CN108700551B - 唾液酸糖链解析方法 - Google Patents

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Abstract

本发明的目的是高效地进行包括糖链末端所连接的唾液酸的连接方式在内的唾液酸糖链的结构解析。对解析对象的试样(糖链)所含的唾液酸残基进行连接方式特异性修饰后(S2)，对该试样进行质量分析并获取质谱(S3)。基于从质谱上观测到的各峰的m/z值所推断出的修饰糖链的质量，对单糖组成进行以单糖的种类和个数范围为条件的逐一比对的推断(S4)，对于各峰可举出的候补单糖组成，通过使用连接方式特异性修饰引起的修饰体的质量差，缩减候选范围(S5)。具体的，是找出具有与连接方式特异性修饰引起的修饰体质量差相当的质量差的峰，视为含有连接异构体的源自同一糖链的一群峰，通过排除不满足有无唾液酸残基修饰体或其个数等条件的候补，对对应于所属峰的候补单糖组成进行锁定。

Description

唾液酸糖链解析方法
技术领域
本发明涉及利用质量分析来解析末端具有唾液酸的唾液酸糖链结构的方法，更详细地，涉及区分唾液酸的连接方式(连接位置)从而解析唾液酸糖链结构的解析方法。
背景技术
据说构成生物体的蛋白质有一半以上受到糖链修饰，糖链修饰对蛋白质的结构和功能的调节起到重要作用。此外，根据近年来的研究表明，细胞表面上发现的糖链对细胞间相互作用和信号传导、产生和分化、以及受精、癌转移等各种生物体内现象有关。此外，已知在糖链的非还原末端一侧结合有唾液酸等单糖，此种结合在末端的单糖也对糖链的功能起到重要的作用。
另外，唾液酸，是对于结合有氨基、羧基的特殊的九碳糖之神经氨酸，氨基、羟基被取代的化合物的总称。5位氨基被乙酰化的N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac)是天然最多的，但除此以外，也有5位的氨基被羟乙酰基修饰的N-羟乙酰神经氨酸(Neu5Gc)和脱氨基体之KDN等各种结构的。
如上所述的生物体内的功能中，糖链末端所连接的唾液酸的数量当然是很重要的，但其唾液酸残基的连接方法，即连接方式也很重要。例如人体中，作为唾液酸残基的连接方式，已知主要是α2,3-连接型和α2,6-连接型。这些也被称为连接异构体，人们也指出，随着癌化，连接方式也会变化，因此也被期待用作生物标志物。此外，基于生物医药品的品质管理等观点，不仅仅要求糖蛋白质、糖肽中氨基酸排列一致，还要求对翻译后修饰的结构进行控制，要求建立起用于进行包括唾液酸残基的连接方式的糖链修饰的控制和品质管理的分析方法。
以往，为了解析糖链中的唾液酸残基的连接方式，有提案提出了进行连接方式特异性之化学修饰的几个方法。它们是主要利用较之于α2,6-唾液酸残基，α2,3-唾液酸残基通过脱水缩合剂容易引起分子内脱水的性质的方法，有提案提出了：通过使糖链与甲醇反应而转化为内酯和甲酯的方法(参照非专利文献1)，通过与乙醇反应而转化为内酯和乙酯的方法(参照非专利文献2)，通过与氯化铵反应而转化为内酯和酰胺的方法(参照非专利文献3)，通过与二甲胺反应而转化为内酯和二甲基酰胺的方法(参照非专利文献4)等。此外，本发明人发现非专利文献5提出，通过使用了异丙胺的酰胺化，可以高精度的区分α2,3-唾液酸残基和α2,6-唾液酸残基。
一般，要使用质量分析来解析糖链结构，必须首先对解析对象之糖链实施质量分析，根据由此得到的质量电荷比值，推断构成糖链的单糖组成。为此，数据解析装置中，以糖链中可能存在的单糖的种类和个数的范围为搜索条件，再设定允许质量精度等分析参数，在此基础上进行逐一比对(round robin)搜索处理。这种处理只是将已知的单糖的正确质量和数量适当组合，搜索与实测质量电荷比值匹配的组合。其结果，计算上可以想到的单糖组成作为候选单糖组成被输出。进行此种搜索时，如果以区分连接方式特异性的唾液酸残基、具体是区分α2,3-唾液酸残基修饰和α2,6-唾液酸残基修饰为搜索条件，那么较之于不区分连接方式的情况，可得到的候选单糖组成大幅增加。这是由于唾液酸所相当的单糖残基单纯的增加了两倍以上。如此，候选单糖组成的数量变多的话，分析人员锁定候选的操作变得困难，操作时间增加，其精度也会下降。
参照图4、图5说明一个例子。图4、图5都是显示对于实测质谱和该质谱上的主峰的单糖组成搜索结果的图。
解析牛胎球蛋白(Fetuin)来源的N型糖链时，如果连接方式非特异性地修饰唾液酸残基从而在规定质量电荷比范围内进行质量分析，那么在质谱上可以观测到图4中▼标记所示的4个主峰。根据该质量分析结果，以规定条件搜索单糖组成的话，可得到的候选单糖组成合计只有10种左右。与此相对，如果连接方式特异性地修饰唾液酸残基从而进行相同质量分析的话，那么质谱上可观测到的主峰如图5所示增加到9个。根据该质量分析结果，以如上相同条件搜索单糖组成的话，可得到的候选单糖组成合计增加到48种。即，较之于观测到的峰数的增大程度，增加更大的是候选单糖组成的数量，而分析人员一个一个确认这众多的候选从而选择适当候选是非常繁琐的。
