JP6508409B2 - シアリル糖鎖解析方法 - Google Patents

Description

本発明は、シアル酸を末端に有するシアリル糖鎖の構造を質量分析を利用して解析する方法に関し、さらに詳しくは、シアル酸の結合様式（結合位置）を区別してシアリル糖鎖の構造を解析する解析方法に関する。

生体を構成するタンパク質の半分以上は糖鎖修飾を受けていると言われており、糖鎖修飾はタンパク質の構造や機能の調節に重要な役割を果たしている。また、近年の研究により、細胞表面上で発現した糖鎖は、細胞間相互作用やシグナル伝達、発生・分化、さらには受精、ガン転移など、様々な生体内現象に関与することが分かってきている。また、糖鎖の非還元末端側にはシアル酸などの単糖が結合することが知られているが、こうした末端に結合する単糖が糖鎖の機能に重要な役目を果たしていることも分かってきている。

なお、シアル酸は、アミノ基やカルボキシ基が結合した特殊な９炭糖であるノイラミン酸に対し、アミノ基やヒドロキシ基が置換された化合物の総称である。５位のアミノ基がアセチル化されたＮ−アセチルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ａｃ）が天然には最も多いと考えられているが、それ以外にも、５位のアミノ基がグリコリル基で修飾されたＮ−グリコリルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ｇｌ）やデアミノ体であるＫＤＮなど様々な構造のものが知られている。

上記のような生体内での機能のうえでは、糖鎖の末端に結合しているシアル酸の数が重要であるのはもちろんであるが、そのシアル酸残基の付き方、即ち結合様式も重要である。例えばヒトにおいては、シアル酸残基の結合様式として、α２，３−結合型とα２，６−結合型とが主として知られている。それらは結合異性体とも呼ばれ、癌化に伴って結合様式が変化することなども指摘されており、バイオマーカーとしての利用も期待されている。また、バイオ医薬品の品質管理などの観点からは、糖タンパク質、糖ペプチドにおいてアミノ酸配列が一致しているのみならず翻訳後修飾の構造の制御も求められ、シアル酸残基の結合様式を含めた糖鎖修飾の制御や品質管理のための分析手法の確立が要望されている。

従来、糖鎖におけるシアル酸残基の結合様式を解析するために、結合様式特異的である化学修飾を行う幾つかの手法が提案されている。それらは、α２，６−シアル酸残基に比べてα２，３−シアル酸残基が脱水縮合剤により分子内脱水を起こし易いという性質を主に利用したものであり、糖鎖をメタノールと反応させることでラクトンとメチルエステルに変換する手法（非特許文献１参照）、エタノールと反応させることでラクトンとエチルエステルに変換する手法（非特許文献２参照）、塩化アンモニウムと反応させることでラクトンとアミドに変換する手法（非特許文献３参照）、ジメチルアミンと反応させることでラクトンとジメチルアミドに変換する手法（非特許文献４参照）、などが提案されている。また本発明者らは、イソプロピルアミンを用いたアミド化によって、α２，３−シアル酸残基とα２，６−シアル酸残基とを高い精度で区別可能であることを非特許文献５で示している。

一般に、質量分析を用いて糖鎖構造を解析するには、まず解析対象である糖鎖に対し質量分析を実施することによって得られた質量電荷比値に基づき糖鎖を構成する単糖の組成を推定することが必要である。そのためには、データ解析装置において、糖鎖中に存在する可能性のある単糖の種類と個数の範囲とを探索条件として指定し、さらに許容質量精度などの分析上のパラメータを設定したうえで、総当たりの探索処理を実行する。これは単に、既知である単糖の正確な質量と数とを適宜組み合わせて、実測の質量電荷比値と整合がとれるような組み合わせを探索する処理である。その結果、計算上想定し得る単糖の組成が単糖組成候補として出力される。こうした探索の際に、結合様式特異的なシアル酸残基、具体的にはα２，３−シアル酸残基の修飾とα２，６−シアル酸残基の修飾とを区別するように探索条件を定めると、結合様式を区別しない場合に比べて、得られる単糖組成候補が大幅に増加する。これは、シアル酸に相当する単糖残基が単純に二倍以上に増加してしまうことによる。このように単糖組成候補の数が多くなると、分析者が候補を絞り込む作業が困難になり、作業時間が掛かるとともにその精度も低下することになる。

図４、図５を参照して一例を説明する。図４、図５はいずれも、実測マススペクトルと該マススペクトル上の主要なピークについての単糖組成探索結果を示す図である。
牛フェツイン（Fetuin）由来Ｎ型糖鎖の解析を行う場合、結合様式非特異的にシアル酸残基を修飾して所定の質量電荷比範囲に亘る質量分析を行うと、マススペクトル上には図４中に▼印で示した主たる４本のピークが観測される。この質量分析結果に基づいて所定の条件で以て単糖組成の探索を行うと、得られる単糖組成候補は全部で１０種類程度に収まる。これに対し、結合様式特異的にシアル酸残基を修飾して同様の質量分析を行うと、マススペクトル上で観測される主たるピークは図５に示すように９本に増加する。この質量分析結果に基づいて上と同じ条件で以て単糖組成の探索を行うと、得られる単糖組成候補は全部で４８種類まで増加してしまう。即ち、観測されるピーク数の増大の程度よりもさらに大きく単糖組成候補数は増大してしまい、こうした多数の候補を一つ一つ分析者が確認して適切な候補を選択するのはたいへん煩わしい。

また、上記計算ではシアル酸としてＮｅｕ５Ａｃしか考慮していないが、シアリル糖鎖中のシアル酸残基としては質量が２９１であるＮｅｕ５Ａｃのほか、質量が３０７であるＮｅｕ５Ｇｌもよく知られており、単糖組成探索では少なくともこの二種類のシアル酸残基を考慮することが望ましい。そうなると、結合非特異的修飾によって生成されるシアル酸残基修飾体の質量の種類はさらに増えることになり、探索によって得られる単糖組成候補の数も膨大になる。

