CN109541115B - 唾液酸化糖链同分异构体的高分辨顺序分离和准确定量分析方法 - Google Patents
唾液酸化糖链同分异构体的高分辨顺序分离和准确定量分析方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提出了一种唾液酸化糖链同分异构体的高分辨顺序分离和准确定量分析方法，包括：利用PNGase F酶对糖蛋白上的N‑糖链进行释放；糖链的唾液酸通过酰胺化方法标记同位素试剂(d0/d5‑)苯胺，以对唾液酸进行保护和稳定同位素标记；利用固相萃取技术(C18柱)除去中性糖链，以避免中性糖链的干扰；唾液酸化糖链的还原末端再标记上吉拉德试剂P(GP)以屏蔽活性醛基和提高质谱检测灵敏度；唾液酸的特异性衍生技术对连接异构体进行识别；最后使用RP‑HPLC‑MS技术对上述处理过的唾液酸化糖链衍生物的同分异构体进行区分、鉴定和定量分析。该方法通用性强，首次实现了在同分异构体水平对唾液酸化糖链的准确定量分析。
Description
技术领域
本发明属于糖生物学技术领域，具体涉及一种在异构体水平对唾液酸化糖链进行相对定量的方法。
背景技术
糖链以游离寡糖、糖脂和糖蛋白等形式在细胞识别、细胞粘附、细菌感染、信号转导、免疫反应等多种生命过程中发挥着重要的作用，具有作为多种疾病生物标志物的潜力，因此糖链的相关研究正在受到越来越多的关注。唾液酸，一组9碳糖结构单元，位于许多游离寡糖链、N-糖链、O-糖链和糖脂糖链的非还原末端，对于糖链结构的稳定性和生物功能的发挥具有重要意义。在哺乳动物体内普遍存在两种唾液酸形式，N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac)和N-羟乙酰神经氨酸(Neu5Gc)，但是人体中在正常部位只含有N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac)，只在癌症部位才存在N-羟乙酰神经氨酸(Neu5Gc)。在N-糖链中唾液酸通过α2-3或α2-6连接方式与糖链非还原末端的半乳糖残基相连，通过α2-6连接方式与N-乙酰葡萄糖残基相连，并且经研究发现，α2-3和α2-6连接方式的改变与流感病毒感染和乳腺癌、胃癌、膀胱癌等有着密切的联系。因此对唾液酸化糖链同分异构体的准确定量分析对多种疾病的诊断具有重要意义。
近年来，质谱已经作为糖链定性定量分析的一种重要检测工具而被广泛应用，但是由于低离子化效率、唾液酸的不稳定性、高分子量和多种异构体形式，唾液酸化糖链在质谱的分析检测中存在诸多困难。因此为了提高唾液酸化糖链的离子化效率和稳定唾液酸，几种针对唾液酸的衍生化方法被发明，如全甲基化、酯化和酰胺化。全甲基化方法是对唾液酸化糖链的羟基、醛基、胺基和羧基组分进行甲基化修饰，从而极大提高糖链的质谱检测灵敏度和稳定性，但是由于苛刻的反应条件和糖链存在大量的修饰位点，例如，双天线唾液酸N-糖链(GlcNAc4Man3Gal2Neu5Ac)存在39个修饰位点，因此在同位素标记过程中即使存在很小的标记效率差异也会导致定量结果存在很大的误差。酯化方法也是唾液酸的一种常用衍生化方法，但是由于在酸碱条件下，酯键的不稳定性，对唾液酸化糖链的检测分析并不适用。酰胺化反应由于反应条件温和，反应效率高，酰胺键的稳定性，已经成为唾液酸化糖链研究的一种常用衍生化方法,并且可以实现对唾液酸化糖链的定量分析，但是这种方法至今没有实现对唾液酸连接异构体的有效区分。
目前对唾液酸连接异构体的区分主要有酶法和化学法两种。酶法是利用糖苷外切酶Sialidase S能特异性识别α2-3连接的唾液酸并且对其进行水解，再结合HILIC-MS技术对唾液酸化糖链连接异构体进行区分及定量。这个方法对唾液酸连接异构体进行了精确区分及定量，但是由于酶效较低及其昂贵价格，不适用于对唾液酸糖链的高通量分析，并且没有实现多组样品间的定量比较分析。相比之下化学法成本较低，适合范围广，适于对唾液酸化糖链异构体的高通量定性分析。目前的化学识别方法为唾液酸特异性衍生化方法，主要是在存在缩合试剂的二甲基亚砜溶液中，在加热条件下，α2-3连接的唾液酸发生内酯化，α2-6连接的唾液酸与标记试剂发生酯化或者酰胺化，再利用分子量的差异分辨唾液酸化糖链的连接异构体。这个方法极大的简化了α2-6和α2-3连接唾液酸的识别，但是对含有多个唾液酸糖链的样品通过同位素标记进行定量分析时，对质谱分辨率的要求会很高，并且质谱图将会高度复杂，对后面的定量分析会造成极大困难。
综上所述，现有的唾液酸化糖链的研究技术存在的主要问题是无法实现在唾液酸糖链同分异构体水平的准确定量分析。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种高通量、高灵敏度和高分辨率的唾液酸化糖链同分异构体的准确定量新方法。
本发明的解决方案如下：
S1：分别称取5mg糖蛋白样品1和2各三份，利用PNGase F酶分别进行N-糖链的释放；释放的N-糖链样品依次经过C18固相萃取柱和石墨碳固相萃取柱纯化，得到纯化的N-糖链样品1和2各三份；
S2：S1中纯化的N-糖链样品1和2各取两份；
(a)第一份利用d0-苯胺通过酰胺化方法对糖链的唾液酸进行标记，然后利用固相萃取技术除去中性糖链，唾液酸化糖链还原末端标记吉拉德试剂P(GP)以屏蔽活性醛基和提高后续质谱检测灵敏度，得到d0-苯胺和GP标记的唾液酸化N-糖链衍生物，记为d0-苯胺衍生物；可通过MALDI-MS检测判断样品是否完全衍生化；
(b)第二份利用d5-苯胺进行唾液酸连接异构体的特异性衍生，并进行GP标记，得到特异性糖链衍生物，记为d5-苯胺衍生物；可通过MALDI-MS检测判断样品是否完全衍生化；
S3：将S2中获得的N-糖链样品1的d0-苯胺衍生物和d5-苯胺衍生物进行混合，N-糖链样品2的d0-苯胺衍生物和d5-苯胺衍生物进行混合，利用反相高效液相色谱和质谱联用技术(RP-HPLC-MS)对N-糖链样品1和2的唾液酸化糖链连接异构体分别进行鉴定；
S4：S1中纯化的N-糖链样品1和2各取余下的那一份，参考S2中(a)步骤，对样品1和2通过酰胺化反应分别标记d0-苯胺和d5-苯胺，混合两种样品，然后标记GP，用反相高效液相色谱和质谱联用技术(RP-HPLC-MS)进行检测，对每个糖链提取离子流图(EIC)，并根据同位素目标峰的峰面积比值进行样品间的定量比较分析。
需要说明的是，以上所述“三份”、“两份”以及“余下的那一份”，是考虑定性、定量分析所需要取用的最低份数，而不是对取用份数的绝对限定。
本发明第一次实现了在同分异构体水平对唾液酸化糖链的准确定量分析，具体有以下有益效果：
(1)唾液酸的同位素苯胺标记，一方面阻止了在质谱检测过程中唾液酸的丢失，稳定了糖链结构，同时稳定同位素标记和使糖链具有发色基团，便于质谱和高效液相色谱的定性和定量分析；
(2)糖链的还原末端被GP标记，不仅封闭了糖链的活性醛基，而且使糖链带上一个正电荷，在质谱检测中形成[M]+峰，从而避免了多离子形式峰，极大提高了质谱检测灵敏度；
(3)剔除了糖链样品中的中性糖链，从而消除了中性糖链对唾液酸化糖链检测分析的影响；
(4)随着唾液酸数目的增多，衍生化后所带的苯环数目越多，紫外吸收越强，因此极大提高了含量比较少的带多个唾液酸的大分子唾液酸化N-糖链的液相检测灵敏度；