此外，上述计算中，作为唾液酸只考虑了Neu5Ac，但作为唾液酸糖链中的唾液酸残基，除了质量为291的Neu5Ac，质量为307的Neu5Gc也广为所知，在单糖组成搜索中，希望至少要考虑这两种唾液酸残基。这样的话，连接非特异性修饰所生成的唾液酸残基修饰体的质量种类会进一步增加，通过搜索可以得到的候选单糖组成的数量也会变得庞大。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献1：Wheeler SF等3人，唾液酸衍生化用于基质辅助激光解吸/电离质谱分析法的稳定并伴随α(2-->3)-和α(2-->6)-异构体的区分(Derivatization of sialicacids for stabilization in matrix-assisted laser desorption/ionization massspectrometry and concomitant differentiation of alpha(2-->3)-and alpha(2-->6)-isomers)，质谱快速通讯(Rapid Commun.Mass Spectrom.)，2009年1月，Vol.23，No.2，pp.303-312
非专利文献2：K.R.Reiding等5人，使用MALDI-TOF-MS通过连接特异性唾液酸酯化反应从而对蛋白质N-糖基化进行高通量分析(High-Throughput Profiling of ProteinN-Glycosylation by MALDI-TOF-MS Employing Linkage-Specific Sialic AcidEsterification)，分析化学(Anal.Chem.)，2014年，Vol.86，No.12，pp.5784-5793
非专利文献3：W.R.Alley等2人，血清糖蛋白衍生的聚糖中唾液酸连接的糖组学分析(Glycomic Analysis of Sialic Acid Linkages in Glycans Derived from BloodSerum Glycoproteins)，蛋白质组研究杂志(J.Proteome Res.)，2010年6月4日，Vol.9，No.6，pp.3062-3072
非专利文献4：N.de Haan等6人，连接特异性唾液酸衍生化用于MALDI-TOF-MS IgG糖肽的分析(Linkage-Specific Sialic Acid Derivatization for MALDI-TOF-MSProfiling of IgG Glycopeptides)，分析化学(Anal.Chem.)，2015年，Vol.87，No.16，pp.8284-8291
非专利文献5：西风(T.Nishikaze)等3人，对糖肽中唾液酸连接的区分：一种新的衍生化方法(Towards the discrimination of sialyl linkages in glycopeptides:Anew derivatization approach)，第63届美国质谱年会记录(ASMS Proceedings)，2015年5月，MP-674
非专利文献6：糖-取峰器(Glyco-Peak finder)，[在线]，[平成28年1月19日搜索]，互联网＜URL：http://www.glyco-peakfinder.org/＞
非专利文献7：金城(K.Kaneshiro)等5人，使用3-氨基喹啉/α-氰基-4-羟基肉桂酸液体基质的新氨基喹啉标记方法对聚糖进行高灵敏度MALDI分析(Highly SensitiveMALDI Analyses of Glycans by a New Aminoquinoline-Labeling Method Using 3-Aminoquinoline/α-Cyano-4-hydroxycinnamic Acid Liquid Matrix)，化学分析(Anal.Chem.)，2011年，Vol.83，No.10，pp.3663-3667
非专利文献8：福山(Y.Fukuyama)等9人，3-氨基喹啉/对香豆酸作为MALDI基质用于糖肽、碳水化合物和磷酸肽(3-Aminoquinoline/p-Coumaric Acid as a MALDI Matrixfor Glycopeptides,Carbohydrates,and Phosphopeptides)，化学分析(Anal.Chem.)，2014年，Vol.86，No.4，pp.1937-1942
发明内容
发明要解决的课题
本发明鉴于上述课题而作，其目的是提供一种唾液酸糖链解析方法，通过高效的锁定根据质量分析结果所推断出的唾液酸糖链的候选单糖组成，可以高效且高精度的进行包括唾液酸糖链中唾液酸残基的连接方式差异在内的结构解析。
解决课题的方法
为了解决上述课题而作的本发明，是一种唾液酸糖链解析方法，所述方法是利用质量分析对结合有唾液酸的唾液酸糖链的结构进行解析的唾液酸糖链解析方法，其特征在于，所述唾液酸糖链解析方法具有下述步骤：
a)修饰处理步骤，该步骤中，对解析对象之唾液酸糖链所含的唾液酸残基进行连接方式特异性地修饰；