ウィラー（Wheeler SF）、ほか２名、「デリバティゼイション・オブ・シアリック・アシッズ・フォー・スタビライゼイション・イン・マトリックス-アシステッド・レーザ・デソープション/イオナイゼイション・マス・スペクトロメトリー・アンド・コンコミタント・ディファレンティエイション・オブ・アルファ・(2 --> 3)-・アンド・アルファ・(2 --> 6)-・アイソマーズ（Derivatization of sialic acids for stabilization in matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry and concomitant differentiation of alpha(2 --> 3)- and alpha(2 --> 6)-isomers）」、ラピッド・コミュニケイションズ・イン・マス・スペクトロメトリー（Rapid Commun. Mass Spectrom.）、2009年1月、Vol.23、No.2、pp.303-312 レイディング（K. R. Reiding）、ほか４名、「ハイ-スループット・プロファイリング・オブ・プロテイン・N-グリコシレイション・バイ・マルディ-トフ-マス・エンプロイイング・リンケージ-スペシフィック・シアリック・アシッド・エステリフィケイション（High-Throughput Profiling of Protein N-Glycosylation by MALDI-TOF-MS Employing Linkage-Specific Sialic Acid Esterification）」、アナリティカル・ケミストリー（Anal. Chem.）、2014年、Vol.86、No.12、pp.5784-5793 アレー（W. R. Alley）、ほか１名、「グリコミック・アナリシス・オブ・シアリック・アシッド・リンケージズ・イン・グリカンズ・デライブド・フロム・ブラッド・セラム・グリコプロテインズ（Glycomic Analysis of Sialic Acid Linkages in Glycans Derived from Blood Serum Glycoproteins）」、ジャーナル・オブ・プロテオーム・リサーチ（J. Proteome Res.）、2010年6月4日、Vol.9、No.6、pp.3062-3072 デ・ハーン（N. de Haan）、ほか５名、「リンケージ-スペシフィック・シアリック・アシッド・デリバティゼイション・フォー・マルディ-トフ-マス・プロファイリング・オブ・lgG・グリコペプタイズ（Linkage-Specific Sialic Acid Derivatization for MALDI-TOF-MS Profiling of IgG Glycopeptides）」、アナリティカル・ケミストリー（Anal. Chem.）、2015年、Vol.87、No.16、pp.8284-8291 西風（T. Nishikaze）、ほか２名、「トゥワーズ・ザ・ディスクリミネイション・オブ・シアリル・リンケージズ・イン・グリコペプタイズ：ア・ニュー・デリバティゼイション・アプローチ（Towards the discrimination of sialyl linkages in glycopeptides: A new derivatization approach）」、63rd ASMS Proceedings、2015年5月、MP-674 「グリコ-ピークファインダー（Glyco-Peakfinder）」、［online］、［平成２８年１月１９日検索］、インターネット＜URL : http://www.glyco-peakfinder.org/＞ 金城（K. Kaneshiro）、ほか４名、「ハイ・センシティブ・マルディ・アナリセス・オブ・グリカンズ・バイ・ア・ニュー・アミノキノリン-ラベリング・メソッド・ユージング・３-アミノキノリン／α-シアノ-４-ハイドロキシナミック・アシッド・リキッド・マトリックス（Highly Sensitive MALDI Analyses of Glycans by a New Aminoquinoline-Labeling Method Using 3-Aminoquinoline/α-Cyano-4-hydroxycinnamic Acid Liquid Matrix）」、アナリティカル・ケミストリー（Anal. Chem.）、2011年、Vol.83、No.10、pp.3663-3667 福山（Y. Fukuyama）、ほか８名、「３-アミノキノリン／p-クーマリック・アシッド・アズ・ア・マルディ・マトリックス・フォー・グリコペプタイズ、カーボハイドレイツ、アンド・フォスフォペプタイズ（3-Aminoquinoline/p-Coumaric Acid as a MALDI Matrix for Glycopeptides, Carbohydrates, and Phosphopeptides）」、アナリティカル・ケミストリー（Anal. Chem.）、2014年、Vol.86、No.4、pp.1937-1942

本発明は上記課題に鑑みて成されたものであり、その目的とするところは、質量分析結果に基づいて推定されるシアリル糖鎖の単糖組成候補の絞り込みを効果的に行うことにより、シアリル糖鎖におけるシアル酸残基の結合様式の相違を含めた構造解析を効率的に且つ精度よく行うことができるシアリル糖鎖解析方法を提供することである。

上記課題を解決するために成された本発明は、シアル酸が結合したシアリル糖鎖の構造を質量分析を利用して解析するシアリル糖鎖解析方法であって、
a)解析対象であるシアリル糖鎖に含まれるシアル酸残基に対し結合様式特異的修飾を行う修飾処理ステップと、
b)前記修飾処理ステップにより修飾を受けたシアリル糖鎖を質量分析してマススペクトル情報を取得する分析実行ステップと、
c)前記分析実行ステップにより得られたマススペクトル上で観測されるピークについて、該ピークの質量情報に基づき単糖組成の候補を推定する候補推定ステップと、
d)前記マススペクトル上で観測される前記結合様式特異的修飾の手法に応じた質量差を有する複数のピークを、同種で結合様式が相違するシアル酸残基を含みシアル酸残基以外の単糖組成が同じであるシアリル糖鎖に対応する一群のピークであるとみなし、該ピークに対して得られている単糖組成候補を、シアル酸残基の有無、特定のシアル酸残基の修飾体の有無若しくは個数、シアル酸残基及びシアル酸残基修飾体以外の単糖組成の同一性の少なくともいずれかを判定することにより絞り込む候補絞り込みステップと、
を有することを特徴としている。

シアリル酸残基の結合様式には、α２，３−、α２，６−、α２，８−などが知られており、結合様式特異的修飾（誘導化）が可能な結合様式であれば、換言すれば、結合様式を区別可能な修飾手法であれば、本発明が対応可能な結合様式に制限はない。典型的には、本発明に係るシアリル糖鎖解析方法は、主要な結合様式であるα２，３−シアル酸残基とα２，６−シアル酸残基とを区別した糖鎖構造の解析に有用である。

この場合、上記修飾処理ステップでは例えば、結合様式特異的修飾としてイソプロピルアミド修飾及びメチルアミド修飾を行うものとすることができる。α２，６−シアル酸残基はイソプロピルアミド修飾され、α２，３−シアル酸残基はメチルアミド修飾され、それらの修飾体の質量差は整数質量で２８Daになる。メチルアミド修飾の代わりにラクトン修飾を用いてもよく、その場合の修飾体の質量差は整数質量で５９Daになる。さらにまた、非特許文献１に記載の結合様式特異的修飾法（ラクトン修飾及びメチルエステル修飾）では修飾体の質量差は整数質量で３２Da、非特許文献２に記載の結合様式特異的修飾法（ラクトン修飾及びエチルエステル修飾）では修飾体の質量差は整数質量で４８Da、非特許文献３に記載の結合様式特異的修飾法（ラクトン修飾及びアミド修飾のあと完全メチル化）では修飾体の質量差は整数質量で１３Da、非特許文献４に記載の結合様式特異的修飾法（ラクトン修飾及びジメチルアミド修飾）では修飾体の質量差は整数質量で４５Daである。

