CN108948176A - 一种骨桥蛋白特征肽及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种骨桥蛋白特征肽及其应用，该特征肽的氨基酸序列为GDSVAYGLK。本发明通过筛选骨桥蛋白的特征肽，获取该特征肽相应的内标肽，并利用高效液相色谱与质谱联用的分析技术，实现了骨桥蛋白的定量检测，该方法具有较好的线性、灵敏度、回收率和精密度。

Description

一种骨桥蛋白特征肽及其应用
技术领域
本发明涉及食品检测技术领域，尤其涉及一种骨桥蛋白特征肽及其应用。
背景技术
骨桥蛋白(OPN)是一种高度磷酸化，并且带负电的非胶原性骨基质糖蛋白，约含300个氨基酸残基，其中天冬氨酸、丝氨酸和谷氨酸残基占有很高的比例，约占总氨基酸量的一半。骨桥蛋白(OPN)中含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)序列，该序列在不同物种的骨桥蛋白(OPN)中都普遍存在，对于骨桥蛋白(OPN)发挥粘附功能起着重要的作用。
骨桥蛋白广泛分布于多种组织和细胞中，发挥着重要的作用：(1)骨桥蛋白(OPN)在对抗感染的非特异性免疫及自身免疫中起一定作用，有助于控制炎症反应的强度，调节组织修复的进程；(2)通过破坏晶体网阵而抑制草酸钙晶体的增长；(3)磷酸化的骨桥蛋白(OPN)能抑制钙矿化，促进骨细胞对钙离子的吸收；(4)骨桥蛋白(OPN)在血管重塑过程中起调节作用，能抑制动脉钙化的发生等等。
申请公布号为CN104165913A的中国专利申请文献公开了一种检测骨桥蛋白的电化学传感器及其构建方法，该电化学传感器为三电极体系，其中，铂丝电极作为对电极、饱和甘汞电极作为参比电极、修饰后金电极作为工作电极，所述修饰后金电极具有三维结构，先通过金巯键在金电极表面修饰ω-巯基十一酸(MUA)与6-巯基己醇(MCH)，再利用氨基与羧基的交联反应连接三维材料葡聚糖胺，短肽的羧基与葡聚糖胺的氨基相连，骨桥蛋白抗体通过Fc末端与短肽相连，即得到修饰后金电极；所述的短肽的序列为：Acetylated-HWRGWVA。该发明结合电化学技术和三维材料的优势，制备出一种新型的电化学生物传感器，通过交流阻抗方法对OPN进行高特异性定量检测。
申请公布号为CN101485381A的中国专利申请文献公开了牛乳中骨桥蛋白的提取方法，该方法按以下步骤实现：(1)离子交换色谱分离：1000～2000mL牛乳离心15～30min，去除沉淀物后与200～400mL DEAE-Sephacel树脂混合，在3～6℃条件下搅拌12～24h，然后静止，去除沉淀物后灌入色谱柱中，再在流速为3～5mL/min的条件下用浓度为0.01～0.015mol/L、pH值为7.2～7.6的磷酸缓冲溶液平衡色谱柱，然后在流速为3～5mL/min、检测波长为280nm的条件下进行梯度洗脱，梯度洗脱分三个阶段完成，并分别收集每一阶段的梯度洗脱液；(2)采用疏水色谱对步骤一获得的梯度洗脱液分别进行分离，分别获得含有骨桥蛋白的粗纯化组分的洗脱液；(3)再采用疏水色谱分别分离步骤二获得的含有骨桥蛋白的粗纯化组分的洗脱液，然后将收集液混合；(4)透析：采用去离子水进行透析，每2～6h更换一次去离子水；五、冻干：真空条件下在3～6℃干燥，即得到牛乳中的骨桥蛋白。
但是，对于利用骨桥蛋白的特征肽进行乳品中骨桥蛋白的定量检测的研究还未见报道。
发明内容
本发明提供了一种骨桥蛋白特征肽及其应用，该特征肽以及利用特征肽的检测方法能够准确检测乳品中骨桥蛋白的含量，具有较高的特异性、灵敏度、回收率和精密度。