b)执行分析步骤，该步骤中，对通过所述修饰处理步骤接受修饰后的唾液酸糖链进行质量分析，获取质谱信息；
c)候选推断步骤，该步骤中，对通过所述执行分析步骤而得到的质谱上观测到的峰，根据该峰的质量信息，推断候选单糖组成；
d)候选缩减步骤，该步骤中，将所述质谱上观测到的具有与所述连接方式特异性修饰方法对应的质量差的多个峰，视作含有同种类、但连接方式不同的唾液酸残基，唾液酸残基以外的单糖组成相同的唾液酸糖链所对应的一组峰，对于由该峰而得到的候选单糖组成，通过判定有无唾液酸残基、特定唾液酸残基修饰体的有无或其个数、唾液酸残基及唾液酸残基修饰体以外的单糖组成的同一性中的至少一个，缩减其范围。
唾液酸残基的连接方式，已知有α2,3-、α2,6-、α2,8-等，只要是能够进行连接方式特异性修饰(衍生化)的连接方式，换言之，只要是可以区分连接方式的修饰方法，则本发明不限制可对应的连接方式。典型的是，本发明涉及的唾液酸糖链解析方法，对区分主要连接方式之α2,3-唾液酸残基和α2,6-唾液酸残基的糖链结构的解析是有用的。
此时，上述修饰处理步骤中，例如，作为连接方式特异性修饰，可以进行异丙基酰胺修饰及甲基酰胺修饰。α2,6-唾液酸残基经异丙基酰胺修饰，α2,3-唾液酸残基经甲基酰胺修饰，它们的修饰体的质量差为整数质量28Da。也可以用内酯修饰代替甲基酰胺修饰，此时的修饰体质量差为整数质量59Da。此外，非专利文献1中记载的连接方式特异性修饰法(内酯修饰及甲酯修饰)中的修饰体质量差为整数质量32Da，非专利文献2中记载的连接方式特异性修饰法(内酯修饰及乙酯修饰)中的修饰体质量差为整数质量48Da，非专利文献3中记载的连接方式特异性修饰法(内酯修饰及酰胺修饰后彻底甲基化)中的修饰体质量差为整数质量13Da，非专利文献4中记载的连接方式特异性修饰法(内酯修饰及二甲基酰胺修饰)中的修饰体质量差为整数质量45Da。
例如唾液酸之一的Neu5Ac的质量为291，但α2,6-唾液酸残基经异丙基酰胺修饰、α2,3-唾液酸残基经甲基酰胺修饰时，区分成异丙基酰胺修饰体的质量为322、甲基酰胺修饰体的质量为304两者。当前，含有3个唾液酸残基的糖链中，作为这3个唾液酸残基的连接方式组合，有全部为α2,3-之[α2,3-、α2,3-、α2,3-]，2个α2,3-之[α2,3-、α2,3-、α2,6-]，1个α2,3-之[α2,3-、α2,6-、α2,6-]，全部为α2,6-之[α2,6-、α2,6-、α2,6-]这四种组合的可能性，根据其组合，糖链的质量不同。因此，质谱上有可能观测到按照与异丙基酰胺修饰体和甲基酰胺修饰体的质量差28Da相当的质量差排列的最大4个峰。
因此，本发明的候选锁定步骤中，作为基于连接方式特异性修饰方法的质量差，提取具有例如28Da的多个峰，将这些峰视为含有连接方式不同的唾液酸残基、唾液酸残基以外的单糖组成相同的唾液酸糖链所对应的一群峰(以下称为“异构体团簇峰”(isomercluster peak))。由于异构体团簇峰所对应的糖链应当必定含有唾液酸，因此，例如对于异构体团簇峰所属的某个峰所得到的候选单糖组成中，如果不存在唾液酸残基，则该候选可以判断为不适合。
此外，属于一个异构体团簇峰的多个峰各自对应的糖链，其唾液酸残基及唾液酸残基修饰体以外的单糖组成应当是相同的。因此，通过判断唾液酸残基及唾液酸残基修饰体以外的单糖组成的同一性，还可以缩减单个组成候选的范围。
此外，例如质量差为28Da或其2倍的56Da的2个峰中，质量大的峰所对应的糖链中应当含有质量相对大的异丙基酰胺修饰体，质量小的峰所对应的糖链中应当含有质量相对小的甲基酰胺修饰体。因此，利用其也可以根据特定唾液酸残基修饰体的有无或其个数来缩减单个组成候选的范围。
即，作为本发明的一个实施方式，在上述候选锁定步骤中，对于一个以上的糖链末端结合有唾液酸的唾液酸糖链，找到上述连接方式特异性修饰引起的唾液酸残基的不同修饰体的质量差，例如28Da所对应的多个峰，以下述为条件：其中低质量侧的峰所对应的单糖组成含有至少一个质量小的唾液酸残基修饰体，例如甲基酰胺修饰体，高质量侧的峰所对应的单糖组成含有至少一个质量大的唾液酸残基修饰体，例如异丙基酰胺修饰体，由此可以锁定候选单糖组成。
更具体的，上述候选锁定步骤中，找出与上述连接方式特异性修饰引起的唾液酸残基的不同修饰体的质量差ΔM的N倍(但N是1以上的整数)相当的2个峰，以该低质量侧的峰所对应的单糖组成含有质量小的N个唾液酸残基修饰体为条件，可以锁定候选单糖组成。该质量小的N个唾液酸修饰体是例如α2,3-唾液酸残基的修饰体。
此外，上述候选锁定步骤中，找出与上述连接方式特异性修饰引起的唾液酸残基的不同修饰体的质量差ΔM的N倍(但N是1以上的整数)相当的2个峰，以高质量侧的峰所对应的单糖组成含有质量大的N个唾液酸残基修饰体为设定，也可以锁定候选单糖组成。该质量大的N个唾液酸修饰体是例如α2,6-唾液酸残基的修饰体。
另外，理论上，即使三个以上的峰同属一个异构体团簇峰时，也不一定能观测到所有的峰。例如如上所述的含有3个唾液酸残基的糖链中，虽然可能观测到4个峰，但实际上经常只能观测到2个或3个峰(其他的峰因强度太小而无法观测到)。因此，不仅仅只是找到与修饰体质量差相当的峰，找到与质量差2倍、3倍等相当的峰也是有用的。
