずに乾固してもよい。アミド化反応の反応時間を短く設定することで、より効率的に試料の解析を行うことができる。
試料とアミド化反応溶液とを接触させることができれば、アミド化反応を起こす際の試料の状態は特に限定されず、固相でも液相でもよい。液相でアミド化反応を行う場合、上述したようにエステル化反応後の溶液を残したまま試料にアミド化反応溶液を加えてもよいし、エステル化反応後に精製、脱塩、可溶化等の公知の前処理を行ってもよい。固相に固定した状態でアミド化反応が行われる場合、固相でエステル化反応に供した試料を、固相に固定した状態を維持して、アミド化反応を行ってもよい。また、試料をエステル化反応に供した後、固相に固定してアミド化反応を行ってもよい。
ステップS1007が終了したら、ステップS1009が開始される。
ステップS1009が終了したら、処理が終了される。
糖ペプチドまたは糖タンパク質にエステル化反応溶液およびアミド化反応溶液を加え、上述のようにシアル酸を修飾した場合、糖ペプチドまたは糖タンパク質に含まれるアミノ酸の側鎖、主鎖の末端にあるアミノ基およびカルボキシ基の間で分子内脱水縮合等の副反応が起こる場合がある。この場合、シアル酸修飾の前にアミノ基を化学修飾などで先にブロックしておくことで、シアル酸修飾時にペプチド部分の副反応を抑制出来る。詳細は、以下の文献を参照されたい:Takashi Nishikaze, Sadanori Sekiya, Shinichi Iwamoto, Koichi Tanaka. “A Universal Approach to linkage-Specific Derivatization for Sialic Acids on Glycopeptides,” Journal of The American Society for Mass Spectrometry, 2017年6月, Volume 28, Issue 1 Supplement, ポスター番号MP091。例えば、糖ペプチドまたは糖タンパク質に対してジメチルラベル化またはグアニジル化などのアミノ基をブロックする反応を行い、その後、エステル化反応およびアミド化反応を行うことができる。
本実施形態の分析用試料の調製方法に好適に用いられる分析用試料の調製用キット(以下、調製用キットと呼ぶ)が提供される。
(変形例1)
上述の実施形態において、アミド化反応で得られた試料の分析に加え、エステル化反応で得られた試料の分析を行ってもよい。アミド化反応で得られた試料の分析を第1分析、エステル化反応で得られた試料の分析を第2分析と呼ぶ。
上述の実施形態では、エステル化されたシアル酸をアミド化反応によりアミド化し、結合様式特異的にシアル酸の修飾を行う例を説明した。しかし、特に結合様式特異的な修飾を目的とすることなく、シアル酸をアミド化する際に上記アミド化反応を用いてもよい。
発明者らは、さらに驚くべきことに、上述のアミド化反応において、アミド化反応溶液の溶媒の組成に基づいて構造特異的に糖鎖におけるシアル酸のアミド化を行うことができることを見出した。このことは、例えば上述の図1のフローチャートのステップS1005または図3のフローチャートのステップS2005においてアミド化反応を行った際、同一または異なる結合様式のシアル酸について、糖鎖におけるシアル酸の位置またはシアル酸近傍の糖鎖の構造に基づいて、シアル酸が選択的にアミド化されることを指す。ここで、「シアル酸近傍の糖鎖の構造」とは、シアル酸が直接結合する単糖と他の糖との結合についての構造を含む。