具体技术方案如下：
一种骨桥蛋白特征肽，氨基酸序列为GDSVAYGLK。
本发明还提供了一种用于检测乳品中骨桥蛋白含量的内标肽，其氨基酸序列为
GDSV*AYGL*K。
本发明还提供了一种液质联用检测乳品中骨桥蛋白含量的试剂盒，包括骨桥蛋白特征肽和所述骨桥蛋白特征肽相对应的内标肽，所述骨桥蛋白特征肽的氨基酸序列为GDSVAYGLK；所述内标肽的氨基酸序列为GDSV*AYGL*K。
所述的骨桥蛋白特征肽可以在检测乳品内骨桥蛋白含量中应用；上述试剂盒也可以在检测乳品内骨桥蛋白含量中应用。
进一步地，所述乳品为奶牛、水牛、耗牛、山羊或绵羊的乳制品。
本发明还提供了一种液质联用检测乳品中骨桥蛋白含量的方法，该方法可以采用方案A或方案B中的任意一种：
其中，方案A：
(1)取待检测的样品，用水稀释，经变性处理、胰蛋白酶酶解处理后，再加入甲醛溶液进行二甲基化处理，得到预处理后的样品溶液；
(2)取如权利要求1所述的骨桥蛋白特征肽的标准品，用水稀释，经变性处理和胰蛋白酶酶解处理后，再加入同位素标记的甲醛溶液进行二甲基化处理，得到骨桥蛋白的内标肽溶液；
(3)将所述内标肽溶液加入至所述样品溶液中混合，得到待测样品；
(4)对所述待测样品进行固相萃取，再采用高效液相色谱-质谱联用技术进行检测；
(5)根据检测结果，计算待测样品中所述骨桥蛋白特征肽与其相对应的内标肽的峰面积比；
(6)将所述峰面积比代入标准曲线中，计算得到待测样品中骨桥蛋白特征肽的浓度，最后计算得到样品中骨桥蛋白的含量。
方案B：
(a)取待检测的样品，用水稀释，加入如权利要求2所述的内标肽，经变性处理、胰蛋白酶酶解处理后，得到待测样品；
(b)对所述待测样品进行固相萃取，再采用高效液相色谱-质谱联用技术进行检测；
(c)根据检测结果，计算待测样品中如权利要求1所述的骨桥蛋白特征肽与其相对应的内标肽的峰面积比；
(d)将所述峰面积比代入标准曲线中，计算得到待测样品中骨桥蛋白特征肽的浓度，最后计算得到样品中骨桥蛋白的含量。
上述两种检测方法均能够有效检测乳品中骨桥蛋白的含量。作为优选，可将上述两种检测方法进行结合，通过相互效正测定的结果，进一步提高检测的准确性。
作为优选，步骤(4)和步骤(b)中，所述固相萃取的条件为：萃取柱采用HLB固相萃取小柱，洗脱溶液采用甲醇。
作为优选，步骤(4)和步骤(b)中，高效液相色谱的检测条件为：色谱柱：AcquityBEH300C18柱(1.7μm，2.1×100mm)；柱温：35℃；进样体积：10μL；样品温度：15℃；流动相A：0.1％甲酸-水，流动相B：0.1％甲酸-乙腈，流速为0.3mL/min。
作为优选，步骤(4)和步骤(b)中，质谱的条件为：电喷雾模式：ESI+；质谱扫描方式：多反应监测(MRM)；毛细管电压4.5kV；离子源温度：150℃；脱溶剂温度：325℃，脱溶剂气流量：10L/min；鞘气温度：375℃，鞘气流量：11.5L/min。
进一步地，步骤(6)中，所述标准曲线由以下方法获得：将骨桥蛋白特征肽配制成系列浓度的标准溶液，经步骤(2)得到内标肽溶液，再经高效液相色谱-质谱联用技术分析，计算得到各标准品中骨桥蛋白特征肽与相应的内标肽的峰面积，绘制得到标准曲线。
步骤(d)中，所述标准曲线由以下方法获得：将骨桥蛋白特征肽配制成系列浓度的标准溶液，加入内标肽后经高效液相色谱-质谱联用技术分析，计算得到各标准品中骨桥蛋白特征肽与相应的内标肽的峰面积，绘制得到标准曲线。
具体地，内标法计算过程如下：