此外，本发明涉及的唾液酸糖链解析方法中，上述候选推断步骤中，可以以可能含有的单糖种类及个数范围为搜索条件，通过计算与峰的质量匹配的单糖组合来推断单糖组成的候选。
这样，只要适当设定单糖的种类和个数范围，就能无遗漏的抽取出候选单糖组成。
此外，本发明涉及的唾液酸糖链解析方法中，上述执行分析步骤中，可以通过负离子模式实施质量分析。负离子模式的质量分析中，较之于正离子模式，糖链离子稳定且难以引起不必要的碎片化，因此适宜根据质谱进行结构解析。此外，负离子模式下，难以产生附加了钠、钾等的加和离子(adduct ion)，因此质谱上不会出现源自加和离子的噪音峰，容易提取源自目标糖链的峰。
另外，本发明涉及的唾液酸糖链解析方法中的候选推断步骤及候选锁定步骤的处理，可以通过运行个人计算机或更高性能的计算机中预装的软件(计算机程序)进行。
发明的效果
根据本发明涉及的唾液酸糖链解析方法，对于根据质量分析结果所推断出的唾液酸糖链的候选单糖组成，可以通过区分唾液酸残基的连接方式而高效锁定并减少候选数量。由此，可以高效且高精度的进行包括唾液酸糖链中的唾液酸残基的连接方式差异在内的结构解析。
附图说明
[图1]显示本发明的一个实施例的唾液酸糖链解析方法中解析顺序概略的流程图。
[图2]本实施例的唾液酸糖链解析方法中的候选单糖组成的锁定方法的说明图(2个唾液酸残基的情况)。
[图3]本实施例的唾液酸糖链解析方法中的候选单糖组成的锁定方法的说明图(3个唾液酸残基的情况)。
[图4]显示唾液酸连接方式非特异性修饰的牛胎球蛋白来源的N型糖链的实测质谱，以及4个主峰的单糖组成搜索结果图。
[图5]显示唾液酸连接方式特异性修饰的牛胎球蛋白来源的N型糖链的实测质谱，以及9个主峰的单糖组成搜索结果图。
[图6]显示唾液酸连接方式特异性修饰的牛胎球蛋白来源的N型糖链的实测质谱的m/z＝2500附近的放大图，以及通过本实施例的方法锁定其中检出的峰的单糖组成搜索结果的图。
[图7]显示唾液酸连接方式特异性修饰的牛胎球蛋白来源的N型糖链的实测质谱的m/z＝2800附近的放大图，以及对于其中检出的峰的单糖组成搜索结果的图。
[图8]显示唾液酸连接方式特异性修饰的牛胎球蛋白来源的N型糖链的实测质谱的m/z＝3150附近的放大图，以及通过本实施例的方法锁定其中检出的峰的单糖组成搜索结果的图。
[图9]显示唾液酸连接方式特异性修饰的牛胎球蛋白来源的N型糖链的实测质谱的m/z＝3500附近的放大图，以及通过本实施例的方法锁定其中检出的峰的单糖组成搜索结果的图。
具体实施方式
以下参照附图详细说明本发明的一个实施例的唾液酸糖链解析方法。图1是显示本实施例的唾液酸糖链解析方法中的解析顺序概略的流程图，图2及图3是用于说明本实施例的唾液酸糖链解析方法中的候选单糖组成的锁定方法的概念图。
首先，参照图1～图3，说明本实施例的唾液酸糖链解析方法的概要和特征之候选单糖组成的锁定方法。
首先，使用已知的方法，从解析对象之含有糖链(唾液酸糖链)的糖蛋白质中，切除糖链，再对切除的糖链进行纯化，制备试样(步骤S1)。
接着，对调制出的试样含有的糖链所连接的唾液酸进行连接方式特异性衍生物化，从而进行修饰(步骤S2)。对于糖链的唾液酸的连接方式，已知的还有α2,8-连接等，但这里考虑的是重要性特别高的α2,3-连接与α2,6-连接等2种。作为区分α2,3-唾液酸残基和α2,6-唾液酸残基从而进行修饰的方法，已知有如上所述的几种方法(参照非专利文献1～5等)。只要可以对唾液酸残基进行连接方式特异性地修饰，则无论其修饰(衍生物化)的方法，这里使用的是非专利文献5中公开的异丙基酰胺修饰/甲基酰胺修饰。此时，α2,6-唾液酸经修饰而成为异丙基酰胺修饰体，α2,3-唾液酸经修饰成为甲基酰胺修饰体。以下说明中，唾液酸的异丙基酰胺修饰体记载为iPA修饰体，唾液酸的甲基酰胺修饰体记载为MA修饰体。
此外，如上所述，唾液酸中除了Neu5Ac以外，还有Neu5Gc、KDN等，但这里考虑的是存在量最多的Neu5Ac。此外，以下的说明中，为了避免繁琐的说明，对于质量，基本上使用名义质量(由天然存在量比最大的同位体构成的整数质量)。该Neu5Ac的质量为291，但iPA修饰体的质量为332，MA修饰体的质量为304，其质量差为28Da。
在如上所述对试样中的糖链所含的唾液酸残基进行连接方式特异性修饰后，对该试样进行质量分析，获取规定的质量电荷比范围内的质谱(步骤S3)。为了如后所述的根据质量信息来推断单糖组成，希望质量精度较高。因此，作为质量分析装置，较好的是使用可以进行高精度、高灵敏度分析的飞行时间型质量分析装置或傅立叶变换型质量分析装置等。
获得质谱后，提取出该质谱上观测到的峰，对于每个提取到的峰，根据其质量值推断单糖组成。具体的，单糖组成的推断，通过以分析者预先指定的单糖种类及其个数范围为搜索条件，再以允许质量误差等为分析参数，逐一比对搜索出与实测峰的质量值一致(实际上会在规定的数值范围内)的单糖组合，从而进行的(步骤S4)。此种搜索可以在电脑上进行，例如可以使用网上免费提供的糖链搜索用软件——Glyco-Peak finder(参照非专利文献6)。当然，也可以使用其他的软件进行同样的处理。
