CN108956789A - 一种血清中免疫球蛋白g糖肽的绝对定量分析方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种绝对定量血清中免疫球蛋白G(IgG)糖肽的定量方法。工艺过程包括血清中IgG糖肽的释放，色谱法对IgG糖肽的富集。将收集到的IgG糖肽分成二份，一份进行IgG糖肽中各种糖型Profiling分析；另一份IgG糖肽进行PNGase F酶解，对去糖基化的IgG肽段进行MRM定量分析；结合Profiling结果计算IgG各种糖型对应糖肽含量。本发明方法可以测量血清中IgG各亚型上每种糖肽的摩尔浓度，方法灵敏度高，精密度好，准确率高，回收率高，可操作性好，适合血清中IgG糖肽高通量绝对定量研究。

Description

一种血清中免疫球蛋白G糖肽的绝对定量分析方法
技术领域
本发明涉及定量人血清中免疫球蛋白G糖肽的质谱绝对定量方法开发，属于蛋白质组学的技术领域。
背景技术
免疫球蛋白(Immunoglobulin，Ig)是一类可溶性血清糖蛋白，具有抗体活性。根据重链性质差异可分为五种，包括IgG，IgM，IgA，IgE和IgD。其中，IgG是血清主要的抗体成分，约占血清免疫球蛋白总量的75％。IgG包含四种亚型：IgG1～4其IgG1占60～70％，IgG2占15～20％，IgG3占5～10％，IgG4占1～7％(Mathiesen T,Hammarstrom L,Fridell E,etal.Aberrant IgG subclass distribution to measles in healthy seropositiveindividuals,in patients with SSPE and in immunoglobulin-deficient patients[J].Clin Exp Immunol,1990,80(2):202-5)。IgG由Fc(结晶段)和Fab(抗原结合段)组成，均含有保守的N-糖基化修饰。研究表明，IgG N-糖基化修饰与许多疾病(如：癌症、类风湿性关节炎和炎症性疾病)的发生发展有关。此外，一类以IgG结构为基础的大分子糖蛋白药物(单克隆抗体药物)，为癌症、自身免疫疾病以及病毒感染等的治疗提供了全新的途径，其糖基化修饰类型及水平对其稳定性、清除效率、免疫原性、抗体依赖细胞毒性及补体依赖细胞毒性等都有一定的作用(Beck A,Wagner-Rousset E,Ayoub D,et al.Characterizationof therapeutic antibodies and related products[J].Anal Chem,2013,85(2):715-736)。由此可见，对IgG糖基化修饰的定性、定量研究对疾病的监测诊断有重要意义，同时对治疗性抗体的生产控制提供新思路。
目前，对于IgG糖基化水平定量分析主要在糖链水平和糖肽水平。糖链水平定量策略是：糖链的释放、荧光标记、分离分析，常用定量分析方法是UPLC-FLR(超高效液相-荧光检测)、HPAEC-PAD(高效阴离子色谱-脉冲检测)和CGE-LIF(毛细管凝胶电泳-激光诱导荧光检测)。其中CGE-LIF缺点是对未知糖链无法定量，需进一步质谱分析未知糖链，质谱鉴定过程需要对糖链进行特定衍生化，此法步骤繁琐；HPAEC-PAD克服上述缺点，但灵敏度和选择性较LC低。基于以上原因，LC-MS(如Q-TOF,IT或Orbitrap)方法被广泛应用于糖链定量研究中。上述方法需对糖链先进行释放，因此对糖链来源及位点信息并不明确，此外标记步骤繁琐，未能达到临床及药物分析发展需要。为解决上述问题，发展糖肽水平定量分析常用方法是LC-ESI-MS(电喷雾质谱)和MALDI-TOF-MS(基质辅助激光解离质谱)。其中MRM技术被认为是分析复杂样品中低丰度化合物最可靠且最有潜力的定量方法。可以在三重四级杆质谱上实现，第一个和第三个四级杆让预先选定的母离子和子离子分别通过，第二个四级杆为碰撞池，因此它具有很高选择性。此外，MRM这种非扫描模式还有很高的灵敏度以及很宽的线性范围，这些特性使得MRM更适合定量分析复杂体系的低丰度化合物。优点是稳定好、分析时间短、灵敏度高、特异性好。此方法缺点在于需要预先知道母离子及其在高能诱导解离信息。由于糖肽标准品缺乏，常用氧鎓离子(荷质比为244、366和292等)作为碎片离子来构建糖肽定量离子对。
Hong等(Hong Q,Lebrilla C B,Miyamoto S,et al.Anal Chem 2013，85(18)：8585-8593)建立了一种利用MRM对IgG及其N-糖肽水平进行绝对定量的方法。该方法中IgG检测下限为60amol，线性范围达3个数量级。同时，不经过任何富集直接对血清中26种高丰度N-糖肽进行糖基化水平定量测定。实现了对IgG及N-糖肽的同时测定。此方法已被应用于其他免疫球蛋白亚型、单克隆抗体及其糖基化水平定量分析。Yang等(Yang N,Goonatilleke E,Park D,et al.Anal Chem 2016，88(14)：7091-7100)通过MRM方法对6种单抗药物的糖基化修饰进行了定量研究，在Hong基础上考察了单抗药物糖基化修饰的位点占有率。与代谢组学和蛋白组学标准化定量研究相比，MRM技术在糖组学的定量研究还处于初级阶段，虽然上述案例说明MRM技术在其临床应用具有潜力，但是由于缺乏可用的N-糖链标准品，MRM技术在监测诊断和治疗性抗体的生产优化方面的应用仍然受限。
