CN109900815B - 血清中IgG糖肽的绝对定量分析 - Google Patents
血清中IgG糖肽的绝对定量分析 Download PDFInfo
- Publication number
- CN109900815B CN109900815B CN201711293842.0A CN201711293842A CN109900815B CN 109900815 B CN109900815 B CN 109900815B CN 201711293842 A CN201711293842 A CN 201711293842A CN 109900815 B CN109900815 B CN 109900815B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- glycopeptide
- immunoglobulin
- serum
- igg
- enzymolysis
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Images
Abstract
本发明提供了一种血清中免疫球蛋白G(IgG)糖肽的绝对定量方法。工艺过程包括两部分：一方面进行IgG糖肽标准品的二维亲水色谱法纯化制备及其定量分析，另一方面采用标准添加的方法进行血清样品中IgG糖肽绝对定量分析。采用标准IgG进行糖肽标品的制备，包括糖肽的释放、反相色谱法富集IgG糖肽、二维亲水色谱法分离纯化及质谱表征；定量分析则是将糖肽标品进行PNGase F糖链释放，对去糖基化的IgG糖肽肽段采用内标曲线进行MRM定量分析，获得每种纯化IgG糖肽的摩尔浓度。血清中IgG糖肽含量测定通过标准添加的方法实现，即一份添加已知浓度的IgG糖肽标准品，另一份不添加进行MRM分析，根据二者峰面积差和添加标品糖肽浓度计算血清中IgG对应糖型糖肽的含量。在此基础上，可计算糖肽绝对相应因子。
Description
技术领域
本发明涉及人血清中免疫球蛋白G糖肽的绝对定量分析方法开发，属于蛋白质组学的技术领域。
背景技术
人体中普遍存在的蛋白质糖基化修饰，约50％人体蛋白都被糖基化修饰的。免疫球蛋白(Immunoglobulin，Ig)是一类具有抗体活性的血清糖蛋白。包括IgG，IgM，IgA，IgE和IgD。其中，IgG约占血清免疫球蛋白总量的75％。IgG又分为四种亚型：IgG1占60～70％，IgG2占15～20％，IgG3占5～10％，IgG4占1～7％。IgG由Fc(结晶段)和Fab(抗原结合段)组成，均含有保守的N-糖基化修饰。许多研究表明，IgG Fc段N-糖基化异常改变与癌症、类风湿性关节炎和炎症性疾病发生发展密切相关。此外，一类以IgG结构为基础的大分子单克隆抗体药物的糖基化修饰类型及水平对药物的稳定性、清除效率、免疫原性、抗体依赖细胞毒性及补体依赖细胞毒性等都有一定的作用(Beck A,Wagner-Rousset E,Ayoub D,etal.Characterization of therapeutic antibodies and related products[J].AnalChem,2013,85(2):715-736)。由此可见，对IgG糖基化修饰的定性、定量研究对疾病的监测诊断以及治疗性抗体药物的质量控制都具有重要意义。
由于糖链/糖肽标准品缺乏，蛋白质糖基化定量研究处于相对定量阶段。相对定量一方面利用同位素标记法(化学标记、酶标记和代谢标记)，比较标记和未标记分析物的峰面积或峰强度，从而实现在同一谱图中比较不同的样品；另一方面采用无标记相对定量，通过加入内标物，或利用分析软件等手段对不同谱图中相同质荷比的峰进行比较。常用的糖链定量方法为色谱法和MALDI-TOF(基质辅助激光解离质谱)质谱法，通常会在分析前对糖链进行荧光标记。标记后的糖链通过反相色谱、亲水色谱、阴离子交换色谱和毛细管凝胶色谱等分离技术对已知糖链进行定量分析。对未知糖链需先质谱定性，此法步骤繁琐；而高效阴离子交换色谱结合脉冲安培检测(HPAEC-PAD)克服上述缺点，但灵敏度和选择性较低。随着质谱技术的发展，LC-MS包括ESI-Q-TOF(电喷雾质谱)，MALDI-TOF，IT或Orbitrap)方法被广泛应用于糖链定量研究中。由于上述方法无法确定糖链来源及位点信息，发展了糖肽相对定量分析方法，通常通过LC-ESI-MS和MALDI-TOF-MS实现。近年来，MRM技术在糖肽定量方面应用较多，被认为是分析复杂样品中低丰度化合物最可靠且最有潜力的定量方法。该方法稳定好、通量高、灵敏度高、特异性好。如Hong等(Hong Q,Lebrilla C B,Miyamoto S,etal.Anal Chem 2013，85(18)：8585-8593)建立了一种利用MRM直接对血清酶解液中26种IgG高丰度N-糖肽进行糖基化水平定量测定。此方法虽然未能测定出糖肽的摩尔浓度，但是表明MRM技术在其临床诊断治疗性抗体的生产优化方面的巨大潜力。由于糖链/糖肽标准品缺乏，糖链/糖肽绝对含量测定未见报道。
目前，糖链主要来源有化学合成，化学-酶法合成和天然糖链纯化制备。化学合成法复杂，且周期很长；酶合成法所用的糖基转移酶很昂贵；由于糖链复杂，连接方式和分支较多，加上异构体的存在，使得分离纯化比较困难。但纯化优点在于具有天然糖链相同的结构。随着二维制备液相色谱发展，糖链/糖肽二维制备液相色谱提高了一维色谱的峰容量和选择性。
因此，本研究通过二维色谱分离纯化制备出IgG N-糖肽标准品，采用MRM技术，通过标准添加方法进行血清IgG糖肽绝对含量。具体方法：一方面合成肽段标准品(去糖基化IgG肽段)用来制作标准曲线进行纯化糖肽单体摩尔浓度测定，另一方面通过糖肽标准品标准添加方法，测定血清中IgG糖肽含量测定。本发明可以实现血清中IgG糖肽精确定量，方法灵敏度高，重现性好，可操作性强等特点，对IgG糖基化定量分析在临床检测和单抗药物的生产发展提供新思路。
发明内容
本发明开发了一种利用MRM模式绝对定量血清中IgG糖肽的方法。所采用的的技术路线为：
可同时绝对定量IgG1、IgG2或IgG3和IgG4之和(IgG3/4)的一种或两种以上；
包括以下步骤：
1)IgG标准品酶解：用缓冲溶液将血清稀释，然后加入二硫苏糖醇进行二硫键还原，反应产物中加入碘代乙酸，避光保存得到反应液，将反应液中加入胰蛋白酶进行酶解反应；
2)免疫球蛋白G糖肽富集：酶解液进行反相色谱富集，经nano-ESI-Q-TOF分析，洗脱得到免疫球蛋白糖肽组分；
3)免疫球蛋白G各亚型糖肽组分分别二维亲水色谱分离纯化：将步骤2)中收集免疫球蛋白糖肽组分进行二维亲水色谱分离纯化，收集免疫球蛋白G糖肽单体馏分；
4)质谱表征：将步骤3)中收集的免疫球蛋白G中性糖肽单体馏分分别进行MALDI-TOF质谱定性分析，各亚型单体糖肽单体根据其糖型分别命名，F代表岩藻糖，A代表除五塘核心外的N乙酰葡糖胺，B代表平分型N乙酰葡糖胺，G代表半乳糖，FmAnBoGp，其中m、n、o、p代表糖数量取大于等于零的整数FA2G0、FA2G1、FA2G2、FA2BG0、FA2BG1、FA2BG2、A2G0、A2G1、A2G2(以IgG1为例)；
将步骤3)中收集的免疫球蛋白G酸性糖肽单体馏分分别进行ESI-Q-TOF质谱定性分析,S代表酸性糖(唾液酸)，命名FA2G1S、FA2G2S(以IgG1为例)；
5)糖链释放：取已知体积步骤3)中收集的免疫球蛋白G糖肽单体分别进行PNGaseF去糖基化反应，从而得到去糖基化的免疫球蛋白G肽段酶解液；
6)去糖基化免疫球蛋白G肽段HPLC-MRM定量分析：将步骤5)中免疫球蛋白G糖肽的PNGase F酶解液进行HPLC-MRM定量分析；具体地，先建立免疫球蛋白G亚型的内标曲线；
采用所述免疫球蛋白G各亚型糖肽对应肽段标准品(购买)，稀释成至少5个不同浓度，浓度范围为20ppb-200ppm，每个浓度的标准品均加入2ppm与各标准品等体积的与亚型对应的内标肽段，所述内标肽段与标准品的区别在于内标肽段在上述液相分离条件下具有与标准品相似保留行为；而后进行HPLC-MRM定量分析，建立与上述亚型对应的内标曲线，曲线纵坐标为上述不同浓度的标准品峰面积与对应的内标肽段峰面积的比值，横坐标为上述标准品的摩尔浓度；
此外，将步骤5)IgG各亚型糖肽酶解液中加入与各酶解液等体积的与建立内标曲线时加入的内标肽段浓度相同的内标肽段，测定免疫球蛋白亚型肽段面积与其对应内标肽段面积比值，将此比值带入内标曲线，得到该亚型免疫球蛋白G总肽段摩尔浓度，即为该免疫球蛋白G亚型总糖肽的摩尔浓度；