推断上述单糖组成时，为了避免遗漏正确的单糖组成，必须将单糖的种类和其个数范围指定的较为宽泛。因此，无法避免的会对每个峰举出多个候选单糖组成。已说明的图5的例中，对于m/z＝3529.4的峰，可举出10种候选单糖组成。因此接下来，对于每个峰，利用步骤S2的连接方式特异性修饰处理方法所对应的质量差信息，锁定候选单糖组成(步骤S5)。对于该锁定方法，参照图2、图3进行说明。
现在，考虑唾液酸糖链为搜索链糖链(双支链)结构、各链末端结合有唾液酸的情况。此时，如图2(a)～(c)所示，α2,3-唾液酸与α2,6-唾液酸的组合可想到3种。这3种的质量相同，无法通过质量进行区分。如果进行上述的连接方式特异性修饰，那么α2,3-唾液酸残基成为MA修饰体，α2,6-唾液酸残基成为iPA修饰体，因此可以想到图2(d)～(f)所示的3种修饰体组合。如上所述，由于MA修饰体与iPA修饰体的质量差为28Da，因此上述3种修饰体组合的质量分别相差28Da。即，经过连接方式特异性修饰的唾液酸糖链的质量，会根据唾液酸残基的连接方式而变得不同，从而可以进行区分。
在对经过了连接方式特异性修饰后的唾液酸糖链进行质量分析后得到的质谱上，上述3种组合呈现为间隔28Da的3个峰P1、P2、P3。因此，质谱上观测到间隔28Da的多个峰的话，它们有很高可能源自仅唾液酸残基的修饰体不同，即唾液酸残基以外的单糖组成相同、唾液酸残基的个数也相同的糖链。因此，这样的多个峰，也视为唾液酸残基以外的单糖组成相同、唾液酸残基的个数也相同、仅该唾液酸残基的连接方式不同的一群峰，即异构体团簇峰。
根据图2所示的3种修饰体组合与3个峰的对应关系，可以明确如下。
(A1)3个峰所对应的单糖组成必定含有唾液酸残基修饰体。
(A2)间隔28Da的任意2个峰中，质量小的峰所对应的单糖组成含有1个以上的MA修饰体、即α2,3-唾液酸残基。
(A3)间隔28Da的任意2个峰中，质量大的峰所对应的单糖组成含有1个以上的iPA修饰体、即α2,6-唾液酸残基。
(A4)观测到具有2个唾液酸残基、间隔28Da的3个峰时，质量最大的峰所对应的单糖组成仅含有iPA修饰体，质量最小的峰所对应的单糖组成仅含有MA修饰体。
(A5)唾液酸残基以外的单糖组成相同。
因此，不满足上述(A1)～(A5)条件的候选单糖组成可以从候选中排除，由此可以锁定候选。
接着，考虑唾液酸糖链为三链糖链(三支链)结构、各链末端结合有唾液酸的情况。此时，如图3(a)～(d)所示，α2,3-唾液酸与α2,6-唾液酸的组合可想到4种。这4种的质量相同，无法通过质量进行区分。进行上述的连接方式特异性修饰后，可想到图2(e)～(h)所示的4种修饰体组合。如上所述，由于MA修饰体与iPA修饰体的质量差为28Da，因此上述4种修饰体组合的质量也分别相差28Da。即，经过连接方式特异性修饰的唾液酸糖链的质量，会根据唾液酸残基的连接方式而变得不同，从而可以进行区分。
在对经过了连接方式特异性修饰后的唾液酸糖链进行质量分析后得到的质谱上，上述4种组合呈现为间隔28Da的4个峰P1、P2、P3、P4。因此，此时在质谱上观测到间隔28Da的多个峰的话，也可以视为异构体团簇峰。与上述的2个唾液酸残基的情况相同，此时对异构体团簇峰也可以举出如下条件。
(B1)4个峰所对应的单糖组成必定含有唾液酸残基修饰体。
(B2)间隔28Da的任意2个峰中，质量小的峰所对应的单糖组成含有1个以上的MA修饰体、即α2,3-唾液酸残基。
(B3)间隔28Da的任意2个峰中，质量大的峰所对应的单糖组成含有1个以上的iPA修饰体、即α2,6-唾液酸残基。
(B4)在质量大侧间隔28Da存在N个峰时1个峰所对应的单糖组成含有N个以上的MA修饰体、即α2,3-唾液酸残基。
(B5)在质量小侧间隔28Da存在N个峰时1个峰所对应的单糖组成含有N个以上的iPA修饰体、即α2,6-唾液酸残基。
因此，不满足上述(B1)～(B5)条件的候选单糖组成也可以从候选中排除，由此可以锁定候选。
如上，根据质谱上的峰的质量差找出异构体团簇峰，对于属于一个异构体团簇峰的多个峰所对应的候选单糖组成，通过有无唾液酸残基修饰体、特定的唾液酸残基修饰体的有无或其个数、或者唾液酸残基以外的单糖组成的同一性等进行判断，排除不匹配的候选，由此可以恰当的锁定候选。另外，此种锁定也可以在电脑上进行。然后，将通过此种锁定后剩下的候选单糖组成，作为解析结果显示在例如显示器的画面上，提供给分析者(步骤S6)。
实施例
接下来，详细说明适用本实施例的唾液酸糖链解析方法的实验例。
[步骤S1]糖链的切出及纯化
本实验中，按照如下顺序，从含有α2,3-唾液酸糖链和α2,6-唾液酸糖链两者的糖蛋白质中，切出游离糖链，制备出试样。