(A)将骨桥蛋白特征肽配制成系列浓度的标准工作曲线溶液，重复所述方法中的步骤(5)或者步骤(c)，进行分离检测，将标准工作曲线中的骨桥蛋白特征肽及其相对应的内标肽的峰面积比与对应的溶液浓度进行线性回归，得出骨桥蛋白特征肽的方程Y＝kX+b；其中，Y为骨桥蛋白特征肽与其相对应的内标肽的峰面积比，X为骨桥蛋白特征肽的浓度，单位为ng/mL；k为线性方程斜率；b为线性方程的截距。
(B)将所述方法步骤(5)或步骤(c)中得到的峰面积比代入上述方程中，计算得到骨桥蛋白特征肽的浓度；再将所述浓度带入含量计算公式中，最终计算得到样品中骨桥蛋白的含量；
所述公式为其中，Cx为待检测的样品中骨桥蛋白的含量，单位为mg/L；na为待检测的样品中骨桥蛋白特征肽的浓度；M1为骨桥蛋白分子量：29240.88g/mol，M2为骨桥蛋白特征肽的分子量：908.46g/mol V1为复溶体积，单位为mL；V2为试样取样体积，单位为mL；F为样品稀释倍数，本标准中F＝4。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明通过筛选骨桥蛋白的特征肽，获取该特征肽相应的内标肽，并利用高效液相色谱与质谱联用的分析技术，实现了骨桥蛋白的定量检测，该方法具有较好的线性、灵敏度、回收率和精密度。
(2)本发明选择骨桥蛋白中的特征肽段作为检测物质，适用于变性蛋白的检测，可以满足样品中的变性与非变性蛋白的同时检测，保证了方法的准确性。
附图说明
图1为实施例1中提及的论上奶牛、水牛、牦牛、山羊、绵羊中骨桥蛋白的氨基酸序列。
图2为实施例1中候选肽段的色谱图。
图3为实施例1中不同洗脱液溶度的回收率图。
图4为实施例1中不同基质下的标准曲线。
图5为实施例2中骨桥蛋白标签肽的标准曲线。
具体实施方式
下面结合具体实施方式和附图说明对本发明进行详细阐述。下列实施例中提及的“特征肽”是指人工合成的既未经同位素标记也未经同位素二甲基化标记的肽段，即：GDSVAYGL，也称为特异肽/特异肽段；“标签肽”是指特征肽经二甲基化标记后的肽段(该标签肽仅针对内标肽1而言，内标肽2由于不进行二甲基化标记，所以无相应的标签肽)。
实施例1
1、特征肽的寻找和确定
特异肽段的选择是靶向蛋白质组学检测技术中的关键步骤，它直接关系到定量方法的准确性。在特异肽段选择过程中，通常将理论数据库与实际样品检测数据结合分析，应用生物信息化的软件协助蛋白质酶解产物的预测与计算。
本发明选择Uniprot数据库以及Peptide Mass工具对奶牛、牦牛、水牛、绵羊、山羊乳中骨桥蛋白OPN(如图1所示)可能存在的胰蛋白酶酶切肽段进行预测与计算。
为了验证实际样品中是否存在理论上所确定的肽段，本发明将5种奶制品(即样品)分别进行前处理，酶解后直接加入甲酸终止反应，样品溶液通过高分辨质谱(QExactive)进行dd-MS模式全扫描，经Proteome Discoverer 2.1软件及Uniprot蛋白质组学数据库(http://www.uniprot.org)分析比对，确定样品中存在的肽段。根据肽段筛选原则，选择含6个以上及20个以下氨基酸个数的肽段。氨基酸组成个数越多，肽段序列越长，肽段雷同的可能性越小，其特异性越强。
因此，本实验选择YPDAVATWLKPDPSQK、GDSVAYGLK和LSQEFHSLEDK作为候选肽段(如图2所示)。
特征肽的酶解特性会影响方法的准确性和效率。LSQEFHSLEDK肽酶解时间过长，实验效率低，不予考虑。YPDAVATWLKPDPSQK肽在二甲基化后存在干扰峰，导致定量不准，不予考虑。故，本发明以GDSVAYGLK为骨桥蛋白的特征肽。