7)血清中免疫球蛋白G目标糖肽根据标准添加法定量分析：将血清样品进行Trypsin酶解，将酶解液均分两份：一份酶解液中添加已知浓度(Ca)的步骤3)纯化的糖肽标准品后进行HPLC-MRM定量分析；得到目标糖型糖肽添加后峰面积Aa；另一份酶解液直接进行HPLC-MRM-IgG糖肽定量分析，得到目标糖型糖肽未添加峰面积Ab，根据标准添加的峰面积和浓度的关系，见下公式，计算血清中目标糖肽的浓度。
更进一步，步骤1)将血清稀释并加入二硫苏糖醇进行二硫键还原反应，反应温度在37-90℃之间，反应时间在50-180min；加入碘代乙酸反应温度在20-30℃之间，反应时间在30-60min；加入胰蛋白酶后反应温度在35-40℃之间，反应时间在18-72h。
更进一步，步骤1)血清酶解稀释所使用的缓冲溶液为碳酸氢铵缓冲溶液，稀释所用缓冲液浓度在50-400mM，pH为7-8，加入原溶液体积的1-3倍体积的缓冲溶液；加入二硫苏糖醇的浓度在0.3-0.6M，血清总蛋白与二硫苏糖醇的质量比例为7:1-3:1；加入碘代乙酸的浓度在0.3-0.6M，血清总蛋白与碘代乙酸的质量比为5.5:1-2.7:1；加入胰蛋白酶和血清总蛋白的质量比为1:50-1:20；酶解后，加入1％-5％(v/v)甲酸终止酶解反应。
更进一步，步骤2)富集所用色谱柱为XAqua C18色谱柱；所用色谱柱键合材料的粒径为5-10μm，采用4.6*100mm色谱柱，流动相为甲醇与水或乙腈与水，两相中均含有或不含有0.1％(v/v)甲酸。洗脱条件按照水相95-70％(v/v)等度或5-60分钟水相由98％(v/v)变化到70％(v/v)线性梯度进行；使用紫外检测器，检测波长为190-280nm；柱温为25-35℃，洗脱液流速为0.6-1.2mL/min，收集保留时间为5-15min的组分；
步骤2)免疫球蛋白G糖肽富集时采用最佳流动相为乙腈和水，两相中均含或不含0.1％(v/v)甲酸，等度洗脱，水在流动比例为98-80％(v/v)。
更进一步，步骤2)免疫球蛋白G富集到的糖肽馏分采用nano-ESI-Q-TOF-MS直接进样检测，正离子模式，喷雾电压2.5kV，扫描范围500-2000，流速1μL/min，进样5μL。
更进一步，步骤3)一维纯化采用硅胶基质键合材料为色谱柱填料Mal，此材料为极性共聚亲水填料；所用色谱柱基质键合材料的粒径为5-10μm，采用4.6*100mm色谱柱，流动相为甲醇与水或乙腈与水混合，两相中均含有或不含有0.1％(v/v)甲酸；洗脱条件按照水相15-50％(v/v)等度或0-60分钟水相由10％(v/v)变化到60％(v/v)线性梯度进行；柱温为25-35℃，洗脱液流速为0.7-1mL/min；二维分离纯化条件为：采用硅胶基质键合材料为色谱柱填料XIon，此材料为极性共聚亲水填料；所用色谱柱基质键合材料的粒径为5-10μm，采用2.1*100mm色谱柱，流动相为甲醇与水或乙腈与水混合，两相中均含有或不含有0.1％(v/v)甲酸；洗脱条件按照水相15-50％(v/v)等度或0-60分钟水相由10％(v/v)变化到60％(v/v)线性梯度进行；柱温为25-35℃，洗脱液流速为0.7-1mL/min。
更进一步，在步骤4)中，将步骤3)中收集的免疫球蛋白G糖肽单体进行MALDI-TOF质谱分析，采用正离子模式，反射模式进行分析。
更进一步，在步骤5)中，取已知体积的步骤3)中收集的免疫球蛋白G糖肽经低温离心冻干处理后，进行PNGase F酶解反应，糖链释放使用碳酸氢铵缓冲溶液，体积50-200μL，浓度为50-200mM，pH为7-9；酶解反应温度为35-40℃；反应时间为10-36小时；加入PNGase F的量为每1-10mg免疫球蛋白糖肽加入1unit酶量。
更进一步，步骤6)HPLC-MRM定量液相部分以硅胶基质键合材料为色谱柱填料XAqua C18，此材料为反相填料；所用色谱柱基质键合材料的粒径为5-10μm，采用2.1*100mm色谱柱，流动相为甲醇与水或乙腈与水，两相中均含有或不含有0.1％(v/v)甲酸；洗脱条件按照水相85-50％(v/v)等度或5-10分钟水相由98％(v/v)变化到10％(v/v)线性梯度进行；柱温为25-35℃，洗脱液流速为0.2-0.6mL/min；质谱条件为：Q-Trap 5500串联四级杆线性离子阱高性能质谱仪，配有Waters UPLC液相、AB SCIEX质谱和Analyst 1.6.1数据处理软件；离子源：Turbo Ion Spray；正离子扫描方式检测；扫描方式为多反应监测；全扫分辨率14000，最大注入时间200ms。
更进一步，步骤6)HPLC-MRM定量使用的购买的内标肽段与免疫球蛋白G糖肽肽段只有一个氨基酸的替换，购买的内标肽段与其对应免疫球蛋白G各亚型糖肽肽段只有一个不同氨基酸，是将去糖基化后的氨基酸D变成了E，均为酸性氨基酸，因此内标肽段在上述液相分离条件下具有与免疫球蛋白G糖肽肽段相似保留行为，因此可作为内标肽段。
选择的免疫球蛋白G糖肽肽段如下：
IgG1糖肽去糖基化肽段氨基酸序列为EEQYDSTYR；
IgG2糖肽去糖基化肽段氨基酸序列为EEQFDSTFR；
IgG3糖肽去糖基化肽段氨基酸序列为EEQYDSTFR；
IgG4糖肽去糖基化肽段氨基酸序列为EEQFDSTYR；
所述加入的内标肽段浓度为2ppm。
由于IgG3和IgG4氨基酸组成相同，具有相同质荷比，在质谱条件下无法区分，因此本方法定量分析IgG3和IgG4糖肽的总含量。
更进一步，步骤7)血清酶解稀释所使用的缓冲溶液为碳酸氢铵缓冲溶液，稀释所用缓冲液浓度在50-400mM，pH为7-8，加入原溶液体积的1-3倍体积的缓冲溶液；加入二硫苏糖醇的浓度在0.3-0.6M，血清总蛋白与二硫苏糖醇的质量比例为7:1-3:1；加入碘代乙酸的浓度在0.3-0.6M，血清总蛋白与碘代乙酸的质量比为5.5:1-2.7:1；加入胰蛋白酶和血清总蛋白的质量比为1:50-1:20；酶解后，加入1％-5％(v/v)甲酸终止酶解反应。
更进一步，步骤7)血清HPLC-MRM定量液相部分以硅胶基质键合材料为色谱柱填料XAqua C18，此材料为反相填料；所用色谱柱基质键合材料的粒径为5-10μm，采用2.1*100mm色谱柱，流动相为甲醇与水或乙腈与水，两相中均含有或不含有0.1％(v/v)甲酸；洗脱条件按照水相85-50％(v/v)等度或5-10分钟水相由98％(v/v)变化到10％(v/v)线性梯度进行；柱温为25-35℃，洗脱液流速为0.2-0.6mL/min；质谱条件为：Q-Trap 5500串联四级杆线性离子阱高性能质谱仪，配有Waters UPLC液相、AB SCIEX质谱和Analyst 1.6.1数据处理软件；离子源：Turbo Ion Spray；正离子扫描方式检测；扫描方式为多反应监测；全扫分辨率14000，最大注入时间200ms。
一种方法定量测定实际人血液样品免疫球蛋白G糖肽的应用，其特征在于能够定量测出血清中各免疫球蛋白G高丰度糖肽的含量，浓度0.1pmol/mL-10nmol/mL。
本发明具有以下优点：
1、可以通过二维亲水作用色谱纯化得到部分高丰度IgG糖肽标准品；
2、不用预先富集血清中的IgG；
3、可以准确测定血清样品中高丰度IgG糖肽的绝对摩尔浓度。方法简单易操作，灵敏度高，准确好，重复率高。且可以应用于血清中其他免疫球蛋白亚型中糖基化水平临床检测和单克隆抗体药物的生产控制中。
附图说明
图1中(a)为IgG1内标曲线；
图1中(b)为IgG2内标曲线；
图1中(c)为IgG3、IgG4之和(IgG3/4)内标曲线。
具体实施方式
现结合实例对本发明进行进一步说明。实例仅限于说明本发明，并非对本发明的限定。
本实施例中所述内标肽段为：
IgG1内标肽段氨基酸序列为EEQYESTYR，
IgG2内标肽段氨基酸序列为EEQFESTFR，
IgG3和IgG4内标肽段氨基酸序列为EEQYESTFR；
标准品为：
IgG1为EEQYDSTYR，
IgG2为EEQFDSTFR，
IgG3为EEQYDSTFR，
IgG4为EEQFDSTYR。
实施例1
同时绝对定量IgG1、IgG2以及IgG3、IgG4之和(IgG3/4)中的糖肽。
(1)标准IgG和血清的胰蛋白酶解：将5mg IgG/50μL血清中各加入50μL 50mM(pH＝7.4)碳酸氢铵溶液，再加入0.3M二硫苏糖醇10μL，37℃，还原180min；反应产物中加0.3M碘代乙酸20μL，20℃避光保存60min；将反应液中加入胰蛋白酶60μg，40℃酶解反应72h。酶解结束后，加入1％(v/v)甲酸终止酶解反应。