例えばシアル酸の一つであるＮｅｕ５Ａｃの質量は２９１であるが、α２，６−シアル酸残基をイソプロピルアミド修飾し、α２，３−シアル酸残基をメチルアミド修飾した場合、イソプロピルアミド修飾体の質量は３２２、メチルアミド修飾体の質量は３０４、と二つに分かれることになる。いま、シアル酸残基を三つ含む糖鎖においては、その三つのシアル酸残基の結合様式の組み合わせとして、全てがα２，３−である［α２，３−、α２，３−、α２，３−］、二つがα２，３−である［α２，３−、α２，３−、α２，６−］、一つがα２，３−である［α２，３−、α２，６−、α２，６−］、全てがα２，６−である［α２，６−、α２，６−、α２，６−］という四つの組み合わせの可能性があり、その組み合わせによって糖鎖の質量は相違する。そのため、マススペクトル上には、イソプロピルアミド修飾体とメチルアミド修飾体との質量差２８Daに相当する質量差で並ぶ最大４本のピークが観測される可能性がある。

そこで、本発明において候補絞り込みステップでは、結合様式特異的修飾の手法に応じた質量差として例えば２８Daを有する複数のピークを抽出し、そのピークを結合様式が相違するシアル酸残基を含みシアル酸残基以外の単糖組成が同じであるシアリル糖鎖に対応する一群のピーク（以下「アイソマークラスタピーク」という）であるとみなす。アイソマークラスタピークに対応する糖鎖は必ずシアル酸を含む筈であるから、例えばアイソマークラスタピークに属する或るピークに対して得られている単糖組成候補にシアル酸残基が存在しなければ、該候補は適切でないと判断できる。

また、一つのアイソマークラスタピークに属する複数のピークにそれぞれ対応する糖鎖は、シアル酸残基及びシアル酸残基修飾体以外の単糖組成が同一である筈である。そこで、シアル酸残基及びシアル酸残基修飾体以外の単糖組成の同一性を判定することで、単組成候補を絞り込むこともできる。
さらにまた、例えば質量差が２８Da又はその２倍の５６Daである２本のピークのうちの質量が大きいほうのピークに対応する糖鎖は質量が相対的に大きなイソプロピルアミド修飾体を含み、質量が小さいほうのピークに対応する糖鎖は質量が相対的に小さなメチルアミド修飾体を含む筈である。そこで、このことを利用し、特定のシアル酸残基の修飾体の有無若しくはその個数に基づいて単組成候補を絞り込むこともできる。

即ち、本発明の一態様として、上記候補絞り込みステップでは、一以上の糖鎖の末端にシアル酸が結合したシアリル糖鎖に対し、上記結合様式特異的修飾によるシアル酸残基の異なる修飾体の質量差、例えば２８Daに対応する複数のピークを見つけ、その中の低質量側のピークに対応する単糖組成は質量が小さいシアル酸残基修飾体、例えばメチルアミド修飾体を少なくとも一つ含み、高質量側のピークに対応する単糖組成は質量が大きいシアル酸残基修飾体、例えばイソプロピルアミド修飾体を少なくとも一つ含むことを条件として単糖組成候補を絞り込むことができる。

より具体的に、上記候補絞り込みステップでは、上記結合様式特異的修飾によるシアル酸残基の異なる修飾体の質量差ΔＭのＮ倍（ただしＮは１以上の整数）に相当する２本のピークを見つけ、その低質量側のピークに対応する単糖組成は質量が小さいＮ個のシアル酸残基修飾体を含むことを条件として単糖組成候補を絞り込むようにすることができる。この質量が小さいＮ個のシアル酸修飾体は例えばα２，３−シアル酸残基の修飾体である。

また、上記候補絞り込みステップでは、上記結合様式特異的修飾によるシアル酸残基の異なる修飾体の質量差ΔＭのＮ倍（ただしＮは１以上の整数）に相当する２本のピークを見つけ、その高質量側のピークに対応する単糖組成は質量が大きいＮ個のシアル酸残基修飾体を含むことを条件として単糖組成候補を絞り込むようにすることもできる。この質量が大きいＮ個のシアル酸修飾体は例えばα２，６−シアル酸残基の修飾体である。

なお、理論的には、三以上のピークが一つのアイソマークラスタピークに属する場合であっても、必ずしもその全てのピークが観測されるとは限らない。例えば上述したようにシアル酸残基を三つ含む糖鎖では４本のピークが観測される可能性があるが、実際には２本又は３本のピークしか観測されない（他のピークは強度が小さすぎて観測できない）こともしばしば起こる。そのため、修飾体の質量差に相当するピークだけでなく、質量差の２倍、３倍等に相当するピークを見つけることも有用である。

また本発明に係るシアリル糖鎖解析方法において、上記候補推定ステップでは、含まれ得る単糖の種類及び個数の範囲を探索条件とし、ピークの質量と整合がとれる単糖の組み合わせを計算することにより単糖組成の候補を推定するものとすることができる。
これによれば、単糖の種類や個数の範囲を適切に設定しさえすれば、単糖組成候補を漏れなく抽出することができる。

また本発明に係るシアリル糖鎖解析方法において、上記分析実行ステップでは、負イオンモードによる質量分析を実施するとよい。負イオンモードによる質量分析では正イオンモードに比べて糖鎖イオンが安定であって不要なフラグメント化が起こりにくいので、マススペクトルに基づく構造解析に都合がよい。また、負イオンモードではナトリウムやカリウムなどが付加したアダクトイオンが発生しにくいので、アダクトイオン由来のノイズピークがマススペクトルに現れず、目的とする糖鎖由来のピークの抽出が容易になる。

なお、本発明に係るシアリル糖鎖解析方法における候補推定ステップ及び候補絞り込みステップの処理は、パーソナルコンピュータやより高性能なコンピュータに予めインストールしたソフトウエア（コンピュータプログラム）を該コンピュータ上で動作させることにより実行することができる。

本発明に係るシアリル糖鎖解析方法によれば、質量分析結果に基づいて推定されるシアリル糖鎖の単糖組成候補について、シアル酸残基の結合様式を区別したうえで効果的に絞り込んで候補数を減らすことができる。それにより、シアリル糖鎖におけるシアル酸残基の結合様式の相違を含めた構造解析を、効率的に且つ精度よく行うことができる。

本発明の一実施例であるシアリル糖鎖解析方法における解析手順の概略を示すフローチャート。 本実施例のシアリル糖鎖解析方法における単糖組成候補の絞り込み方法の説明図（シアル酸残基が２個の場合）。 本実施例のシアリル糖鎖解析方法における単糖組成候補の絞り込み方法の説明図（シアル酸残基が３個の場合）。 シアル酸結合様式非特異的に修飾した牛フェツイン由来Ｎ型糖鎖の実測マススペクトル、及び主要な４本のピークについての単糖組成探索結果を示す図。 シアル酸結合様式特異的に修飾した牛フェツイン由来Ｎ型糖鎖の実測マススペクトル、及び主要な９本のピークについての単糖組成探索結果を示す図。 シアル酸結合様式特異的に修飾した牛フェツイン由来Ｎ型糖鎖の実測マススペクトルのm/z＝２５００付近の拡大図、及びその中で検出されるピークについての単糖組成探索結果を本実施例の方法で絞り込んだ結果を示す図。 シアル酸結合様式特異的に修飾した牛フェツイン由来Ｎ型糖鎖の実測マススペクトルのm/z＝２８００付近の拡大図、及びその中で検出されるピークについての単糖組成探索結果を示す図。 シアル酸結合様式特異的に修飾した牛フェツイン由来Ｎ型糖鎖の実測マススペクトルのm/z＝３１５０付近の拡大図、及びその中で検出されるピークについての単糖組成探索結果を本実施例の方法で絞り込んだ結果を示す図。 シアル酸結合様式特異的に修飾した牛フェツイン由来Ｎ型糖鎖の実測マススペクトルのm/z＝３５００付近の拡大図、及びその中で検出されるピークについての単糖組成探索結果を本実施例の方法で絞り込んだ結果を示す図。

以下、本発明の一実施例であるシアリル糖鎖解析方法について、添付図面を参照して詳細に説明する。図１は本実施例のシアリル糖鎖解析方法における解析手順の概略を示すフローチャート、図２及び図３は本実施例のシアリル糖鎖解析方法における単糖組成候補の絞り込み方法を説明するための概念図である。

まず、図１〜図３を参照して、本実施例のシアリル糖鎖解析方法の概要と特徴的である単糖組成候補を絞り込む方法について説明する。
まず、解析対象である糖鎖（シアリル糖鎖）を含む糖タンパク質から既知の手法により糖鎖を切り出し、さらに切り出した糖鎖を精製して試料を調製する（ステップＳ１）。

次いで、調製された試料に含まれる糖鎖に結合しているシアル酸を結合様式特異的に誘導体化することで修飾する（ステップＳ２）。糖鎖へのシアル酸の結合様式には、α２，８−結合なども知られているが、ここでは特に重要性の高いα２，３−結合とα２，６−結合の２種類について考える。α２，３−シアル酸残基とα２，６−シアル酸残基とを区別して修飾する手法としては上述したように幾つかの手法が知られている（非特許文献１〜５など参照）。結合様式特異的にシアル酸残基を修飾できさえすれば修飾（誘導化）の手法は問わないが、ここでは非特許文献５に開示されているイソプロピルアミド修飾／メチルアミド修飾を用いるものとする。この場合、α２，６−シアル酸は修飾によりイソプロピルアミド修飾体となり、α２，３−シアル酸は修飾によりメチルアミド修飾体となる。以下の説明では、シアル酸のイソプロピルアミド修飾体をｉＰＡ修飾体、シアル酸のメチルアミド修飾体をＭＡ修飾体と記す。

また、上述したように、シアル酸にはＮｅｕ５Ａｃのほかに、Ｎｅｕ５Ｇｃ、ＫＤＮなどがあるが、ここでは存在量が最も多いＮｅｕ５Ａｃを考える。また、以下の説明では、説明が煩雑になるのを避けるために、質量については基本的にノミナルマス（天然存在量比が最大である同位体からなる整数質量）を用いる。このＮｅｕ５Ａｃの質量は２９１であるが、ｉＰＡ修飾体の質量は３３２、ＭＡ修飾体の質量は３０４となり、その質量差は２８Daである。

上述したように試料中の糖鎖に含まれるシアル酸残基を結合様式特異的修飾したあと、該試料を質量分析し所定の質量電荷比範囲に亘るマススペクトルを取得する（ステップＳ３）。後述するように質量情報に基づいて単糖組成を推定するには、質量精度が高いことが望ましい。したがって、質量分析装置としては高精度、高感度の分析が可能な飛行時間型質量分析装置やフーリエ変換型質量分析装置などを用いるとよい。

マススペクトルが得られたならば、該マススペクトル上で観測されるピークを抽出し、抽出されたピーク毎に、その質量値に基づいて単糖組成を推定する。具体的には、単糖組成の推定は、予め分析者により指定された単糖の種類及びその個数の範囲を探索条件とし、さらに許容質量誤差などを分析パラメータとして、実測ピークの質量値に一致する（実際には所定の数値範囲に収まる）単糖の組み合わせを総当たり的に探索することにより行う（ステップＳ４）。こうした探索はコンピュータ上で行うことができ、例えばインターネットのＷｅｂ上で利用可能な糖鎖探索用ソフトウエアとして無料で提供されているグリコピークファインダー（非特許文献６参照）を用いることができる。もちろん、同様の処理はそれ以外のソフトウエアを用いても実行可能である。

上記単糖組成の推定の際には、正解である単糖組成が漏れるのを避けるために、単糖の種類やその個数範囲を広めに指定しておく必要がある。そのため、ピーク毎に複数の単糖組成候補が挙げられることは避けられない。すでに説明した図５の例では、m/z＝３５２９．４のピークに対しては１０種類もの単糖組成候補が挙げられている。そこで次に、ピーク毎に、ステップＳ２で行った結合様式特異的修飾処理の手法に応じた質量差の情報を利用して、単糖組成候補の絞り込みを行う（ステップＳ５）。この絞り込みの方法について、図２、図３を参照して説明する。

いま、シアリル糖鎖が探索鎖糖鎖（二分岐）構造で各鎖の末端にシアル酸が結合している場合を考える。この場合、図２（ａ）〜（ｃ）に示すように、α２，３−シアル酸とα２，６−シアル酸との組み合わせは３種類が考え得る。この３種類の質量は同じであり、質量から区別することはできない。上述した結合様式特異的修飾が行われると、α２，３−シアル酸残基はＭＡ修飾体に、α２，６−シアル酸残基はｉＰＡ修飾体になるから、図２（ｄ）〜（ｆ）に示す３種類の修飾体の組み合わせが考え得る。上述したように、ＭＡ修飾体とｉＰＡ修飾体との質量差は２８Daであるので、上記３種類の修飾体の組み合わせの質量は２８Daずつ相違する。即ち、結合様式特異的修飾されたシアリル糖鎖の質量は、シアル酸残基の結合様式によって異なるものとなり区別が可能である。