上述の変形例3において、結合様式特異的かつ構造特異的にアミノ酸を修飾してもよい。本変形例では、α2,6-シアル酸は、エステル化反応でエステル化される。α2,6-シアル酸以外のシアル酸のうち変形例3に記載した条件を満たすものが第1段階のアミド化で修飾される。この第1段階のアミド化を起こす反応を第1アミド化反応と呼び、第1アミド化反応におけるアミド化反応溶液およびアミド化反応剤をそれぞれ第1アミド化反応溶液および第1アミド化反応剤と呼ぶ。α2,6-シアル酸以外のシアル酸のうち変形例3に記載した条件を満たさないものが第2段階のアミド化で修飾される。この第2段階のアミド化を起こす反応を第2アミド化反応と呼び、第2アミド化反応におけるアミド化反応溶液およびアミド化反応剤をそれぞれ第2アミド化反応溶液および第2アミド化反応剤と呼ぶ。第1アミド化反応剤および第2アミド化反応剤は、これらがシアル酸に結合することにより生成される修飾体が質量分析等の分析により区別して検出されるように選択される。
上述した複数の例示的な実施形態またはその変形は、以下の態様の具体例であることが当業者により理解される。
実施例1~4では、N型糖鎖を担体に結合させた状態でエステル化反応およびアミド化反応を行い、得られた糖鎖試料を質量分析により分析した。
以下の1-3の手順を番号順に行い、α2,3-シアル酸を二つ含む糖鎖A2 glycan (33A2)を作成した。α2,3-シアリルグリコペプチド(α2,3- Sialylglycopeptide(SGP)、伏見製薬所)からPNGase Fを用いてA2 glycan (33A2) を遊離した。遊離した糖鎖はStage Tip Carbonで脱塩処理した。Stage Tip Carbonは、エムポアディスクカーボン(3M製)を、直径約1 mmに切り抜き、200 μLのチップに詰めたカーボンカラムである。
1. α2,3-SGPを1 nmol/μLの濃度で含む溶液20 μLが分注されたチューブに対して、PNGase F(SIGMA) 0.25U/μLを10μL加えた(2.5U/チューブ)。
2. 軽くタッピングと遠心を行い、37℃でオーバーナイト(o/n)のインキュベーションした。
3. 翌日、糖鎖をStage Tip Carbonを用いて脱塩した。
α2,6-シアル酸を含むA2GN1糖鎖(東京化成工業)を水に再溶解させ、混合し、評価用糖鎖試料とした。
以下の1-8の手順を番号順に行い、作成された上記評価用糖鎖試料をエステル化反応およびアミド化反応に供した。エステル化反応で1-メチル-3-p-トリルトリアゼン(MTT)および1-エチル-3-p-トリルトリアゼン(ETT)のいずれを用いたか、および、アミド化反応におけるアミド化反応剤は、各実施例の結果のところで説明する。
1. 作成された評価用糖鎖試料をヒドラジドビーズ(BlotGlyco; 住友ベークライト)に結合させた。BlotGlycoのプロトコルに従って、結合が行われた。
2. 溶媒をDMSOとし、500mMのMTTまたはETTを含む溶液を100 μLビーズに加え、60 ℃で1時間反応させた(エステル化反応)。
3. ビーズをメタノール200 μLにより3回洗浄した。
4. アミド化反応溶液100 μLをビーズに加えて撹拌した後、遠心によりアミド化反応溶液を除去した。
5. ビーズをメタノール200 μLにより3回洗浄した。
6. 糖鎖試料をビーズから遊離させた。Blotglycoのプロトコルに従って、遊離が行われた。
7. 遊離された糖鎖試料を減圧遠心濃縮により乾固させた。
8. 糖鎖をStage Tip Carbonを用いて脱塩した。
脱塩し乾固した糖鎖を20 μLの水に再溶解させた。再溶解により得られた溶液0.5 μLを700 μm μフォーカスプレート(Hudson Surface Technology)に滴下した。マトリックスとして50% アセトニトリル(ACN)に溶解させた5mg/mL 2,5-ジヒドロキシ安息香酸(DHB)を含むマトリックス溶液(5mMのNaClを含む)を加え、常温常圧で風乾した後、エタノール0.2 μLを添加し再結晶させて質量分析用試料を得た。その後、MALDI-四重極イオントラップ(Quadrupole Ion Trap)-飛行時間型(Time of Flight)質量分析計(MALDI-QIT-TOF-MS)(AXIMA-Resonance, Shimadzu/Kratos) を用い正イオンモードで測定を行った。