(2)标准IgG糖肽富集：酶解液经过反相XAqua C18(4.6*150mm，5μm)色谱柱进行糖肽富集。流动相采用甲醇与水，条件90％(v/v)水等度洗脱；检测波长为190nm；柱温为25℃，洗脱液流速为0.6mL/min，收集馏分进行nano-ESI-Q-TOF质谱分析，其中10-25min馏分即为IgG糖肽组分。低温离心浓缩备用。
(3)IgG糖肽二维亲水色谱分离纯化：将步骤(2)中收集IgG糖肽进行一维亲水分离纯化，采用亲水Mal(4.6*150mm，5μm)，流动相为甲醇与水，洗脱条件按照水相15％(v/v)等度洗脱；柱温为25℃，洗脱液流速为1mL/min，收集其馏分，进行二维亲水色谱纯化，采用亲水XIon(2.1*150mm，5μm)，流动相为甲醇与水，洗脱条件按照水相25％(v/v)等度洗脱；柱温为25℃，洗脱液流速为0.2mL/min，收集其馏分。
(4)质谱表征：将步骤3)中收集的免疫球蛋白G中性糖肽单体馏分分别进行MALDI-TOF质谱定性分析，各亚型单体糖肽单体根据其糖型分别命名，F代表岩藻糖，A代表除五塘核心外的N乙酰葡糖胺，B代表平分型N乙酰葡糖胺，G代表半乳糖，FmAnBoGp，其中m、n、o、p代表糖数量取大于等于零的整数；
将步骤3)中收集的免疫球蛋白G酸性糖肽单体馏分分别进行ESI-Q-TOF质谱定性分析,S代表酸性糖(唾液酸)；
(5)IgG糖肽PNGase F去糖基化：取已知体积的步骤(3)中收集馏分进行PNGase F酶解反应。具体地，将已知体积的步骤(3)中收集的免疫球蛋白G糖肽馏分先进行低温离心浓缩，旋干处理后，加入50mM碳酸氢铵缓冲溶液100μL，pH为7；加入1unit PNGase F，35℃酶解反应36h。
(6)去糖基化IgG肽段MRM定量分析：采用购买的合成的标准IgG去糖基化糖肽肽段稀释至一系列浓度，加入各标准品相同体积，浓度2ppm的内标肽段，使标准肽段与其内标肽段比值为1：100，1：50，1：25，1：10，1：5，1：2.5，1:1，2.5：1，5：1，10：1，25：1，50:1，100：1；HPLC-MRM定量分析，建立内标曲线，曲线纵坐标为上述不同浓度的标准品峰面积与对应的内标肽段峰面积的比值，横坐标为上述标准品的浓度。再将加入内标的IgG糖肽PNGase F酶解液进行HPLC-MRM定量分析，测定免疫球蛋白G各亚型肽段峰面积与其对应内标肽段峰面积比值，将此比值带入内标曲线，得到每种亚型下各糖型免疫球蛋白G肽段摩尔浓度，即为每种亚型下各糖型糖肽摩尔浓度，见表1a.(nmol/mL)。采用反相XAqua C18(2.1*100mm，5μm)色谱柱，流动相为甲醇与水。洗脱条件水相85％(v/v)等度洗脱，柱温为25℃，洗脱液流速为0.2mL/min。质谱条件为：Q-Trap 5500串联四级杆线性离子阱高性能质谱仪，配有WatersUPLC液相、AB SCIEX质谱和Analyst1.6.1数据处理软件；离子源：Turbo Ion Spray；正离子扫描方式检测；扫描方式为多反应监测；全扫分辨率14000，最大注入时间200ms。
(7)血清中免疫球蛋白G目标糖肽定量分析：将经Trypsin酶解的血清酶解液样品均分两份：一份酶解液中添加已知浓度(Ca)的步骤3)纯化的糖肽标准品后进行HPLC-MRM定量分析；得到目标糖型糖肽添加后峰面积Aa；另一份酶解液直接进行HPLC-MRM定量分析，得到目标糖型糖肽未添加峰面积Ab，根据标准添加的峰面积和浓度的关系
计算血清中目标糖肽的浓度。血清中高丰度糖肽浓度见表1a.(nmol/mL)。
实施例2
分别绝对定量IgG1、2以及3、4之和的糖肽。
(1)血清的胰蛋白酶解：将5mg IgG/50μL血清中各加入100μL 100mM(pH＝7.8)碳酸氢铵溶液，再加入0.5M二硫苏糖醇10μL，37℃，还原120min；反应产物中加0.5M碘代乙酸20μL，25℃避光保存40min；将反应液中加入胰蛋白酶75μg，37℃酶解反应36h。酶解结束后，加入2％(v/v)甲酸终止酶解反应。
(2)IgG糖肽富集：酶解液经过反相XAqua C18(4.6*150mm，5μm)色谱柱进行糖肽富集。流动相采用乙腈与水，条件80％(v/v)水等度洗脱；检测波长为280nm；柱温为30℃，洗脱液流速为1mL/min，收集馏分进行nano-ESI-Q-TOF质谱分析，其中5-12min馏分即为IgG1，13-15min馏分即为IgG3和IgG4之和(IgG3/4)，15-20min馏分即为IgG2糖肽组分。低温离心浓缩后备用。
(3)IgG糖肽二维亲水色谱分离纯化：一维亲水分离纯化，采用亲水Mal(4.6*150mm，5μm)，流动相为乙腈与水，洗脱条件按照水相50％(v/v)等度洗脱；柱温为25℃，洗脱液流速为1mL/min，收集其馏分，进行二维亲水色谱纯化，采用亲水XIon(2.1*150mm，5μm)，流动相为乙腈与水，洗脱条件0-60min按照水相10％-60％(v/v)梯度洗脱；柱温为30℃，洗脱液流速为0.2mL/min，收集其馏分。
(4)质谱表征：将步骤3)中收集的免疫球蛋白G中性糖肽单体馏分分别进行MALDI-TOF质谱定性分析，各亚型单体糖肽单体根据其糖型分别命名，F代表岩藻糖，A代表除五塘核心外的N乙酰葡糖胺，B代表平分型N乙酰葡糖胺，G代表半乳糖，FmAnBoGp，其中m、n、o、p代表糖数量取大于等于零的整数；
将步骤3)中收集的免疫球蛋白G酸性糖肽单体馏分分别进行ESI-Q-TOF质谱定性分析,S代表酸性糖(唾液酸)；
(5)IgG糖肽PNGase F去糖基化：将取已知体积的步骤(3)中收集馏分进行PNGaseF酶解反应。具体地，将步骤(3)中收集的免疫球蛋白G糖肽另一份通过低温离心浓缩仪在8℃条件旋干处理后，加入100mM碳酸氢铵缓冲溶液100uL，pH为7.8；加入2unit PNGase F，37℃酶解反应24h。
(6)去糖基化IgG肽段MRM定量分析：采用购买的合成的标准IgG去糖基化糖肽肽段稀释至一系列浓度，加入相同体积，浓度2ppm内标肽段，使标准肽段与其内标肽段比值为1：100，1：50，1：25，1：10，1：5，1：2.5，1:1，2.5：1，5：1，10：1，25：1，50:1，100：1，HPLC-MRM定量分析，建立内标曲线，曲线纵坐标为上述不同浓度的标准品峰面积与对应的内标肽段峰面积的比值，横坐标为上述标准品的浓度。内标曲线见图1。再将加入内标的IgG糖肽PNGase F酶解液进行HPLC-MRM定量分析，测定免疫球蛋白G各亚型肽段面积与其对应内标肽段面积比值，将此比值带入内标曲线，得到每种亚型下各糖型免疫球蛋白G肽段摩尔浓度，即为每种亚型下各糖型糖肽摩尔浓度，见表1a.(nmol/mL)。采用反相XAqua C18(2.1*100mm，5μm)，流动相为乙腈与水。洗脱条件水相70％(v/v)等度洗脱，柱温为30℃，洗脱液流速为0.4mL/min。质谱条件为：Q-Trap 5500串联四级杆线性离子阱高性能质谱仪，配有Waters UPLC液相、AB SCIEX质谱和Analyst 1.6.1数据处理软件；离子源：Turbo Ion Spray；正离子扫描方式检测；扫描方式为多反应监测；全扫分辨率14000，最大注入时间200ms。
(7)血清中免疫球蛋白G目标糖肽定量分析：将经Trypsin酶解的血清酶解液样品均分两份：一份酶解液中添加已知浓度(Ca)的步骤3)纯化的糖肽标准品后进行HPLC-MRM定量分析；得到目标糖型糖肽添加后峰面积Aa；另一份酶解液直接进行HPLC-MRM定量分析，得到目标糖型糖肽未添加峰面积Ab，根据标准添加的峰面积和浓度的关系
计算血清中目标糖肽的浓度血清中高丰度糖肽浓度见表1b.(nmol/mL)。
实施例3
(1)血清的胰蛋白酶解：将5mg IgG/50μL血清中各加入150μL 100mM(pH＝7.8)碳酸氢铵溶液，再加入0.6M二硫苏糖醇10μL，37℃，还原90min；反应产物中加0.6M碘代乙酸20μL，30℃避光保存30min；将反应液中加入胰蛋白酶150μg，35℃酶解反应18h。酶解结束后，加入5％(v/v)甲酸终止酶解反应。
(2)IgG糖肽富集：酶解液经过反相XAqua C18(4.6*150mm，5μm)色谱柱进行糖肽富集。流动相采用乙腈与水，含0.1％(v/v)甲酸。条件为5-60分钟水相由98％(v/v)变化到70％(v/v)线性梯度进行洗脱；检测波长为254nm；柱温为35℃，洗脱液流速为1.2mL/min，收集馏分进行nano-ESI-Q-TOF质谱分析，其中5-12minL馏分为IgG1，12-16min馏分为IgG3和IgG4之和(IgG3/4)，17-25min馏分为IgG2糖肽组分。离心浓缩备用。