2、内标肽的获取
利用两种内标肽对乳品中骨桥蛋白进行定量化检测。
第一种，采用同位素二甲基标记法获得内标肽1，内标肽1的制备方法是：将骨桥蛋白特征肽标准溶液加入同位素甲醛溶液进行同位素二甲基标记，得到内标肽1(内标肽1的具体制备方法见下文)。
第二种，采用化学合成的方法获得内标肽2，即：GDSV*AYGL*K。内标肽2通过化学合成方法将特征肽进行同位素标记后得到。
3、待测样品的前处理方法
3.1针对内标肽1的待测样品的前处理方法
(1)液态奶：取50μL液态奶于2mL塑料管中，加入950μL超纯水，涡旋混匀。
奶粉样品：称取2.5g奶粉样品溶解，转移到容量瓶中定容至50mL；取100μL液态奶于2mL塑料管中，加入900μL超纯水，涡旋混匀。
(2)准确吸取300μL试样溶液，加入4.2mL碳酸氢钠(100mmol/L)溶液涡旋混匀后，再加入60μL DTT溶液(500mmol/L)，70℃恒温反应30min，取出冷却至室温，加入180μL IAA溶液(500mmol/L)，避光静置30min，再加入60μL胰蛋白酶溶液(1mg/mL)，37℃恒温酶解12小时以上，完成后取出，加入150μL甲醛溶液(4％)和150μL氰基硼氢化钠溶液(0.6mol/L)，涡旋混匀后在25℃放置1小时，最后加入600μL氨水(1％)和300μL甲酸终止反应，得到前处理后的待测样品溶液。
(3)移取特征肽溶液(10μg/mL)100μL，加入25μL同位素甲醛溶液(4％)和25μL氰基硼氢化钠溶液(0.6mol/L)，涡旋混匀后在25℃放置1小时，最后加入100μL氨水(1％)和50μL甲酸终止反应，放置30min，得到内标肽1溶液。
(4)将预处理后的待测样品溶液放置30min后，准确移取5mL溶液，加入50μL内标肽1溶液混匀，得到待萃取样品溶液。
3.2针对内标肽1的标签肽溶液
取特征肽溶液(10μg/mL)100μL，加入700μL超纯水，加入25μL甲醛溶液(4％)和25μL氰基硼氢化钠溶液(0.6mol/L)，涡旋混匀后在25℃放置1小时，最后加入100μL氨水(1％)和50μL甲酸终止反应，放置30min，得到标签肽溶液。
3.3针对内标肽2的待测样品的前处理方法
(1)液态奶：取50μL液态奶于2mL塑料管中，加入950μL超纯水，涡旋混匀。
奶粉样品：称取2.5g奶粉样品溶解，转移到容量瓶中定容至50mL；取100μL液态奶于2mL塑料管中，加入900μL超纯水，涡旋混匀。
(2)准确吸取300μL试样溶液，加入4.2mL碳酸氢钠(100mmol/L)溶液涡旋混匀后，再加入60μL DTT溶液(500mmol/L)，70℃恒温反应30min，取出冷却至室温，加入180μL IAA溶液(500mmol/L)，避光静置30min，再加入60μL胰蛋白酶溶液(1mg/mL)，37℃恒温酶解12小时以上，完成后取出，加入60μL甲酸终止反应，放置30min后加入1080μL超纯水(总体积为6mL)。
(3)准确移取预处理后的待测样品溶液5mL，加入60μL内标肽2，得到待萃取样品溶液。
4、固相萃取条件的优化
选择Waters Oasis HLB固相萃取小柱；为了获得较高的回收率，对洗脱液和洗脱体积进行优化；通过比较溶剂标曲和基质标曲，进一步说明固相萃取技术能净化样品基质。
a、洗脱溶液的优化
HLB固相萃取小柱，用甲醇溶液活化，水平衡后，将前处理后的待测样品溶液上样，10％甲醇溶液淋洗，弃去全部流出液。分别用6mL的60％、70％、80％、90％、100％的甲醇水溶液洗脱。收集所有洗脱液，氮吹至近干。用超纯水复溶至1mL，过0.22μm滤膜，以备进样检测分析。