図6は、本実施例で用いたα2,3-シアル酸を含む糖鎖試料(以下、α2,3-糖鎖試料と呼ぶ)の構造を示す概念図である。α2,3-糖鎖試料は、N-アセチル-D-グルコサミン(GlcNAc)およびマンノース(Man)からなる基本型の構造と、2つの側鎖とを備える。2つの側鎖にはそれぞれGlcNAc、ガラクトース(Gal)およびシアル酸(Neu5Ac)が結合されている。
図7のマススペクトル(a)は、固相担体に糖鎖を結合した状態でシアル酸に対するメチルエステル化修飾反応を行った後、アミド化反応を行わず、糖鎖を遊離させて得られた試料のマススペクトルである。マススペクトルは、横軸に検出したイオンのm/z、縦軸に検出したイオンの検出信号の強度を示し、以下の各図でも同様である。m/z 2070.9のピークは糖鎖中の2か所のシアル酸が双方ともメチルエステル化されたα2,6-糖鎖試料のピークである。これに対して、α2,3-糖鎖試料については、2か所のシアル酸がメチルエステル化されたピーク(m/z 2273.9)と、2か所のシアル酸のうち一方がメチルエステル化し、他方がラクトン化したピーク(m/z 2241.9)との双方が観測された。
図8は、固相担体に糖鎖を結合した状態でシアル酸に対するメチルエステル化修飾反応を行った後、それぞれ重量/体積%で5.6% アンモニア水 (a)、10% メチルアミン溶液(b)、17.5% エチルアミン溶液(c)、16.7% ジメチルアミン溶液(d)および20% トリメチルアミン溶液(e)を用いてアミド化反応を行って得られた試料のマススペクトルを示す図である。(a)のアンモニアを用いた場合では、図7の(a)に示したm/z 2273.9やm/z 2241.9のピークが検出されず、糖鎖中の2つのシアル酸がアミド化された糖鎖に対応するm/z 2243.9のピークに集約された。従って、α2,3-シアル酸の構造特異的にアミド化されたことがわかる。(b)は図7と同様である。(c)のエチルアミンを用いた場合でも問題なく、結合様式特異的にエチルアミド化(m/z 2300.0)されたことがわかる。一方で、ジメチルアミン(d)またはトリメチルアミン(e)を用いた場合ではα2,3-シアル酸を含む糖鎖のピークが消失した。これらは、ラクトンのアミノリシス(非特許文献2参照)を起こしにくいアミンであるので、加水分解が促進された結果、おおもとのカルボン酸(-COOH)構造に戻りイオン化効率が低下し、正イオンモードでは検出されなくなったためと考察できる。
図9は、固相担体に糖鎖を結合した状態でシアル酸に対するメチルエステル化修飾反応を行った後、それぞれ水 (a)、メタノール(b)、ジメチルスルホキシド(c)およびアセトニトリル(d)を溶媒とした5または6%(重量/体積%)のメチルアミン溶液を用いてアミド化反応を行って得られた試料のマススペクトルを示す図である。有機溶媒でも問題なくα2,3-シアル酸に特異的なアミド化が進行したことが示された。溶媒を水とした場合よりも、有機溶媒条件下で行った方が、α2,6-シアル酸エステルのアミド化がより抑制された。
図10の上段(a)は、MTTを用いてシアル酸に対するメチルエステル化修飾反応を行った後、17.5 %(重量/体積%)エチルアミン溶液を用いてエチルアミド化反応を行って得られた試料のマススペクトルである。図10の下段(b)は、ETTを用いてシアル酸に対するエチルエステル化修飾反応を行った後、10 %(重量/体積%)メチルアミン溶液を用いてメチルアミド化反応を行って得られた試料のマススペクトルを示す図である。エステルとアミンの組み合わせを変えても、問題なくエステル化されたα2,3-シアル酸が選択的にアミドに変換されたことがわかる。
実施例5では、糖脂質型糖鎖を担体に結合させた状態でエステル化反応およびアミド化反応を行い、得られた糖鎖試料を質量分析により分析した。
