CN109725094A - 糖蛋白的双酶处理法 - Google Patents
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Abstract
本申请涉及糖蛋白的双酶处理法,是将糖苷酶与胰蛋白酶同时加入样品中进行处理。本申请的双酶处理法可用于处理诸如重组人促卵泡激素(rhFSH)这样的糖蛋白,例如用于rhFSH的N端不均一性分析和肽图检测。
Description
技术领域
本申请涉及对糖蛋白同时开始去糖基化和蛋白水解的酶处理方法,是将糖苷酶与蛋白水解酶同时加入糖蛋白中进行酶处理。本申请的酶处理方法可用于处理诸如重组人促卵泡激素(rhFSH)这样的糖蛋白激素,尤其是用于 rhFSH的N端不均一性分析和肽图检测。
背景技术
糖蛋白是由糖链与肽链中的氨基酸以糖苷键共价连接而成,在自然界和人体中广泛存在,有多种生物学用途,例如,人体中的多种激素都是糖蛋白激素。
为了研究糖蛋白的活性或测定糖蛋白产品的纯度,通常要将糖链和肽链分开。因此,对糖蛋白的处理包括,用糖苷酶去糖基化,以及,用蛋白水解酶产生短肽片段。由于糖苷酶本身也是一种蛋白质,也能被蛋白水解酶例如胰蛋白酶切割,故在本申请之前,未发现有人将糖苷酶与蛋白水解酶例如胰蛋白酶混在一起、同时进行去糖基化和蛋白水解。
发明内容
本申请人意外发现,通过检测糖苷酶对目标糖蛋白的去糖基化效率,可以筛选到能很快完成目标糖蛋白的去糖基化任务的糖苷酶,从而在该目标糖蛋白需要去糖基化和蛋白水解两者的处理中,通过将糖苷酶和蛋白水解酶同时加入反应体系,可以在蛋白水解酶还没来得及对糖苷酶造成破坏之前,就让糖苷酶完成去糖基化的任务。进一步地,本申请意外发现,让糖苷酶和蛋白水解酶同时存在于反应体系中,有可能大大提高它们各自去糖基化和蛋白水解的效率,使得整体上对糖蛋白的酶切处理时间大大缩短。
因此,本申请涉及一种在糖蛋白中同时加入糖苷酶和蛋白水解酶进行酶处理的方法。所谓“同时”,是指添加糖苷酶的时间比添加蛋白水解酶的时间提早最多10分钟、或者提早最多5分钟,例如提早4分钟、提早3分钟、提早2分钟、提早1分钟、或提早0分钟。
在一个具体方面,本申请的糖苷酶是在30分钟内完成对目标糖蛋白的去糖基化的酶,优选是25分钟内完成去糖基化,更优选20分钟内完成去糖基化,还更优选15分钟内完成去糖基化,最优选10分钟内完成去糖基化。所谓“完成对目标糖蛋白的去糖基化”,可以是经过诸如十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、高效液相色谱(HPLC)、或质谱分析(MS)等常规方法检测而不再出现带糖的蛋白分子特有的信号,例如,去糖基化后的样品经HPLC分析,不出现带糖形式在去糖基化0分钟时表现出的特有峰。
糖苷酶的例子有肽-N-糖苷酶(peptide-N-glycodase,PNGase),例如糖苷酶 F(PNGase F)、内切糖苷酶F1、内切糖苷酶F2、内切糖苷酶F3。PNGase在 N-糖蛋白内部的N-乙酰氨基葡糖(GlcNAc)与天冬酰胺(Asn)之间进行切割,且此处的GlcNAc不得少于2个,否则不引起催化。与内切糖苷酶F1、F2、 F3不同,PNGase F对外部糖链结构的选择性不高,故有较宽泛的特异性。优选地,本申请的糖苷酶是糖苷酶F(EC 3.5.1.52)。
在另一具体方面,本申请的蛋白水解酶是指,经过至少4个小时而对目标糖蛋白的蛋白部分酶切达到所需程度的酶。