结果如图3，回收率均在90％以上，其中纯甲醇洗脱时回收率最高。氮吹时，水含量越高，氮吹时间越长。综合考虑，本实验选择纯甲醇作为洗脱溶液。
b、洗脱体积的优化
HLB固相萃取小柱，用甲醇溶液活化，水平衡后，将前处理后的待测样品溶液上样，10％甲醇溶液淋洗，弃去全部流出液。分别用1mL、2mL、3mL、4mL、5mL、6mL纯甲醇洗脱，收集所有洗脱液，氮吹至近干。用超纯水复溶至1mL，过0.22μm滤膜，以备进样检测分析。
结果为：1mL、2mL、3mL、4mL、5mL、6mL纯甲醇洗脱，其回收率分别为95.8％、96.5％、96.2％、96.3％、98.4％、98.0％，可见在不同体积洗脱液处理下，回收率无明显差异。考虑氮吹效率以及试剂用量，本实验选择用2mL纯甲醇进行洗脱。
c、基质效应
移取10μL、25μL、50μL、100μL、200μL标签肽溶液(1μg/mL)于2mL进样小瓶，分别用0.1％甲酸水溶液(Curve 1)、样品经3.1中样品的前处理步骤(1)操作后的溶液(Curve2)、样品经3.1中样品的前处理步骤(1)并使用优化后的固相萃取条件富集后的溶液(Curve3)补足体积至1mL。混匀后，以备进样分析(如图4所示)。
从3条不同基质稀释的标准曲线可见，存在基质效应的影响，但是过HLB小柱后，基质效应减缓，说明使用HLB小柱不仅可以富集特征肽，而且能减少基质效应。
5、液相色谱和质谱的条件
5.1采用的仪器设备如下：
超高效液相色谱串联静电场轨道离子阱质谱(UPLC-Q-Exactive，ThermoFisherScientific公司，美国)；超高效液相色谱串联四级杆质谱(UHPLC-MS/MS，Agilent公司，美国)。
5.2采用的液相色谱条件如下：
(1)硅烷基C18柱，柱长100mm，柱内径2.1mm；填料粒径1.7μm，孔径或等效者，柱温35℃；
(2)流动相A相0.1％甲酸-水；B相0.1％甲酸-乙腈；
(3)梯度洗脱：参考梯度洗脱程序见表1；
表1流动相梯度洗脱程序
(4)流动相流速：0.3mL/min；
(5)样品温度：15℃；
(6)进样体积：10μL。
5.3针对内标肽1所采用的质谱条件如下：
电喷雾模式：ESI+；质谱扫描方式：多反应监测(MRM)；毛细管电压4.5kV；离子源温度：150℃；脱溶剂温度：325℃，脱溶剂气流量：10L/min；鞘气温度：375℃，鞘气流量：11.5L/min；其它质谱参数见表2。
表2质谱参数
注：表中带*为定量离子；不同质谱仪器，质谱参数条件可能存在差异，测定前应将质谱条件优化到最佳。
5.4针对内标肽2所采用的质谱条件如下：
电喷雾模式：ESI+；质谱扫描方式：多反应监测(MRM)；毛细管电压4.5kV；离子源温度：150℃；脱溶剂温度：325℃，脱溶剂气流量：10L/min；鞘气温度：375℃，鞘气流量：11.5L/min；其它质谱参数见表3。
表3质谱参数
注：表中带*为定量离子；不同质谱仪器，质谱参数条件可能存在差异，测定前应将质谱条件优化到最佳。
实施例2
1、针对内标肽1的标准曲线以及回收率和精密度
(1)标准曲线的建立
准确吸取骨桥蛋白标签肽溶液(1μg/mL)10μL、25μL、50μL、75μL、100μL，并加入50μL内标肽1溶液(1μg/mL)，再分别加入0.1％的甲酸水溶液940μL、925μL、900μL、875μL、850μL涡旋混匀。