首先，将牛胎球蛋白溶解在20mM浓度的重碳酸铵、10mM浓度的二硫苏糖醇(DTT)、0.02％浓度的十二烷基硫酸钠(SDS)的混合液中，通过100℃、热处理3分钟从而进行改性及还原。然后，将该溶液冷却至室温，加入作为消化酶的PNGase F(Peptide-N-GlycosidaseF)，37℃下保温培养一晩，由此使得糖链从肽游离。然后，进行100℃、3分钟热处理，使得PNGase F失活，由此停止酶反应。
接着，使用碳柱，对通过酶反应而切出的糖链进行脱盐纯化。这里使用的碳柱，是通过切取出直径约1mm的活性炭盘(EMPORE(注册商标)Disk Carbon)，层叠、充填在200μL容积的柱片(column chip)而制作出的如纯化柱般的自制微片(micro chip)。首先，向该碳柱加入100μL的乙腈(ACN)后，离心排出溶液。然后，使用1M浓度的氢氧化钠(NaOH)、1M浓度的盐酸(HCl)、60％浓度的ACN、0.1％浓度的三氟乙酸(TFA)溶液、以及水分别进行同样的操作，以清洗柱载体和使其平衡化。将该酶反应溶液导入柱内，离心排出溶液。再加入200μL的水，然后离心排出液体，重复3次该操作进行清洗。最后，加入60％浓度的ACN和0.1％浓度的TFA溶液的混合液20μL，离心回收溶液，重复2次该操作，使得糖链溶出。合并2次量的溶出液，使用离心真空浓缩器除去溶剂，使其干固。
[步骤S2]唾液酸残基的连接方式特异性修饰
在干固的试样中，加入溶解于二甲基亚砜(DMSO)的4M浓度的异丙胺盐酸盐10μL。接着，作为脱水缩合剂，加入以各自浓度分别为500mM的方式将二异丙基碳二亚胺(DIC)及1-羟基苯并三唑(HOBt)溶解于DMSO所得的溶液10μL，室温下搅拌2分钟后，使其在37℃下反应1小时。在反应后的溶液中，加入93.3％浓度的ACN、0.13％浓度的TFA溶液120μL而稀释，使用GL Sciences公司制造的GL-Tip(注册商标)酰胺除去过量的试剂。具体的，在GL-Tip酰胺中加入水100μL，离心排出，重复3次操作进行清洗，由此清洗柱片(chip)。接着，加入100μL的90％浓度的ACN、0.1％浓度的TFA溶液，离心排出，重复3次进行平衡化。接着，全量加入稀释后的反应溶液并进行离心，使糖链吸附在载体上。然后，加入200μL的90％浓度的ACN、0.1％浓度的TFA溶液，离心排出，重复3次进行清洗。最后加入水10μL，离心排出，重复2次使糖链溶出。然后合并2次量的溶出液，使用离心真空浓缩器除去溶剂并干固。
接着，在干固的试样中，加入溶解于DMSO的2M浓度的甲胺盐酸盐10μL。接着，作为脱水缩合剂，加入溶解于30％浓度的N-甲基吗啡啉(NMM)的500mM浓度的六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷(PyBOP)10μL，室温下搅拌1小时，促进反应。在该反应后的溶液中，加入93.3％浓度的ACN、0.13％浓度的TFA溶液120μL，使用GL-Tip酰胺，进行上述同样的纯化及溶出操作，使用离心真空浓缩器，使回收的溶出液干固。
通过以上的处理，制备出结合有糖链的唾液酸经过连接特异性修饰的试样。
[步骤S3]实施质量分析
将干固的试样用适量的水再次溶解，仅将1μL的溶液滴至MALDI用聚焦板上，加入作为基质的溶解于50％浓度的ACN中的100mM浓度的3AQ/CA、2mM浓度的硫酸铵0.5μL后，在75℃的加热块上放置1.5小时。由此，通过3AQ促进了糖链的还原末端的标记化反应。反应结束后，将板冷却至室温，作为质量分析装置，使用MALDI-QIT-TOFMS(岛津制作所/克雷托斯(Kratos)公司制造的AXIMA Resonance)，以负离子模式进行质量分析，由此获取规定质量电荷比范围内的质谱。另外，这里使用的测定方法被称为在靶3AQ化(on target 3AQ化)，是本申请人在非专利文献7、8等中提出的高灵敏度糖链检测法，但也不限定为该测定方法。
[步骤S4]单糖组成的推断
单糖组成的推断中，使用的是作为搜索与质谱上检出的质量电荷比值一致的候选单糖组成的软件的Glyco–Peak Finder。这是基本上不使用数据库、而是计算已知单糖的质量信息和其数量的组合的逐一比对搜索。但是，由于上述软件原本并不对应唾液酸的修饰，因此，在追加受到修饰的唾液酸残基的质量作为任意的单糖残基的基础上进行搜索。
作为搜索条件所指定的单糖的种类及个数范围如下。
·己醣(Hex)：3～15
·N-乙酰己糖胺(HexNAc)：2～14
·脱氧已糖(dHex)：0～4
·N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac)：0～5(但是，在受到修饰时因连接方式而质量不同的情况下，对于每一质量，按0～5计)
·硫酸盐(S)：0～2
上述搜索的结果如已经说明的图5所示。
[步骤S5]锁定候选单糖组成
＜双链糖链+2个唾液酸残基的情况＞
图6显示的是m/z＝2500附近的质谱放大图及该部分中的单糖组成搜索结果一览。图6(以及图8、图9也相同)中的单糖组成搜索结果一览中，经锁定而排除的候选以浅色文字表示。