优选地,蛋白水解所需达到的程度是,目标糖蛋白的N端第一个肽段被完全酶切,酶切产物中不存在原来的完整蛋白,也不存在第一个肽段与后续一或多个肽段相连的情形。例如,经过诸如SDS-PAGE、HPLC、或MS等方法检测而不再出现完整蛋白或目标肽段相连的信号。在FSH的例子中,被完全酶切后不再有βL1-2或βL1-4之类的肽段,也不再有完整的FSH蛋白。
相应地,本申请的蛋白水解酶是水解肽链内部(而非尾端的)链接的蛋白水解酶,例如胰蛋白酶,或内肽酶、内蛋白酶等等,例如精氨酸蛋白酶,最优选胰蛋白酶EC3.4.21.4。
在本申请的方法中,同时加入糖苷酶和蛋白水解酶这两种酶后,进行双酶切的时间取决于蛋白水解的需求。即,本申请的双酶处理时间是目标糖蛋白被蛋白水解酶酶切到所需程度花费的时间。本领域技术人员根据所用的蛋白水解酶和需要进行酶切的糖蛋白的特性,可以很容易地确定所述双酶处理时间。优选地,本申请的双酶处理时间不少于4小时;更优选处理时间为4~6 小时,还更优选为4~5小时,或为4小时。
相应地,在一个具体实施方案中,本申请涉及一种糖蛋白的双酶处理方法,其包括,将糖苷酶与蛋白水解酶同时添加到待处理的目标糖蛋白中,作用指定的时间,其中,所述糖苷酶是在30分钟内、优选25分钟内、更优选 20分钟内、还更优选15分钟内、最优选10分钟内对目标糖蛋白的去糖基化达到所需程度的酶;所述蛋白水解酶是在所述指定的时间内对目标糖蛋白的水解达到所需程度的酶;所述指定的时间是不少于4小时,优选所述指定的时间为4~6小时,更优选为4~5小时,或为4小时。
在另一方面,本申请涉及一种对糖蛋白进行肽图分析的方法,是先进行上述双酶处理方法,然后进行肽图分析。已知,肽图分析(Peptide Mapping) 是用特异性蛋白水解酶、尤其内肽酶将多肽裂解成小片段,再形成特征性指纹图谱的分析方法。将本申请的糖蛋白双酶处理法与肽图分析方法相结合,可以在显著缩短的时间内对良好去糖基化的蛋白水解产物进行准确识别,排除糖链的干扰,因此是高效的质量控制和评价方法。
优选地,本申请的肽图分析方法采用液相色谱,例如反相液相色谱,尤其反相(RP)-HPLC来进行。
在一个具体实施方案中,本申请涉及rhFSH的肽图分析方法,包括
(1)将糖苷酶和胰蛋白酶同时加入rhFSH中,优选还同时加入Ca2+试剂,
进行不少于4小时的双酶处理,
(2)进行RP-HPLC。
色谱柱的填装颗粒的粒径是本领域技术人员能选择的。例如,在rhFSH 的例子中,可采用3.5μm以下的粒径,例如当前有可商购的2.7或1.8μm粒径的色谱柱,最优选2.7μm粒径。在定性分析中,也可以采用3.5μm粒径。
在还有一方面,本申请的肽图分析方法可用于对糖蛋白进行N端不均一性分析。优选地,其中蛋白酶的例子可以是原本就具有足以完全切割目标糖蛋白上N端第一个酶切位点的活性的酶,或者是通过添加酶活性增强剂而能完全切割目标糖蛋白上N端第一个酶切位点的酶。酶活性增强剂的例子有离子试剂,这是本领域普通技术人员基于具体的酶可以选出的。例如,在胰蛋白酶的情形中,可选用Ca2+试剂或Mg2+试剂,因为这些离子的存在可使胰蛋白酶的活性更强。
在还有一方面,本申请一种试剂盒,其包含糖苷酶和蛋白酶(例如胰蛋白酶),以及同时添加糖苷酶和蛋白酶的说明。优选地,该试剂盒还包含增强蛋白酶活性的离子试剂,例如Ca2+试剂或Mg2+试剂,以及同时添加糖苷酶、蛋白酶和离子试剂的说明。