(5)由于本发明中反相高效液相色谱是根据唾液酸糖链衍生物的非还原末端进行分离，因此液相分离时可以根据唾液酸化N-糖链所带唾液酸的数目、N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac)被N-羟乙酰神经氨酸(Neu5Gc)所取代的个数和含有的α2-3连接和α2-6连接的唾液酸个数，以及精确的糖链结构的不同进行顺序分离，从而实现唾液酸化糖链同分异构体高分辨分离。
附图说明
图1为唾液酸化N-糖链同分异构体准确定量的研究策略；
图2为胎牛血清糖蛋白唾液酸化N-糖链通过酰胺化标记d0-苯胺和还原末端被GP标记的衍生物的MALDI-MS图谱；
图3为胎牛血清糖蛋白唾液酸化N-糖链通过酰胺化标记d0-苯胺和还原末端被GP标记的衍生物的RP-HPLC-MS检测结果；
其中图3A为胎牛血清蛋白唾液酸化N-糖链衍生物的Uv检测图谱；图3B为胎牛血清蛋白唾液酸化N-糖链衍生物的总离子流图谱(TIC)；
图4为唾液酸化N-糖链连接异构体的定性研究策略；
图5为两种糖链标品对特异性衍生化方法的衍生特异性进行验证的MALDI-MS图谱；
图6为胎牛血清蛋白唾液酸化N-糖链经唾液酸特异性衍生化后的MALDI-MS图谱；
图7为胎牛血清蛋白唾液酸化N-糖链Bi-2Ac异构体定性的提取离子流图(EIC)；
其中图7A为糖链Bi-2Ac经酰胺化反应标记d0-苯胺和GP的EIC图；图7B为Bi-2Ac糖链经唾液酸特异性衍生后根据含有两个α2-6连接唾液酸的分子量(m/z)为1270.83的EIC图；图7C为Bi-2Ac糖链经唾液酸特异性衍生后根据含有一个α2-6连接唾液酸和一个α2-3连接唾液酸的分子量(m/z)为1221.83的EIC图；图7D为Bi-2Ac糖链经唾液酸特异性衍生后根据含有两个α2-3连接唾液酸的分子量(m/z)为1172.33的EIC图；
图8为以胎牛血清糖蛋白主要的唾液酸化N-糖链为标准糖链制作的定量标准曲线；
图9为牛IgG唾液酸化N-糖链衍生化后的MALDI-MS图谱；
其中图9A为牛IgG唾液酸化N-糖链通过酰胺化衍生标记d0-苯胺和还原端标记GP的MALDI-MS图谱；图9B为牛IgG唾液酸化N-糖链经过唾液酸特异性衍生化标记d5-苯胺和还原端标记GP的MALDI-MS图谱；
图10为兔IgG唾液酸化N-糖链衍生化后的MALDI-MS图谱；
其中图10A为兔IgG唾液酸化N-糖链通过酰胺化衍生标记d0-苯胺和还原端标记GP的MALDI-MS图谱；图10B为兔IgG唾液酸化N-糖链经过唾液酸特异性衍生化标记d5-苯胺和还原端标记GP的MALDI-MS图谱；
图11为牛IgG唾液酸化N-糖链和兔IgG唾液酸化N-糖链通过酰胺化衍生后，衍生物经RP-HPLC-MS分析的TIC图；
其中图11A为牛IgG唾液酸化N-糖链衍生物的TIC图；图11B为兔IgG唾液酸化N-糖链衍生物的TIC图；
图12为牛IgG唾液酸化N-糖链和兔IgG唾液酸化N-糖链在同分异构体水平的相对定量柱状图；
图13为健康人血清唾液酸化N-糖链衍生化后的MALDI-MS图谱；
其中图13A为健康人血清唾液酸化N-糖链通过酰胺化衍生标记d0-苯胺和还原端标记GP的MALDI-MS图谱；图13B为健康人血清唾液酸化N-糖链经过唾液酸特异性衍生化标记d5-苯胺和还原端标记GP的MALDI-MS图谱；
图14为肝癌病人血清唾液酸化N-糖链衍生化后的MALDI-MS图谱；
其中图14A为肝癌病人血清唾液酸化N-糖链通过酰胺化衍生标记d0-苯胺和还原端标记GP的MALDI-MS图谱；图14B为肝癌病人血清唾液酸化N-糖链经过唾液酸特异性衍生化标记d5-苯胺和还原端标记GP的MALDI-MS图谱；
图15为健康人血清唾液酸化N-糖链和肝癌病人血清唾液酸化N-糖链通过酰胺化衍生后，衍生物经RP-HPLC-MS分析的TIC图；
其中图15A为健康人血清唾液酸化N-糖链衍生物的TIC图；图15B为肝癌病人血清唾液酸化N-糖链衍生物的TIC图；
图16为健康人血清唾液酸化N-糖链和肝癌病人血清唾液酸化N-糖链在同分异构体水平的相对定量柱状图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步的详细描述。应当理解，本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，或者按照各制造商所建议的条件。下面所描述的实施例，除非其他方面表明，所有的温度单位为摄氏度，反应温度为室温，室温指25℃±5℃，所有的温度误差为±5℃。
下述实施例中，胎牛血清、色谱纯乙腈(ACN)购自Thermo scientific公司；牛IgG、兔IgG、氘代试剂d5-苯胺均购于Sigma-Aldrich公司；健康人血清和肝癌血清来自于西安交通大学第二附属医院的20个健康人志愿者和20个肝癌病人志愿者；糖链标品3’-唾液酸乳糖和6’-唾液酸乳糖均购于Carbosynth Limited公司；PNGase F酶购于New EnglandBioLabs公司；十二烷基硫酸钠(SDS)、二硫苏糖醇(DTT)、NP-40、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)、1-羟基苯并三唑-水合物(HOBt)均购于Aladdin IndustrialInc公司；吉拉德试剂P(GP)购于TCI Development Co.,Ltd公司；购于Thermo scientific公司；ODS-BP色谱柱购于Elient公司；固相萃取小柱Sep-Pak C18(100mg/1mL)购于Waters公司；固相萃取小柱多孔石墨碳柱(150mg/4mL)购于Alltech Associates公司；其它试剂均为分析纯。本发明中质谱鉴定AXIMA Performance MALDI-TOF-MS质谱仪(日本Shimadu公司)、反相高效液相色谱质谱联用技术(RP-HPLC-MS)使用高效液相色谱和电喷雾电离线性离子阱质谱(LTQ XL，Thermo Scientific，USA)联用技术检测。
电喷雾电离线性离子阱质谱(ESI-MS)的参数为：工作电压为4kV；鞘气流速为20arb；辅助气体流速为10arb；毛细管电压为37V；毛细管透镜电压是250V；毛细管温度是300℃；扫描类型为一级全扫描；最大注入时间是1000ms；微扫描是3次；数据采集使用LTQTune软件。
本发明中的MALDI-TOF-MS检测均在Reflectron模式下检测，ESI-MS检测均是在正离子模式下检测的。
本发明中缩写词对应的中文如下：
ACN(乙腈)，arb arbitrary unit(任意单位，属于压力单位)，DMSO(二甲基亚砜)，DTT(二硫苏糖醇)，SDS(十二烷基硫酸钠)，FBS(胎牛血清)，MeOH(甲醇)，mL(毫升)，min(分钟)，ms(毫秒)，h(小时)，Relative Abundance(相对丰度)，V(伏)，M(mol/mL)，TFA(三氟乙酸)，d0-(非氘代)，d5-(氘代)，EDC(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐)，HOBt(1-羟基苯并三唑-水合物)，GP(吉拉德试剂P)，RP-HPLC-MS(反相高效液相色谱质谱联用技术)，Uv图(紫外检测色谱图)，TIC(总离子流色谱图)，EIC(提取离子流色谱图)，Retentiontime(保留时间)。
实施例