图4及图5所示质谱上观测到的m/z＝2471.9的峰，根据其质量电荷比值，如图6中所示糖链结构，可知是双链糖链附加了2个唾液酸残基。观察图6所示质谱，在以m/z＝2499.9的峰为中心的左右，可以观测到基于α2,3-唾液酸残基与α2,6-唾液酸残基的不同(MA修饰体与iPA修饰体的差异)的差28Da的峰。因此，将这3个峰视为构成异构体团簇峰。如上所述，与异构体团簇峰所属的3个峰对应的糖链应当含有唾液酸残基，因此这3个峰对应的候选单糖组成中，不含唾液酸残基的被从候选中排除。图6的例中，从峰P3对应的四个候选中，由于第1个和第2个候选不含唾液酸残基，因此被排除。
此外，上述3个峰中，质谱上质量大侧存在的具有质量差28Da的峰所对应的单糖，其组成中应当含有一个以上的MA修饰体。因此，该峰所对应的候选单糖组成中，排除不含MA修饰体的候选。图6的例中，峰P2所对应的两个候选中，由于第2个候选不含α2,3-唾液酸残基，因此被排除。
相反，质谱上质量小侧存在的具有质量差28Da的峰所对应的单糖，其组成中应当含有一个以上的iPA修饰体。因此，该峰对应的候选单糖组成中，排除一个iPA修饰体都不含的候选。图6的例中，峰P1所对应的两个候选中，由于第2个候选一个α2,6-唾液酸残基都不含，因此被排除。
此外，对于峰P3，由于在质量小侧的28Da的两倍之56Da的质量差位置存在峰P2，因此与峰P3对应的单糖组成中应当含有两个以上的iPA修饰体。因此，对于峰P3，所剩余的两个候选中，只含有一个α2,6-唾液酸残基的第4个候选被排除。
通过此种处理，可以锁定候选单糖组成。图6所示例中，可以将与3个峰对应的候选单糖组成分别锁定到一个。
＜三链糖链+2个唾液酸残基的情况＞
图7显示的是m/z＝2800附近的质谱放大图及该部分中的单糖组成搜索结果一览。此时，对于m/z＝2865.1的峰，可推断出三个单糖组成。但是，在这里无法观测到有意义的强度的、即强度在规定阈值以上的异构体团簇峰。因此，此时无法进行如上所述的利用异构体团簇来锁定候选。
＜三链糖链+唾液酸残基3个的情况＞
图8显示的是m/z＝3150附近的质谱放大图及该部分单糖组成搜索结果一览。
m/z＝3141.1的峰，根据其质量电荷比值，如图8中所示的糖链结构，可知是三链糖链附加了3个唾液酸残基。该m/z＝3141.1的峰可以举出四个候选单糖组成，对于该峰，在+28Da和+56(＝28×2)Da的位置分别观测到峰。因此，推断这3个峰是异构体团簇峰。
该异构体团簇峰所属的与m/z＝3141.1的峰对应的候选单糖组成中，可以排除不含α2,3-唾液酸残基(Neu5Ac(a2,3))的第1个候选和只含有1个α2,3-唾液酸残基的第4个候选。上述3个峰正中的m/z＝3169.1的峰可以举出七个候选单糖组成，但可以排除不含唾液酸残基的第1个～第3个候选。此外，由于应当分别含有1个以上的α2,3-唾液酸残基(Neu5Ac(a2,3))和α2,6-唾液酸残基(Neu5Ac(a2,6))，因此也可以排除第6个和第7个候选。此外，上述3个峰的质量最大的m/z＝3197.3的峰可以举出六个候选单糖组成，但由于应当含有2个以上的α2,6-唾液酸(Neu5Ac(a2,6))，因此可以排除第1个～第3个、以及第6个候选。
如此将质量差为28Da的三个峰视为异构体团簇峰，可以将合计17个候选单糖组成减少至6个。
＜三链糖链+4个唾液酸残基的情况＞
图9显示的是m/z＝3500附近的质谱放大图及该部分中的单糖组成搜索结果一览。
m/z＝3501.4的峰，根据其质量电荷比值，如图9中所示糖链结构，可知是三链糖链附加了4个唾液酸残基。此时，由于存在4个唾液酸残基，因此α2,3-唾液酸残基与α2,6-唾液酸残基的组合可以认为有4种，但在质谱上只观测到了质量电荷比差为28Da的3个峰。此时也可根据与上述相同的规则来排除候选单糖组成。
即，对于m/z＝3501.4的峰，在+28Da的位置观测到峰，因此m/z＝3501.4的峰所对应的10个候选单糖组成中，排除不含α2,3-唾液酸残基的第1个、第3个、第5个、以及第10个候选。此外，尽管强度低但在-28Da的位置观测到峰，因此也排除一个α2,6-唾液酸也不含的第2个、第4个、以及第6个候选。其结果是可以缩减到三个候选。
同样的，m/z＝3529.4的峰所对应的10个候选单糖组成中，首先可以排除一个唾液酸残基也不含的第7个候选，由于在-28Da的位置存在峰，因此也可以排除一个α2,6-唾液酸残基也不含的第1个、第3个、以及第5个候选。进一步地，由于在-56Da的位置也存在峰，因此也可以排除只含有1个α2,6-唾液酸残基的第2个、第4个、以及第6个候选。其结果是，可以锁定三个候选。通过该锁定，剩余的候选单糖组成含有4个唾液酸残基。如此，即使只能观测到一部分应当属于异构体团簇峰的峰，也可以进行充分锁定。
另外，上述实验的锁定中，根据唾液酸残基、唾液酸残基修饰体的有无或其个数而排除候选，但如上所述，与异构体团簇峰所属的峰对应的糖链，也可以通过不符合唾液酸残基修饰体以外的单糖组成相同这样的条件，即排除单糖组成不同的候选，来进行锁定。
另外，上述实施例中，作为连接方式特异性修饰，使用的是异丙基酰胺修饰及甲基酰胺修饰，但也可以使用内酯修饰替代该甲基酰胺修饰，由于此时修饰体的质量差是整数质量59Da，为了找到异构体团簇峰，可以搜索59Da或其整数倍间隔的峰。
此外，非专利文献1中记载的连接方式特异性修饰法(内酯修饰及甲酯修饰)中，修饰体的质量差是整数质量32Da，非专利文献2中记载的连接方式特异性修饰法(内酯修饰及乙酯修饰)中，修饰体的质量差是整数质量48Da，非专利文献3中记载的连接方式特异性修饰法(内酯修饰及酰胺修饰后彻底甲基化)中，修饰体的质量差是整数质量13Da，非专利文献4中记载的连接方式特异性修饰法(内酯修饰及二甲基酰胺修饰)中，修饰体的质量差是整数质量45Da，对它们也可以同样地搜索其质量差或其整数倍间隔的峰，由此找到异构体团簇峰。
另外，上述实施例中，作为离子化方法，使用了MALDI，当然，使用其他的离子化方法，例如可以产生多价离子的电喷雾离子化等的离子化也可适用于本发明。通过利用此种离子化方法，样品以多价离子形式被检测出时，只要留意应当考虑的修饰体的质量差是价数分之一，就可以找到正确的异构体团簇峰。或者，在最近的高性能质量分析装置中，根据从得到的质谱求得的同位体质量的间隔，可以马上判断是几价的离子，因此可以从中推断出修饰糖链的质量。此外，异构体团簇峰的检测也可以不使用质量电荷比，而使用从该质量电荷比推断出的修饰糖链的质量。
另外，上述实施例中，作为唾液酸，仅推断了N-乙酰神经氨酸，但很明显，除此以外种类的唾液酸，例如本发明也可适用于N-羟乙酰神经氨酸。此外，对于α2,3-、α2,6-以外的连接方式，只要其连接方式可进行特异性修饰，就明确也可适用于本发明。
此外，上述实施例只是本发明的一个例子，除了上述记载的变形例以外，在本发明主旨范围内的适当变形、修正、追加等也当然包含于本专利权利要求的范围之内。

Claims (10)

1.一种唾液酸糖链解析方法，所述方法利用质量分析对结合有唾液酸的唾液酸糖链的结构进行解析，其特征在于，所述唾液酸糖链解析方法具有下述步骤：a)修饰处理步骤，该步骤中，对解析对象之唾液酸糖链所含的唾液酸残基进行连接方式特异性地修饰；b)执行分析步骤，该步骤中，对通过所述修饰处理步骤受到修饰后的唾液酸糖链进行质量分析，获取质谱信息；c)候选推断步骤，该步骤中，对于通过所述执行分析步骤而得到的质谱上观测到的峰，依据该峰的质量信息，推定候选单糖组成；d)候选范围缩减步骤，该步骤中，将所述质谱上观测到的、具有与所述连接方式特异性修饰方法对应的质量差的多个峰，视为含有同种类、但连接方式不同的唾液酸残基，唾液酸残基以外的单糖组成相同的唾液酸糖链所对应的一组峰，对于由该峰而得到的候选单糖组成，通过以下步骤i)+ii)+iii)或步骤iv)，缩减其范围：
i)排除不包括唾液酸残基的单糖组合物候选物；
ii)排除不包括特定唾液酸残基修饰体的单糖组合物候选物；
iii)排除不包括预定数量的特定唾液酸残基修饰体的单糖组合物候选物；
iv)排除唾液酸残基及唾液酸残基修饰体以外的单糖组成不相同的单糖组合物候选物。
2.根据权利要求1所述的唾液酸糖链解析方法，其特征在于，作为连接方式不同的唾液酸残基，进行区分α2,3-唾液酸残基和α2,6-唾液酸残基的糖链结构解析。
3.根据权利要求2所述的唾液酸糖链解析方法，其特征在于，所述修饰处理步骤中，作为连接方式特异性修饰，进行异丙基酰胺修饰及甲基酰胺修饰。
4.根据权利要求1所述的唾液酸糖链解析方法，其特征在于，所述候选范围缩减步骤中，对于一个以上的糖链末端上结合有唾液酸的唾液酸糖链，找出与所述连接方式特异性修饰引起的唾液酸残基的不同修饰体的质量差对应的多个峰，以其中的低质量侧的峰所对应的单糖组成含有至少一个质量小的唾液酸残基修饰体、高质量侧的峰所对应的单糖组成含有至少一个质量大的唾液酸残基修饰体为条件，缩减候候单糖组成范围。
5.根据权利要求4所述的唾液酸糖链解析方法，其特征在于，所述候选范围缩减步骤中，找出与所述连接方式特异性修饰引起的唾液酸残基的不同修饰体的质量差ΔM的N倍相当的2个峰，N是1以上的整数，以其低质量侧的峰所对应的单糖组成含有质量小的N个唾液酸残基修饰体为条件，缩减候选单糖组成范围。
6.根据权利要求5所述的唾液酸糖链解析方法，其特征在于，所述质量小的N个唾液酸修饰体是α2,3-唾液酸残基的修饰体。
7.根据权利要求4所述的唾液酸糖链解析方法，其特征在于，所述候选范围缩减步骤中，找出与所述连接方式特异性修饰引起的唾液酸残基的不同修饰体的质量差ΔM的N倍相当的2个峰，N是1以上的整数，以其高质量侧的峰所对应的单糖组成含有质量大的N个唾液酸残基修饰体为条件，缩减候选单糖组成范围。
8.根据权利要求7所述的唾液酸糖链解析方法，其特征在于，所述质量大的N个唾液酸修饰体是α2,6-唾液酸残基的修饰体。
9.根据权利要求1所述的唾液酸糖链解析方法，其特征在于，所述候选断步骤中，以可能含有的单糖种类及个数范围为搜索条件，通过计算与峰的质量匹配的单糖组合，推断候选糖链组成。
10.根据权利要求1所述的唾液酸糖链解析方法，其特征在于，所述执行分析步骤中，实施基于负离子模式的质量分析。
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