因此，急需建立一种灵敏度高，稳定性好，操作性高的血清样品IgG糖肽绝对定量方法。本研究为了克服N-糖链标准品缺乏的问题，采用MRM方法进行IgG糖肽Profiling分析和去糖基化IgG肽段绝对定量分析。具体方法：一方面合成肽段标准品(去糖基化IgG肽段)用来制作标准曲线进行总糖肽摩尔浓度测定，另一方面通过各糖型糖肽归一化到与其总糖肽信号强度进行Profiling分析，进而计算各糖肽绝对摩尔浓度。本发明可以实现血清中IgG糖肽精确定量，方法灵敏度高，重现性好，可操作性强等特点，对IgG糖基化定量分析在临床检测和单抗药物的生产发展提供新思路。
发明内容
本发明开发了一种利用MRM模式绝对定量血清中IgG糖肽的方法。所采用的的技术路线为：
可同时绝对定量IgG1、IgG2或IgG3和IgG4之和(IgG3/4)的一种或两种以上；
血清中免疫球蛋白G糖肽绝对定量方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)血清酶解：用缓冲溶液将血清稀释，然后加入二硫苏糖醇进行二硫键还原，反应产物中加入碘代乙酸，得到反应液，将反应液中加入胰蛋白酶进行酶解反应；
2)免疫球蛋白G糖肽富集：酶解液进行一维色谱富集，经nano-ESI-Q-TOF分析，洗脱得到免疫球蛋白G糖肽组分；将收集的免疫球蛋白G糖肽分成两份；
3)免疫球蛋白G糖肽Profiling分析：将步骤2)中收集的免疫球蛋白G糖肽中的一份进行HPLC-MRM分析：将免疫球蛋白G亚型中各糖肽峰面积归一化到与其对应亚型总糖肽峰面积之和，即可得到免疫球蛋白G亚型中各糖肽占该亚型总糖肽的百分比；
4)糖链释放：将步骤2)中收集的免疫球蛋白G糖肽另一份进行PNGase F酶解反应，从而得到去糖基化的免疫球蛋白G肽段酶解液；
5)去糖基化免疫球蛋白G肽段HPLC-MRM定量分析：将步骤4)中免疫球蛋白G糖肽的PNGase F酶解液进行HPLC-MRM定量分析；具体地，先建立免疫球蛋白G亚型的内标曲线；
采用所述免疫球蛋白G亚型的一种或两种以上亚型，在上述一种或两种以上亚型中选取各亚型中的任一糖肽对应肽段作为标准品，即1～4个标准品，一起稀释成至少5个不同浓度，浓度范围为20ppb-200ppm，每个浓度的标准品均加入1ppm～4ppm与各标准品等体积的与亚型对应的内标肽段，所述内标肽段与标准品的区别在于内标肽段在上述液相分离条件下具有与标准品相似保留行为；而后进行HPLC-MRM定量分析，建立与上述亚型对应的内标曲线，曲线纵坐标为上述不同浓度的标准品峰面积与对应的内标肽段峰面积的比值，横坐标为上述标准品的摩尔浓度；
而后，将步骤4)酶解液中加入与该酶解液等体积的1ppm～4ppm所述内标肽段，进行HPLC-MRM定量分析，测定步骤4)酶解液中免疫球蛋白G亚型中与标准品对应的肽段峰面积与对应的内标肽段峰面积的比值，将此比值带入内标曲线，得到该亚型总肽段摩尔浓度，即为该免疫球蛋白G亚型总糖肽的摩尔浓度；
6)免疫球蛋白G亚型中每种糖肽浓度计算：将步骤3)中得到的免疫球蛋白G亚型中各糖肽占亚型总糖肽的百分比，与步骤5)中得到的免疫球蛋白G亚型总糖肽的摩尔浓度的乘积，即为一种或两种以上免疫球蛋白G亚型中的各糖肽的摩尔浓度。
所述步骤1)将血清稀释并加入二硫苏糖醇进行二硫键还原反应，反应温度在37-90℃之间，反应时间在50-180min；加入碘代乙酸反应温度在20-30℃之间，反应时间在30-60min；加入胰蛋白酶后反应温度在35-40℃之间，反应时间在18-72h。
步骤1)血清酶解稀释所使用的缓冲溶液为碳酸氢铵缓冲溶液，稀释所用缓冲液浓度在50-400mM，pH为7-8，加入原溶液体积的1-3倍体积的缓冲溶液；加入二硫苏糖醇的浓度在0.3-0.6M，血清总蛋白与二硫苏糖醇的质量比例为7:1-3:1；加入碘代乙酸的浓度在0.3-0.6M，血清总蛋白与碘代乙酸的质量比为5.5:1-2.7:1；加入胰蛋白酶和血清总蛋白的质量比为1:50-1:20；酶解后，加入1％-5％(v/v)甲酸终止酶解反应。
所述步骤2)富集所用色谱柱为C18色谱柱；所用色谱柱键合材料的粒径为5-10微米，流动相为甲醇与水或乙腈与水，两相中均含有或不含有0.1％(v/v)甲酸；洗脱条件按照水相95-70％(v/v)等度或5-60分钟水相由98％(v/v)变化到70％(v/v)线性梯度进行；使用紫外检测器，检测波长为190-280nm；柱温为25-35℃，洗脱液流速为0.6-1.2mL/min，收集保留时间为5-15min的组分；
步骤2)免疫球蛋白G糖肽富集时采用最佳流动相为乙腈和水，两相中均含或不含0.1％(v/v)甲酸，等度洗脱，水在流动比例为98-80％(v/v)。
所述步骤2)免疫球蛋白G富集到的糖肽馏分采用nano-ESI-Q-TOF-MS直接进样检测，正离子模式，喷雾电压2.5kV，扫描范围500-2000，流速1μL/min，进样5μL。
所述步骤3)HPLC-MRM的液相部分以硅胶基质键合材料为色谱柱填料C18，此材料为反相填料；所用色谱柱基质键合材料的粒径为5-10微米，流动相为甲醇与水或乙腈与水混合，两相中均含有或不含有0.1％(v/v)甲酸；洗脱条件按照水相85-50％(v/v)等度或5-10分钟水相由98％(v/v)变化到10％(v/v)线性梯度进行；柱温为25-35℃，洗脱液流速为0.2-0.6mL/min；质谱条件为：Q-Trap5000串联四级杆线性离子阱高性能质谱仪，配有waters UPLC液相、AB SCIEX质谱和Analyst 1.6.1数据处理软件；离子源：Turbo IonSpray；正离子扫描方式检测；扫描方式为多反应监测；全扫分辨率14000，最大注入时间200ms。
所述步骤4)中，将步骤2)中收集的免疫球蛋白G糖肽另一份通过低温离心浓缩仪在8℃条件旋干处理后进行PNGase F酶解反应，糖链释放使用的缓冲溶液为碳酸氢铵缓冲溶液，体积50-200μL，浓度为50-200mM，pH为7-9；酶解反应温度为35-40℃；反应时间为10-36小时；加入PNGase F的量为每1-10mg免疫球蛋白糖肽加入1unit酶量。