(3)IgG糖肽二维亲水色谱分离纯化：一维亲水分离纯化，采用亲水Mal(4.6*150mm，5μm)，流动相为乙腈与水，洗脱条件按照0-60min水相15-50％(v/v)梯度洗脱；柱温为25℃，洗脱液流速为1mL/min，收集其馏分，进行二维亲水色谱纯化，采用亲水XIon(2.1*150mm，5μm)，流动相为乙腈与水，含有0.1％(v/v)甲酸，洗脱条件0-60min按照水相10％-60％(v/v)梯度洗脱；柱温为30℃，洗脱液流速为0.2mL/min，收集其馏分。
(4)质谱表征：将步骤3)中收集的免疫球蛋白G中性糖肽单体馏分分别进行MALDI-TOF质谱定性分析，各亚型单体糖肽单体根据其糖型分别命名，F代表岩藻糖，A代表除五塘核心外的N乙酰葡糖胺，B代表平分型N乙酰葡糖胺，G代表半乳糖，FmAnBoGp，其中m、n、o、p代表糖数量取大于等于零的整数；
将步骤3)中收集的免疫球蛋白G酸性糖肽单体馏分分别进行ESI-Q-TOF质谱定性分析,S代表酸性糖(唾液酸)；
(5)IgG糖肽PNGase F去糖基化：取已知体积的步骤(3)中收集馏分进行PNGase F酶解反应。具体地，将步骤(3)中收集的免疫球蛋白G糖肽另一份通过低温离心浓缩仪在8℃条件旋干处理后，加入50mM碳酸氢铵缓冲溶液100μL，pH为7.8；加入1unit PNGase F，40℃酶解反应10h。
(6)去糖基化IgG肽段MRM定量分析：采用购买的合成的标准IgG去糖基化糖肽肽段稀释至一系列浓度，加入相同浓度内标2ppm，使标准肽段与其内标肽段比值为1：100，1：50，1：25，1：10，1：5，1：2.5，1:1，2.5：1，5：1，10：1，25：1，50:1，100：1，HPLC-MRM定量分析，建立内标曲线，曲线纵坐标为上述不同浓度的标准品峰面积与对应的内标肽段峰面积的比值，横坐标为上述标准品的浓度。，内标曲线见图1。再将加入内标的IgG糖肽PNGase F酶解液进行HPLC-MRM定量分析，测定免疫球蛋白G各亚型肽段面积与其对应内标肽段面积比值，将此比值带入内标曲线，得到每种亚型下各糖型免疫球蛋白G肽段摩尔浓度，即为每种亚型下各糖型糖肽摩尔浓度，见表1a.(nmol/mL)。采用反相XAqua C18(2.1*100mm，5μm)，流动相为流动相采用乙腈与水，含0.1％(v/v)甲酸。洗脱条件5-10分钟水相由98％(v/v)变化到10％(v/v)线性梯度进行洗脱，柱温为35℃，洗脱液流速为0.6mL/min。质谱条件为：Q-Trap 5500串联四级杆线性离子阱高性能质谱仪，配有Waters UPLC液相、AB SCIEX质谱和Analyst1.6.1数据处理软件；离子源：Turbo Ion Spray；正离子扫描方式检测；扫描方式为多反应监测；全扫分辨率14000，最大注入时间200ms。
(7)血清中免疫球蛋白G目标糖肽定量分析：将经Trypsin酶解的血清酶解液样品均分两份：一份酶解液中添加已知浓度(Ca)的步骤3)纯化的糖肽标准品后进行HPLC-MRM定量分析；得到目标糖型糖肽添加后峰面积Aa；另一份酶解液直接进行HPLC-MRM定量分析，得到目标糖型糖肽未添加峰面积Ab，根据标准添加的峰面积和浓度的关系
计算血清中目标糖肽的浓度血清中高丰度糖肽浓度见表1c.(nmol/mL)。
实施例4
(1)血清的胰蛋白酶解：将5mg IgG/50μL血清中各加入50μL 300mM(pH＝8)碳酸氢铵溶液，再加入0.55M二硫苏糖醇10μL，37℃，还原60min；反应产物中加0.45M碘代乙酸20μL，30℃避光保存40min；将反应液中加入胰蛋白酶90μg，37℃酶解反应24h。酶解结束后，加入5％(v/v)甲酸终止酶解反应。
(2)IgG糖肽富集：酶解液经过反相XAqua C18(4.6*150mm，5μm)色谱柱进行糖肽富集。流动相采用乙腈与水，含0.1％(v/v)甲酸。条件为5-60分钟水相95％(v/v)等度进行洗脱；检测波长为195nm；柱温为30℃，洗脱液流速为1.2mL/min，收集馏分进行nano-ESI-Q-TOF质谱分析，其中8-25min馏分即为IgG糖肽组分。离心浓缩备用。
(3)IgG糖肽二维亲水色谱分离纯化：一维亲水分离纯化，采用亲水Mal(4.6*150mm，5μm)，流动相为乙腈与水，含有0.1％(v/v)甲酸，洗脱条件按照0-60min水相15-50％(v/v)梯度洗脱；柱温为25℃，洗脱液流速为1mL/min，收集其馏分，进行二维亲水色谱纯化，采用亲水XIon(2.1*150mm，5μm)，流动相为乙腈与水，含有0.1％(v/v)甲酸，洗脱条件按照水相30％(v/v)等度洗脱；柱温为35℃，洗脱液流速为0.2mL/min，收集其馏分。
(4)质谱表征：将步骤3)中收集的免疫球蛋白G中性糖肽单体馏分分别进行MALDI-TOF质谱定性分析，各亚型单体糖肽单体根据其糖型分别命名，F代表岩藻糖，A代表除五塘核心外的N乙酰葡糖胺，B代表平分型N乙酰葡糖胺，G代表半乳糖，FmAnBoGp，其中m、n、o、p代表糖数量取大于等于零的整数；
将步骤3)中收集的免疫球蛋白G酸性糖肽单体馏分分别进行ESI-Q-TOF质谱定性分析,S代表酸性糖(唾液酸)；
(5)IgG糖肽PNGase F去糖基化：取已知体积的步骤(3)中收集馏分进行PNGase F酶解反应。具体地，将步骤(3)中收集的免疫球蛋白G糖肽另一份通过低温离心浓缩仪在8℃条件旋干处理后，加入100mM碳酸氢铵缓冲溶液100uL，pH为8；加入1unit PNGase F，37℃酶解反应20h。
(6)去糖基化IgG肽段MRM定量分析：采用购买的合成的标准IgG去糖基化糖肽肽段稀释至一系列浓度，加入相同浓度内标2ppm，使标准肽段与其内标肽段比值为1：100，1：50，1：25，1：10，1：5，1：2.5，1:1，2.5：1，5：1，10：1，25：1，50:1，100：1，进行标准曲线绘制，内标曲线见图1。再将加入内标的IgG糖肽PNGase F酶解液进行HPLC-MRM定量分析，测定免疫球蛋白G各亚型肽段面积与其对应内标肽段面积比值，将此比值带入内标曲线，得到每种亚型下各糖型免疫球蛋白G肽段摩尔浓度，即为每种亚型下各糖型糖肽摩尔浓度，见表1a.(nmol/mL)。采用反相XAqua C18(2.1*100mm，5μm)，流动相为流动相采用甲醇与水，含0.1％(v/v)甲酸。洗脱条件5-10分钟水相由98％(v/v)变化到10％(v/v)线性梯度进行洗脱，柱温30℃，洗脱液流速为0.4mL/min。质谱条件为：Q-Trap 5500串联四级杆线性离子阱高性能质谱仪，配有Waters UPLC液相、AB SCIEX质谱和Analyst 1.6.1数据处理软件；离子源：TurboIon Spray；正离子扫描方式检测；扫描方式为多反应监测；全扫分辨率14000，最大注入时间200ms。
(7)血清中免疫球蛋白G目标糖肽定量分析：将经Trypsin酶解的血清酶解液样品均分两份：一份酶解液中添加已知浓度(Ca)的步骤3)纯化的糖肽标准品后进行HPLC-MRM定量分析；得到目标糖型糖肽添加后峰面积Aa；另一份酶解液直接进行HPLC-MRM定量分析，得到目标糖型糖肽未添加峰面积Ab，根据标准添加的峰面积和浓度的关系
计算血清中目标糖肽的浓度。血清中高丰度糖肽浓度见表1d.(nmol/mL)。
实施例5
(1)血清的胰蛋白酶解：将5mg IgG/50μL血清中各加入50μL 400mM(pH＝8.5)碳酸氢铵溶液，再加入0.5M二硫苏糖醇10μL，37℃，还原60min；反应产物中加0.45M碘代乙酸20μL，20℃避光保存40min；将反应液中加入胰蛋白酶60μg，37℃酶解反应72h。酶解结束后，加入1％(v/v)甲酸终止酶解反应。
(2)IgG糖肽富集：酶解液经过反相XAqua C18(4.6*150mm，5μm)色谱柱进行糖肽富集。流动相采用甲醇与水，条件70％(v/v)水等梯度进行洗脱；检测波长为195nm；柱温为30℃，洗脱液流速为0.6mL/min，收集5-20min馏分即为IgG糖肽组分。离心浓缩备用。