試料としてスフィンゴ糖脂質であるHuman Disialoganglioside(ジシアロガングリオシド)GD1a および GD1b(HyTest)を使用した。0.2% Tritonx100 を含む 50 mM 酢酸ナトリウム緩衝液(pH5.5)45 μLに上記糖脂質を溶解し、60℃で20分間温置した後、Endoglycoceramidase I (以下の文献を参考に放線菌から精製したもの;Ishibashi Y, Nakasone T, Kiyohara M, Horibata Y, Sakaguchi K, Hijikata A, Ichinose S, Omori A, Yasui Y, Imamura A, Ishida H, Kiso M, Okino N, and Ito M. “A novel endoglycoceramidase hydrolyzes oligogalactosylceramides to produce galactooligosaccharides and ceramides,” Journal of Biological Chemistry, 2007年, Volume 282, pp.11386-11396)を 5 μL加え、37 ℃で16時間糖鎖脱離反応を行った。
以下の1-7の手順を番号順に行い、作成された上記評価用糖鎖試料をエステル化反応およびアミド化反応に供した。
1. 作成された評価用糖鎖試料を固相担体(BlotGlyco)に結合させた。BlotGlycoのプロトコルに従って、結合が行われた。
2. 溶媒をDMSOとし、500mMのMTTを含む溶液をビーズに加え、エステル化反応を行った。
3. 固相担体をメタノール200 μLにより3回洗浄した。
4. メチルアミン溶液200 μLにより固相担体を3回洗浄することでアミド化反応を行った。
5. 固相担体を水200 μLにより3回洗浄した。
6. BlotGlycoのプロトコルに基づき、糖鎖の還元末端にMALDI用高感度化ラベルaoWRを反応させた。
7. HILICプレート(Waters)を用いて試料から過剰試薬を除去した。
DHBをマトリックスとし、Ultraflex II TOF/TOF-MS(Bruker)を用い正イオンモードで測定を行った。
本実施例で用いたGD1a糖鎖およびGD1b糖鎖の構造は、それぞれ上記図4Aおよび4Bに示した。
上述の実施例では、固相担体に結合された状態でアミド化反応を行った。本実施例では、標準血清由来N型糖鎖を試料とし、固相担体に吸着させた状態でアミド化反応を行い、得られた糖鎖試料を質量分析により分析した。
市販の血清を還元アルキル化した後、トリプシン消化およびPNGase Fによる糖鎖の遊離を行い、N型糖鎖を調製した。
以下の1-5の手順を番号順に行い、血清中糖タンパク質由来のN型糖鎖をエステル化反応に供し、還元末端をaoWRでラベル化した。
1. 調製したN型糖鎖をビーズ(BlotGlyco)に結合させた。結合はBlotGlycoのプロトコルに沿って行われた。
2. DMSOに溶解させた500mMのMTT溶液を100 μLビーズに加え、60 ℃で1時間反応させた。
3. ビーズをメタノール200 μLにより3回洗浄した。
4. aoWR試薬により糖鎖を標識し、回収した。
5. HILICプレート(Waters)を用いてaoWR試薬を除去した。
上記エステル化反応後のヒト血清糖タンパク質由来N型糖鎖を、99%アセトニトリル/1%酢酸を用いて希釈し、90%アセトニトリル濃度に調製した。その後、糖鎖試料を含む溶液をHILICプレート(waters)にアプライし、背面から真空吸引することで溶液をプレートの担体に通液させ、HILIC担体上に糖鎖を吸着させた。その後、エステルアミド変換を行うため5~40%(重量/体積%)のエチルアミンを含むアセトニトリルをアミド化反応溶液としてプレートに添加し、背面から真空吸引することでアミド化反応溶液をプレートの担体に通液させた。その後、プレートに95%アセトニトリル/1%酢酸を加え、同じく背面から真空吸引することでプレート担体を洗浄した。これを三回繰り返した。最後に5%アセトニトリル/1%酢酸をプレートに添加し糖鎖をHILICプレートから溶出させた。