所述步骤5)HPLC-MRM定量液相条件与步骤3)相同；液相部分以硅胶基质键合材料为色谱柱填料C18色谱柱，此材料为反相填料；所用色谱柱基质键合材料的粒径为5-10微米，流动相为甲醇与水或乙腈与水，两相中均含有或不含有0.1％(v/v)甲酸；洗脱条件按照水相85-50％(v/v)等度或5-10分钟水相由98％(v/v)变化到10％(v/v)线性梯度进行；柱温为25-35℃，洗脱液流速为0.2-0.6mL/min；质谱条件为：Q-Trap 5000串联四级杆线性离子阱高性能质谱仪，配有Waters UPLC液相、AB SCIEX质谱和Analyst 1.6.1数据处理软件；离子源：Turbo Ion Spray；正离子扫描方式检测；扫描方式为多反应监测；全扫分辨率14000，最大注入时间200ms。
所述步骤5)中所述内标肽段为：
IgG1内标肽段氨基酸序列为EEQYESTYR，
IgG2内标肽段氨基酸序列为EEQFESTFR，
IgG3和IgG4内标肽段氨基酸序列为EEQYESTFR；
所述免疫球蛋白G亚型中糖肽的对应肽段的标准品为：
IgG1为EEQYDSTYR，
IgG2为EEQFDSTFR，
IgG3为EEQYDSTFR，
IgG4为EEQFDSTYR。
以上方法可以同时对IgG1、IgG2或IgG3和IgG4之和(IgG3/4)的一种或两种以上中的糖肽进行绝对定量。
使用以上任意一种方法定量测定实际人血液样品免疫球蛋白G糖肽的应用，其特征在于能够定量测出血清中各免疫球蛋白G糖肽的含量，浓度0.1pmol/mL-10nmol/mL。
此外，由于IgG3和IgG4氨基酸组成相同，具有相同质荷比，在质谱条件下无法区分，因此本方法定量分析IgG3和IgG4糖肽的总含量。
本发明具有以下优点：
1、不用预先富集血清中的IgG；
2、利用自制反相色谱填料富集到Trypsin酶解的IgG糖肽；
3、可以准确测定血清样品中IgG糖肽的绝对摩尔浓度。方法简单易操作，灵敏度高，准确好，重复率高。且可以应用于血清中其他免疫球蛋白亚型中糖基化水平临床检测和单克隆抗体药物的生产控制中。
附图说明
图1中(a)为IgG1内标曲线；
图1中(b)为IgG2内标曲线；
图1中(c)为IgG3、IgG4之和(IgG3/4)内标曲线。
具体实施方式
现结合实例对本发明进行进一步说明。实例仅限于说明本发明，并非对本发明的限定。
本实施例中所述内标肽段为：
IgG1内标肽段氨基酸序列为EEQYESTYR，
IgG2内标肽段氨基酸序列为EEQFESTFR，
IgG3和IgG4内标肽段氨基酸序列为EEQYESTFR；
标准品为：
IgG1为EEQYDSTYR，
IgG2为EEQFDSTFR，
IgG3为EEQYDSTFR，
IgG4为EEQFDSTYR。
实施例1
同时绝对定量IgG1、IgG2以及IgG3、IgG4之和(IgG3/4)中的糖肽。
(1)血清的胰蛋白酶解：将50μL血清中加入50μL 50mM(pH＝7.4)碳酸氢铵溶液，再加入0.3M二硫苏糖醇10μL，37℃，还原180min；反应产物中加0.3M碘代乙酸20μL，20℃避光保存60min；将反应液中加入胰蛋白酶60μg，40℃酶解反应72h。酶解结束后，加入1％(v/v)甲酸终止酶解反应。
(2)IgG糖肽富集：酶解液经过反相C18(4.6*150mm，5μ)色谱柱进行糖肽富集。流动相采用甲醇与水，条件90％(v/v)水等度洗脱；检测波长为190nm；柱温为25℃，洗脱液流速为0.6mL/min，收集馏分进行nano-ESI-Q-TOF质谱分析，其中10-25min馏分即为IgG糖肽组分。离心浓缩后，将此组分分成两等份，一份用于Profiling分析，另一份用于PNGase F去糖基化肽段定量分析。
(3)IgG糖肽Profiling分析：将步骤(2)中收集IgG糖肽其中一份直接进行HPLC-MRM分析。采用反相C18(2.1*100mm，5μ)，流动相为甲醇与水，洗脱条件按照水相85％(v/v)等度洗脱；柱温为25℃，洗脱液流速为0.2mL/min。Profiling分析原则是将每一种免疫球蛋白G亚型糖肽峰面积归一化到与其对应总糖肽峰面积之和，即可得到各免疫球蛋白亚型糖肽占其总糖肽的百分比，IgG1、IgG2和IgG3和IgG4之和(IgG3/4)糖肽Profiling分析结果见表1a中Ratio(％)。质谱条件为：Q-Trap5000串联四级杆线性离子阱高性能质谱仪，配有waters UPLC液相、AB SCIEX质谱和Analyst1.6.1数据处理软件；离子源：Turbo IonSpray；正离子扫描方式检测；扫描方式为多反应监测；全扫分辨率14000，最大注入时间200ms。
(4)IgG糖肽PNGase F去糖基化：将步骤(2)中收集IgG糖肽另一等份进行PNGase F酶解反应。具体地，将步骤(2)中收集的免疫球蛋白G糖肽另一份通过低温离心浓缩仪在8℃条件旋干处理后，加入50mM碳酸氢铵缓冲溶液100μL，pH为7；加入1unit PNGase F，35℃酶解反应36h。
(5)去糖基化IgG肽段MRM定量分析：采用购买的合成的标准IgG去糖基化糖肽肽段稀释至一系列浓度，加入各标准品相同体积，浓度2ppm的内标肽段，使标准肽段与其内标肽段比值为1∶100，1∶50，1∶25，1：10，1：5，1：2.5，1:1，2.5：1，5：1，10：1，25：1，50:1，100∶1；HPLC-MRM定量分析，建立内标曲线，曲线纵坐标为上述不同浓度的标准品峰面积与对应的内标肽段峰面积的比值，横坐标为上述标准品的浓度。再将加入内标的IgG糖肽PNGase F酶解液进行HPLC-MRM定量分析，测定免疫球蛋白G各亚型肽段峰面积与其对应内标肽段峰面积比值，将此比值带入内标曲线，得到每种亚型免疫球蛋白G总肽段摩尔浓度，即为总糖肽摩尔浓度，见表1a Total Conc.(nmol/mL)。采用反相C18(2.1*100mm，5μ)色谱柱，流动相为甲醇与水。洗脱条件水相85％(v/v)等度洗脱，柱温为25℃，洗脱液流速为0.2mL/min。质谱条件为：Q-Trap 5000串联四级杆线性离子阱高性能质谱仪，配有Waters UPLC液相、ABSCIEX质谱和Analyst 1.6.1数据处理软件；离子源：Turbo Ion Spray；正离子扫描方式检测；扫描方式为多反应监测；全扫分辨率14000，最大注入时间200ms。(6)各免疫球蛋白G亚型中每种糖肽浓度计算：每种免疫球蛋白G亚型糖肽占其总糖肽的百分比和与其对应总糖肽摩尔浓度乘积即为各免疫球蛋白G亚型中每种糖肽摩尔浓度，IgG1糖肽、IgG2以及IgG3、IgG4之和(IgG3/4)主要糖肽定量结果见表1a Conc.(nmol/mL)。
实施例2
分别绝对定量IgG1、2以及3、4之和的糖肽。
(1)血清的胰蛋白酶解：将50μL血清中加入100μL 100mM(pH＝7.8)碳酸氢铵溶液，再加入0.5M二硫苏糖醇10μL，37℃，还原120min；反应产物中加0.5M碘代乙酸20μL，25℃避光保存40min；将反应液中加入胰蛋白酶75μg，37℃酶解反应36h。酶解结束后，加入2％(v/v)甲酸终止酶解反应。
(2)IgG糖肽富集：酶解液经过反相C18(4.6*150mm，5μ)色谱柱进行糖肽富集。流动相采用乙腈与水，条件80％(v/v)水等度洗脱；检测波长为280nm；柱温为30℃，洗脱液流速为1mL/min，收集馏分进行nano-ESI-Q-TOF质谱分析，其中5-12min馏分即为IgG1，13-15min馏分即为IgG3和IgG4之和(IgG3/4)，15-20min馏分即为IgG2糖肽组分。离心浓缩后，将此组分分别分成两等份，一份用于Profiling分析，另一份用于PNGase F去糖基化肽段定量分析。
(3)IgG糖肽Profiling分析：将步骤(2)中收集IgG糖肽分别进行HPLC-MRM分析。采用反相C18(2.1*100mm，5μ)，流动相为乙腈与水，洗脱条件按照水相70％(v/v)等度洗脱；柱温为30℃，洗脱液流速为0.4mL/min。Profiling分析原则是将每一种免疫球蛋白G亚型糖肽峰面积归一化到与其对应的总糖肽峰面积之和，即可得到各免疫球蛋白亚型糖肽占其总糖肽的百分比。IgG1、IgG2以及IgG3、IgG4之和(IgG3/4)糖肽Profiling分析结果见表1bRatio(％)。质谱条件为：Q-Trap5000串联四级杆线性离子阱高性能质谱仪，配有watersUPLC液相、AB SCIEX质谱和Analyst 1.6.1数据处理软件；离子源：Turbo Ion Spray；正离子扫描方式检测；扫描方式为多反应监测；全扫分辨率14000，最大注入时间200ms
(4)IgG糖肽PNGase F去糖基化：将步骤(2)中收集IgG糖肽另一等份进行PNGase F酶解反应。具体地，将步骤(2)中收集的免疫球蛋白G糖肽另一份通过低温离心浓缩仪在8℃条件旋干处理后，加入100mM碳酸氢铵缓冲溶液100uL，pH为7.8；加入2unit PNGase F，37℃酶解反应24h。
(5)去糖基化IgG肽段MRM定量分析：采用购买的合成的标准IgG去糖基化糖肽肽段稀释至一系列浓度，加入相同体积，浓度2ppm内标肽段，使标准肽段与其内标肽段比值为1：100，1：50，1∶25，1∶10，1∶5，1：2.5，1:1，2.5：1，5：1，10：1，25：1，50:1，100：1，HPLC-MRM定量分析，建立内标曲线，曲线纵坐标为上述不同浓度的标准品峰面积与对应的内标肽段峰面积的比值，横坐标为上述标准品的浓度。内标曲线见图1。再将加入内标的IgG糖肽PNGase F酶解液进行HPLC-MRM定量分析，测定免疫球蛋白G各亚型肽段面积与其对应内标肽段面积比值，将此比值带入内标曲线，得到每种亚型免疫球蛋白G总肽段摩尔浓度，即为总糖肽摩尔浓度，见表1b Total Conc.(nmol/mL)。采用反相C18(2.1*100mm，5μ)，流动相为乙腈与水。洗脱条件水相70％(v/v)等度洗脱，柱温为30℃，洗脱液流速为0.4mL/min。质谱条件为：Q-Trap 5000串联四级杆线性离子阱高性能质谱仪，配有Waters UPLC液相、AB SCIEX质谱和Analyst 1.6.1数据处理软件；离子源：Turbo Ion Spray；正离子扫描方式检测；扫描方式为多反应监测；全扫分辨率14000，最大注入时间200ms。
(6)各免疫球蛋白G亚型中每种糖肽浓度计算：每种免疫球蛋白G亚型糖肽占其总糖肽的百分比和与其对应的总糖肽摩尔浓度乘积即为各免疫球蛋白G亚型中每种糖肽摩尔浓度。IgG1糖肽、IgG2以及IgG3、IgG4之和(IgG3/4)主要糖肽定量结果见表1b Conc.(nmol/mL)。
实施例3
(1)血清的胰蛋白酶解：将50μL血清中加入150μL 100mM(pH＝7.8)碳酸氢铵溶液，再加入0.6M二硫苏糖醇10μL，37℃，还原90min；反应产物中加0.6M碘代乙酸20μL，30℃避光保存30min；将反应液中加入胰蛋白酶150μg，35℃酶解反应18h。酶解结束后，加入5％(v/v)甲酸终止酶解反应。
(2)IgG糖肽富集：酶解液经过反相C18(4.6*150mm，5μ)色谱柱进行糖肽富集。流动相采用乙腈与水，含0.1％(v/v)甲酸。条件为5-60分钟水相由98％(v/v)变化到70％(v/v)线性梯度进行洗脱；检测波长为254nm；柱温为35℃，洗脱液流速为1.2mL/min，收集馏分进行nano-ESI-Q-TOF质谱分析，其中5-12minL馏分为IgG1，12-16min馏分为IgG3和IgG4之和(IgG3/4)，17-25min馏分为IgG2糖肽组分。离心浓缩后，将此组分分别分成两等份，一份用于Profiling分析，另一份用于PNGase F去糖基化肽段定量分析。
(3)IgG糖肽Profiling分析：将步骤(2)中收集IgG糖肽进行HPLC-MRM分析。采用反相C18(2.1*100mm，5μ)，流动相采用乙腈与水，含0.1％(v/v)甲酸，洗脱条件5-10分钟水相由98％(v/v)变化到10％(v/v)线性梯度进行洗脱；柱温为35℃，洗脱液流速为0.6mL/min。Profiling分析原则是将每一种免疫球蛋白G亚型糖肽峰面积归一化到与其对应总糖肽峰面积之和，即可得到各免疫球蛋白亚型糖肽占其总糖肽的百分比。IgG1、IgG2和IgG3和IgG4之和(IgG3/4)糖肽Profiling分析结果见表1c中Ratio(％)。质谱条件为：Q-Trap5000串联四级杆线性离子阱高性能质谱仪，配有waters UPLC液相、AB SCIEX质谱和Analyst 1.6.1数据处理软件；离子源：Turbo Ion Spray；正离子扫描方式检测；扫描方式为多反应监测；全扫分辨率14000，最大注入时间200ms。
(4)IgG糖肽PNGase F去糖基化：将步骤(2)中收集IgG糖肽另一等份进行PNGase F酶解反应。具体地，将步骤(2)中收集的免疫球蛋白G糖肽另一份通过低温离心浓缩仪在8℃条件旋干处理后，加入50mM碳酸氢铵缓冲溶液100μL，pH为7.8；加入1unit PNGase F，40℃酶解反应10h。
(5)去糖基化IgG肽段MRM定量分析：采用购买的合成的标准IgG去糖基化糖肽肽段稀释至一系列浓度，加入相同浓度内标2ppm，使标准肽段与其内标肽段比值为1∶100，1∶50，1∶25，1∶10，1：5，1：2.5，1:1，2.5：1，5：1，10：1，25：1，50:1，100：1，HPLC-MRM定量分析，建立内标曲线，曲线纵坐标为上述不同浓度的标准品峰面积与对应的内标肽段峰面积的比值，横坐标为上述标准品的浓度。，内标曲线见图1。再将加入内标的IgG糖肽PNGase F酶解液进行HPLC-MRM定量分析，测定免疫球蛋白G各亚型肽段面积与其对应内标肽段面积比值，将此比值带入内标曲线，得到每种亚型免疫球蛋白G总肽段摩尔浓度，即为总糖肽摩尔浓度，见表1c Total Conc.(nmol/mL)。采用反相C18(2.1*100mm，5μ)，流动相为流动相采用乙腈与水，含0.1％(v/v)甲酸。洗脱条件5-10分钟水相由98％(v/v)变化到10％(v/v)线性梯度进行洗脱，柱温为35℃，洗脱液流速为0.6mL/min。质谱条件为：Q-Trap 5000串联四级杆线性离子阱高性能质谱仪，配有Waters UPLC液相、AB SCIEX质谱和Analyst 1.6.1数据处理软件；离子源：Turbo Ion Spray；正离子扫描方式检测；扫描方式为多反应监测；全扫分辨率14000，最大注入时间200ms。(6)各免疫球蛋白G亚型中每种糖肽浓度计算：每种免疫球蛋白G亚型糖肽占其总糖肽的百分比和与其对应的总糖肽摩尔浓度乘积即为各免疫球蛋白G亚型中每种糖肽摩尔浓度。IgG1、IgG2以及IgG3、IgG4之和(IgG3/4)糖肽定量分析结果见表1cConc.(nmol/mL)。
实施例4
(1)血清的胰蛋白酶解：将50μL血清中加入50μL 300mM(pH＝8)碳酸氢铵溶液，再加入0.55M二硫苏糖醇10μL，37℃，还原60min；反应产物中加0.45M碘代乙酸20μL，30℃避光保存40min；将反应液中加入胰蛋白酶90μg，37℃酶解反应24h。酶解结束后，加入5％(v/v)甲酸终止酶解反应。
(2)IgG糖肽富集：酶解液经过反相C18(4.6*150mm，5μ)色谱柱进行糖肽富集。流动相采用乙腈与水，含0.1％(v/v)甲酸。条件为5-60分钟水相95％(v/v)等度进行洗脱；检测波长为195nm；柱温为30℃，洗脱液流速为1.2mL/min，收集馏分进行nano-ESI-Q-TOF质谱分析，其中8-25min馏分即为IgG糖肽组分。离心浓缩后，将此组分分成两等份，一份用于Profiling分析，另一份用于PNGase F去糖基化肽段定量分析。
(3)IgG糖肽Profiling分析：将步骤(2)中收集IgG糖肽进行HPLC-MRM分析。采用反相C18(2.1*100mm，5μ)，流动相采用乙腈与水，含0.1％(v/v)甲酸，洗脱条件5-10分钟水相由98％(v/v)变化到10％(v/v)线性梯度进行洗脱；柱温为30℃，洗脱液流速为0.4mL/min。Profiling分析原则是将每一种免疫球蛋白G亚型糖肽峰面积归一化到与其对应总糖肽峰面积之和，即可得到各免疫球蛋白亚型糖肽占其总糖肽的百分比。IgG1、IgG2和IgG3和IgG4之和(IgG3/4)糖肽Profiling分析结果见表1d中Ratio(％)。质谱条件为：Q-Trap5000串联四级杆线性离子阱高性能质谱仪，配有waters UPLC液相、AB SCIEX质谱和Analyst 1.6.1数据处理软件；离子源：Turbo Ion Spray；正离子扫描方式检测；扫描方式为多反应监测；全扫分辨率14000，最大注入时间200ms。
(4)IgG糖肽PNGase F去糖基化：将步骤(2)中收集IgG糖肽另一等份进行PNGase F酶解反应。具体地，将步骤(2)中收集的免疫球蛋白G糖肽另一份通过低温离心浓缩仪在8℃条件旋干处理后，加入100mM碳酸氢铵缓冲溶液100uL，pH为8；加入1unit PNGase F，37℃酶解反应20h。
(5)去糖基化IgG肽段MRM定量分析：采用购买的合成的标准IgG去糖基化糖肽肽段稀释至一系列浓度，加入相同浓度内标2ppm，使标准肽段与其内标肽段比值为1：100，1：50，1：25，1：10，1：5，1：2.5，1:1，2.5：1，5：1，10：1，25：1，50:1，100：1，进行标准曲线绘制，内标曲线见图1。再将加入内标的IgG糖肽PNGase F酶解液进行HPLC-MRM定量分析，测定免疫球蛋白G各亚型肽段面积与其对应内标肽段面积比值，将此比值带入内标曲线，得到每种亚型免疫球蛋白G总肽段摩尔浓度，即为总糖肽摩尔浓度，见表1d Total Conc.(nmol/mL)。采用反相C18(2.1*100mm，5μ)，流动相为流动相采用甲醇与水，含0.1％(v/v)甲酸。洗脱条件5-10分钟水相由98％(v/v)变化到10％(v/v)线性梯度进行洗脱，柱温30℃，洗脱液流速为0.4mL/min。质谱条件为：Q-Trap 5000串联四级杆线性离子阱高性能质谱仪，配有WatersUPLC液相、AB SCIEX质谱和Analyst 1.6.1数据处理软件；离子源：Turbo Ion Spray；正离子扫描方式检测；扫描方式为多反应监测；全扫分辨率14000，最大注入时间200ms。(6)各免疫球蛋白G亚型中每种糖肽浓度计算：每种免疫球蛋白G亚型糖肽占其总糖肽的百分比和与其对应总糖肽摩尔浓度乘积即为各免疫球蛋白G亚型中每种糖肽摩尔浓度。IgG1、IgG2和IgG3、IgG4之和(IgG3/4)糖肽定量分析结果见表1d Conc.(nmol/mL)。
实施例5
(1)血清的胰蛋白酶解：将50μL血清中加入50μL 400mM(pH＝8.5)碳酸氢铵溶液，再加入0.5M二硫苏糖醇10μL，37℃，还原60min；反应产物中加0.45M碘代乙酸20μL，20℃避光保存40min；将反应液中加入胰蛋白酶60μg，37℃酶解反应72h。酶解结束后，加入1％(v/v)甲酸终止酶解反应。
(2)IgG糖肽富集：酶解液经过反相C18(4.6*150mm，5μ)色谱柱进行糖肽富集。流动相采用甲醇与水，条件70％(v/v)水等梯度进行洗脱；检测波长为195nm；柱温为30℃，洗脱液流速为0.6mL/min，收集5-20min馏分即为IgG糖肽组分。离心浓缩后，将此组分分成两等份，一份用于Profiling分析，另一份用于PNGase F去糖基化肽段定量分析。
(3)IgG糖肽Profiling分析：将步骤(2)中收集IgG糖肽进行HPLC-MRM分析。采用反相C18(2.1*100mm，5μ)，流动相为甲醇与水，洗脱条件按照水相50％(v/v)等度洗脱；柱温为30℃，洗脱液流速为0.2mL/min。Profiling分析原则是将每一种免疫球蛋白G亚型糖肽峰面积归一化到与其对应总糖肽峰面积之和，即可得到各免疫球蛋白亚型糖肽占其总糖肽的百分比。IgG1、IgG2和IgG3和IgG4之和(IgG3/4)糖肽Profiling分析结果见表1e中Ratio(％)。质谱条件为：Q-Trap5000串联四级杆线性离子阱高性能质谱仪，配有waters UPLC液相、ABSCIEX质谱和Analyst 1.6.1数据处理软件；离子源：Turbo Ion Spray；正离子扫描方式检测；扫描方式为多反应监测；全扫分辨率14000，最大注入时间200ms。
(4)IgG糖肽PNGase F去糖基化：将步骤(2)中收集IgG糖肽另一等份进行PNGase F酶解反应。具体地，将步骤(2)中收集的免疫球蛋白G糖肽另一份通过低温离心浓缩仪在8℃条件旋干处理后，加入200mM碳酸氢铵缓冲溶液100μL，pH为8；加入0.5unit PNGase F，37℃酶解反应36h。
(5)去糖基化IgG肽段MRM定量分析：采用购买的合成的标准IgG去糖基化糖肽肽段稀释至一系列浓度，加入相同体积，浓度2ppm内标肽段，使标准肽段与其内标肽段比值为1：100，1：50，1：25，1：10，1：5，1：2.5，1:1，2.5：1，5：1，10：1，25：1，50:1，100：1，HPLC-MRM定量分析，建立内标曲线，曲线纵坐标为上述不同浓度的标准品峰面积与对应的内标肽段峰面积的比值，横坐标为上述标准品的浓度。内标曲线见图1。再将加入内标的IgG糖肽PNGase F酶解液进行HPLC-MRM定量分析，测定免疫球蛋白G各亚型肽段面积与其对应内标肽段面积比值，将此比值带入内标曲线，得到每种亚型免疫球蛋白G总肽段摩尔浓度，即为总糖肽摩尔浓度，见表1e Total Conc.(nmol/mL)。采用反相C18(2.1*100mm，5μ)，流动相为甲醇与水。洗脱条件水50％(v/v)等度洗脱，柱温为30℃，洗脱液流速为0.2mL/min。质谱条件为：Q-Trap 5000串联四级杆线性离子阱高性能质谱仪，配有Waters UPLC液相、AB SCIEX质谱和Analyst 1.6.1数据处理软件；离子源：Turbo Ion Spray；正离子扫描方式检测；扫描方式为多反应监测；全扫分辨率14000，最大注入时间200ms。(6)各免疫球蛋白G亚型中每种糖肽浓度计算：每种免疫球蛋白G亚型糖肽占其总糖肽的百分比和与其对应总糖肽摩尔浓度乘积即为各免疫球蛋白G亚型中每种糖肽摩尔浓度。IgG1、IgG2以及IgG3、IgG4之和(IgG3/4)糖肽定量分析结果见表1e Conc.(nmol/mL)。
实施例6
(1)血清的胰蛋白酶解：将50μL血清中加入150μL 300mM(pH＝8)碳酸氢铵溶液，再加入0.4M二硫苏糖醇10μL，37℃，还原120min；反应产物中加0.5M碘代乙酸20μL，25℃避光保存40min；将反应液中加入胰蛋白酶75μg，37℃酶解反应36h。酶解结束后，加入3％(v/v)甲酸终止酶解反应。
(2)IgG糖肽富集：酶解液经过反相C18(4.6*150mm，5μ)色谱柱进行糖肽富集。流动相采用乙腈与水，条件为5-60分钟水95％(v/v)等梯度进行洗脱；检测波长为280nm；柱温为30℃，洗脱液流速为1mL/min，收集5-20min馏分即为IgG糖肽组分。离心浓缩后，将此组分分成两等份，一份用于Profiling分析，另一份用于PNGase F去糖基化肽段定量分析。
(3)IgG糖肽Profiling分析：将步骤(2)中收集IgG糖肽进行HPLC-MRM分析。采用反相C18(2.1*100mm，5μ)，流动相为乙腈与水，洗脱条件按照5-10分钟水相由98％(v/v)变化到10％(v/v)梯度进行洗脱；柱温为30℃，洗脱液流速为0.4mL/min。Profiling分析原则是将每一种免疫球蛋白G亚型糖肽峰面积归一化到总糖肽峰面积之和，即可得到各免疫球蛋白亚型糖肽占其总糖肽的百分比。IgG1、IgG2以及IgG3和IgG4之和(IgG3/4)糖肽Profiling分析结果见表1f中Ratio(％)。质谱条件为：Q-Trap5000串联四级杆线性离子阱高性能质谱仪，配有waters UPLC液相、AB SCIEX质谱和Analyst 1.6.1数据处理软件；离子源：TurboIon Spray；正离子扫描方式检测；扫描方式为多反应监测；全扫分辨率14000，最大注入时间200ms。
(4)IgG糖肽PNGase F去糖基化：将步骤(2)中收集IgG糖肽另一等份进行PNGase F酶解反应。具体地，将步骤(2)中收集的免疫球蛋白G糖肽另一份通过低温离心浓缩仪在8℃条件旋干处理后，加入100mM碳酸氢铵缓冲溶液100μL，pH为7.8；加入2unit PNGase F，37℃酶解反应24h。
(5)去糖基化IgG肽段MRM定量分析：采用购买的合成的标准IgG去糖基化糖肽肽段稀释至一系列浓度，加入相同体积，浓度2ppm内标肽段，使标准肽段与其内标肽段比值为1：100，1：50，1：25，1：10，1：5，1：2.5，1:1，2.5：1，5：1，10：1，25：1，50:1，100：1，HPLC-MRM定量分析，建立内标曲线，曲线纵坐标为上述不同浓度的标准品峰面积与对应的内标肽段峰面积的比值，横坐标为上述标准品的浓度。内标曲线见图1。再将加入内标的IgG糖肽PNGase F酶解液进行HPLC-MRM定量分析，测定免疫球蛋白G各亚型肽段面积与其对应内标肽段面积比值，将此比值带入内标曲线，得到每种亚型免疫球蛋白G总肽段摩尔浓度，即为总糖肽摩尔浓度，见表1f Total Conc.(nmol/mL)。采用反相C18(2.1*100mm，5μ)，流动相为乙腈与水。洗脱条件按照5-10分钟水相由98％(v/v)变化到10％(v/v)线性梯度进行洗脱，柱温为30℃，洗脱液流速为0.4mL/min。质谱条件为：Q-Trap 5000串联四级杆线性离子阱高性能质谱仪，配有Waters UPLC液相、AB SCIEX质谱和Analyst 1.6.1数据处理软件；离子源：TurboIon Spray；正离子扫描方式检测；扫描方式为多反应监测；全扫分辨率14000，最大注入时间200ms。(6)各免疫球蛋白G亚型中每种糖肽浓度计算：每种免疫球蛋白G亚型糖肽占其总糖肽的百分比和与其对应总糖肽摩尔浓度乘积即为各免疫球蛋白G亚型中每种糖肽摩尔浓度。IgG1、IgG2以及IgG3、IgG4之和(IgG3/4)糖肽定量分析结果见表1f Conc.(nmol/mL)。
表1.IgG1&2糖肽Profiling分析及定量分析

Claims (10)

1.血清中免疫球蛋白G糖肽绝对定量方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)血清酶解：用缓冲溶液将血清稀释，然后加入二硫苏糖醇进行二硫键还原，反应产物中加入碘代乙酸，得到反应液，将反应液中加入胰蛋白酶进行酶解反应；
2)免疫球蛋白G糖肽富集：酶解液进行一维色谱富集，经nano-ESI-Q-TOF分析，洗脱得到免疫球蛋白G糖肽组分；将收集的免疫球蛋白G糖肽分成两份；
3)免疫球蛋白G糖肽Profiling分析：将步骤2)中收集的免疫球蛋白G糖肽中的一份进行HPLC-MRM分析：将免疫球蛋白G亚型中各糖肽峰面积归一化到与其对应亚型总糖肽峰面积之和，即可得到免疫球蛋白G亚型中各糖肽占该亚型总糖肽的百分比；
4)糖链释放：将步骤2)中收集的免疫球蛋白G糖肽另一份进行PNGase F酶解反应，从而得到去糖基化的免疫球蛋白G肽段酶解液；
5)去糖基化免疫球蛋白G肽段HPLC-MRM定量分析：将步骤4)中免疫球蛋白G糖肽的PNGase F酶解液进行HPLC-MRM定量分析；具体地，先建立免疫球蛋白G亚型的内标曲线；
采用所述免疫球蛋白G亚型的一种或两种以上亚型，在上述一种或两种以上亚型中选取各亚型中的任一糖肽对应肽段作为标准品，即1～4个标准品，一起稀释成至少5个不同浓度，浓度范围为20ppb-200ppm，每个浓度的标准品均加入1ppm～4ppm与各标准品等体积的与亚型对应的内标肽段，所述内标肽段与标准品的区别在于内标肽段在上述液相分离条件下具有与标准品相似保留行为；而后进行HPLC-MRM定量分析，建立与上述亚型对应的内标曲线，曲线纵坐标为上述不同浓度的标准品峰面积与对应的内标肽段峰面积的比值，横坐标为上述标准品的摩尔浓度；
而后，将步骤4)酶解液中加入与该酶解液等体积的1ppm～4ppm所述内标肽段，进行HPLC-MRM定量分析，测定步骤4)酶解液中免疫球蛋白G亚型中与标准品对应的肽段峰面积与对应的内标肽段峰面积的比值，将此比值带入内标曲线，得到该亚型总肽段摩尔浓度，即为该免疫球蛋白G亚型总糖肽的摩尔浓度；
6)免疫球蛋白G亚型中每种糖肽浓度计算：将步骤3)中得到的免疫球蛋白G亚型中各糖肽占亚型总糖肽的百分比，与步骤5)中得到的免疫球蛋白G亚型总糖肽的摩尔浓度的乘积，即为一种或两种以上免疫球蛋白G亚型中的各糖肽的摩尔浓度。
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于：步骤1)将血清稀释并加入二硫苏糖醇进行二硫键还原反应，反应温度在37-90℃之间，反应时间在50-180min；加入碘代乙酸反应温度在20-30℃之间，反应时间在30-60min；加入胰蛋白酶后反应温度在35-40℃之间，反应时间在18-72h。
步骤1)血清酶解稀释所使用的缓冲溶液为碳酸氢铵缓冲溶液，稀释所用缓冲液浓度在50-400mM，pH为7-8，加入原溶液体积的1-3倍体积的缓冲溶液；加入二硫苏糖醇的浓度在0.3-0.6M，血清总蛋白与二硫苏糖醇的质量比例为7:1-3:1；加入碘代乙酸的浓度在0.3-0.6M，血清总蛋白与碘代乙酸的质量比为5.5:1-2.7:1；加入胰蛋白酶和血清总蛋白的质量比为1:50-1:20；酶解后，加入1％-5％(v/v)甲酸终止酶解反应。
3.根据权利要求1所述方法，其特征在于：步骤2)富集所用色谱柱为C18色谱柱；所用色谱柱键合材料的粒径为5-10微米，流动相为甲醇与水或乙腈与水，两相中均含有或不含有0.1％(v/v)甲酸；洗脱条件按照水相95-70％(v/v)等度或5-60分钟水相由98％(v/v)变化到70％(v/v)线性梯度进行；使用紫外检测器，检测波长为190-280nm；柱温为25-35℃，洗脱液流速为0.6-1.2mL/min，收集保留时间为5-15min的组分；
步骤2)免疫球蛋白G糖肽富集时采用最佳流动相为乙腈和水，两相中均含或不含0.1％(v/v)甲酸，等度洗脱，水在流动比例为98-80％(v/v)。
4.根据权利要求1所述方法，其特征在于：步骤2)免疫球蛋白G富集到的糖肽馏分采用nano-ESI-Q-TOF-MS直接进样检测，正离子模式，喷雾电压2.5kV，扫描范围500-2000，流速1μL/min，进样5μL。
5.根据权利要求1所述方法，其特征在于：步骤3)HPLC-MRM的液相部分以硅胶基质键合材料为色谱柱填料C18，此材料为反相填料；所用色谱柱基质键合材料的粒径为5-10微米，流动相为甲醇与水或乙腈与水混合，两相中均含有或不含有0.1％(v/v)甲酸；洗脱条件按照水相85-50％(v/v)等度或5-10分钟水相由98％(v/v)变化到10％(v/v)线性梯度进行；柱温为25-35℃，洗脱液流速为0.2-0.6mL/min；质谱条件为：Q-Trap5000串联四级杆线性离子阱高性能质谱仪，配有waters UPLC液相、AB SCIEX质谱和Analyst 1.6.1数据处理软件；离子源：Turbo Ion Spray；正离子扫描方式检测；扫描方式为多反应监测；全扫分辨率14000，最大注入时间200ms。
6.根据权利要求1所述方法，其特征在于：在步骤4)中，将步骤2)中收集的免疫球蛋白G糖肽另一份通过低温离心浓缩仪在8℃条件旋干处理后进行PNGase F酶解反应，糖链释放使用的缓冲溶液为碳酸氢铵缓冲溶液，体积50-200μL，浓度为50-200mM，pH为7-9；酶解反应温度为35-40℃；反应时间为10-36小时；加入PNGase F的量为每1-10mg免疫球蛋白糖肽加入1unit酶量。
7.根据权利要求1所述方法，其特征在于：步骤5)HPLC-MRM定量液相条件与步骤3)相同；液相部分以硅胶基质键合材料为色谱柱填料C18色谱柱，此材料为反相填料；所用色谱柱基质键合材料的粒径为5-10微米，流动相为甲醇与水或乙腈与水，两相中均含有或不含有0.1％(v/v)甲酸；洗脱条件按照水相85-50％(v/v)等度或5-10分钟水相由98％(v/v)变化到10％(v/v)线性梯度进行；柱温为25-35℃，洗脱液流速为0.2-0.6mL/min；质谱条件为：Q-Trap 5000串联四级杆线性离子阱高性能质谱仪，配有Waters UPLC液相、AB SCIEX质谱和Analyst 1.6.1数据处理软件；离子源：Turbo Ion Spray；正离子扫描方式检测；扫描方式为多反应监测；全扫分辨率14000，最大注入时间200ms。
8.根据权利要求1所述方法，其特征在于：步骤5)中所述内标肽段为：
IgG1内标肽段氨基酸序列为EEQYESTYR，
IgG2内标肽段氨基酸序列为EEQFESTFR，
IgG3和IgG4内标肽段氨基酸序列为EEQYESTFR；
所述免疫球蛋白G亚型中糖肽的对应肽段的标准品为：
IgG1为EEQYDSTYR，
IgG2为EEQFDSTFR，
IgG3为EEQYDSTFR，
IgG4为EEQFDSTYR。
9.按照权利要求1所述方法，其特征在于，可以同时对IgG1、IgG2或IgG3和IgG4之和(IgG3/4)的一种或两种以上中的糖肽进行绝对定量。
10.使用权利要求1-9任意一种方法定量测定实际人血液样品免疫球蛋白G糖肽的应用，其特征在于能够定量测出血清中各免疫球蛋白G糖肽的含量，浓度0.1pmol/mL-10nmol/mL。
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