(3)IgG糖肽二维亲水色谱分离纯化：3)IgG糖肽二维亲水色谱分离纯化：一维亲水分离纯化，采用亲水Mal(4.6*150mm，5μm)，流动相为甲醇与水，含有0.1％(v/v)甲酸，洗脱条件按照0-60min水相15-50％(v/v)梯度洗脱；柱温为25℃，洗脱液流速为1mL/min，收集其馏分，进行二维亲水色谱纯化，采用亲水XIon(2.1*150mm，5μm)，流动相为甲醇与水，含有0.1％(v/v)甲酸，洗脱条件按照水相30％(v/v)等度洗脱；柱温为35℃，洗脱液流速为0.2mL/min，收集其馏分。
(4)质谱表征：将步骤3)中收集的免疫球蛋白G中性糖肽单体馏分分别进行MALDI-TOF质谱定性分析，各亚型单体糖肽单体根据其糖型分别命名，F代表岩藻糖，A代表除五塘核心外的N乙酰葡糖胺，B代表平分型N乙酰葡糖胺，G代表半乳糖，FmAnBoGp，其中m、n、o、p代表糖数量取大于等于零的整数；
将步骤3)中收集的免疫球蛋白G酸性糖肽单体馏分分别进行ESI-Q-TOF质谱定性分析,S代表酸性糖(唾液酸)；
(5)IgG糖肽PNGase F去糖基化：取已知体积的步骤(3)中收集馏分进行PNGase F酶解反应。具体地，将步骤(2)中收集的免疫球蛋白G糖肽另一份通过低温离心浓缩仪在8℃条件旋干处理后，加入200mM碳酸氢铵缓冲溶液100μL，pH为8；加入0.5unit PNGase F，37℃酶解反应36h。
(6)去糖基化IgG肽段MRM定量分析：采用购买的合成的标准IgG去糖基化糖肽肽段稀释至一系列浓度，加入相同体积，浓度2ppm内标肽段，使标准肽段与其内标肽段比值为1：100，1：50，1：25，1：10，1：5，1：2.5，1:1，2.5：1，5：1，10：1，25：1，50:1，100：1，HPLC-MRM定量分析，建立内标曲线，曲线纵坐标为上述不同浓度的标准品峰面积与对应的内标肽段峰面积的比值，横坐标为上述标准品的浓度。内标曲线见图1。再将加入内标的IgG糖肽PNGase F酶解液进行HPLC-MRM定量分析，测定免疫球蛋白G各亚型肽段面积与其对应内标肽段面积比值，将此比值带入内标曲线，得到每种亚型下各糖型免疫球蛋白G肽段摩尔浓度，即为每种亚型下各糖型糖肽摩尔浓度，见表1a.(nmol/mL)。采用反相XAqua C18(2.1*100mm，5μm)，流动相为甲醇与水。洗脱条件水50％(v/v)等度洗脱，柱温为30℃，洗脱液流速为0.2mL/min。质谱条件为：Q-Trap 5500串联四级杆线性离子阱高性能质谱仪，配有Waters UPLC液相、AB SCIEX质谱和Analyst 1.6.1数据处理软件；离子源：Turbo Ion Spray；正离子扫描方式检测；扫描方式为多反应监测；全扫分辨率14000，最大注入时间200ms。
(7)血清中免疫球蛋白G目标糖肽定量分析：将经Trypsin酶解的血清酶解液样品均分两份：一份酶解液中添加已知浓度(Ca)的步骤3)纯化的糖肽标准品后进行HPLC-MRM定量分析；得到目标糖型糖肽添加后峰面积Aa；另一份酶解液直接进行HPLC-MRM定量分析，得到目标糖型糖肽未添加峰面积Ab，根据标准添加的峰面积和浓度的关系
计算血清中目标糖肽的浓度。血清中高丰度糖肽浓度见表1e.(nmol/mL)。
实施例6
(1)血清的胰蛋白酶解：将5mg IgG/50μL血清中各加入150μL 300mM(pH＝8)碳酸氢铵溶液，再加入0.4M二硫苏糖醇10μL，37℃，还原120min；反应产物中加0.5M碘代乙酸20μL，25℃避光保存40min；将反应液中加入胰蛋白酶75μg，37℃酶解反应36h。酶解结束后，加入3％(v/v)甲酸终止酶解反应。
(2)IgG糖肽富集：酶解液经过反相XAqua C18(4.6*150mm，5μm)色谱柱进行糖肽富集。流动相采用乙腈与水，条件为5-60分钟水95％(v/v)等梯度进行洗脱；检测波长为280nm；柱温为30℃，洗脱液流速为1mL/min，收集5-20min馏分即为IgG糖肽组分。离心浓缩备用。
(3)IgG糖肽二维亲水色谱分离纯化：一维亲水分离纯化，采用亲水Mal(4.6*150mm，5μm)，流动相为甲醇与水，含有0.1％(v/v)甲酸，洗脱条件按照水相25％(v/v)等度洗脱；柱温为25℃，洗脱液流速为1mL/min，收集其馏分，进行二维亲水色谱纯化，采用亲水XIon(2.1*150mm，5μm)，流动相为乙腈与水，含有0.1％(v/v)甲酸，洗脱条件按照水相10％-60％(v/v)等度洗脱；柱温为35℃，洗脱液流速为0.2mL/min，收集其馏分。
(4)质谱表征：将步骤3)中收集的免疫球蛋白G中性糖肽单体馏分分别进行MALDI-TOF质谱定性分析，各亚型单体糖肽单体根据其糖型分别命名，F代表岩藻糖，A代表除五塘核心外的N乙酰葡糖胺，B代表平分型N乙酰葡糖胺，G代表半乳糖，FmAnBoGp，其中m、n、o、p代表糖数量取大于等于零的整数；
将步骤3)中收集的免疫球蛋白G酸性糖肽单体馏分分别进行ESI-Q-TOF质谱定性分析,S代表酸性糖(唾液酸)；
(5)IgG糖肽PNGase F去糖基化：取已知体积的步骤(3)中收集馏分进行PNGase F酶解反应。具体地，将步骤(3)中收集的免疫球蛋白G糖肽另一份通过低温离心浓缩仪在8℃条件旋干处理后，加入100mM碳酸氢铵缓冲溶液100uL，pH为8；加入1unit PNGase F，37℃酶解反应20h。
(6)去糖基化IgG肽段MRM定量分析：采用购买的合成的标准IgG去糖基化糖肽肽段稀释至一系列浓度，加入相同浓度内标2ppm，使标准肽段与其内标肽段比值为1：100，1：50，1：25，1：10，1：5，1：2.5，1:1，2.5：1，5：1，10：1，25：1，50:1，100：1，进行标准曲线绘制，内标曲线见图1。再将加入内标的IgG糖肽PNGase F酶解液进行HPLC-MRM定量分析，测定免疫球蛋白G各亚型肽段面积与其对应内标肽段面积比值，将此比值带入内标曲线，得到每种亚型下各糖型免疫球蛋白G肽段摩尔浓度，即为每种亚型下各糖型糖肽摩尔浓度，见表1a.(nmol/mL)。采用反相C18(2.1*100mm，5μm)，流动相为流动相采用甲醇与水，含0.1％(v/v)甲酸。洗脱条件5-10分钟水相由98％(v/v)变化到10％(v/v)线性梯度进行洗脱，柱温30℃，洗脱液流速为0.4mL/min。质谱条件为：Q-Trap 5500串联四级杆线性离子阱高性能质谱仪，配有Waters UPLC液相、AB SCIEX质谱和Analyst 1.6.1数据处理软件；离子源：Turbo IonSpray；正离子扫描方式检测；扫描方式为多反应监测；全扫分辨率14000，最大注入时间200ms。
(7)血清中免疫球蛋白G目标糖肽定量分析：将经Trypsin酶解的血清酶解液样品均分两份：一份酶解液中添加已知浓度(Ca)的步骤3)纯化的糖肽标准品后进行HPLC-MRM定量分析；得到目标糖型糖肽添加后峰面积Aa；另一份酶解液直接进行HPLC-MRM定量分析，得到目标糖型糖肽未添加峰面积Ab，根据标准添加的峰面积和浓度的关系
计算血清中目标糖肽的浓度。血清中高丰度糖肽浓度见表1f.(nmol/mL)。
表1.IgG1&2糖肽Profiling分析及定量分析
Claims (10)
1.血清中免疫球蛋白G糖肽绝对定量方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）IgG标准品酶解：用缓冲溶液将血清稀释，然后加入二硫苏糖醇进行二硫键还原，反应产物中加入碘代乙酸，得到反应液，将反应液中加入胰蛋白酶进行酶解反应；
2）免疫球蛋白G糖肽富集：酶解液进行反相色谱富集，经nano-ESI-Q-TOF分析，洗脱得到免疫球蛋白G各亚型糖肽组分IgG1、IgG2、IgG3/4 ；
3）免疫球蛋白G各亚型糖肽组分分别进行二维亲水色谱分离纯化：将步骤2）中收集的免疫球蛋白G各亚型糖肽组分分别进行二维亲水色谱分离纯化，收集二维纯化馏分为免疫球蛋白G中性糖肽单体馏分；
4）质谱表征：将步骤3）中收集的免疫球蛋白G中性糖肽单体馏分分别进行MALDI-TOF质谱定性分析，各亚型单体糖肽单体根据其糖型分别命名；将步骤3）中收集的免疫球蛋白G酸性糖肽单体馏分分别进行ESI-Q-TOF质谱定性分析,S代表酸性糖；
5）糖链释放：取已知体积步骤3）中收集的免疫球蛋白G各亚型糖肽单体分别进行PNGase F去糖基化反应，从而得到去糖基化的免疫球蛋白G肽段酶解液；
6）去糖基化免疫球蛋白G糖肽肽段定量分析：将步骤5）中免疫球蛋白G糖肽的PNGase F酶解液进行HPLC-MRM定量分析；具体地，先建立免疫球蛋白G亚型的内标曲线；