DHBをマトリックスとし、Ultraflex II TOF/TOF-MS(Bruker)を用い正イオンモードで測定を行った。
図12は、本実施例で検出したヒト血清糖タンパク質由来N型糖鎖の構造の一例を示す概念図である。図12に示された糖鎖試料は、GlcNAcおよびManからなる基本型の構造と、3つの側鎖とを備える。3つの側鎖にはそれぞれGlcNAc、Galおよびシアル酸(Neu5Ac)が結合されている。シアル酸の結合様式はα2,3-またはα2,6-である。後述の実施例7でも同様の糖鎖が検出された。
本実施例では、標準血清由来N型糖鎖を試料とし、液相でアミド化反応を行い、得られた糖鎖試料を質量分析により分析した。評価用糖鎖試料の作成とエステル化反応は、実施例6と同様の条件で行った。
上記の方法で調製したヒト血清糖タンパク質由来N型糖鎖をチューブ内に分注し、2.5~40%(重量/体積%)エチルアミンを含むアセトニトリル溶液で10倍に希釈し、軽くボルテックスミキサーで混合することでアミド化反応を行った。その後、試料を含む溶液をHILICプレート(Waters)にアプライし、背面から真空吸引することで当該溶液をプレートの担体に通液させ、HILIC担体上に糖鎖を吸着させた。その後、95%アセトニトリル/1%酢酸をプレートに加え、同じく背面から真空吸引することでプレート担体を洗浄した。これを三回繰り返した。最後に5%アセトニトリル/1%酢酸をプレートに添加して糖鎖をHILICプレートから溶出させた。
DHBをマトリックスとし、MALDI-QIT-TOF-MS(AXIMA-Resonance, Shimadzu/Kratos) を用い正イオンモードで測定を行った。
実施例8では、スフィンゴ糖脂質(Glycosphingolipid; GSL)から得られたGSL糖鎖を担体に結合させた状態でエチルエステル化反応を行い、得られた糖鎖試料に対してアミド化反応を行い、質量分析により分析した。
実施例5の方法と同様の方法でα2,3-またはα2,8-シアル酸を合計二つ含む糖鎖(GD1a、GD1b)を作成した。遊離した糖鎖はグライコブロッティング法により固相担体へ結合させ、1-エチル-3-p-トリルトリアゼン(ETT)によりエチルエステル化を行い、aoWR標識糖鎖(100 μL)として回収した。A2GN1糖鎖についても、上記実施例1と同様に試料を作成し、本実施例の上記と同様にエステル化反応に供した。
得られたaoWR標識糖鎖溶液25 μLを250 μLのアミン溶液(濃度1 mol/L、溶媒はアセトニトリル)と混合し、HILICプレート(Waters)を用いて試料から過剰試薬を除去した。DHBをマトリックスとし、Ultraflex II TOF/TOF-MS(Bruker)を用い正イオンモードで測定を行った。A2GN1糖鎖についても、同様にアミド化反応および質量分析に供した。
図16は、GD1aおよびA2GN1糖鎖を試料としてエチルエステル化修飾反応を行った後、アミド化反応を行わなかった試料(a)と、1 M(Mはmol/L) メチルアミン、エチルアミンおよびプロピルアミンをそれぞれ含むアセトニトリル溶液を用いたアミド化反応を行って得られた試料(b、c、d)のマススペクトルを示す図である。GD1aについては、ETTによるエチルエステル化を行い、アミド化を行わないと、2つのα2,3-シアル酸がメチルエステル化された場合に対応するピーク(m/z 1776)が検出された。以下の各図において、マススペクトル中に示された矢印は、ピークと生成物の修飾体とを対応付けて示す。メチルエステル化の後、メチルアミン溶液によるアミド化反応を行うとシアル酸の一つのみがメチルアミド化された生成物(m/z 1761)に集約された。同様にエチルアミン、プロピルアミン溶液を用いた場合においてもシアル酸の一つのみがアミド化された生成物(m/z 1775、1789)に集約された。