本发明提供的方法是基于MALDI-TOF-MS和RP-HPLC-MS两种检测技术实现对唾液酸化糖链的苯胺和吉拉德试剂P(GP)的衍生、唾液酸化糖链衍生物的色谱分离，唾液酸化糖链同分异构体的准确定量分析。图1为唾液酸化N-糖链同分异构体的准确定量研究策略，图2为胎牛血清糖蛋白唾液酸化N-糖链衍生物的MALDI-MS图谱；图3为胎牛血清糖蛋白唾液酸化N-糖链衍生物的RP-HPLC-MS检测结果，图4为本发明对唾液酸化N-糖链连接异构体的定性研究策略，图5为两种糖链标品对特异性衍生化方法的衍生特异性进行验证的MALDI-MS图谱，图6为胎牛血清蛋白唾液酸化N-糖链经唾液酸特异性衍生化后的MALDI-MS图谱，图7为胎牛血清蛋白唾液酸化N-糖链Bi-2Ac异构体定性的提取离子流图(EIC)，图8为以胎牛血清糖蛋白主要的唾液酸化N-糖链为标准糖链制作的定量标准曲线。图7和图8中，Bi表示糖链为双天线，2Ac表示2个N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac)，2Gc表示2个N-羟乙酰神经氨酸(Neu5Gc)，SA表示唾液酸。由图2可以看出胎牛血清唾液酸N-糖链被完全衍生化，没有发现脱唾液酸的现象，都是[M]+离子形式峰，并且发现了多个含有N-羟乙酰神经氨酸(Neu5Gc)的目标峰；图3可以看出反相色谱柱对唾液酸化N-糖链同分异构体具有很高的分离度，并且可以按照唾液酸糖链含有的唾液酸数目、N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac)被N-羟乙酰神经氨酸(Neu5Gc)所取代的个数进行顺序分离；图5可以看出本发明中的唾液酸特异性衍生具有特别高的特异性；图6可以看出用唾液酸特异性衍生化方法衍生的胎牛血清N-糖链很好的区分了唾液酸的连接异构体；图7可以看出本发明对胎牛血清唾液酸化N-糖链Bi-2Ac实现了连接异构体的定性；图8可以看出本发明对唾液酸化糖链同分异构体的定量有很好的线性,并且其具体实验结果数值如表1所示，
表1.以胎牛血清蛋白主要唾液酸化N-糖链为标准糖链在异构体水平的相对定量标准曲线的实验结果汇总表
上表中：Bi-表示双天线；Tri-表示三天线；Tetra-表示四天线；Ac表示N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac)；Mean表示平均值；SD表示标准偏差；CV表示变异系数。
下面列举几个实施例以具体说明本发明对唾液酸化糖链同分异构体的定性和定量方法：
实施例1
一种标准糖蛋白IgG唾液酸化N-糖链连接异构体的定性方法，研究对象为牛IgG标准糖蛋白的唾液酸化N-糖链，具体步骤如下：
S1，分别称取两份5mg牛IgG标准糖蛋白，分别溶于500μL蛋白变性液，100℃加热10min，当样品冷却后，分别加入50μL磷酸盐缓冲液(pH 7.5)，50μL 10％NP-40(v/v)溶液和2μL PNGase F酶，37℃反应24h。释放的N-糖链依次经过C18固相萃取柱和石墨碳固相萃取柱纯化，得到纯化的N-糖链样品；
其中蛋白变性液为0.4M的二硫苏糖醇(DTT)和5％十二烷基磺酸钠(SDS)；磷酸盐缓冲液为1M磷酸钠，用磷酸调pH值至7.5；2μL PNGase F酶为1000酶单位。
C18固相萃取柱纯化过程为：C18固相萃取柱先用3倍柱体积乙腈活化，再用10倍柱体积双蒸水平衡，然后上样，10倍柱体积双蒸水洗脱糖链。
石墨碳固相萃取柱纯化过程为：石墨碳固相萃取柱先用3倍柱体积乙腈活化，再用10倍柱体积双蒸水平衡，然后将经C18固相萃取柱纯化的样品上样，上样后先用10倍柱体积双蒸水洗脱除盐，然后用5mL含有0.1％三氟乙酸的25％乙腈水溶液洗脱样品，收集洗脱液，冻干，得纯化后的N-糖链样品。
S2，取S1所得的一份牛IgG N-糖链样品，加入450μL 1M d0-苯胺，90μL 2M 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)，并且用盐酸调节pH值为4.5，反应6h，依次通过微晶纤维素柱和C18固相萃取柱纯化样品并且除去中性N-糖链，得到通过酰胺化反应用d0-苯胺标记的牛IgG唾液酸化N-糖链的衍生物，并用MALDI-MS进行检测；
其中，微晶纤维素柱纯化过程为：将所得的糖链衍生物通过离心浓缩仪浓缩，溶于少量水，上样，45℃干燥，40mL 96％的乙腈水溶液洗脱除去多余的苯胺和一部分盐，10mL双蒸水洗脱糖链样品并收集，离心浓缩。
C18固相萃取柱纯化过程为：C18固相萃取柱先用3倍柱体积乙腈活化，再用10倍柱体积双蒸水平衡，然后将经纸色谱柱纯化的样品上样，3mL双蒸水洗脱除盐和除中性糖链，5mL 25％乙腈水溶液洗脱糖链样品，收集洗脱液，离心浓缩干燥，得纯化后的唾液酸化N-糖链衍生物。
S3，唾液酸连接异构体的特异性衍生：取自S1的一份牛IgG N-糖链样品溶于1μL水，加入20μL反应液A，60℃反应1h，加入反应液B，60℃反应1h，乙腈沉淀得唾液酸特异性衍生的d5-苯胺标记牛IgG唾液酸N-糖链衍生物，并用MALDI-MS进行检测；
其中，反应液A为250mM 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)和500mM 1-羟基苯并三唑-水合物(HOBt)的二甲基亚砜溶液；反应液B为500mM 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)，1M 1-羟基苯并三唑-水合物(HOBt)和500mM d5-苯胺的二甲基亚砜溶液。
乙腈沉淀过程为：向通过唾液酸特异性衍生化后的样品液中加入大于10倍体积的乙腈，摇匀，-20℃保存20min，13500r/min离心得糖链衍生物沉淀。
S4，将S2和S3中得到的两份糖链衍生物样品进行混合，离心浓缩干燥；溶于20μL0.1M吉拉德试剂P(GP)与水/甲醇/乙酸(v/v/v)＝6:3:1的混合溶液，70℃反应1h，离心浓缩干燥，糖链还原端被GP标记和唾液酸被两种衍生化方法分别标记d0-苯胺和d5-苯胺的牛IgG N-糖链衍生物混合样品；
S5，将牛IgG N-糖链衍生物混合样品进行RP-HPLC-MS分析；
其中，RP-HPLC的色谱分离条件为：
选用ODS-BP柱，柱温25℃，检测波长为254nm，流速800μL/min；
流动相A为乙腈，B为pH＝5.5的10mM乙酸铵水溶液，C为双蒸水；
样品分离条件：t＝0min，1％A，99％B，t＝30min，1％A，99％B；t＝40min，9％A，91％B；t＝100min，13.5％A，86.5％B；t＝160min，18％A，82％B；t＝175min，23％A，77％B。
电喷雾电离线性离子阱质谱(ESI-MS)的参数为：工作电压为4kV；鞘气流速为20arb；辅助气体流速为10arb；毛细管电压为37V；毛细管透镜电压是250V；毛细管温度是300℃；扫描类型为一级全扫描；最大注入时间是1000ms；微扫描是3次；数据采集使用LTQTune软件。
MALDI-TOF-MS检测均在Reflectron模式下检测，ESI-MS检测均是在正离子模式下检测的。
图9为牛IgG唾液酸化N-糖链通过不同衍生化方法标记后的MALDI-MS图谱；其中，图9A为牛IgG唾液酸化N-糖链通过酰胺化衍生标记d0-苯胺的MALDI-MS图谱，从图中可以看出本发明可以完全区分牛IgG唾液酸N-糖链上的唾液酸类型为N-乙酰神经氨酸或者N-羟乙酰神经氨酸；图9B为牛IgG唾液酸化N-糖链经过唾液酸特异性衍生化标记d5-苯胺的MALDI-MS图谱，可以发现牛IgG唾液酸N-糖链都为α2-6连接的异构体。通过图9A和图9B的对比，证明了本发明既能区分标准糖蛋白唾液酸N-糖链上的唾液酸类型为N-乙酰神经氨酸或者N-羟乙酰神经氨酸，也能有效区分标准糖蛋白唾液酸化N-糖链的连接异构体。
实施例2
一种标准糖蛋白唾液酸化N-糖链连接异构体的定性方法，研究对象为兔IgG标准糖蛋白的唾液酸化N-糖链，具体步骤如下：
S1，分别称取两份5mg兔IgG标准糖蛋白,分别溶于500μL蛋白变性液，100℃加热10min，当样品冷却后，分别加入50μL磷酸盐缓冲液(pH 7.5)，50μL 10％的NP-40(v/v)溶液和2μL PNGase F酶，37℃反应24h。释放的N-糖链依次经过C18固相萃取柱和石墨碳固相萃取柱纯化，得到纯化的N-糖链样品；
其中蛋白变性液为0.4M的二硫苏糖醇(DTT)和5％十二烷基磺酸钠(SDS)；磷酸盐缓冲液为1M磷酸钠，用磷酸调pH值为7.5；2μL PNGase F酶为1000酶单位。
C18固相萃取柱纯化过程为：C18固相萃取柱先用3倍柱体积乙腈活化，再用10倍柱体积双蒸水平衡，然后上样，10倍柱体积双蒸水洗脱糖链。
石墨碳固相萃取柱纯化过程为：石墨碳固相萃取柱先用3倍柱体积乙腈活化，再用10倍柱体积双蒸水平衡，然后将经C18固相萃取柱纯化的样品上样，上样后先用10倍柱体积双蒸水洗脱除盐，然后用5mL含有0.1％三氟乙酸的25％乙腈水溶液洗脱样品，收集洗脱液，冻干，得纯化后的N-糖链样品。
S2，取S1所得的一份兔IgG N-糖链样品，加入450μL 1M d0-苯胺，90μL 2M 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)，并且用盐酸调节pH值至4.5，反应6h，，依次通过微晶纤维素柱和C18固相萃取柱纯化样品并且除去中性N-糖链，得到通过酰胺化反应用d0-苯胺标记兔IgG唾液酸化N-糖链的衍生物，并用MALDI-MS进行检测；
其中，微晶纤维素柱纯化过程为：将所得的糖链衍生物通过离心浓缩仪浓缩，溶于少量水，上样，45℃干燥，40mL 96％的乙腈水溶液洗脱除去多余的苯胺和一部分盐，10mL双蒸水洗脱糖链样品并收集，离心浓缩。
C18固相萃取柱纯化过程为：C18固相萃取柱先用3倍柱体积乙腈活化，再用10倍柱体积双蒸水平衡，然后将经纸色谱柱纯化的样品上样，3mL双蒸水洗脱除盐和除中性糖链，5mL 25％乙腈水溶液洗脱糖链样品，收集洗脱液，离心浓缩干燥，得纯化后的唾液酸糖链衍生物。
S3，唾液酸连接异构体的特异性衍生：取自S1的一份兔IgG N-糖链样品溶于1μL水，加入20μL反应液A，60℃反应1h，加入反应液B，60℃反应1h，乙腈沉淀得唾液酸特异性衍生的d5-苯胺标记兔IgG唾液酸N-糖链衍生物，并用MALDI-MS进行检测；
其中，反应液A为250mM 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)和500mM 1-羟基苯并三唑-水合物(HOBt)的二甲基亚砜溶液；反应液B为500mM 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC),1M 1-羟基苯并三唑-水合物(HOBt)和500mM d5-苯胺的二甲基亚砜溶液。
乙腈沉淀过程为：向通过唾液酸特异性衍生化后的样品液中加入大于10倍体积的乙腈，摇匀，-20℃保存20min，13500r/min离心得糖链衍生物沉淀。
S4，将S2和S3中得到的两份糖链衍生物样品进行混合，离心浓缩干燥；溶于20μL0.1M吉拉德试剂P(GP)与水/甲醇/乙酸(v/v/v)＝6:3:1的混合溶液，70℃反应1h，离心浓缩干燥，糖链还原端被GP标记和唾液酸被两种衍生化方法分别标记d0-苯胺和d5-苯胺的兔IgG N-糖链衍生物混合样品；
S5，将兔IgG N-糖链衍生物混合样品进行RP-HPLC-MS分析；
其中，RP-HPLC的色谱分离条件为：
选用ODS-BP柱，柱温25℃，检测波长为254nm，流速为800μL/min；
流动相A为乙腈，B为pH＝5.5的10mM乙酸铵水溶液，C为双蒸水；
样品分离条件：t＝0min，1％A，99％B，t＝30min，1％A，99％B；t＝40min，9％A，91％B；t＝100min，13.5％A，86.5％B；t＝160min，18％A，82％B；t＝175min，23％A，77％B。
电喷雾电离线性离子阱质谱(ESI-MS)的参数为：工作电压为4kV；鞘气流速为20arb；辅助气体流速为10arb；毛细管电压为37V；毛细管透镜电压是250V；毛细管温度是300℃；扫描类型为一级全扫描；最大注入时间是1000ms；微扫描是3次；数据采集使用LTQTune软件。
MALDI-TOF-MS检测均在Reflectron模式下检测，ESI-MS检测均是在正离子模式下检测的。
图10为兔IgG唾液酸化N-糖链通过不同衍生化方法标记后的MALDI-MS图谱；其中，图10A为兔IgG唾液酸化N-糖链通过酰胺化衍生标记d0-苯胺的MALDI-MS图谱，从图中可以看出本发明可以完全区分兔IgG唾液酸化N-糖链上的唾液酸类型为N-乙酰神经氨酸或者N-羟乙酰神经氨酸；图10B为兔IgG唾液酸化N-糖链经过唾液酸特异性衍生化标记d5-苯胺的MALDI-MS图谱，可以发现兔IgG唾液酸化N-糖链也都为α2-6连接的异构体。通过图10A和图10B的对比，进一步证明了本发明既能区分标准糖蛋白唾液酸化N-糖链上的唾液酸类型为N-乙酰神经氨酸或者N-羟乙酰神经氨酸，也能有效区分标准糖蛋白唾液酸N-糖链的连接异构体。
实施例3
一种标准糖蛋白唾液酸化N-糖链同分异构体的定量方法，研究对象为标准糖蛋白牛IgG和兔IG的唾液酸化N-糖链，具体步骤如下：
S1，分别称取九份5mg标准糖蛋白牛IgG和兔IgG，分别溶于500μL蛋白变性液，100℃加热10min，当样品冷却后，分别加入5μL磷酸盐缓冲液(pH 7.5)，50μL 10％NP-40(v/v)溶液和2μL PNGase F酶，37℃反应24h。释放的N-糖链依次经过C18固相萃取柱和石墨碳固相萃取柱纯化，得到纯化好的N-糖链样品；
其中蛋白变性液为0.4M的二硫苏糖醇(DTT)和5％十二烷基磺酸钠(SDS)；磷酸盐缓冲液为1M磷酸钠，用磷酸调pH值至7.5；2μL PNGase F酶为1000酶单位。
C18固相萃取柱纯化过程为：C18固相萃取柱先用3倍柱体积乙腈活化，再用10倍柱体积双蒸水平衡，然后上样，10倍柱体积双蒸水洗脱糖链。
石墨碳固相萃取柱纯化过程为：石墨碳固相萃取柱先用3倍柱体积乙腈活化，再用10倍柱体积双蒸水平衡，然后将经C18固相萃取柱纯化的样品上样，上样后先用10倍柱体积双蒸水洗脱除盐，然后用5mL含有0.1％三氟乙酸的25％乙腈水溶液洗脱样品，收集洗脱液，冻干，得纯化后的N-糖链样品。
S2，取S1所得的六份牛IgG N-糖链样品和三份兔IgG N-糖链样品，分别加入450μL1M d0-苯胺，取S1所得的三份牛IgG N-糖链样品和六份兔IgG N-糖链样品，分别加入450μL1M d5-苯胺，再分别向每份样品中加入90μL 2M 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)，并且用盐酸调节pH值至4.5，反应6h，每份N-糖链衍生物样品依次通过微晶纤维素柱和C18固相萃取柱纯化样品并且除去中性N-糖链。分别得到六份用d0-苯胺标记的牛IgG唾液酸化N-糖链衍生物，三份用d5-苯胺标记的牛IgG唾液酸化N-糖链衍生物；三份用d0-苯胺标记的兔IgG唾液酸化N-糖链衍生物和六份用d5-苯胺标记的兔IgG唾液酸化N-糖链衍生物；