本文中,“糖蛋白”是指含有寡糖的蛋白。优选地,寡糖占总分子量的至少3%重量,优选至少5%重量,更优选至少10%重量,至少15%重量,至少20%重量,至少25%重量,至少30%重量,至少35%重量,至少40%重量,至少45%重量,或至少48%重量。具体举例地,糖蛋白中的寡糖可占总分子量的范围为上述各数值之间,例如3~48%,3~45%,5~45%,等等。糖蛋白的例子有,糖蛋白激素,糖蛋白性质的抗体,以及糖蛋白性质的其它生物制品例如促红细胞生成素(EPO),等等。
优选地,本申请的糖蛋白是糖蛋白激素。糖蛋白激素例子有,由垂体生成的黄体生成素(LH)、卵泡刺激素(FSH)和促甲状腺激素(TSH),由胎盘生成的绒毛膜促性腺激素(CG)。它们在结构上有较大共性,例如,都由ɑ亚基和β亚基组成,ɑ亚基的一级结构都是一样的,都有N末端缺失现象,等等。
本申请还涉及一种糖蛋白激素产品的质量评价方法,是对糖蛋白激素产品先用糖苷酶和胰蛋白酶同时进行酶切,然后进行肽图分析。
在一个具体实施方案中,本申请的方法是处理rhFSH的方法。
人体内FSH不足是不孕不育的主要原因,可以通过注射FSH予以治疗。重组的人FSH(rhFSH)比天然FSH来源充足,质量和效力也更稳定,是当前商用的主要产品,例如,默克雪兰诺(欧洲Merck Serono/北美EMD Serono) 的果纳芬(Conal F)、默沙东(Merck Sharp&Dohme)的普丽康(Puregon)、长春金赛药业的金赛恒。
与其他糖蛋白激素一样,FSH的肽链也由ɑ亚基和β亚基组成。每一个亚基通过2个N-糖苷键分别连接2个糖链。总共四个糖链占FSH总分子量的15%~30%重量。去除糖链,将导致FSH的生物活性降低或甚至失活。
欧洲药典收载了对rhFSH的肽图分析方法(参见欧洲药典9.5版之重组人促卵泡激素各论,本文简称“欧洲药典方法”)。该方法先将α亚基和β亚基分开,分别进行还原、修饰和脱盐,经反相色谱后冻干,然后用Lys-C内切酶处理过夜,整个处理需2~3天。最后,分别进行反相(RP)-HPLC。因未经糖苷酶处理,欧洲药典方法得到的亚基曲线是带糖链亚基的表现(图4:α亚基,图5:β亚基)。
目前可购买得到的糖苷酶产品有Promega公司的PNGase F、Biolabs公司的N-糖苷酶F,等等。这些厂家的说明书显示,它们的糖苷酶对糖蛋白的处理时间都至少为1小时。
本申请人意外发现,糖苷酶F只需短短10分钟即可切完rhFSH(图1)。由于在10分钟时,蛋白水解酶还来不及对糖苷酶F造成实质破坏,糖苷酶就已经完成去糖基化,之后即使糖苷酶F被蛋白水解酶破坏,也不影响去糖基化,故无需将去糖基化与蛋白水解步骤分开进行。换而言之,在处理糖蛋白的去糖基化和蛋白水解需求时,可以同时加入糖苷酶F和蛋白水解酶。这样也大大缩短了酶处理的总时间。
FSH还有另外一个特点是有明显的N端不均一性表现。
天然hFSH的肽链广泛存在N端序列缺失的现象。例如,α亚基N端缺失1~3个氨基酸的比例约为40%,β亚基N端缺失2个氨基酸的比例约为 50%。
重组FSH果纳芬的β亚基N端缺失比例仍约为50%,但α亚基N端缺失的比例与天然hFSH不同,约为1%~2%。虽然rhFSH上市已20年,但N 端缺失对临床安全性以及药效学方面的影响尚不明确。
本申请人发现,经过胰蛋白酶切割的rhFSH中,可能会出现以下肽段:
完整βL1-2:β亚基N端完整第一肽段与第二肽段相连;
短βL1-2:β亚基N端第一、二肽段相连且第一肽段N端缺失一或两个氨基酸;
完整βL1:β亚基N端完整的第一肽段;