実施例9では、アミド化反応溶液としてアセトニトリルを溶媒としたプロピルアミン溶液を用い、プロピルアミン溶液におけるプロピルアミンの濃度を0 M-3 Mの範囲の複数の濃度にそれぞれ調製した。その他は、実施例8と同様の方法でGSL糖鎖の質量分析を行った。
図19は、様々な濃度のプロピルアミン溶液をアミド化反応溶液としてそれぞれ用いた場合に得られたGD1aのマススペクトルを示す図である。GD1aの場合、0.125 Mのプロピルアミン溶液を用いた場合では、エステルアミド交換はほぼ進行せず、0.25 Mまたは0.5 Mより高い濃度を用いた場合に糖鎖の末端に存在するα2,3-シアル酸一つのみがプロピルアミド化した。
Claims (24)
- 糖鎖を含む試料からの分析用試料の調製方法であって、
前記糖鎖に含まれるシアル酸の少なくとも一部を、メチルエステル化、エチルエステル化、プロピルエステル化、ブチルエステル化、ペンチルエステル化、ヘキシルエステル化、およびベンジルエステル化からなる群から選択される少なくとも一つのエステル化に供するエステル化反応を行うことと、
前記試料と、前記エステル化により修飾されているシアル酸と反応させるアンモニア、第一級アミン、ヒドラジン、ヒドラジン誘導体およびヒドロキシアミンならびにこれらの塩からなる群から選択される少なくとも一つの化合物を含む、アミド化反応溶液とを接触させ、前記エステル化により修飾されているシアル酸のエステル化修飾をアミド化修飾に変換するアミド化反応を行うこととを備え、
前記アミド化反応において、前記アミド化反応溶液における前記化合物の濃度は、前記エステル化により修飾されているα2,6-シアル酸のエステル化修飾から前記アミド化修飾への変換が起きないように調節され、前記エステル化により修飾されているα2,3-シアル酸の少なくとも一部、α2,8-シアル酸、およびα2,9-シアル酸からなる群から選択される少なくとも一つのシアル酸のエステル化修飾がアミド化修飾に変換される分析用試料の調製方法。 - 請求項1に記載の分析用試料の調製方法において、
前記アミド化反応溶液の溶媒は、有機溶媒を含む、分析用試料の調製方法。 - 請求項2に記載の分析用試料の調製方法において、
前記有機溶媒は、アセトニトリルである、分析用試料の調製方法。 - 請求項2または3に記載の分析用試料の調製方法において、
前記アミド化反応において、α2,3-シアル酸の少なくとも一部、α2,8-シアル酸、およびα2,9-シアル酸からなる群から選択される少なくとも一つのシアル酸が、前記少なくとも一つのシアル酸の前記糖鎖における位置または前記糖鎖の構造に基づいてアミド化される分析用試料の調製方法。 - 請求項2から4までのいずれか一項に記載の分析用試料の調製方法において、
前記アミド化反応において、α2,3-シアル酸のうち該α2,3-シアル酸が直接結合する単糖の4位に別の単糖が結合していない2,3-シアル酸のエステル化修飾がアミド化修飾に変換される分析用試料の調製方法。 - 請求項1から5までのいずれか一項に記載の分析用試料の調製方法において、
前記試料と、エステル化反応溶液とを接触させることにより前記エステル化反応を行
うことを備え、
前記エステル化反応溶液は、アルコールおよびエステル化剤の少なくとも一つを含む、分析用試料の調製方法。 - 請求項6に記載の分析用試料の調製方法において、
前記エステル化反応溶液はエステル化剤を含み、
前記エステル化剤はトリアゼン誘導体である、分析用試料の調製方法。 - 請求項6または7に記載の分析用試料の調製方法において、
前記アミド化反応は、前記試料から前記エステル化反応溶液を除去するための操作の後、 前記試料を前記アミド化反応溶液と接触させることのみにより行われる、分析用試料の調製方法。 - 請求項6から8までのいずれか一項に記載の分析用試料の調製方法において、