結合様式特異的修飾されたシアリル糖鎖を質量分析して得られたマススペクトル上で、上記３種類の組み合わせは２８Da間隔の３本のピークＰ１、Ｐ２、Ｐ３として現れる。したがって、マススペクトル上において２８Da間隔で複数本のピークが観測されれば、それらはシアル酸残基の修飾体のみが相違する、つまりはシアル酸残基以外の単糖の組成は同一であってシアル酸残基の数も同一である糖鎖由来である可能性が高い。そこで、そうした複数本のピークは、シアル酸残基以外の単糖の組成は同一でシアル酸残基の数も同一で該シアル酸残基の結合様式のみが相違する一群のピーク、即ちアイソマークラスタピークであるとみなす。

図２に示す３種類の修飾体の組み合わせと３本のピークとの対応関係から、次のことが明らかである。
（Ａ１）３本のピークに対応する単糖組成は必ずシアル酸残基修飾体を含む。
（Ａ２）２８Da間隔である任意の２本のピークのうち、質量が小さいほうのピークに対応する単糖組成は、ＭＡ修飾体つまりはα２，３−シアル酸残基を一つ以上含む。
（Ａ３）２８Da間隔である任意の２本のピークのうち、質量が大きいほうのピークに対応する単糖組成は、ｉＰＡ修飾体つまりはα２，６−シアル酸残基を一つ以上含む。
（Ａ４）シアル酸残基を二つ有し２８Da間隔で３本のピークが観測される場合、質量が最も大きいピークに対応する単糖組成はｉＰＡ修飾体のみを含み、質量が最も小さいピークに対応する単糖組成はＭＡ修飾体のみを含む。
（Ａ５）シアル酸残基以外の単糖組成は同一である。
したがって、上記（Ａ１）〜（Ａ５）の条件に適合しない単糖組成候補は候補から除外することができ、それによって候補の絞り込みが可能である。

次に、シアリル糖鎖が３本鎖糖鎖（三分岐）構造で各鎖の末端にシアル酸が結合している場合を考える。この場合、図３（ａ）〜（ｄ）に示すように、α２，３−シアル酸とα２，６−シアル酸との組み合わせは４種類が考え得る。この４種類の質量は同じであり、質量から区別することはできない。上述した結合様式特異的修飾が行われると、図２（ｅ）〜（ｈ）に示す４種類の修飾体の組み合わせが考え得る。上述したように、ＭＡ修飾体とｉＰＡ修飾体との質量差は２８Daであるので、上記４種類の修飾体の組み合わせの質量も２８Daずつ相違する。即ち、結合様式特異的修飾されたシアリル糖鎖の質量は、シアル酸残基の結合様式によって異なるものとなり区別が可能である。

結合様式特異的修飾されたシアリル糖鎖を質量分析して得られたマススペクトル上で、上記４種類の組み合わせは２８Da間隔の４本のピークＰ１、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ４として現れる。したがって、この場合にも、マススペクトル上において２８Da間隔で複数本のピークが観測されればアイソマークラスタピークであるとみなすことができる。上述したシアル酸残基が２個である場合と同様に、この場合にもアイソマークラスタピークには次のような条件を挙げることができる。
（Ｂ１）４本のピークに対応する単糖組成は必ずシアル酸残基修飾体を含む。
（Ｂ２）２８Da間隔である任意の２本のピークのうち、質量が小さいほうのピークに対応する単糖組成は、ＭＡ修飾体つまりはα２，３−シアル酸残基を一つ以上含む。
（Ｂ３）２８Da間隔である任意の２本のピークのうち、質量が大きいほうのピークに対応する単糖組成は、ｉＰＡ修飾体つまりはα２，６−シアル酸残基を一つ以上含む。
（Ｂ４）質量が大きい側に２８Da間隔でＮ本のピークが存在するような１本のピークに対応する単糖組成は、Ｎ個以上のＭＡ修飾体つまりはα２，３−シアル酸残基を含む。
（Ｂ５）質量が小さい側に２８Da間隔でＮ本のピークが存在するような１本のピークに対応する単糖組成は、Ｎ個以上のｉＰＡ修飾体つまりはα２，６−シアル酸残基含む。
したがって、上記（Ｂ１）〜（Ｂ５）の条件に適合しない単糖組成候補も候補から除外することができ、それによって候補の絞り込みが可能である。

以上のように、マススペクトル上のピークの質量差からアイソマークラスタピークを見つけ、一つのアイソマークラスタピークに属する複数本のピークに対応付けられている単糖組成候補について、シアル酸残基修飾体の有無、特定のシアル酸残基修飾体の有無や個数、或いは、シアル酸残基以外の単糖組成の同一性などにより判定して整合性がとれない候補を除外することで、候補を適切に絞り込むことができる。なお、こうした絞り込みもコンピュータ上で行うことができる。そして、そうした絞り込みによって残った単糖組成候補を解析結果として例えば表示部の画面上に表示し分析者に提示する（ステップＳ６）。

次に、本実施例のシアリル糖鎖解析方法を適用した実験例について詳細に説明する。
［ステップＳ１］糖鎖の切り出し及び精製
本実験では、次のような手順で、α２，３−シアリル糖鎖とα２，６−シアリル糖鎖の両方を含む糖タンパク質から遊離糖鎖を切り出し試料を調製した。
まず、牛由来フェツインを２０ｍＭ濃度の重炭酸アンモニウム、１０ｍＭ濃度のジチオトレイトール（ＤＴＴ）、０．０２％濃度のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）の混合液に溶解し、１００℃で３分間熱処理することで変性及び還元させた。そのあと、該溶液を室温まで冷却し、消化酵素であるＰＮＧａｓｅ Ｆ（Peptide-N-Glycosidase F）を加えて３７℃で一晩インキュベーションすることで糖鎖をペプチドから遊離させた。そして、１００℃で３分間熱処理を行い、ＰＮＧａｓｅ Ｆを失活させることで酵素反応を停止させた。

続いて、酵素反応により切り出した糖鎖をカーボンカラムを用いて脱塩精製した。ここで用いたカーボンカラムは、活性炭のディスク（エムポア（登録商標）ディスクカーボン）を直径約１ｍｍに切り抜き、２００μＬ容積のカラムチップに積層・充填することで作製した、精製用カラムのような自作のマイクロチップである。まず、このカーボンカラムに１００μＬのアセトニトリル（ＡＣＮ）を加えたあと、遠心により溶液を排出した。そのあと、１Ｍ濃度の水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）、１Ｍ濃度の塩酸（ＨＣｌ）、６０％濃度のＡＣＮ、０．１％濃度のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）溶液、及び水をそれぞれ用いて同様の操作を行い、カラム担体の洗浄と平衡化を図った。その酵素反応溶液をカラムに導入し、遠心により溶液を排出した。さらに２００μＬの水を加えたあと、遠心により液を排出する操作を３回繰り返し洗浄を行った。最後に、６０％濃度のＡＣＮと０．１％濃度のＴＦＡ溶液の混合液を２０μＬ加え、遠心により溶液を回収する操作を２回繰り返し糖鎖を溶出させた。この２回分の溶出液を合わせ、遠心減圧濃縮器を用いて溶媒を除去し乾固させた。

［ステップＳ２］シアル酸残基の結合様式特異的修飾
乾固した試料に、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解した４Ｍ濃度のイソプロピルアミン塩酸塩を１０μＬ加えた。次いで、脱水縮合剤として、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）及び１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）をそれぞれの濃度が５００ｍＭとなるようにＤＭＳＯに溶解したものを１０μＬ加え、室温で２分間撹拌したあと３７℃で１時間反応させた。その反応後の溶液に、９３．３％濃度のＡＣＮ、０．１３％濃度のＴＦＡ溶液を１２０μＬ加えて希釈し、ジーエルサイエンス社製のＧＬ−Ｔｉｐ（登録商標）Ａｍｉｄｅを用いて過剰な試薬を除去した。具体的には、ＧＬ−Ｔｉｐ Ａｍｉｄｅに水１００μＬを加え遠心して排出する操作を３回繰り返し洗浄を行うことでチップの洗浄を行った。次に、１００μＬの９０％濃度のＡＣＮ、０．１％濃度のＴＦＡ溶液を加え、遠心して排出することを３回繰り返し、平衡化を行った。次いで、希釈した反応溶液を全量加えて遠心し、担体に糖鎖を吸着させた。その後、２００μＬの９０％濃度のＡＣＮ、０．１％濃度のＴＦＡ溶液を加え、遠心して排出することを３回繰り返し、洗浄を行った。最後に水１０μＬを加え、遠心により排出することを２回繰り返し、糖鎖を溶出させた。そして２回分の溶出液を合わせ、遠心減圧濃縮器を用いて溶媒を除去し乾固させた。

続いて、乾固した試料に、ＤＭＳＯに溶解した２Ｍ濃度のメチルアミン塩酸塩を１０μＬ加えた。次いで、脱水縮合剤として、３０％濃度のＮ−メチルモルホリン（ＮＭＭ）に溶解した５００ｍＭ濃度のヘキサフルオロリン酸トリピロリジノホスホニウム（ＰｙＢＯＰ）を１０μＬ加え、室温で１時間撹拌することで反応を促した。その反応後の溶液に、９３．３％濃度のＡＣＮ、０．１３％濃度のＴＦＡ溶液を１２０μＬ加え、ＧＬ−Ｔｉｐ Ａｍｉｄｅを用いて上記と同様に精製及び溶出の操作を行い、回収した溶出液を遠心減圧濃縮器を用いて乾固させた。
以上の処理によって、糖鎖に結合しているシアル酸が結合特異的修飾された試料が調製される。

［ステップＳ３］質量分析の実行
乾固した試料を適量の水に再度溶解させ、その溶液を１μＬだけＭＡＬＤＩ用フォーカスプレート上に滴下し、マトリクスとして５０％濃度のＡＣＮに溶解させた１００ｍＭ濃度の３ＡＱ／ＣＡ、２ｍＭ濃度の硫酸アンモニウムを０．５μＬ加えたあとに、７５℃のヒートブロック上に１．５時間放置した。これにより、３ＡＱによる糖鎖の還元末端のラベル化の反応を促進させた。反応終了後、プレートを室温まで冷却し、質量分析装置としてＭＡＬＤＩ−ＱＩＴ−ＴＯＦＭＳ（島津製作所／クレイトス（Kratos）社製のAXIMAResonance）を使用して負イオンモードで質量分析を実施することで、所定の質量電荷比範囲に亘るマススペクトルを取得した。なお、ここで用いた測定手法は、オンターゲット３ＡＱ化と呼ばれる、本出願人が非特許文献７、８等で提案している高感度糖鎖検出法であるが、この測定手法に限るものではない。

［ステップＳ４］単糖組成の推定
単糖組成の推定には、マススペクトル上で検出される質量電荷比値に合致する単糖組成候補を探索するソフトウエアであるグリコピークファインダーを用いた。これは、基本的にはデータベースを用いない、既知である単糖の質量情報とその数との組み合わせを計算した総当たり探索である。ただし、上記ソフトウエアはもともとシアル酸の修飾には対応していないため、任意の単糖残基として修飾を受けたシアル酸残基の質量を追加したうえで探索を実行した。

探索条件として指定した単糖の種類及び個数範囲は以下のとおりである。
・ヘキソース（Ｈｅｘ）：３〜１５
・Ｎ−アセチルヘキソサミン（ＨｅｘＮＡｃ）：２〜１４
・デオキシヘキソース（ｄＨｅｘ）：０〜４
・Ｎ−アセチルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ａｃ）：０〜５（ただし、修飾を受けたときに結合様式に応じて質量が異なる場合にはその質量毎に０〜５）
・硫酸塩（Ｓ）：０〜２
上記探索の結果はすでに説明した図５に示したとおりである。

［ステップＳ５］単糖組成候補の絞り込み
＜２本鎖糖鎖＋シアル酸残基２個の場合＞
図６にm/z＝２５００付近のマススペクトルの拡大図及びこの部分における単糖組成探索結果一覧を示す。図６（及び図８、図９も同様）中の単糖組成探索結果一覧では、絞り込みによって除外された候補は薄い色の文字で示されている。

図４及び図５に示したマススペクトル上で観測されるm/z＝２４７１．９のピークは、その質量電荷比値から、図６中に示した糖鎖構造のように、２本鎖糖鎖にシアル酸残基が二つ付加したものであることが分かる。図６に示すマススペクトルをみると、m/z＝２４９９．９のピークを中心にその左右に、α２，３−シアル酸残基とα２，６−シアル酸残基との相違（ＭＡ修飾体とｉＰＡ修飾体の差異）に基づく２８Da差のピークが観測されている。そこで、これら３本のピークはアイソマークラスタピークを構成するとみなせる。上述したように、アイソマークラスタピークに属する３本のピークに対応する糖鎖はシアル酸残基を含む筈であるから、これら３本のピークに対応付けられている単糖組成候補のうち、シアル酸残基を一つも有していないものは候補から除外する。図６の例では、ピークＰ３に対応付けられている四つの候補のうち、１番目と２番目の候補はシアル酸残基を一つも含まないから除外される。

また、上記３本のピークのうちの、マススペクトル上で質量が大きい側に２８Daの質量差を有するピークが存在するピークに対応する単糖は、その組成中に一つ以上のＭＡ修飾体を有する筈である。したがって、そのピークに対応付けられている単糖組成候補のうち、ＭＡ修飾体を一つも含まない候補を除外する。図６の例では、ピークＰ２に対応付けられている二つの候補のうち、２番目の候補はα２，３−シアル酸残基を一つも含まないから除外される。

逆に、マススペクトル上で質量が小さい側に２８Daの質量差を有するピークが存在するピークに対応する単糖は、その組成中に一つ以上のｉＰＡ修飾体を有する筈である。したがって、そのピークに対応付けられている単糖組成候補のうち、ｉＰＡ修飾体を一つも含まない候補を除外する。図６の例では、ピークＰ１に対応付けられている二つの候補のうち、２番目の候補はα２，６−シアル酸残基を一つも含まないから除外される。
また、ピークＰ３に対し、質量が小さい側に２８Da二つ分である５６Daの質量差の位置にピークＰ２が存在することから、ピークＰ３に対応する単糖は、その組成中に二つ以上のｉＰＡ修飾体を有する筈である。このため、ピークＰ３に関して残っている二つの候補のうち、α２，６−シアル酸残基を一つしか含まない４番目の候補が除外される。
こうした処理によって単糖組成候補を絞ることができる。図６に示した例では、３本のピークに対応付けられている単糖組成候補はそれぞれ一つに絞り込まれる。

＜３本鎖糖鎖＋シアル酸残基２個の場合＞
図７にm/z＝２８００付近のマススペクトルの拡大図及びこの部分における単糖組成探索結果一覧を示す。この場合、m/z＝２８６５．１のピークに対し三つの単糖組成が推定されている。しかしながら、ここでは、有意な強度の、つまりは強度が所定閾値以上であるアイソマーククラスタピークが観測されない。そのため、この場合には、上述したようなアイソマーククラスタを利用した候補の絞り込みは行えない。

＜３本鎖糖鎖＋シアル酸残基３個の場合＞
図８にm/z＝３１５０付近のマススペクトルの拡大図及びこの部分における単糖組成探索結果一覧を示す。
m/z＝３１４１．１のピークは、その質量電荷比値から、図８中に示した糖鎖構造のように、３本鎖糖鎖にシアル酸残基が三つ付加したものであることが分かる。このm/z＝３１４１．１のピークには四つの単糖組成候補が挙げられているが、該ピークに対し＋２８Daと＋５６（＝２８×２）Daの位置にそれぞれピークが観測されている。したがって、これら３本のピークはアイソマーククラスタピークであると推定される。

このアイソマーククラスタピークに属する、m/z＝３１４１．１のピークに対応する単糖組成候補のうち、α２，３−シアル酸残基（Ｎｅｕ５Ａｃ（ａ２，３））を含まない１番目の候補とα２，３−シアル酸残基を一つしか含まない４番目の候補は除外できる。上記３本のピークの真中のm/z＝３１６９．１のピークには七つの単糖組成候補が挙げられているが、シアル酸残基を一つも含まない１番目〜３番目の候補は除外できる。また、α２，３−シアル酸残基（Ｎｅｕ５Ａｃ（ａ２，３））とα２，６−シアル酸残基（Ｎｅｕ５Ａｃ（ａ２，６））とをそれぞれ一つ以上有する筈であるから、６番目と７番目の候補も除外できる。さらにまた、上記３本のピークの最も質量が大きいm/z＝３１９７．３のピークには六つの単糖組成候補が挙げられているが、α２，６−シアル酸（Ｎｅｕ５Ａｃ（ａ２，６））を二つ以上有する筈であるから、１番目〜３番目、及び６番目の候補は除外できる。
このように質量差が２８Daである三つのピークをアイソマークラスタピークとして捉えることで、合計１７個あった単糖組成候補を６個にまで減らすことができる。

＜３本鎖糖鎖＋シアル酸残基４個の場合＞
図９にm/z＝３５００付近のマススペクトルの拡大図及びこの部分における単糖組成探索結果一覧を示す。
m/z＝３５０１．４のピークは、その質量電荷比値から、図９中に示した糖鎖構造のように、３本鎖糖鎖にシアル酸残基が四つ付加したものであることが分かる。この場合、シアル酸残基が４個存在するので、α２，３−シアル酸残基とα２，６−シアル酸残基の組み合わせは４種類考えられるが、マススペクトル上では質量電荷比差が２８Daである３本のピークしか観測されない。この場合でも上記と同様の規則に基づき単糖組成候補を除外することができる。

即ち、m/z＝３５０１．４のピークに対しては＋２８Daの位置にピークが観測されるので、m/z＝３５０１．４のピークに対応する１０個の単糖組成候補のうち、α２，３−シアル酸残基を一つも含まない１番目、３番目、５番目、及び１０番目の候補を除外する。また、強度は低いながらも−２８Daの位置にピークが観測されるので、α２，６−シアル酸を一つも含まない２番目、４番目、及び６番目の候補も除外する。その結果、三つの候補に絞り込むことができる。
同様にm/z＝３５２９．４のピークに対応する１０個の単糖組成候補のうち、まずシアル酸残基を一つも含まない７番目の候補は除外でき、−２８Daの位置にピークが存在することから、α２，６−シアル酸残基を一つも含まない１番目、３番目、及び５番目の候補も除外できる。さらに、−５６Daの位置にもピークが存在することから、α２，６−シアル酸残基を一つしか含まない２番目、４番目、及び６番目の候補も除外できる。その結果、三つの候補に絞り込むことができる。この絞り込みによって残った単糖組成候補は４個のシアル酸残基を含んでいる。このように、アイソマークラスタピークに属する筈である一部のピークしか観測されない場合であっても、十分な絞り込みが可能である。

なお、上記実験における絞り込みでは、シアル酸残基やシアル酸残基の修飾体の有無や数に基づいて候補を除外していったが、上述したように、アイソマークラスタピークに属するピークに対応する糖鎖では、シアル酸残基修飾体以外の単糖組成が同じであるという条件に合わない、つまりは単糖組成が異なる候補を除外することで絞り込みを行ってもよい。

また上記実施例では、結合様式特異的修飾としてイソプロピルアミド修飾及びメチルアミド修飾を用いていたが、そのメチルアミド修飾の代わりにラクトン修飾を用いてもよく、その場合の修飾体の質量差は整数質量で５９Daになるから、アイソマークラスタピークを見つけるために５９Da又はその整数倍の間隔のピークを探せばよい。

さらにまた、非特許文献１に記載の結合様式特異的修飾法（ラクトン修飾及びメチルエステル修飾）では修飾体の質量差は整数質量で３２Da、非特許文献２に記載の結合様式特異的修飾法（ラクトン修飾及びエチルエステル修飾）では修飾体の質量差は整数質量で４８Da、非特許文献３に記載の結合様式特異的修飾法（ラクトン修飾及びアミド修飾のあと完全メチル化）では修飾体の質量差は整数質量で１３Da、非特許文献４に記載の結合様式特異的修飾法（ラクトン修飾及びジメチルアミド修飾）では修飾体の質量差は整数質量で４５Daであるから、これらについても同様にその質量差又はその整数倍の間隔のピークを探すことでアイソマークラスタピークを見つけることができる。

また上記実施例ではイオン化法としてＭＡＬＤＩを用いていたが、当然のことながら、他のイオン化法、例えば多価イオンを生じるようなエレクトロスプレーイオン化などのイオン化を用いた場合にも本発明を適用することができる。こうしたイオン化法を利用したことでサンプルが多価イオンとして検出される場合には、考慮すべき修飾体の質量差が価数分の一になることに留意しさえすれば、正しいアイソマークラスタピークを見つけることができる。或いは、最近の高性能の質量分析装置では、得られたマススペクトルから求まる同位体質量の間隔に基づいて何価のイオンであるかが即時に判断できるため、そこから修飾糖鎖の質量を推定することが可能である。また、アイソマークラスタピークの検出には、質量電荷比ではなくこの質量電荷比から推定される修飾糖鎖の質量を用いてもよい。

さらにまた上記実施例では、シアル酸としてＮ−アセチルノイラミン酸のみを想定していたが、それ以外の種類のシアル酸、例えばＮ−グリコリルノイラミン酸にも本発明を適用可能であることは明らかである。また、α２，３−、α２，６−以外の結合様式に対しても、その結合様式に特異的な修飾が可能でありさえすれば、本発明を適用可能であることは明らかである。

また、上記実施例は本発明の一例にすぎず、上記記載の変形例以外でも、本発明の趣旨の範囲で適宜変形、修正、追加等を行っても本願特許請求の範囲に包含されることは当然である。

Claims (10)

1. シアル酸が結合したシアリル糖鎖の構造を質量分析を利用して解析するシアリル糖鎖解析方法であって、
   a)解析対象であるシアリル糖鎖に含まれるシアル酸残基に対し結合様式特異的修飾を行う修飾処理ステップと、
   b)前記修飾処理ステップにより修飾を受けたシアリル糖鎖を質量分析してマススペクトル情報を取得する分析実行ステップと、
   c)前記分析実行ステップにより得られたマススペクトル上で観測されるピークについて、該ピークの質量情報に基づき単糖組成の候補を推定する候補推定ステップと、
   d)前記マススペクトル上で観測される前記結合様式特異的修飾の手法に応じた質量差を有する複数のピークを、同種で結合様式が相違するシアル酸残基を含みシアル酸残基以外の単糖組成が同じであるシアリル糖鎖に対応する一群のピークであるとみなし、該ピークに対して得られている単糖組成候補を、シアル酸残基の有無、特定のシアル酸残基の修飾体の有無若しくは個数、シアル酸残基及びシアル酸残基修飾体以外の単糖組成の同一性の少なくともいずれかを判定することにより絞り込む候補絞り込みステップと、
   を有することを特徴とするシアリル糖鎖解析方法。
2. 請求項１に記載のシアリル糖鎖解析方法であって、
   結合様式が相違するシアル酸残基としてα２，３−シアル酸残基とα２，６−シアル酸残基とを区別した糖鎖構造の解析を行うことを特徴とするシアリル糖鎖解析方法。
3. 請求項２に記載のシアリル糖鎖解析方法であって、
   前記修飾処理ステップでは、結合様式特異的修飾としてイソプロピルアミド修飾及びメチルアミド修飾を行うことを特徴とするシアリル糖鎖解析方法。
4. 請求項１に記載のシアリル糖鎖解析方法であって、
   前記候補絞り込みステップでは、一以上の糖鎖の末端にシアル酸が結合したシアリル糖鎖に対し、前記結合様式特異的修飾によるシアル酸残基の異なる修飾体の質量差に対応する複数のピークを見つけ、その中の低質量側のピークに対応する単糖組成は質量が小さいシアル酸残基修飾体を少なくとも一つ含み、高質量側のピークに対応する単糖組成は質量が大きいシアル酸残基修飾体を少なくとも一つ含むことを条件として単糖組成候補を絞り込むことを特徴とするシアリル糖鎖解析方法。
5. 請求項４に記載のシアリル糖鎖解析方法であって、
   前記候補絞り込みステップでは、前記結合様式特異的修飾によるシアル酸残基の異なる修飾体の質量差ΔＭのＮ倍（ただしＮは１以上の整数）に相当する２本のピークを見つけ、その低質量側のピークに対応する単糖組成は質量が小さいＮ個のシアル酸残基修飾体を含むことを条件として単糖組成候補を絞り込むことを特徴とするシアリル糖鎖解析方法。
6. 請求項５に記載のシアリル糖鎖解析方法であって、
   前記質量が小さいＮ個のシアル酸修飾体はα２，３−シアル酸残基の修飾体であることを特徴とするシアリル糖鎖解析方法。
7. 請求項４に記載のシアリル糖鎖解析方法であって、
   前記候補絞り込みステップでは、前記結合様式特異的修飾によるシアル酸残基の異なる修飾体の質量差ΔＭのＮ倍（ただしＮは１以上の整数）に相当する２本のピークを見つけ、その高質量側のピークに対応する単糖組成は質量が大きいＮ個のシアル酸残基修飾体を含むことを条件として単糖組成候補を絞り込むことを特徴とするシアリル糖鎖解析方法。
8. 請求項７に記載のシアリル糖鎖解析方法であって、
   前記質量が大きいＮ個のシアル酸修飾体はα２，６−シアル酸残基の修飾体であることを特徴とするシアリル糖鎖解析方法。
9. 請求項１に記載のシアリル糖鎖解析方法であって、
   前記候補推定ステップでは、含まれ得る単糖の種類及び個数の範囲を探索条件とし、ピークの質量と整合がとれる単糖の組み合わせを計算することにより糖鎖組成の候補を推定することを特徴とするシアリル糖鎖解析方法。
10. 請求項１に記載のシアリル糖鎖解析方法であって、
    前記分析実行ステップでは、負イオンモードによる質量分析を実施することを特徴とするシアリル糖鎖解析方法。

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