采用所述免疫球蛋白G各亚型糖肽对应肽段标准品，稀释成至少5个不同浓度，浓度范围为20 ppb-200 ppm，每个浓度的标准品均加入2 ppm与各标准品等体积的与亚型对应的内标肽段，所述内标肽段与标准品的区别在于内标肽段在液相分离条件下具有与标准品相似保留行为；随后进行HPLC-MRM定量分析，建立与上述亚型对应的内标曲线，曲线纵坐标为上述不同浓度的标准品峰面积与对应的内标肽段峰面积的比值，横坐标为上述标准品的摩尔浓度；
而后，将步骤5）IgG各亚型糖肽酶解液中加入与该酶解液等体积的2 ppm所述IgG各亚型糖肽对应内标肽段，进行HPLC-MRM定量分析，测定免疫球蛋白G各亚型糖肽肽段峰面积与对应的内标肽段峰面积的比值，将此比值带入内标曲线，得到各亚型每种糖肽肽段摩尔浓度，即为每种纯化糖肽单体的摩尔浓度；
7）血清中免疫球蛋白G目标糖肽根据标准添加法定量分析：将血清样品进行Trypsin酶解，将酶解液均分两份：一份酶解液中添加已知浓度的步骤3）纯化的糖肽标准品Ca后进行HPLC-MRM定量分析，得到目标糖型糖肽添加后峰面积Aa；另一份酶解液直接进行HPLC-MRMIgG糖肽定量分析，得到目标糖型糖肽未添加峰面积Ab，根据标准添加的峰面积和浓度的关系，见下公式，计算血清中目标糖型糖肽摩尔浓度Ci；
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于：步骤1）将血清稀释并加入二硫苏糖醇进行二硫键还原反应，反应温度在37-90℃之间，反应时间在50-180 min；加入碘代乙酸反应温度在20-30℃之间，反应时间在30-60 min；加入胰蛋白酶后反应温度在35-40℃之间，反应时间在18-72 h；
步骤1）血清酶解稀释所使用的缓冲溶液为碳酸氢铵缓冲溶液，稀释所用缓冲液浓度在50-400 mM，pH为7-8，加入原溶液体积的1-3倍体积的缓冲溶液；加入二硫苏糖醇的浓度在0.3-0.6M，血清总蛋白与二硫苏糖醇的质量比例为7:1-3:1；加入碘代乙酸的浓度在0.3-0.6 M，血清总蛋白与碘代乙酸的质量比为5.5:1-2.7:1；加入胰蛋白酶和血清总蛋白的质量比为1:50-1:20；酶解后，加入1%-5%（v/v）甲酸终止酶解反应；
步骤2）富集所用色谱柱为XAqua C18色谱柱；所用色谱柱键合材料的粒径为5-10 μm，采用4.6*150mm色谱柱，流动相为甲醇与水或乙腈与水，两相中均含有或不含有0.1%（v/v）甲酸；洗脱条件按照水相95-70%（v/v）等度或5-60分钟水相由98%（v/v）变化到70%（v/v）线性梯度进行；使用紫外检测器，检测波长为190-280 nm；柱温为25-35℃，洗脱液流速为0.6-1.2 mL/min，收集保留时间为5-15 min的组分；
步骤2）免疫球蛋白G糖肽富集时采用最佳流动相为乙腈和水，两相中均含或不含0.1%（v/v）甲酸，等度洗脱，水在流动相中的比例为98-80%（v/v）；
步骤2）免疫球蛋白G富集到的糖肽馏分采用nano-ESI-Q-TOF-MS直接进样检测，正离子模式，喷雾电压2.5kV，扫描范围500-2000，流速1μL /min，进样5μL。
3.根据权利要求1所述方法，其特征在于：步骤3）一维分离纯化采用硅胶基质键合材料为色谱柱填料Mal，此材料为极性共聚亲水填料；所用色谱柱基质键合材料的粒径为5-10 μm，采用4.6*150mm色谱柱，流动相为甲醇与水或乙腈与水混合，两相中均含有或不含有0.1%（v/v）甲酸；洗脱条件按照水相15-50%（v/v）等度或5-60分钟水相由10%（v/v）变化到60%（v/v）线性梯度进行；柱温为25-35℃，洗脱液流速为0.7-1 mL/min；二维分离纯化条件为：采用硅胶基质键合材料为色谱柱填料XIon，此材料为极性共聚亲水填料；所用色谱柱基质键合材料的粒径为5-10μm，采用2.1*150mm色谱柱，流动相为甲醇与水或乙腈与水混合，两相中均含有或不含有0.1%（v/v）甲酸；洗脱条件按照水相15-50%（v/v）等度或5-60分钟水相由10%（v/v）变化到60%（v/v）线性梯度进行；柱温为25-35℃，洗脱液流速为0.2 mL/min；
在步骤4）中，将步骤3）中收集的IgG糖肽馏分进行MALDI-TOF质谱表征，采用正离子模式，反射模式进行表征分析。
4.根据权利要求1所述方法，其特征在于：在步骤5）中，取出已知体积的步骤3）中收集的免疫球蛋白G糖肽单体先经低温离心浓缩仪在8℃旋干处理后，进行PNGase F酶解反应，糖链释放使用碳酸氢铵缓冲溶液，体积50-200 μL，浓度为50-200 mM， pH为7-9；酶解反应温度为35-40℃；反应时间为10-36小时；加入PNGase F的量为每1-10 mg免疫球蛋白糖肽加入1 unit酶量。
5.根据权利要求1所述方法，其特征在于：步骤6）HPLC-MRM定量分析液相部分以硅胶基质键合材料为色谱柱填料XAqua C18，此材料为反相填料；所用色谱柱基质键合材料的粒径为5-10 μm，采用2.1*100 mm色谱柱，流动相为甲醇与水或乙腈与水，两相中均含有或不含有0.1%（v/v）甲酸；洗脱条件按照水相85-50%（v/v）等度或5-10分钟水相由98%（v/v）变化到10%（v/v）线性梯度进行；柱温为25-35℃，洗脱液流速为0.2-0.6 mL/min；质谱条件为：Q-Trap 5000串联四级杆线性离子阱高性能质谱仪，配有Waters UPLC液相、AB SCIEX 质谱和Analyst 1.6.1数据处理软件；离子源：Turbo Ion Spray；正离子扫描方式检测；扫描方式为多反应监测；全扫分辨率14000，最大注入时间200ms。
6.根据权利要求1所述方法，其特征在于：步骤6）中所述内标肽段为：IgG1内标肽段氨基酸序列为EEQYESTYR，
IgG2内标肽段氨基酸序列为EEQFESTFR，
IgG3和IgG4内标肽段氨基酸序列为EEQYESTFR；
所述免疫球蛋白G亚型中糖肽的对应肽段的标准品为：
IgG1为EEQYDSTYR，
IgG2为EEQFDSTFR，
IgG3为EEQYDSTFR，
IgG4为EEQFDSTYR。
7.根据权利要求1所述方法，其特征在于：步骤7）将血清稀释并加入二硫苏糖醇进行二硫键还原反应，反应温度在37-90℃之间，反应时间在50-180 min；加入碘代乙酸反应温度在20-30℃之间，反应时间在30-60 min；加入胰蛋白酶后反应温度在35-40℃之间，反应时间在18-72 h；
步骤7）血清酶解稀释所使用的缓冲溶液为碳酸氢铵缓冲溶液，稀释所用缓冲液浓度在50-400 mM，pH为7-8，加入原溶液体积的1-3倍体积的缓冲溶液；加入二硫苏糖醇的浓度在0.3-0.6M，血清总蛋白与二硫苏糖醇的质量比例为7:1-3:1；加入碘代乙酸的浓度在0.3-0.6 M，血清总蛋白与碘代乙酸的质量比为5.5:1-2.7:1；加入胰蛋白酶和血清总蛋白的质量比为1:50-1:20；酶解后，加入1%-5%（v/v）甲酸终止酶解反应。
8.根据权利要求1所述方法，其特征在于：步骤7）HPLC-MRM定量分析液相部分以硅胶基质键合材料为色谱柱填料XAqua C18，此材料为反相填料；所用色谱柱基质键合材料的粒径为5-10 μm，采用2.1*100mm色谱柱流动相为甲醇与水或乙腈与水，两相中均含有或不含有0.1%（v/v）甲酸；洗脱条件按照水相85-50%（v/v）等度或5-10分钟水相由98%（v/v）变化到10%（v/v）线性梯度进行；柱温为25-35℃，洗脱液流速为0.2-0.6 mL/min；质谱条件为：Q-Trap 5500串联四级杆线性离子阱高性能质谱仪，配有Waters UPLC液相、AB SCIEX 质谱和Analyst 1.6.1数据处理软件；离子源：Turbo Ion Spray；正离子扫描方式检测；扫描方式为多反应监测；全扫分辨率14000，最大注入时间200ms。
9.按照权利要求1所述方法，其特征在于，可以对IgG1、IgG2或IgG3和IgG4之和IgG3/4的一种或两种以上中的亚型糖肽进行绝对定量。
10.使用权利要求1-9任意一种方法定量测定实际人血液样品免疫球蛋白G糖肽的应用，其特征在于能够定量测出血清中免疫球蛋白G高丰度糖肽的含量，浓度0.1pmol/mL-10nmol/mL。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201711293842.0A CN109900815B (zh) | 2017-12-08 | 2017-12-08 | 血清中IgG糖肽的绝对定量分析 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201711293842.0A CN109900815B (zh) | 2017-12-08 | 2017-12-08 | 血清中IgG糖肽的绝对定量分析 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN109900815A CN109900815A (zh) | 2019-06-18 |