所得溶液按实施例1第5部分所述的液相色谱和质谱条件进行检测分析，每个样品平行检测6次，所得结果制作标准曲线如图5所示，标准曲线公式：y＝0.024985x-0.041725，R2＝0.999，其中x为骨桥蛋白标签肽的浓度(ng/mL)，y为样品峰面积与内标肽1峰面积的比值。
(2)回收率与精密度
方法准确性主要通过三个浓度水平加标实验来评估，每个加标水平实验平行六次，加标水平及回收率结果，如表4所示。精密度则通过日间、日内(连续重复三天)RSD来表示，结果显示日内RSD均小于4.0％；日间RSD均小于6.2％。
表4准确度及精密度结果
2、针对内标肽2的标准曲线以及回收率和精密度
(1)标准曲线的建立
准确吸取骨桥蛋白特征肽标准溶液(1μg/mL)10μL、25μL、50μL、75μL、100μL，并加入50μL内标肽2(1μg/mL)，再分别加入0.1％的甲酸水溶液940μL、925μL、900μL、875μL、850μL，涡旋混匀。
所得溶液按实施例1第5部分所述的液相色谱和质谱条件进行检测分析，每个样品平行检测6次，所得结果制作标准曲线如图1所示，标准曲线公式：y＝0.0125x-0.0166，R2＝0.998，其中x为骨桥蛋白特征肽的浓度(ng/mL)，y为样品峰面积与内标肽峰面积的比值。
(2)回收率与精密度
方法准确性主要通过三个浓度水平加标实验来评估，每个加标水平实验平行六次，加标水平及回收率结果，如表5所示。精密度则通过日间、日内(连续重复三天)RSD来表示，结果显示日内RSD均小于3.0％；日间RSD均小于2.0％。
表5准确度及精密度结果
内标肽1的方法回收率较高，但精密度较低。二甲基化方法所加试剂量小，操作误差大，因此其精密度较差。而内标肽2的方法回收率偏低，但是稳定性好，易操作，样品检测效率高。
实施例3采用内标肽1进行乳及乳制品中骨桥蛋白含量的检测
选取奶牛奶、水牛奶、牦牛奶、山羊奶、绵羊奶和配方奶粉作为研究对象，进行乳及乳制品中骨桥蛋白含量的测定，具体方法如下：
(1)液态奶：取50μL液态奶于2mL塑料管中，加入950μL超纯水，涡旋混匀。
奶粉样品：称取2.5g奶粉样品溶解，转移到容量瓶中定容至50mL。取100μL液态奶于2mL塑料管中，加入900μL超纯水，涡旋混匀。
(2)准确吸取300μL样品溶液，加入4.2mL碳酸氢钠(100mmol/L)溶液涡旋混匀，加入60μL DTT溶液(500mmol/L)，70℃恒温反应30min，取出冷却至室温，加入180μL IAA溶液(500mmol/L)，避光静置30min，加入60μL胰蛋白酶溶液(1mg/mL)，37℃恒温酶解12小时以上，完成后取出加入150μL甲醛溶液(4％)和150μL氰基硼氢化钠溶液(0.6mol/L)，涡旋混匀后在25℃放置1小时，最后加入600μL氨水(1％)和300μL甲酸终止反应，得到前处理后的待测样品溶液。
(3)准确移取特征肽(10μg/mL)100μL，加入25μL同位素甲醛溶液(4％，v/v)和25μL氰基硼氢化钠溶液(0.6mol/L)，涡旋混匀后在室温放置1小时，最后加入100μL氨水(1％)和50μL甲酸终止反应，放置30min，得到内标肽1溶液。
(4)将预处理后的待测样品溶液放置30min后，准确移取5mL溶液，加入50μL内标肽1溶液混匀，得到待萃取样品溶液。
(5)采用HLB固相萃取小柱对待萃取样品溶液进行固相萃取处理，用甲醇溶液活化，水平衡后，将上述溶液上样，10％甲醇溶液淋洗，弃去全部流出液。用2mL甲醇溶液洗脱，收集所有洗脱液，氮吹至近干。用超纯水复溶至1mL，过0.22μm滤膜，所得溶液作为进样液进行高效液相色谱-质谱联用分析(具体液相色谱和质谱的条件见实施例1第5部分)。
检测结果，如表6所示。
表6不同奶制品中骨桥蛋白的含量
总结：该方法可以测定奶牛奶，水牛奶，牦牛奶，山羊奶，绵羊奶以及其乳制品中的骨桥蛋白含量，在鲜奶中，牦牛奶中骨桥蛋白含量最高，为74.3mg/L，奶牛奶和水牛奶中骨桥蛋白含量分别为48.7mg/L和49.5mg/L，结果相近。绵羊奶和山羊奶中骨桥蛋白含量也相近，分别为48.8mg/L和41.9mg/L。配方奶粉1、3中骨桥蛋白结果相近，分别为41.9mg/100g和34.0mg/100g。配方奶粉2、4中骨桥蛋白含量较高。
实施例4采用内标肽2进行乳及乳制品中骨桥蛋白含量的检测
选取奶牛奶、水牛奶、牦牛奶、山羊奶、绵羊奶和配方奶粉作为研究对象，进行乳及乳制品中骨桥蛋白含量的测定，具体方法如下：
(1)液态奶：取50μL液态奶于2mL塑料管中，加入950μL超纯水，涡旋混匀。
奶粉样品：称取2.5g奶粉样品溶解，转移到容量瓶中定容至50mL。取100μL液态奶于2mL塑料管中，加入900μL超纯水，涡旋混匀。
(2)准确吸取300μL试样溶液，加入4.2mL碳酸氢钠(100mmol/L)溶液涡旋混匀后，再加入60μL DTT溶液(500mmol/L)，70℃恒温反应30min，取出冷却至室温，加入180μL IAA溶液(500mmol/L)，避光静置30min，再加入60μL胰蛋白酶溶液(1mg/mL)，37℃恒温酶解12小时以上，完成后取出，加入60μL甲酸终止反应，放置30min后加入1080μL超纯水(总体积为6mL)。
(3)准确移取预处理后的待测样品溶液5mL，加入50μL内标肽2溶液混匀，得到待萃取样品溶液。
(4)采用HLB固相萃取小柱对待萃取样品溶液进行固相萃取处理，用甲醇溶液活化，水平衡后，将上述溶液上样，10％甲醇溶液淋洗，弃去全部流出液。用2mL甲醇溶液洗脱，收集所有洗脱液，氮吹至近干。用超纯水复溶至1mL，过0.22μm滤膜，所得溶液作为进样液进行高效液相色谱-质谱联用分析(具体液相色谱和质谱的条件见实施例1第5部分)。
检测结果，如表7所示。
表7不同奶制品中骨桥蛋白的含量
总结：该方法可以测定奶牛奶，水牛奶，牦牛奶，山羊奶，绵羊奶以及其乳制品中的骨桥蛋白含量，在鲜奶中，牦牛奶中骨桥蛋白含量较其他物种奶中含量高，为61.4mg/L。奶牛奶和水牛奶中骨桥蛋白含量分别为48.0mg/L和44.6mg/L，结果相近。山羊奶和绵羊奶中骨桥蛋白含量相近，分别为36.4mg/L和40.5mg/L。配方奶粉1、3中骨桥蛋白结果相近，分别为39.1mg/100g和34.5mg/100g。配方奶粉2、4中骨桥蛋白含量较高，在80mg/100g左右。
采用T-test对实施例3和实施例4数据进行分析发现P＞0.05(P＝0.615)，说明两个方法的检测结果具有可比性。
序列表
<110> 杭州璞湃科技有限公司
<120> 一种骨桥蛋白的特征肽及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Gly Asp Ser Val Ala Tyr Gly Leu Lys
1 5

Claims (10)

1.一种骨桥蛋白特征肽，其特征在于，氨基酸序列为GDSVAYGLK。
2.一种用于检测乳品中骨桥蛋白含量的内标肽，其特征在于，氨基酸序列为GDSV*AYGL*K。
3.一种液质联用检测乳品中骨桥蛋白含量的试剂盒，其特征在于，包括骨桥蛋白特征肽和所述骨桥蛋白特征肽相对应的内标肽，所述骨桥蛋白特征肽的氨基酸序列为GDSVAYGLK；所述内标肽的氨基酸序列为GDSV*AYGL*K。
4.如权利要求1所述的骨桥蛋白特征肽在检测乳品内骨桥蛋白含量中的应用。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述乳品为奶牛、水牛、耗牛、山羊或绵羊的乳制品。
6.一种液质联用检测乳品中骨桥蛋白含量的方法，其特征在于，采用方案A或方案B；
方案A：
(1)取待检测的样品，用水稀释，经变性处理、胰蛋白酶酶解处理后，再加入甲醛溶液进行二甲基化处理，得到预处理后的样品溶液；
(2)取如权利要求1所述的骨桥蛋白特征肽的标准品，用水稀释，经变性处理和胰蛋白酶酶解处理后，再加入同位素标记的甲醛溶液进行二甲基化处理，得到骨桥蛋白的内标肽溶液；
(3)将所述内标肽溶液加入至所述样品溶液中混合，得到待测样品；
(4)对所述待测样品进行固相萃取，再采用高效液相色谱-质谱联用技术进行检测；
(5)根据检测结果，计算待测样品中所述骨桥蛋白特征肽与其相对应的内标肽的峰面积比；
(6)将所述峰面积比代入标准曲线中，计算得到待测样品中骨桥蛋白特征肽的浓度，最后计算得到样品中骨桥蛋白的含量。
方案B：
(a)取待检测的样品，用水稀释，加入如权利要求2所述的内标肽，经变性处理、胰蛋白酶酶解处理后，得到待测样品；
(b)对所述待测样品进行固相萃取，再采用高效液相色谱-质谱联用技术进行检测；
(c)根据检测结果，计算待测样品中如权利要求1所述的骨桥蛋白特征肽与其相对应的内标肽的峰面积比；
(d)将所述峰面积比代入标准曲线中，计算得到待测样品中骨桥蛋白特征肽的浓度，最后计算得到样品中骨桥蛋白的含量。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(4)和步骤(b)中，所述固相萃取的条件为：萃取柱采用HLB固相萃取小柱，洗脱溶液采用甲醇。
8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(4)和步骤(b)中，高效液相色谱的检测条件为：色谱柱：Acquity BEH 300 C18柱(1.7μm，2.1×100mm)；柱温：35℃；进样体积：10μL；样品温度：15℃；流动相A：0.1％甲酸-水，流动相B：0.1％甲酸-乙腈，流速为0.3mL/min。
9.如权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(4)和步骤(b)中，质谱的条件为：电喷雾模式：ESI+；质谱扫描方式：多反应监测(MRM)；毛细管电压4.5kV；离子源温度：150℃；脱溶剂温度：325℃，脱溶剂气流量：10L/min；鞘气温度：375℃，鞘气流量：11.5L/min。
10.如权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(6)中，所述标准曲线由以下方法获得：将骨桥蛋白特征肽配制成系列浓度的标准溶液，经步骤(2)得到内标肽溶液，再经高效液相色谱-质谱联用技术分析，计算得到各标准品中骨桥蛋白特征肽与相应的内标肽的峰面积，绘制得到标准曲线。
步骤(d)中，所述标准曲线由以下方法获得：将骨桥蛋白特征肽配制成系列浓度的标准溶液，加入内标肽后经高效液相色谱-质谱联用技术分析，计算得到各标准品中骨桥蛋白特征肽与相应的内标肽的峰面积，绘制得到标准曲线。
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