前記アミド化反応溶液は、脱水縮合剤を含まない、分析用試料の調製方法。 - 請求項1から9までのいずれか一項に記載の分析用試料の調製方法において、
前記試料と前記アミド化反応溶液とを接触させた後、前記試料と脱水縮合剤とを反応させる操作を行わない、分析用試料の調製方法。 - 請求項1から10までのいずれか一項に記載の分析用試料の調製方法において、
前記アミド化反応を行うために前記試料と前記アミド化反応溶液とを接触させる時間は30分より短い、分析用試料の調製方法。 - 請求項1から11までのいずれか一項に記載の分析用試料の調製方法において、
前記アミド化反応の前に、前記エステル化反応により生成したラクトン構造を開裂するための操作を行わない、分析用試料の調製方法。 - 請求項1から12までのいずれか一項に記載の分析用試料の調製方法において、
前記化合物は第一級アミンである、分析用試料の調製方法。 - 請求項13に記載の分析用試料の調製方法において、
前記第一級アミンのアミノ基に結合した炭素原子に1以下の炭素原子が直接結合している、分析用試料の調製方法。 - 請求項1から14までのいずれか一項に記載の分析用試料の調製方法において、
前記化合物はアルキル基を含む、分析用試料の調製方法。 - 請求項1から15までのいずれか一項に記載の分析用試料の調製方法において、
前記アミド化反応溶液のpHは、7.7以上である、分析用試料の調製方法。 - 請求項6から9までのいずれか一項に記載の分析用試料の調製方法において、
前記試料と前記エステル化反応溶液とを接触させた際に、前記エステル化により修飾されなかったシアル酸の少なくとも一部がラクトン化され、
前記試料と、前記アミド化反応溶液とを接触させた際に、前記ラクトン化により修飾されているシアル酸のラクトン構造がアミド化修飾に変換される分析用試料の調製方法。 - 請求項1から17までのいずれか一項に記載の分析用試料の調製方法において、
前記エステル化反応および前記アミド化反応の少なくとも一つは、前記試料が固相担体に結合または吸着した状態で行われる、分析用試料の調製方法。 - 請求項4または5に記載の分析用試料の調製方法において、
前記有機溶媒を含むアミド化反応溶液を用いて前記アミド化反応を行った後、水系溶媒を含むアミド化反応溶液を前記アミド化反応に供された前記試料と接触させ、前記アミド化反応でアミド化されなかったシアル酸のアミド化を行うことをさらに備える、分析用試料の調製方法。 - 請求項1から19までのいずれか一項に記載の分析用試料の調製方法において、
前記アミド化反応に供した後の前記試料から第1分析用試料を調製することと、
前記エステル化反応に供した後、前記アミド化反応に供する前の前記試料から第2分析用試料を調製することと
を備える分析用試料の調製方法。 - 請求項1から19までのいずれか一項の分析用試料の調製方法により試料を調製することと、
調製した前記分析用試料の分析を行うことと
を備える分析方法。 - 請求項20に記載の分析用試料の調製方法により前記第1分析用試料および前記第2分析用試料を調製することと、
調製した前記第1分析用試料および前記第2分析用試料の分析を行うことと、
前記第1分析用試料の前記分析で得られたデータと前記第2分析用試料の前記分析で得られたデータの違いに基づいて、前記試料に含まれる糖鎖の解析を行うことと
を備える分析方法。 - 請求項21または22に記載の分析方法において、
前記分析は、質量分析およびクロマトグラフィの少なくとも一つにより行われる分析方法。 - 請求項1から19までのいずれか一項に記載の分析用試料の調製方法に用いられる分析用試料の調製用キットであって、
前記エステル化反応に用いられるアルコールまたはエステル化剤と前記化合物とを含む分析用試料の調製用キット。
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