| CN109900815B true CN109900815B (zh) | 2021-06-29 |
Family
ID=66940292
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201711293842.0A Active CN109900815B (zh) | 2017-12-08 | 2017-12-08 | 血清中IgG糖肽的绝对定量分析 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN109900815B (zh) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110632194A (zh) * | 2019-08-27 | 2019-12-31 | 郑州科技学院 | 一种反相液相色谱混标加样法测定食品中阿斯巴甜和阿力甜的方法 |
| CN110346485A (zh) * | 2019-08-27 | 2019-10-18 | 郑州科技学院 | 一种反相液相色谱混标加样增量法测定食品中阿斯巴甜和阿力甜的方法 |
| CN110632229A (zh) * | 2019-09-24 | 2019-12-31 | 华兰生物工程重庆有限公司 | 高效液相色谱仪检测静注人免疫球蛋白(pH4)蛋白质含量的方法 |
| CN112326773B (zh) * | 2020-10-16 | 2024-01-12 | 华中科技大学鄂州工业技术研究院 | 一种高通量分析IgG糖肽的方法 |
| CN113687002A (zh) * | 2021-09-15 | 2021-11-23 | 谱天（天津）生物科技有限公司 | 一种排除样本异质性及高丰度干扰能力的质控方法 |
Citations (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102483420A (zh) * | 2009-05-29 | 2012-05-30 | 生物梅里埃公司 | 通过质谱对蛋白质进行定量的新方法 |
| WO2012079978A1 (en) * | 2010-12-13 | 2012-06-21 | Universite De Liege | Biomarkers, uses of biomarkers and a method of identifying biomarkers for colorectal carcinoma (crc) liver metastasis |
| CN102687020A (zh) * | 2009-10-09 | 2012-09-19 | 西福根有限公司 | 利用特征肽和质谱对混合物中的单个重组蛋白进行多重定量 |
| WO2013021057A4 (en) * | 2011-08-11 | 2013-08-01 | Institut De Recherche Pour Le Développement (Ird) | Method of neonatal serological diagnosis |
| JP2014501388A (ja) * | 2010-12-24 | 2014-01-20 | マップ ダイアグノースティックス ピーティーワイ エルティーディー | 選択反応モニタリング（ｓｒｍ）による癌および他の病理学的実体のタンパク質プロファイル |
| CN103890174A (zh) * | 2011-08-24 | 2014-06-25 | 大塚化学株式会社 | IgG结合性肽及利用其检测和纯化IgG的方法 |
| CN105755073A (zh) * | 2014-12-15 | 2016-07-13 | 中国科学院大连化学物理研究所 | 从卵清蛋白中制备n-连接聚糖的高效分离制备及聚糖 |
| CN106399432A (zh) * | 2015-07-31 | 2017-02-15 | 中国科学院大连化学物理研究所 | 一种从单克隆抗体中制备n-连接糖肽的方法及n-连接糖肽 |
| CN106442833A (zh) * | 2016-08-30 | 2017-02-22 | 广西医科大学 | 一种非同位素标记肽段加入法结合mrm的蛋白质定量方法 |
| CN106483294A (zh) * | 2015-08-27 | 2017-03-08 | 中国科学院大连化学物理研究所 | 一种选择性富集和鉴定n-连接糖肽的方法 |
| CN106526026A (zh) * | 2016-11-10 | 2017-03-22 | 广州博厚医疗技术有限公司 | 血清中25‑羟基维生素d的检测方法 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20140038203A1 (en) * | 2012-07-09 | 2014-02-06 | Musc Foundation For Research Development | Methods for detecting or predicting kidney disease |
| US9618524B2 (en) * | 2014-03-26 | 2017-04-11 | Plaxgen Inc. | Method, composition, isolation and identification of a plaque particle and related biomarker |
-
2017
- 2017-12-08 CN CN201711293842.0A patent/CN109900815B/zh active Active
Patent Citations (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102483420A (zh) * | 2009-05-29 | 2012-05-30 | 生物梅里埃公司 | 通过质谱对蛋白质进行定量的新方法 |
| CN102687020A (zh) * | 2009-10-09 | 2012-09-19 | 西福根有限公司 | 利用特征肽和质谱对混合物中的单个重组蛋白进行多重定量 |
| WO2012079978A1 (en) * | 2010-12-13 | 2012-06-21 | Universite De Liege | Biomarkers, uses of biomarkers and a method of identifying biomarkers for colorectal carcinoma (crc) liver metastasis |
| JP2014501388A (ja) * | 2010-12-24 | 2014-01-20 | マップ ダイアグノースティックス ピーティーワイ エルティーディー | 選択反応モニタリング（ｓｒｍ）による癌および他の病理学的実体のタンパク質プロファイル |
| WO2013021057A4 (en) * | 2011-08-11 | 2013-08-01 | Institut De Recherche Pour Le Développement (Ird) | Method of neonatal serological diagnosis |
| CN103890174A (zh) * | 2011-08-24 | 2014-06-25 | 大塚化学株式会社 | IgG结合性肽及利用其检测和纯化IgG的方法 |
| CN105755073A (zh) * | 2014-12-15 | 2016-07-13 | 中国科学院大连化学物理研究所 | 从卵清蛋白中制备n-连接聚糖的高效分离制备及聚糖 |
| CN106399432A (zh) * | 2015-07-31 | 2017-02-15 | 中国科学院大连化学物理研究所 | 一种从单克隆抗体中制备n-连接糖肽的方法及n-连接糖肽 |