其中，微晶纤维素柱纯化过程为：将所得的糖链衍生物通过离心浓缩仪浓缩，溶于少量水，上样，45℃干燥，40mL 96％的乙腈水溶液洗脱除去多余的苯胺和一部分盐，10mL双蒸水洗脱糖链样品并收集，离心浓缩。
C18固相萃取柱纯化过程为：C18固相萃取柱先用3倍柱体积乙腈活化，再用10倍柱体积双蒸水平衡，然后将经纸色谱柱纯化的样品上样，3mL双蒸水洗脱除盐和除中性糖链，5mL 25％乙腈水溶液洗脱糖链样品，收集洗脱液，离心浓缩干燥，得纯化后的唾液酸糖链衍生物。
S3，将S2所得的糖链衍生物样品分别按照三种不同方式等量混合，(i)三份d0-苯胺标记的牛IgG唾液酸化N-糖链衍生物和三份用d5-苯胺标记的牛IgG唾液酸化N-糖链衍生物分别混合；(ii)三份用d0-苯胺标记的兔IgG唾液酸化N-糖链衍生物和三份用d5-苯胺标记的兔IgG唾液酸化N-糖链衍生物分别混合；(iii)三份d0-苯胺标记的牛IgG唾液酸化N-糖链衍生物和三份用d5-苯胺标记的兔IgG唾液酸化N-糖链衍生物分别混合。将所有的混合样品离心浓缩干燥；
S4，将S3所得的糖链衍生物混合样品分别溶于20μl 0.1M吉拉德试剂P(GP)与水/甲醇/乙酸(v/v/v)＝6:3:1的混合溶液，70℃反应1h，离心浓缩干燥，得到糖链还原端被GP标记的糖链衍生物；
S5，将S4所得糖链衍生物用反相高效液相色谱和质谱联用技术(RP-HPLC-MS)进行检测分析，以同位素目标峰为内标，根据目标峰与同位素目标峰的EIC峰面积比值进行相对定量分析。
其中，RP-HPLC的色谱分离条件为：
选用ODS-BP柱，柱温25℃，检测波长为254nm，流速为800μL/min；
流动相A为乙腈，B为pH＝5.5的10mM乙酸铵水溶液，C为双蒸水；
样品分离条件：t＝0min，1％A，99％B，t＝30min，1％A，99％B；t＝40min，9％A，91％B；t＝100min，13.5％A，86.5％B；t＝160min，18％A，82％B；t＝175min，23％A，77％B。
电喷雾电离线性离子阱质谱(ESI-MS)的参数为：工作电压为4kV；鞘气流速为20arb；辅助气体流速为10arb；毛细管电压为37V；毛细管透镜电压是250V；毛细管温度是300℃；扫描类型为一级全扫描；最大注入时间是1000ms；微扫描是3次；数据采集使用LTQTune软件。ESI-MS检测均是在正离子模式下检测的。
图11为图11为牛IgG唾液酸化N-糖链和兔IgG唾液酸化N-糖链通过酰胺化衍生后，衍生物经RP-HPLC-MS分析的TIC图；
其中图11A为牛IgG唾液酸化N-糖链衍生物的TIC图，从图中可以发现RP-HPLC对牛IgG唾液酸化N-糖链衍生物根据所含唾液酸的个数，N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac)被N-羟乙酰神经氨酸(Neu5Gc)取代的个数，含有的α2-6连接和α2-3连接的唾液酸个数，以及精细的糖链结构实现高分辨的顺序分离；图11B为兔IgG唾液酸化N-糖链衍生物的TIC图，从图中可以发现RP-HPLC对兔IgG唾液酸化N-糖链衍生物根据所含唾液酸的个数，N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac)被N-羟乙酰神经氨酸(Neu5Gc)取代的个数，含有的α2-6连接和α2-3连接的唾液酸个数，以及精细的糖链结构也能实现高分辨的顺序分离。
图12为牛IgG唾液酸化N-糖链和兔IgG唾液酸化N-糖链异构体的相对定量柱状图；从图中可以发现牛IgG唾液酸化N-糖链数目比较少，兔IgG唾液酸化N-糖链数目较多，并且只有少数几条唾液酸化N-糖链两种IgG样品中都含有，但是含量差异也及其显著。证明本发明能对标准糖蛋白的唾液酸化N-糖链异构体进行有效的相对定量。
实施例4
一种复杂生物样品唾液酸化N-糖链连接异构体的定性方法，研究对象为正常人血清蛋白的唾液酸化N-糖链，具体步骤如下：
S1，分别称取两份5mg正常人血清蛋白,分别溶于500μL蛋白变性液，100℃加热10min，当样品冷却后，分别加入50μL磷酸盐缓冲液(pH 7.5)，50μL 10％NP-40(v/v)溶液和2μL PNGase F酶，37℃反应24h。释放的N-糖链依次经过C18固相萃取柱和石墨碳固相萃取柱纯化，得到纯化好的N-糖链样品；
其中蛋白变性液为0.4M的二硫苏糖醇(DTT)和5％十二烷基磺酸钠(SDS)；磷酸盐缓冲液为1M磷酸钠，用磷酸调pH值至7.5；2μL PNGase F酶为1000酶单位。
C18固相萃取柱纯化过程为：C18固相萃取柱先用3倍柱体积乙腈活化，再用10倍柱体积双蒸水平衡，然后上样，10倍柱体积双蒸水洗脱糖链。
石墨碳固相萃取柱纯化过程为：石墨碳固相萃取柱先用3倍柱体积乙腈活化，再用10倍柱体积双蒸水平衡，然后将经C18固相萃取柱纯化的样品上样，上样后先用10倍柱体积双蒸水洗脱除盐，然后用5mL含有0.1％三氟乙酸的25％乙腈水溶液洗脱样品，收集洗脱液，冻干，得纯化后的N-糖链样品。
S2，取S1所得的一份键康人血清蛋白N-糖链样品，加入450μL 1M d0-苯胺，90μL2M 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)，并且用盐酸调节pH值至4.5，反应6h，，依次通过微晶纤维素柱和C18固相萃取柱纯化样品并且除去中性N-糖链，得到通过酰胺化反应用d0-苯胺标记的健康人血清蛋白唾液酸N-糖链的衍生物，并用MALDI-MS进行检测；
其中，微晶纤维素柱纯化过程为：将所得的糖链衍生物通过离心浓缩仪浓缩，溶于少量水，上样，45℃干燥，40mL 96％的乙腈水溶液洗脱除去多余的苯胺和一部分盐，10mL双蒸水洗脱糖链样品并收集，离心浓缩。
C18固相萃取柱纯化过程为：C18固相萃取柱先用3倍柱体积乙腈活化，再用10倍柱体积双蒸水平衡，然后将经纸色谱柱纯化的样品上样，3mL双蒸水洗脱除盐和除中性糖链，5mL 25％乙腈水溶液洗脱糖链样品，收集洗脱液，离心浓缩干燥，得纯化后的唾液酸糖链衍生物。
S3，唾液酸连接异构体的特异性衍生：取自S1的一份正常人血清蛋白N-糖链样品溶于1μL水，加入20μL反应液A，60℃反应1h,加入反应液B，60℃反应1h，乙腈沉淀得唾液酸特异性衍生的d5-苯胺标记正常人血清蛋白唾液酸N-糖链衍生物，并用MALDI-MS进行检测；
其中，反应液A为250mM 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)和500mM 1-羟基苯并三唑-水合物(HOBt)的二甲基亚砜溶液；反应液B为500mM 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC),1M 1-羟基苯并三唑-水合物(HOBt)和500mM d5-苯胺的二甲基亚砜溶液。
乙腈沉淀过程为：向通过唾液酸特异性衍生化后的样品液中加入大于10倍体积的乙腈，摇匀，-20℃保存20min，13500r/min离心得糖链衍生物沉淀。
S4，将S2和S3中得到的两份糖链衍生物样品进行混合，离心浓缩干燥；溶于20μL0.1M吉拉德试剂P(GP)与水/甲醇/乙酸(v/v/v)＝6:3:1的混合溶液，70℃反应1h，离心浓缩干燥，糖链还原端被GP标记和唾液酸被两种衍生化方法分别标记d0-苯胺和d5-苯胺的正常人血清蛋白N-糖链衍生物混合样品；
S5，将健康人血清蛋白N-糖链衍生物混合样品分别进行RP-HPLC-MS分析；
其中，RP-HPLC的色谱分离条件为：
选用ODS-BP柱，柱温25℃，检测波长为254nm，流速为800μL/min；
流动相A为乙腈，B为pH＝5.5的10mM乙酸铵水溶液，C为双蒸水；
样品分离条件：t＝0min，1％A，99％B，t＝30min，1％A，99％B；t＝40min，9％A，91％B；t＝100min，13.5％A，86.5％B；t＝160min，18％A，82％B；t＝175min，23％A，77％B。
电喷雾电离线性离子阱质谱(ESI-MS)的参数为：工作电压为4kV；鞘气流速为20arb；辅助气体流速为10arb；毛细管电压为37V；毛细管透镜电压是250V；毛细管温度是300℃；扫描类型为一级全扫描；最大注入时间是1000ms；微扫描是3次；数据采集使用LTQTune软件。
MALDI-TOF-MS检测均在Reflectron模式下检测，ESI-MS检测均是在正离子模式下检测的。
图13为健康人血清蛋白唾液酸化N-糖链通过不同衍生化方法标记后的MALDI-MS图谱；其中，图12A为健康人血清蛋白唾液酸化N-糖链通过酰胺化衍生标记d0-苯胺的MALDI-MS图谱，从图中可以看出本发明可以检测到含量稀少的分子量(m/z)为4115.25的糖链(Fuc1Hex7HexNAc6Neu5Ac4)；图12B为健康人血清蛋白唾液酸化N-糖链经过唾液酸特异性衍生化标记d5-苯胺的MALDI-MS图谱,可以发现健康人血清蛋白唾液酸N-糖链既有α2-6连接的异构体，也有α2-3连接的异构体。通过图12A和图12B的对比，证明了本发明高灵敏度的质谱检测和能有效区分复杂血清样品糖蛋白唾液酸化N-糖链的连接异构体。
实施例5
一种复杂生物样品唾液酸化N-糖链连接异构体的定性方法，研究对象为肝癌病人血清蛋白的唾液酸化N-糖链，具体步骤如下：
S1，分别称取两份5mg肝癌病人血清蛋白,分别溶于500μL蛋白变性液，100℃加热10min，当样品冷却后，分别加入50μL磷酸盐缓冲液(pH 7.5)，50μL 10％的NP-40(v/v)溶液和2μL PNGase F酶，37℃反应24h。释放的N-糖链依次经过C18固相萃取柱和石墨碳固相萃取柱纯化，得到纯化好的N-糖链样品；
其中蛋白变性液为0.4M的二硫苏糖醇(DTT)和5％十二烷基磺酸钠(SDS)；磷酸盐缓冲液为1M磷酸钠，用磷酸调pH值至7.5；2μL PNGase F酶为1000酶单位。
C18固相萃取柱纯化过程为：C18固相萃取柱先用3倍柱体积乙腈活化，再用10倍柱体积双蒸水平衡，然后上样，10倍柱体积双蒸水洗脱糖链。
石墨碳固相萃取柱纯化过程为：石墨碳固相萃取柱先用3倍柱体积乙腈活化，再用10倍柱体积双蒸水平衡，然后将经C18固相萃取柱纯化的样品上样，上样后先用10倍柱体积双蒸水洗脱除盐，然后用5mL含有0.1％三氟乙酸的25％乙腈水溶液洗脱样品，收集洗脱液，冻干，得纯化后的N-糖链样品。
S2，取S1所得的一份肝癌病人血清蛋白，加入450μL 1M d0-苯胺，90μL 2M 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)，并且用盐酸调节pH值至4.5，反应6h，，依次通过微晶纤维素柱和C18固相萃取柱纯化样品并且除去中性糖链，得到通过酰胺化反应用d0-苯胺标记肝癌病人血清蛋白唾液酸N-糖链的衍生物，并用MALDI-MS进行检测；
其中，微晶纤维素柱纯化过程为：将所得的糖链衍生物通过离心浓缩仪浓缩，溶于少量水，上样，45℃干燥，40mL 96％的乙腈水溶液洗脱除去多余的苯胺和一部分盐，10mL双蒸水洗脱糖链样品并收集，离心浓缩。
C18固相萃取柱纯化过程为：C18固相萃取柱先用3倍柱体积乙腈活化，再用10倍柱体积双蒸水平衡，然后将经纸色谱柱纯化的样品上样，3mL双蒸水洗脱除盐和除中性糖链，5mL 25％乙腈水溶液洗脱糖链样品，收集洗脱液，离心浓缩干燥，得纯化的唾液酸化N-糖链衍生物。
S3，唾液酸连接异构体的特异性衍生：取自S1的一份肝癌病人血清蛋白N-糖链样品溶于1μL水，加入20μL反应液A，60℃反应1h,加入反应液B，60℃反应1h，乙腈沉淀得唾液酸特异性衍生的d5-苯胺标记肝癌病人血清蛋白唾液酸化N-糖链衍生物，并用MALDI-MS进行检测；
其中，反应液A为250mM 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)和500mM 1-羟基苯并三唑-水合物(HOBt)的二甲基亚砜溶液；反应液B为500mM 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC),1M 1-羟基苯并三唑-水合物(HOBt)和500mM d5-苯胺的二甲基亚砜溶液。
乙腈沉淀过程为：向通过唾液酸特异性衍生化后的样品液中加入大于10倍体积的乙腈，摇匀，-20℃保存20min，13500r/min离心得糖链衍生物沉淀。
S4，将S2和S3中得到的两份糖链衍生物样品进行混合，离心浓缩干燥；溶于20μL0.1M吉拉德试剂P(GP)与水/甲醇/乙酸(v/v/v)＝6:3:1的混合溶液，70℃反应1h，离心浓缩干燥，糖链还原端被GP标记和唾液酸被两种衍生化方法分别标记d0-苯胺和d5-苯胺的肝癌病人血清蛋白N-糖链衍生物混合样品；
S5，将肝癌病人血清蛋白N-糖链衍生物混合样品分别进行RP-HPLC-MS分析；
其中，RP-HPLC的色谱分离条件为：
选用ODS-BP柱，柱温25℃，检测波长为254nm，流速为800μL/min；
流动相A为乙腈，B为pH＝5.5的10mM乙酸铵水溶液，C为双蒸水；
样品分离条件：t＝0min，1％A，99％B，t＝30min，1％A，99％B；t＝40min，9％A，91％B；t＝100min，13.5％A，86.5％B；t＝160min，18％A，82％B；t＝175min，23％A，77％B。
电喷雾电离线性离子阱质谱(ESI-MS)的参数为：工作电压为4kV；鞘气流速为20arb；辅助气体流速为10arb；毛细管电压为37V；毛细管透镜电压是250V；毛细管温度是300℃；扫描类型为一级全扫描；最大注入时间是1000ms；微扫描是3次；数据采集使用LTQTune软件。
MALDI-TOF-MS检测均在Reflectron模式下检测，ESI-MS检测均是在正离子模式下检测的。
图14为肝癌病人血清蛋白唾液酸化N-糖链通过不同衍生化方法标记后的MALDI-MS图谱；其中，图13A为肝癌病人血清蛋白唾液酸化N-糖链通过酰胺化衍生标记d0-苯胺的MALDI-MS图谱，从图中可以看出本发明本发明可以检测到微量的分子量(m/z)为4115.25的糖链(Fuc1Hex7HexNAc6Neu5Ac4)；图13B为肝癌病人血清蛋白唾液酸化N-糖链经过唾液酸特异性衍生化标记d5-苯胺的MALDI-MS图谱,可以发现肝癌病人血清蛋白唾液酸N-糖链既有α2-6连接的异构体，也有α2-3连接的异构体。通过图13A和图13B的对比，进一步证明了本发明高灵敏度的质谱检测和能有效区分复杂血清样品糖蛋白唾液酸化N-糖链的连接异构体。
实施例6
一种复杂生物样品唾液酸化N-糖链同分异构体的相对定量方法，研究对象为健康人血清蛋白和肝癌病人血清蛋白的唾液酸化N-糖链，具体步骤如下：
S1，分别称取九份5mg正常人血清蛋白和肝癌病人血清蛋白，分别溶于500μL蛋白变性液，100℃加热10min，当样品冷却后，分别加入50μL磷酸盐缓冲液(pH 7.5)，50μL 10％NP-40(v/v)溶液和2μL PNGase F酶，37℃反应24h。释放的N-糖链依次经过C18固相萃取柱和石墨碳固相萃取柱纯化，得到纯化好的N-糖链样品；
其中蛋白变性液为0.4M的二硫苏糖醇(DTT)和5％十二烷基磺酸钠(SDS)；磷酸盐缓冲液为1M磷酸钠，用磷酸调pH值至7.5；2μL PNGase F酶为1000酶单位。
C18固相萃取柱纯化过程为：C18固相萃取柱先用3倍柱体积乙腈活化，再用10倍柱体积双蒸水平衡，然后上样，10倍柱体积双蒸水洗脱糖链。
石墨碳固相萃取柱纯化过程为：石墨碳固相萃取柱先用3倍柱体积乙腈活化，再用10倍柱体积双蒸水平衡，然后将经C18固相萃取柱纯化的样品上样，上样后先用10倍柱体积双蒸水洗脱除盐，然后用5mL含有0.1％三氟乙酸的25％乙腈水溶液洗脱样品，收集洗脱液，冻干，得纯化后的N-糖链样品。
S2，取S1所得的六份健康人血清蛋白N-糖链样品和三份肝癌病人血清蛋白N-糖链样品，分别加入450μL 1M d0-苯胺，取S1所得的三份健康人血清蛋白N-糖链样品和六份肝癌病人血清蛋白N-糖链样品，分别加入450μL 1M d5-苯胺，再分别向每份样品中加入90μL2M 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)，并且用盐酸调节pH值至4.5，反应6h，每份N-糖链衍生物样品依次通过手工制作的纸色谱柱和C18固相萃取柱纯化样品并且除去中性糖链。分别得到六份用d0-苯胺标记的健康人血清蛋白唾液酸化N-糖链衍生物，三份用d5-苯胺标记的肝癌病人血清蛋白唾液酸化N-糖链衍生物；三份用d0-苯胺标记的健康人血清蛋白唾液酸化N-糖链衍生物和六份用d5-苯胺标记的肝癌病人血清蛋白唾液酸化N-糖链衍生物；
其中，纸色谱柱纯化过程为：将所得的糖链衍生物通过离心浓缩仪浓缩，溶于少量水，上样，45℃干燥，40mL 96％的乙腈水溶液洗脱除去多余的苯胺和一部分盐，10mL双蒸水洗脱糖链样品并收集，离心浓缩。
C18固相萃取柱纯化过程为：C18固相萃取柱先用3倍柱体积乙腈活化，再用10倍柱体积双蒸水平衡，然后将经纸色谱柱纯化的样品上样，3mL双蒸水洗脱除盐和除中性糖链，5mL 25％乙腈水溶液洗脱糖链样品，收集洗脱液，离心浓缩干燥，得纯化后的唾液酸糖链衍生物。
S3，将S2所得的糖链衍生物样品分别按照三种不同方式等量混合，(i)三份d0-苯胺标记的健康人血清蛋白唾液酸化N-糖链衍生物和三份用d5-苯胺标记的健康人血清蛋白唾液酸化N-糖链衍生物分别混合；(ii)三份用d0-苯胺标记的肝癌病人血清蛋白唾液酸化N-糖链衍生物和三份用d5-苯胺标记的肝癌病人血清蛋白唾液酸化N-糖链衍生物分别混合；(iii)三份d0-苯胺标记的健康人血清蛋白唾液酸化N-糖链衍生物和三份用d5-苯胺标记的肝癌病人血清蛋白唾液酸化N-糖链衍生物分别混合。将所有的混合样品离心浓缩干燥；
S4，将S3所得的糖链衍生物混合样品分别溶于20μL 0.1M吉拉德试剂P(GP)与水/甲醇/乙酸(v/v/v)＝6:3:1的混合溶液，70℃反应1h，离心浓缩干燥，得到糖链还原端被GP标记的糖链衍生物；
S5，将S4所得糖链衍生物用反相高效液相色谱和质谱联用技术(RP-HPLC-MS)进行检测分析，以同位素目标峰为内标，根据目标峰与同位素目标峰的EIC峰面积比值进行相对定量分析。
其中，RP-HPLC的色谱分离条件为：
选用ODS-BP柱，柱温25℃，检测波长为254nm，流速为800μL/min；
流动相A为乙腈，B为pH＝5.5的10mM乙酸铵水溶液，C为双蒸水；
样品分离条件：t＝0min，1％A，99％B，t＝30min，1％A，99％B；t＝40min，9％A，91％B；t＝100min，13.5％A，86.5％B；t＝160min，18％A，82％B；t＝175min，23％A，77％B。
电喷雾电离线性离子阱质谱(ESI-MS)的参数为：工作电压为4kV；鞘气流速为20arb；辅助气体流速为10arb；毛细管电压为37V；毛细管透镜电压是250V；毛细管温度是300℃；扫描类型为一级全扫描；最大注入时间是1000ms；微扫描是3次；数据采集使用LTQTune软件。ESI-MS检测均是在正离子模式下检测的。
图15为健康人血清蛋白唾液酸化N-糖链和肝癌病人血清蛋白唾液酸化N-糖链通过酰胺化衍生后，衍生物经RP-HPLC-MS分析的TIC图；
其中图15A为健康人血清蛋白唾液酸化N-糖链衍生物的TIC图，从图中可以发现RP-HPLC对健康人血清蛋白唾液酸化N-糖链衍生物根据所含唾液酸的个数，N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac)被N-羟乙酰神经氨酸(Neu5Gc)取代的个数，含有的α2-6连接和α2-3连接的唾液酸个数，以及精细的糖链结构实现高分辨的顺序分离；图15B为肝癌病人血清蛋白唾液酸化N-糖链衍生物的TIC图，从图中可以发现RP-HPLC对肝癌病人血清蛋白唾液酸化N-糖链衍生物根据所含唾液酸的个数，N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac)被N-羟乙酰神经氨酸(Neu5Gc)取代的个数，含有的α2-6连接和α2-3连接的唾液酸个数，以及精细的糖链结构也能实现高分辨的顺序分离。
图16为健康人血清蛋白唾液酸化N-糖链和肝癌病人血清蛋白唾液酸化N-糖链异构体的相对定量柱状图；从图中可以发现健康人血清蛋白唾液酸化N-糖链与肝癌病人血清蛋白唾液酸化N-糖链完全一致，但是其中一些唾液酸N-糖链的含量有显著差异，通过分类比较发现肝癌病人血清蛋白唾液酸化N-糖链比健康人血清蛋白唾液酸化N-糖链的α2-3连接异构体含量减少，但是α2-6连接异构体的含量增多并且主要是岩藻糖基化的糖链。证明本发明完全能适用于对复杂生物样品中唾液酸化N-糖链异构体的相对定量。
综上所述，该方法与现有技术相比具有以下优点：通用性强，除去糖链样品中的中性糖链，对唾液酸化糖链进行特异性的分析；具有更高的质谱(MS)和高效液相色谱(HPLC)检测灵敏度；由于根据唾液酸化糖链的非还原末端进行分离，因此可根据糖链所含唾液酸的个数，N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac)被N-羟乙酰神经氨酸(Neu5Gc)取代的个数，含有的α2-3连接和α2-6连接的唾液酸个数以及精确的糖链结构的不同实现唾液酸化糖链的顺序分离，且具有更高的分离度和定性准确性；第一次实现了在同分异构体水平对唾液酸化糖链的准确定量分析。该方法的发展对疾病糖链标志物的筛选具有重要意义。
Claims (10)
1.唾液酸化糖链同分异构体的高分辨顺序分离和准确定量分析方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：分别称取5mg糖蛋白样品1和2各三份，利用PNGase F酶分别进行N-糖链的释放；释放的N-糖链样品依次经过C18固相萃取柱和石墨碳固相萃取柱纯化，得到纯化的N-糖链样品1和2各三份；
S2：S1中纯化的N-糖链样品1和2各取两份；
（a）第一份利用d0-苯胺通过酰胺化方法对糖链的唾液酸进行标记，然后利用固相萃取技术除去中性糖链，唾液酸化糖链还原末端标记吉拉德试剂P(GP) 以屏蔽活性醛基和提高后续质谱检测灵敏度，得到d0-苯胺和GP标记的唾液酸化N-糖链衍生物，记为d0-苯胺衍生物；
（b）第二份利用d5-苯胺进行唾液酸连接异构体的特异性衍生，其中先使α2,3-连接唾液酸形成内酯，然后使α2,6-连接唾液酸发生酰胺化；再进行GP标记，得到特异性糖链衍生物，记为d5-苯胺衍生物；
S3：将S2中获得的N-糖链样品1的d0-苯胺衍生物和d5-苯胺衍生物进行混合，N-糖链样品2的d0-苯胺衍生物和d5-苯胺衍生物进行混合，利用反相高效液相色谱和质谱联用技术（RP-HPLC-MS）对N-糖链样品1和2的唾液酸化糖链连接异构体分别进行鉴定；
S4：S1中纯化的N-糖链样品1和2各取余下的那一份，参考S2中（a）步骤，对N-糖链样品1和2通过酰胺化反应分别标记d0-苯胺和d5-苯胺，混合两种样品，然后标记GP，用反相高效液相色谱和质谱联用技术（RP-HPLC-MS）进行检测，对每个糖链提取离子流图（EIC），并根据同位素目标峰的峰面积比值进行样品间的定量比较分析。
2.根据权利要求1所述的唾液酸化糖链同分异构体的高分辨顺序分离和准确定量分析方法，其特征在于：步骤S1，具体是：将每份糖蛋白样品溶于500μL蛋白变性液，100℃加热10min，当样品冷却后，加入50μL pH 7.5的磷酸盐缓冲液、50μL 10%（v/v）的NP-40溶液和2μL PNGase F酶，37℃反应24h；释放的N-糖链依次经过C18固相萃取柱和石墨碳固相萃取柱纯化，得到纯化的N-糖链样品。
3.根据权利要求2所述的唾液酸化糖链同分异构体的高分辨顺序分离和准确定量分析方法，其特征在于：步骤S1中，所述蛋白变性液为0.4M的二硫苏糖醇（DTT）和5%十二烷基磺酸钠(SDS)；磷酸盐缓冲液为1M磷酸钠，用磷酸调pH值为7.5；2μL PNGase F酶为1000酶单位。
4.根据权利要求2所述的唾液酸化糖链同分异构体的高分辨顺序分离和准确定量分析方法，其特征在于：步骤S1中，C18固相萃取柱纯化过程为：C18固相萃取柱先用3倍柱体积乙腈活化，再用10倍柱体积双蒸水平衡，然后上样，10倍柱体积双蒸水洗脱糖链；
石墨碳固相萃取柱纯化过程为：石墨碳固相萃取柱先用3倍柱体积乙腈活化，再用10倍柱体积双蒸水平衡，然后将经C18固相萃取柱纯化的样品上样，上样后先用10倍柱体积双蒸水洗脱除盐，然后用5mL 含有0.1%三氟乙酸的25%乙腈水溶液洗脱样品，收集洗脱液，冻干，得纯化后的N-糖链样品。
5.根据权利要求1所述的唾液酸化糖链同分异构体的高分辨顺序分离和准确定量分析方法，其特征在于：步骤S2和S4中，得到酰胺化标记的唾液酸化N-糖链衍生物的过程具体是：
向S1所得的N-糖链样品中加入450μL 1M d0/d5-苯胺和90μL 2M 1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐（EDC），并且用盐酸调节pH值至4.5，反应6h；
依次通过微晶纤维素柱和C18固相萃取柱纯化样品和除去中性N-糖链，得到酰胺化标记的唾液酸化N-糖链衍生物；或者，依次通过纸色谱柱和C18固相萃取柱纯化样品并且除去中性糖链，得到酰胺化标记的唾液酸化N-糖链衍生物。
6.根据权利要求5所述的唾液酸化糖链同分异构体的高分辨顺序分离和准确定量分析方法，其特征在于：
微晶纤维素柱纯化过程为：将所得的糖链衍生物通过离心浓缩仪浓缩，溶于少量水，上样，45℃干燥，40mL 96%的乙腈水溶液洗脱除去多余的苯胺和一部分盐，10mL双蒸水洗脱糖链样品并收集，离心浓缩；
纸色谱柱纯化过程为：将所得的糖链衍生物通过离心浓缩仪浓缩，溶于少量水，上样，45℃干燥，40mL 96%的乙腈水溶液洗脱除去多余的苯胺和一部分盐，10mL双蒸水洗脱糖链样品并收集，离心浓缩；
C18固相萃取柱纯化过程为：C18固相萃取柱先用3倍柱体积乙腈活化，再用10倍柱体积双蒸水平衡，然后将经微晶纤维素柱纯化或纸色谱柱纯化的样品上样，3mL双蒸水洗脱除盐和除中性糖链，5mL 25%乙腈水溶液洗脱糖链样品，收集洗脱液，离心浓缩干燥，得纯化后的唾液酸化N-糖链衍生物。
7.根据权利要求1所述的唾液酸化糖链同分异构体的高分辨顺序分离和准确定量分析方法，其特征在于：步骤S2所述唾液酸连接异构体的特异性衍生具体是：将纯化的N-糖链样品溶于1μL水，加入20μL反应液A，60℃反应1h, 加入反应液B，60℃反应 1h，乙腈沉淀得特异性糖链衍生物；其中反应液A为250mM 1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐（EDC）和500mM 1-羟基苯并三唑-水合物（HOBt）的二甲基亚砜溶液；反应液B为500mM 1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐（EDC）、1M 1-羟基苯并三唑-水合物（HOBt）和500mM d5-苯胺的二甲基亚砜溶液。
8.根据权利要求1所述的唾液酸化糖链同分异构体的高分辨顺序分离和准确定量分析方法，其特征在于：步骤S2和S4中GP标记方法具体是：将其溶于20μL 0.1M的吉拉德试剂P（GP）与水/甲醇/乙酸（v/v/v）=6:3:1的混合溶液，70℃反应1h，离心浓缩干燥，得到糖链还原端被GP标记的糖链。
9.根据权利要求1所述的唾液酸化糖链同分异构体的高分辨顺序分离和准确定量分析方法，其特征在于：步骤S2中MALDI-MS检测条件为：糖链样品被溶于适当的50%甲醇水溶液中，0.5μL样品溶液与等体积的DHB基质溶液在一个384孔MALDI靶板上混合，在reflectron模式下进行检测；其中DHB基质溶液为20mg DHB溶于1mL乙腈和0.1%三氟乙酸的1:1混合溶液。
10.根据权利要求1所述的唾液酸化糖链同分异构体的高分辨顺序分离和准确定量分析方法，其特征在于：步骤S3和S4中采用的反相高效液相色谱和质谱联用技术（RP-HPLC-MS），色谱条件为：
选用ODS-BP柱，柱温25℃，检测波长为254nm，流速为800μL/min；
流动相A为乙腈，B为pH = 5.5的10mM乙酸铵水溶液，C为双蒸水；
样品分离条件：t = 0 min，1% A，99% B，t = 30 min，1% A，99% B；t = 40 min，9% A，91% B；t = 100 min，13.5% A，86.5% B；t = 160 min，18% A，82% B；t = 175 min，23% A，77% B；
步骤S3和S4中采用的反相高效液相色谱和质谱联用技术（RP-HPLC-MS），ESI-MS条件为：
分子量范围：m/z 850-2000
工作电压为4 kV；
鞘气流速为20 arb，辅助气体流速为10 arb；
毛细管电压为37 V，毛细管透镜电压是250 V，毛细管温度是300 ℃；
最大注入时间是1000 ms，微扫描是3次；
同位素宽度m/z 3.00；
离子碰撞能量是35%~45%；
激活电荷是0.25；
激活时间是30 ms。
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