短βL1:β亚基缺失了两个氨基酸的N端第一肽段。
但是,在本申请之前,没有一种方法能将这些肽段一一清楚地区分开来。
例如,欧洲药典方法未能将rhFSH的“完整βL1”和“短βL1”分开,甚至也不能将完整β亚基与βL1-4肽段分开(图5)。
βL1-2、βL1-4这类肽段的出现,说明蛋白水解不够彻底,βL1不能被全部释放。在这些情形中,即使通过肽图分析来检测rhFSH样品,也无法对βL1进行准确定量。
如果蛋白水解酶作用足够长的时间,可以避免上述βL1-2、βL1-4这类肽段的出现。本申请人发现,用胰蛋白酶处理rhFSH,经过3小时仍不能完成酶切,RP-HPLC(2.7μm柱)的肽图能清楚地区分出短βL1、完整βL1、短βL1-2、以及完整βL1-2(图8、图9)。但处理达到4小时后,就不再出现βL1-2的完整和缩短形式,处理5小时和6小时的取样都是同样的结果(图 6和图7),说明胰蛋白酶处理4小时就能完成对rhFSH的酶切。
另一方面,蛋白水解效率也与蛋白酶活性关联,酶活性越强,水解效率越高。在本申请的一个实施方案中,用到了胰蛋白酶的酶活性增强剂,具体是氯化钙(CaCl2)。
相应地,本申请涉及简便快速的检测诸如rhFSH等糖蛋白的N端不均一性的方法。该方法包括将糖苷酶、以及蛋白水解酶一同加载至诸如rhFSH 之类的目标糖蛋白,待蛋白水解酶完成对该目标糖蛋白N端第一肽段的酶切之后,进行肽图分析。
在优选实施方案中,本申请的糖蛋白N端不均一性检测方法在添加糖苷酶和蛋白水解酶的同时,还添加蛋白水解酶的酶活性增强剂。所谓“同时”,是指依次添加糖苷酶、蛋白水解酶的酶活性增强剂和蛋白水解酶,或者依次添加糖苷酶、蛋白水解酶和蛋白水解酶的酶活性增强剂,相邻两添加之间的间隔时间例如为5分钟、4分钟、3分钟、2分钟、1分钟、或0分钟。
优选酶活性增强剂是Ca2+试剂,例如氯化钙(CaCl2)。更优选地,按μg 计的氯化钙用量是胰蛋白酶用量的50倍以上,例如,55倍以上,60倍以上, 65倍以上,70倍以上,75倍以上,80倍以上,或者85倍以上。
在本申请的肽图分析的实例中,对FSH采用了填料为C18的HPLC色谱柱。
在填料的粒径方面,本申请可以采用不超过3.5μm的粒径,最优选2.7μm 的粒径,可从Agilent、Sigma-Aldrich、Halo、Waters等公司购买。申请人的试验发现,3.5μm色谱柱的图谱中完整βL1与短βL1重合,无法进行定量分析,但可以进行定性分析。2.7μm色谱柱可有效分离完整βL1、完整βL1-2、短βL1、以及短βL1-2,分离度符合中国药典要求,且峰面积稳定(见图8、图9)。1.8μm色谱柱因粒径更小,对压力要求更高,最好是配合使用超高效液相色谱(UPLC),得到分离效果的较好(数据未显示),但这使得设备成本增加;如果提高柱箱温度来降低系统压力,需要注意肽段在高温的稳定性。
相应地,本申请涉及如下的rhFSH检测方法:将糖苷酶、胰蛋白水解酶和胰蛋白水解酶的酶活性增强剂一同加载至rhFSH,酶切至少4个小时之后,进行肽图分析。
在一个优选的rhFSH检测方法中,所述酶活性增强剂是Ca2+试剂,例如氯化钙(CaCl2)。更优选地,按μg计的氯化钙用量是胰蛋白酶用量的50倍以上,例如,55倍以上,60倍以上,65倍以上,70倍以上,75倍以上,80 倍以上,或者85倍以上。
本申请通过小粒径RP-HPLC色谱柱对胰蛋白酶释放出的β亚基N端第一个肽段βL1的完整与缺失形式进行分离,经面积归一法测定完整与缺失β L1的相对含量。本申请方法中βL1酶切完全,完整与缺失片段的分离度高,处理时间从欧洲药典方法的约50小时,缩短到本申请的约4小时。肽图中的目的肽段分离度优于欧洲药典方法,并可由肽图一个检查项目完成肽图鉴别、N端不均一性检测两个试验。经证明该方法稳定性好,准确度高,可作为重组人促卵泡激素的质量研究和质量控制新方法。
附图说明
图1示rhFSH的糖苷酶F酶切时间分析。从下到上依次是糖苷酶酶切0 min、10min、1h、4h、8h、和16h时所得样品的色谱图。0min那条线上,左起第一个峰为带糖链α亚基,第二个峰为带糖链β亚基。此时未开始切糖链,受糖链影响,亚基的峰形较宽。开始切糖链后,第一组峰为去糖链的α亚基,第二组峰为去糖链的β亚基。去糖链的α亚基组未发现带有N端缺失的蛋白的峰,这不违反重组产品α链缩短率1~2%的事实。去糖链β亚基组中的第一个箭头所指峰是有氨基酸缺失的β亚基,第二个箭头所指峰是完整的β亚基。糖苷酶酶切时间分析。
图2示本申请的双酶处理法所得的肽图。三条线分别是三个批次的 rhFSH。本申请方法所得的整体肽图。
图3示图2红圈处放大图,可见完整βL1与短βL1有效分离,且附近无βL1-2峰,说明βL1已酶切完全。为图2中圈处的放大图。
图4示对应于图2的三个批次rhFSH经欧洲药典方法而得到的α亚基的肽图。L1、L2、L3,均指从N端开始被酶切的第一个、第二个、第三个肽段;而L1-2是指L1和L2没有被酶切开而连在一起的肽段。其所用酶是Lys 特异性内切酶。欧洲药典方法得到的FSHα亚基的肽图。
图5示对应于图2的三个批次rhFSH经欧洲药典方法而得到的β亚基的肽图,未消化完全的β亚基与βL1-4重合。图中,L1-4是指L1、L2、L3、 L4没有被酶切开而连在一起的肽段。其所用酶是Lys特异性内切酶。欧洲药典方法得到的FSHβ亚基的肽图。
图6本申请的双酶处理方法的稳定性分析。糖苷酶+胰酶酶切稳定性考察。
图7为图6中52min处放大图,显示β亚基L1肽段稳定性。β亚基L1肽段稳定性考察(图6中52min处的放大图)。
图8是对应于图2中第二个批次的rhFSH样品经2.7μm RP-HPLC柱分析的结果。从左至右,依次是短βL1、完整βL1、短βL1-2、以及完整βL1-2。说明该样品的酶切不完全,但2.7μm的色谱柱能完全区分各个肽段的完整形式和缩短形式。2.7μm色谱柱可有效区分完整的βL1与βL1-2(分离度>1.5)、缺失的βL1与βL1-2。
图9是图8红圈处放大图,可见短βL1、完整βL1、短βL1-2、以及完整βL1-2都清楚地分开。图8中4个相关肽段的放大图。
实施例1
将实施例2所述还原烷基化并换液后的样品溶液100μL,按体积比1:50 (PNGaseF:样品)加入PNGase F,37℃水浴,分别取0min,10min,1h, 4h,8h,16h当时的样品,一起加载至HPLC色谱,按如下条件进行分析:
色谱柱:XBridge Peptide BEH C18 250mm×4.6mm,3.5μm;
流动相A:0.1%TFA-水溶液;
流动相B:0.1%TFA乙腈溶液;
检测波长:214nm;
流速:0.8mL/min;
柱温:30℃;
进样量:30μL;
表1洗脱梯度
如图1所示,原本可见于0min色谱图中的带糖链亚基的峰,自糖苷酶 F酶切10min后不再出现;并且,酶切10min和酶切16h结果一致,表明自糖苷酶F酶切10min开始,糖链就已切除干净。
实施例2
1.还原烷基化
rhFSH原液(浓度:1.42mg/mL)1mL,转入10KD超滤管中,4℃,12000 r/min离心30min,加入8moL/L尿素变性缓冲液1mL,4℃,12000r/min 离心30min,加入8moL/L尿素变性缓冲液,使终体积约为1.42mL,浓度约为1mg/mL,80℃水浴加热10min,将变性后样品冷却至室温。
每1mL样品溶液加入1moL/L二硫苏糖醇(DTT)溶液10μL,37℃水浴 1h;每1mL溶液加入1moL/L碘乙酸溶液25uL,室温避光反应1h,然后在每1mL溶液中加入1moL/L DTT溶液50μL终止反应。
将所得样品用3kD超滤管对50mM碳酸氢铵溶液超滤换液3次,使终浓度约为1mg/mL。放置-20℃冰箱备用,临用前放置室温待解冻后使用。
2.去糖基化与蛋白水解
取还原烷基化得到的1mg/mL rhFSH样品100μL,同时加入以下物质:
(1)按体积比1:50(PNGase F:样品)加入PNGase F,
(2)按体积比1:25(CaCl2:样品)加入0.5mol/L CaCl2溶液,
(3)按质量比1:40(胰蛋白酶:样品)加入1mg/mL胰蛋白酶,
37℃水浴4h,然后90℃加热10min以终止反应。
3.HPLC检测条件:
色谱柱:CORTECS C18+,150mm×4.6mm,2.7μm;
流动相A:0.1%三氟乙酸(TFA)-水溶液
流动相B:0.1%TFA-100%乙腈溶液;
检测波长:214nm;
流速:0.8mL/min;
柱温:55℃;
进样量:30μl;
表1洗脱梯度
4.结果见图2:完整βL1与短βL1已清楚地区分开,未见βL1-2肽段或βL1-4肽段。
实施例3稳定性检验
按实施例2的方法,将样品同时加入糖苷酶与胰蛋白酶,分别酶切4h、 5h、和6h后进行HPLC,结果见图6和7:在Ca2+存在的情况下,胰蛋白酶酶切4h,5h,6h的肽图结果基本一致,并且没有新的杂质峰出现。从下表可见,完整βL1与短βL1的峰面积较为稳定(RSD都小于1%),表明仪器和方法的精密度良好,酶切完全且稳定。
表2稳定性测定结果
Claims (10)
1.糖蛋白的双酶处理法,是将糖苷酶与蛋白水解酶同时加入目标糖蛋白中进行处理。
2.权利要求1的方法,其中糖苷酶是在30分钟内完成对所述糖蛋白的去糖基化的酶。
3.权利要求2的方法,其中的糖苷酶是糖苷酶F。
4.权利要求1的方法,其中的蛋白水解酶是经过至少4个小时而对目标糖蛋白的酶切达到所需程度的内切蛋白酶。
5.权利要求1的方法,其中的糖蛋白是指糖蛋白激素。
6.权利要求1的方法,用于处理重组人促卵泡激素(rhFSH)。
7.权利要求1的方法,还包括随后对糖蛋白进行肽图分析。
8.权利要求7的方法,其中的肽图分析通过液相色谱进行。
9.权利要求7的方法,用于测定糖蛋白的N端不均一性。
10.权利要求9的方法,是将糖苷酶、蛋白水解酶和Ca2+试剂同时加入rhFSH中进行酶切,待蛋白水解酶对目标糖蛋白进行完全酶切后,对酶切产物进行肽图分析。
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PB01 | Publication | ||
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20190507 |
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