| CN106483294A (zh) * | 2015-08-27 | 2017-03-08 | 中国科学院大连化学物理研究所 | 一种选择性富集和鉴定n-连接糖肽的方法 |
| CN106442833A (zh) * | 2016-08-30 | 2017-02-22 | 广西医科大学 | 一种非同位素标记肽段加入法结合mrm的蛋白质定量方法 |
| CN106526026A (zh) * | 2016-11-10 | 2017-03-22 | 广州博厚医疗技术有限公司 | 血清中25‑羟基维生素d的检测方法 |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| A novel HPLC–UV–MS method for quantitative analysis of protein glycosylation;Anton S.Karnoup等;《Journal of Chromatography B》;20071115;第859卷(第2期);第178-191页 * |
| Quantitation of Site-Specific Glycosylation in Manufactured Recombinant Monoclonal Antibody Drugs;Nan Yang等;《Analytical Chemistry》;20160616;第88卷;第7091-7100页 * |
| Quantitative analysis of immunoglobulin subclasses and subclass specific glycosylation by LC–MS–MRM in liver disease;Wei Yuan等;《JOURNAL OF PROTEOMICS》;20150226;第116卷;第24-33页 * |
| 液相色谱法测定大鼠血清中lgG的研究;杨旭等;《实验动物科学》;20100228;第27卷(第1期);第64-67页 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN109900815A (zh) | 2019-06-18 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN109900815B (zh) | 血清中IgG糖肽的绝对定量分析 | |
| de Haan et al. | Monitoring of immunoglobulin N-and O-glycosylation in health and disease | |
| Huhn et al. | IgG glycosylation analysis | |
| Largy et al. | Orthogonal liquid chromatography–mass spectrometry methods for the comprehensive characterization of therapeutic glycoproteins, from released glycans to intact protein level | |
| Planinc et al. | Glycan characterization of biopharmaceuticals: updates and perspectives | |
| Wuhrer et al. | Protein glycosylation analysis by liquid chromatography–mass spectrometry | |
| Aizpurua-Olaizola et al. | Mass spectrometry for glycan biomarker discovery | |
| Franc et al. | Elucidating heterogeneity of IgA1 hinge-region O-glycosylation by use of MALDI-TOF/TOF mass spectrometry: role of cysteine alkylation during sample processing | |
| Reusch et al. | High-throughput work flow for IgG Fc-glycosylation analysis of biotechnological samples | |
| Sinha et al. | Comparison of LC and LC/MS methods for quantifying N-glycosylation in recombinant IgGs | |
| AU2008213716A1 (en) | Affinity selected signature peptides for protein identification and quantification | |
| JP2013507603A (ja) | 署名ペプチドおよび質量分析による混合物中の個々の組換えタンパク質の多重定量化 | |
| M Wooding et al. | Characterization of pharmaceutical IgG and biosimilars using miniaturized platforms and LC-MS/MS | |
| CN109541115B (zh) | 唾液酸化糖链同分异构体的高分辨顺序分离和准确定量分析方法 | |
| Szabo et al. | In-depth analyses of native N-linked glycans facilitated by high-performance anion exchange chromatography-pulsed amperometric detection coupled to mass spectrometry | |
| Todoroki et al. | Current mass spectrometric tools for the bioanalyses of therapeutic monoclonal antibodies and antibody-drug conjugates | |
| Xiao et al. | Mass spectrometry-based qualitative and quantitative N-glycomics: An update of 2017–2018 | |
| US11959897B2 (en) | High confidence compound identification by liquid chromatography-mass spectrometry | |
| JP2008309501A (ja) | 糖鎖の解析方法 | |
| Molnarova et al. | Liquid chromatography and capillary electrophoresis in glycomic and glycoproteomic analysis | |
| Cao et al. | Absolute quantitation of high abundant Fc-glycopeptides from human serum IgG-1 | |
| Klapoetke et al. | Glycosylation characterization of human IgA1 with differential deglycosylation by UPLC–ESI TOF MS | |
| CN108956789A (zh) | 一种血清中免疫球蛋白g糖肽的绝对定量分析方法 | |
| Liu et al. | Mass spectrometry-based analysis of IgG glycosylation and its applications | |
| Wang et al. | Glycan reductive amino acid coded affinity tagging (GRACAT) for highly specific analysis of N-glycome by mass spectrometry |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |