CN113866312A

CN113866312A - Pirin同源蛋白的特征肽及其应用

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Publication number: CN113866312A
Application number: CN202111155008.1A
Authority: CN
Inventors: 郭宾; 张璐; 王美玲; 丑芳; 文泽星; 魏丹; 贾宗超
Original assignee: Hunan Normal University
Current assignee: Hunan Normal University
Priority date: 2021-09-29
Filing date: 2021-09-29
Publication date: 2021-12-31
Anticipated expiration: 2041-09-29
Also published as: CN113866312B

Abstract

本发明涉及一种Pirin同源蛋白的特征肽及其应用，所述特征肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4所示。利用上述特征肽，可以通过液质联用检测方法测定Pirin同源蛋白，能够满足复杂生物样品中高效、专一、灵敏、准确地对Pirin同源蛋白进行绝对定量，进而可实现不同生物样品如肝细胞、猪肉组织、黑色素瘤细胞等的Pirin同源蛋白表达差异的比较。

Description

Pirin同源蛋白的特征肽及其应用

技术领域

本发明涉及分子生物技术领域，特别是涉及一种Pirin同源蛋白的特征肽及其应用。

背景技术

Pirin是一种高度保守的蛋白质，最初是在1997年通过酵母双杂交筛选分离出来的，通过固相酶联免疫吸附和Western blot实验确定了Pirin是一种核蛋白，它主要位于亚核的点状结构内，在动物组织中普遍表达，且广泛存在于各种生物中。其N端结构高度保守，从结构和序列同源性上被认为是功能多样的Cupin超家族成员。Pirin同源蛋白可以调节许多生物过程，主要与细胞凋亡和应激相关。例如，人类hPirin是转录调节因子；拟南芥中的直系同源蛋白AtPirin1是一种多功能调节蛋白，能调节种子的发芽和早期幼苗发育；番茄中Le-Pirin蛋白与细胞死亡相关；在细胞质超氧化物歧化酶缺陷型小鼠的脾脏和肾脏中，Pirin表达明显上调。尽管Pirin的生物学功能尚未明确，但上述研究可以说明Pirin蛋白在许多物种的基本细胞过程中的重要性。

传统的大分子蛋白类化合物分析研究多采用免疫印迹、酶联免疫吸附方法(ELISA)等，但这些方法存在周期长、可能存在蛋白交叉反应、重现性差、容易产生假阳性等缺陷。质谱是蛋白质定量的另一常用工具，通常与液相色谱联合使用。目前有多种质谱仪可以用来定量蛋白质，应用最广泛的是三重四级杆质量仪。该仪器可以选择特定的前体离子和产物离子，组成离子对，进行定性定量分析，实现最灵敏和可重复的测量。相比于免疫分析方法，质谱法不需要抗体，且可以监测多个蛋白质的不同肽段离子对的转换，进行多重分析，而且广泛地应用于临床研究、食品监测、环境保护等方面。目前，研究蛋白质的两种主要方法是自上而下法和自下而上法。自上而下法的分析对象为完整蛋白质，完整蛋白质分子量较大，即使在质谱中碎裂后，得到的依然是大分子量片段，仪器容易受到限制，成本较高，且蛋白质较肽段相比更难溶解。而自下而上法的分析对象为蛋白质酶解后的肽段，进而间接分析蛋白质，肽段分子量较小，对仪器的兼容性大，且更容易溶解，适用于分析复杂样品。

目前，尚缺乏有效鉴定和定量Pirin同源蛋白的方法，阻碍了该同源蛋白组织表达差异的检测。

发明内容

基于此，本发明提供了一种Pirin同源蛋白的特征肽，通过使用该Pirin同源蛋白的特征肽可有效鉴定和定量Pirin同源蛋白。

一种Pirin同源蛋白的特征肽，所述特征肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：1、SEQ IDNO：2、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4所示。

本发明利用BLAST比对分析目标蛋白质理论酶解肽段对应的匹配得分与干扰数目，虚拟筛选出属于Pirin同源蛋白的若干候选特征肽段序列，并进一步对候选肽段的稳定性、灵敏度、抗干扰性等进一步优化，最终确立了可用于定性与定量的特征肽HSQPIPK、SIGRPELK、EQSEGVGAR以及TPTLYLDFK。利用上述特征肽，可以通过液质联用检测方法测定Pirin同源蛋白，能够满足复杂生物样品中高效、专一、灵敏、准确地对Pirin同源蛋白进行绝对定量，进而可实现不同生物样品如肝细胞、猪肉组织、黑色素瘤细胞等的Pirin同源蛋白表达差异的比较。

本发明还提供了如上所述的特征肽在Pirin同源蛋白的检测中的应用。

在其中一个实施例中，其通过液质联用检测方法对待测样品中所述特征肽的含量进行检测。

在其中一个实施例中，所述检测方法包括以下步骤：

将待测样品进行酶解处理，得到酶解产物；

将所述酶解产物进行二甲基化衍生处理，得到二甲基化产物；

对所述二甲基化产物进行液质联用检测，分析其中所述特征肽的含量。

在其中一个实施例中，所述酶解处理包括以下步骤：将待测样品加热以使蛋白变性，冷却后加入尿素进行反应，然后加入胰蛋白酶处理，所述胰蛋白酶与所述待测样品中蛋白质的质量比为1:(18～22)。

在其中一个实施例中，所述二甲基化衍生处理包括以下步骤：将甲醛溶液和氰基硼氢化钠溶液混合，然后再与所述酶解产物混合，反应70～90分钟后终止反应。

在其中一个实施例中，在所述二甲基化衍生处理之前还包括以下步骤：将所述酶解产物上样至C18固相萃取柱，加入含0.8wt％～1.2wt％甲酸和2wt％～4wt％乙腈的水溶液进行清洗，然后加入含0.08wt％～0.12wt％甲酸、78wt％～82wt％乙腈的水溶液进行洗脱，收集洗脱液，得到纯化的酶解产物。

在其中一个实施例中，所述液质联用检测中液相色谱的条件为：色谱柱为Accucore Polar Premium C18，流动相A相为甲酸水溶液，流动相B相为甲酸乙腈溶液，流速为0.1mL/min～0.5mL/min，进样体积为1μL～5μL，洗脱方式为梯度洗脱。

在其中一个实施例中，所述液质联用检测中质谱的条件为：离子源为电喷雾离子源，雾化气流速为2.5L/min～3.5L/min，干燥气流速为8L/min～12L/min，脱溶剂管温度为240℃～260℃，加热模块温度为380℃～420℃，离子源接口电压为3.8kV～4.2kV，扫描模式为多反应监测。

本发明还提供了一种Pirin同源蛋白的检测试剂盒，其包括酶解试剂和如上所述的特征肽或内标肽，所述内标肽为如上所述的特征肽经过同位素标记得到。

附图说明

图1为实施例1中hPirin蛋白的序列以及酶切位点示意图；

图2为实施例1中酶解产物的提取离子流图；

图3为实施例1中酶解条件优化的结果图，其中A为二硫苏糖醇和碘乙酰胺的使用比例优化结果，B为酶与底物比例的优化结果；

图4为实施例1中固相萃取条件优化的结果图，其中A为清洗液成分优化结果，B为清洗液体积优化结果，C为洗脱液成分优化结果，D为洗脱液体积优化结果；

图5为实施例1中二甲基化反应条件优化的结果图，其中A为甲醛溶液体积优化结果，B为氰基硼氢化钠溶液体积优化结果，C为反应时间优化结果；

图6为实施例1中二甲基化前后特征肽响应变化的结果图，其中A为峰面积对比图，B为保留时间对比图；

图7为实施例1中肝细胞样品的特征肽离子流图，其中A为HSQPIPK的图谱，B为EQSEGVGAR的图谱；

图8为实施例2中Pirin同源蛋白序列的对比图，从上到下依次为人(O00625)、小鼠(Q9D711)、猪(K7GKW6)、牛(A6QQH1)、羊(W5PRF2)。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述，并给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

本发明一实施例的Pirin同源蛋白的特征肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1、SEQID NO：2、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4所示。

SEQ ID NO：1	HSQPIPK
		SEQ ID NO：2	SIGRPELK
SEQ ID NO：3	EQSEGVGAR
		SEQ ID NO：4	TPTLYLDFK

本发明一实施例的Pirin同源蛋白的检测方法，其通过液质联用检测方法对待测样品中上述特征肽的含量进行检测。

可以理解，利用特征肽检测Pirin同源蛋白的方法不限于此，可根据需要选择，例如还可以通过定量肽段串联体法(Quantification concatamers，QconCAT)对特征肽进行定量检测，进而实现对Pirin同源蛋白的定量检测。

在一个具体示例中，Pirin同源蛋白的检测方法包括以下步骤S1～S3：

S1、将待测样品进行酶解处理，得到酶解产物；

S2、将酶解产物进行二甲基化衍生处理，得到二甲基化产物；

S3、对二甲基化产物进行液质联用检测，分析其中上述特征肽的含量。

在一个具体示例中，酶解处理包括以下步骤：将待测样品加热以使蛋白变性，冷却后加入尿素进行反应，然后加入胰蛋白酶处理，胰蛋白酶与待测样品中蛋白质的质量比为1:(18～22)。优选地，将待测样品于85～95℃水浴加热4～6min，尿素的浓度为8M～10M，胰蛋白酶处理的时间为15～17小时。加热和尿素两种变性方法并用会有更高的酶解效率，为了防止尿素在高温条件下转化为氨甲酰化伯胺，在尿素变性之前先将样品进行热变性。而且，在酶解过程当中不需要加入二硫苏糖醇和碘乙酰胺进行还原烷基化，可以避免副反应，缩短工作流程。

在一个具体示例中，二甲基化衍生处理包括以下步骤：将甲醛溶液和氰基硼氢化钠溶液混合，然后再与酶解产物混合，反应70～90分钟后终止反应。优选地，甲醛溶液的浓度为2wt％～6wt％，氰基硼氢化钠溶液的浓度为500mM～700mM。为减少副反应的发生，提前将甲醛和氰基硼氢化钠混匀，加入多肽混合液中。

在一个具体示例中，在二甲基化衍生处理之前还包括以下步骤：将酶解产物上样至C18固相萃取柱，加入含0.8wt％～1.2wt％甲酸和2wt％～4wt％乙腈的水溶液进行清洗，然后加入含0.08wt％～0.12wt％甲酸、78wt％～82wt％乙腈的水溶液进行洗脱，收集洗脱液，得到纯化的酶解产物。固相萃取是为了除去反应液中对质谱造成污染的物质，同时可以去除实际样品中的磷脂，蛋白质和盐等物质，起到净化样品、富集目标物、降低基质效应的作用。可选地，在二甲基化衍生处理之后也可以进行上述固相萃取步骤洗去乙酸钠、氰基硼氢化钠等物质。

在一个具体示例中，液质联用检测中液相色谱的条件为：色谱柱为AccucorePolar Premium C18，流动相A相为甲酸水溶液，流动相B相为甲酸乙腈溶液，流速为0.1mL/min～0.5mL/min，进样体积为1μL～5μL，洗脱方式为梯度洗脱。

在一个具体示例中，液质联用检测中质谱的条件为：离子源为电喷雾离子源，雾化气流速为2.5L/min～3.5L/min，干燥气流速为8L/min～12L/min，脱溶剂管温度为240℃～260℃，加热模块温度为380℃～420℃，离子源接口电压为3.8kV～4.2kV，扫描模式为多反应监测。

本发明还提供了一种Pirin同源蛋白的检测试剂盒，其包括如上所述的特征肽或内标肽，内标肽为上述特征肽经过同位素标记得到。

在一个具体示例中，检测试剂盒还包括蛋白提取试剂、细胞裂解试剂、酶解试剂(例如胰蛋白酶等)、甲醛和氰基硼氢化钠中的一种或多种。

本发明一实施例的核酸分子，其编码如上所述的特征肽即编码链，或与编码如上所述的特征肽的核苷酸序列反向互补即反义链。

本发明一实施例的重组载体，其含有如上所述的核酸分子的核苷酸序列。

下面主要结合具体实施方式和附图对本发明作进一步详细的说明。

实施例1

hPirin即人体Pirin同源蛋白，是一种高度保守的金属核蛋白，在大部分组织中弱表达，且在肝脏和心脏中的表达量最高。hPirin具备槲皮素2,3-双加氧酶活性，Pirin的过表达可以降低槲皮素的抗病毒抑制作用。此外Pirin还是核转录因子，NF-κB氧化还原调节剂，与免疫和应激反应相关。而一些转录因子的表达失调或结构异常会破坏细胞正常分化，最终可能导致疾病的发生。此外hPirin的表达量还与不同类型肿瘤相关。所以，建立一种鉴定及定量hPirin的方法显得极为重要。目前，关于Pirin表达量的研究方式大多都是免疫印迹法，该方法耗时且成本较高，而质谱法以高灵敏度、特异性的优势已经广泛用于蛋白质分析，但是迄今还没有关于hPirin的质谱鉴定方法。

本实施例表达并纯化了hPirin蛋白质，并且通过质谱法鉴定了hPirin的酶解产物，综合Blast分析和质谱响应强度，确定了hPirin的特征肽。为了提高离子化效率，对酶解产物进行二甲基化衍生，鉴定到了12种二甲基化产物。二甲基化是用甲醛和氰基硼氢化钠在多肽水平上进行标记，该方法快速、简单、经济、高效且易于多重标记，不仅提高了分离度，还提高了离子化效率。建立了hPirin二甲基化的质谱多反应监测方法，并将该方法成功地运用于鉴定肝细胞中hPirin蛋白质。

1.实验步骤

1.1实验试剂和实验仪器

卡那霉素为生物级试剂，购于上海生工生物工程股份有限公司；甲醛(37％水溶液)、氰基硼氢化钠(95％)购于伊诺凯科技有限公司；氘代甲醛(98％)购自爱必信生物科技有限公司；hPirin质粒由加拿大女王大学合作实验室提供。

1.2hPirin蛋白的表达及纯化方法

取1.5μL hPirin质粒于感受态E.coli BL21中进行转化，取200μL，涂于培养板中，放入培养箱中12-20小时。从培养板中挑取一点放入含有5mL LB液体培养基和5μL卡那霉素的培养管中，放入摇床(37℃，220rpm)中7-14小时。往灭过菌的培养基中加入50mL TB盐、500μL卡那霉素，接种5mL，再放入摇床(37℃，220rpm)中，待OD600值在0.6到0.8之间时，加入0.5mL IPTG诱导蛋白质表达，将其转入摇床(20℃，160rpm)中培养20小时。将菌液离心，再加入PBS缓冲液清洗，弃去上清液，再加入30mL PBS缓冲液重悬沉淀，加入溶菌酶，放于-80℃冰箱中10小时。将悬浮液超声破壁，再转移到4℃离心机中，10000rpm离心1小时，将上清液上样到Ni柱，用缓冲液A(含0.1M PBS缓冲液，0.6M氯化钠，10％甘油，10mM咪唑，pH7.5)清洗杂蛋白，缓冲液B(含0.1M PBS缓冲液，0.6M氯化钠，10％甘油，300mM咪唑，pH 7.5)洗脱目的蛋白，再用10kDa超滤管截留目的蛋白，脱盐，收集，保存于-80℃冰箱中。

1.3hPirin前处理

1.3.1酶解

方法一：移取50μg hPirin蛋白质置于90℃水浴锅中加热5分钟，冷却至室温，加入20μL 9M尿素，涡旋混匀，反应15分钟，加入一定体积100mM Tris缓冲液(pH 8.0)将尿素浓度稀释至0.55M，按酶与底物1:20的比例加入胰蛋白酶，放于37℃恒温振荡水浴锅中酶解16小时，之后加入甲酸至其终浓度为1％以停止反应。

方法二：移取50μg hPirin蛋白质置于90℃水浴锅中加热5分钟，冷却至室温，加入20μL 9M尿素，涡旋混匀，反应15分钟，加入二硫苏糖醇至其终浓度为20mM，并放于56℃水浴锅中加热50分钟，再加入碘乙酰胺至其终浓度为40mM，于室温下避光反应30分钟，加入一定体积100mM Tris缓冲液(pH 8.0)将尿素浓度稀释至0.55M，胰蛋白酶的加入比例是1:20(酶：底物)，放于37℃恒温振荡水浴锅中酶解16小时，加入甲酸至其终浓度为1％以停止反应。

血浆及牛血清白蛋白的酶解方法同方法二。

1.3.2固相萃取

首先将C18固相萃取小柱先后用1mL甲醇和水活化，其次向消化液中加入2倍体积的100mM Tris缓冲液(pH 8.0)，稀释上样至小柱，加入0.8mL清洗液(含1％甲酸、3％乙腈的水溶液)，最后再加入1.2mL洗脱液(含0.1％甲酸、80％乙腈的水溶液)。收集洗脱液，将溶剂挥干，用含3％乙腈、0.1％甲酸的水溶液复溶。每次清洗和洗脱时遵循少量多次的原则。

1.3.3二甲基化

将进行固相萃取时收集到的洗脱液挥干，加入100μL乙酸钠缓冲液(pH 5.8)复溶，加入40μL 4％甲醛溶液和40μL 600mM氰基硼氢化钠溶液，于室温振荡反应80分钟，加入5μL氨水终止反应。后续利用固相萃取的方法除去氰基硼氢化钠，固相萃取的洗脱步骤同1.3.2。

1.3.4肝细胞样品前处理

提取肝细胞样品中总蛋白：首先，平放细胞培养瓶，吸出培养基，往培养瓶中加入1mL细胞级胰酶，放入37℃培养箱中，将贴壁细胞消化下来，一分钟后，吸出胰酶，再加入2mLPBS缓冲液冲洗，将收集到的胰酶及PBS缓冲液转移至10mL离心管中，1000rpm离心五分钟，弃去上清液，加入RIPA裂解液，静置1分钟，再次离心(4℃，12000rpm，15分钟)，取上清液，BCA法定量总蛋白。

取300μg总蛋白，用50mM碳酸氢铵稀释至100μL，加入4倍体积预冷丙酮，沉淀过夜，之后15000rpm离心30分钟，弃去上清液，再依次用500μL冷丙酮、500μL 70％乙醇、500μL冷丙酮各洗涤一次，并收集沉淀，最后挥干丙酮，用9M尿素复溶。对提取到的总蛋白进行酶解，方法与1.3.1中方法一相同，通过固相萃取柱除去缓冲盐等容易污染质谱的成分，方法与1.3.2一致，最后进行二甲基化衍生，方法与1.3.3一致。

1.4筛选特征肽

第一步：通过Blast(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)库进行筛查。设定的部分参数为：选择blastp算法，数据库为UniprotKB/Swiss-Prot(swissprot)，排除低复杂度序列，最大靶序列为500，物种为Homo sapiens(taxid:9606)，序列覆盖率和同一性均为100％。

第二步：评估所选择的特征肽的抗干扰性。将血浆蛋白、牛血清白蛋白消化液挥干溶剂后，用含3％乙腈、0.1％甲酸的水溶液配制成0.001、0.01、0.1μg/μL(总蛋白浓度)，与hPirin蛋白消化液混合，过0.22μm水膜，上样，进行液质分析。

1.5液质条件

对样品进行分离分析的仪器为岛津三重四极杆液质联用仪(仪器型号LC-MS8050)。液相条件：用于分离样品的色谱柱为Accucore Polar Premium C18(150mm×3mm，粒径2.6μm，Thermo)。流动相A相是含0.1％甲酸的水溶液，流动相B相是含0.1％甲酸的乙腈溶液，流速为0.3mL/min，进样体积2μL，洗脱方式是梯度洗脱，时间程序：0-5min，5％-9％；5-9.5min，9％-14.5％；9.5-13min，14.5％-40％；13-15min，40％-90％；15-17min，90％-90％；17-18min，90％-5％；18-25min，5％。质谱采用正离子采集模式，质谱参数见表1。

表1

2.实验结果

2.1特征肽的筛查

首先使用Peptide Cutter(https://web.expasy.org/peptide_cutter/)对目标蛋白质hPirin的胰蛋白酶酶切肽段进行了预测。蛋白质的序列以及酶切位点如图1所示。胰蛋白酶的酶切位点是精氨酸和赖氨酸，且对精氨酸的裂解效率更高，但是也有例外的时候，比如图1中的酶切片段SIGRPELK和GGRPGGFPDHPHR，这是因为脯氨酸对精氨酸的切割产生了阻碍作用。

要成为hPirin的特征肽，首先必须要满足的一点是这一条肽段只在hPirin蛋白上，其他蛋白质中不含这条肽段；其次没有漏切或者发生修饰；肽链长度为5-25个氨基酸；最后要有良好的仪器响应强度，并且稳定性较好。确定肽段与蛋白质之间的唯一性是通过Blast数据库进行筛查。图1中标出了32个胰蛋白酶酶切位点，其中肽段氨基酸数目在5-25之间的有21条，对其进行Blast分析。主要关注表2筛查结果中的Max Score和E值。序列之间相似度越高，Max Score分值越大；E值表示随机匹配时出现的概率，E值越低，表明其他非目标蛋白中出现的偶然性越低。E值是随着Max Score分值的增加呈指数下降趋势，与查询序列长度相关。从表2中可以看出，肽链的氨基酸数目越多，得分越高，E值越低，匹配的蛋白质越少，但是肽链越长容易受仪器限制且离子化效率较差；短序列的E值较高，随机出现的概率更高，如VYTR匹配了67种蛋白质。综合以上分析，初步确定hPirin蛋白的特征肽有以下几种：VTLSVLSR、DGVTVAVISGEALGIK、TPTLYLDFK、SEEIPKPSK、GGRPGGFPDHPHR、EQSEGVGAR、SIGRPELK、NLDPFLLFDEFK、HSQPIPK、MNPGDLQWMTAGR、EPVIQHGPFVMNTNEEISQAILDFR、SHFVLIAGEPLR、GWTSFIYTISGDVYIGPDDAQQK、IEPHHTAVLGEGDSVQVENK。

表2

2.2条件优化

2.2.1酶解方法的条件优化

酶解方法主要是针对蛋白质变性和还原烷基化，有时会加入表面活性剂(脱氧胆酸钠DOC、十二烷基苯磺酸钠SDS等)提高酶解效率，但是很容易产生质谱干扰。加热和尿素两种变性方法并用会有更高的酶解效率，为了防止尿素在高温条件下转化为氨甲酰化伯胺，在尿素变性之前先将样品进行热变性。酶解产物的离子流图见图2。

总共鉴定到了14条多肽，图2只标注了响应较好的几条肽，在鉴定到的酶解产物中，特征肽有VTLSVLSR、DGVTVAVISGEALGIK、GGRPGGFPDHPHR、EQSEGVGAR、SIGRPELK、HSQPIPK、MNPGDLQWMTAGR、SEEIPKPSK、SHFVLIAGEPLR、IEPHHTAVLGEGDSVQVENK、TPTLYLDFK。综合了质谱响应强度，进一步确定hPirin的特征肽为EQSEGVGAR、SIGRPELK、SEEIPKPSK、HSQPIPK、VTLSVLSR、TPTLYLDFK，并对这六条特征肽的质谱响应强度进行了条件优化。

蛋白质中的二硫键是由不同位点中的半胱氨酸形成，是比较稳定的化学键。为了提高酶解效率，通常需要加入二硫苏糖醇或三(2-羧乙基)膦等还原剂将二硫键还原为巯基，之后还要加入碘乙酰胺或者碘乙酸等烷基化试剂，防止再次形成二硫键，但这一步骤通常有较多的副反应，而副反应的程度可以通过控制二硫苏糖醇和碘乙酰胺的比例得到控制。因此，在实验过程中设计了四组实验。第一组：反应流程中只对蛋白质进行变性处理，不进行还原烷基化过程；第二组：二硫苏糖醇和碘乙酰胺的终浓度比例是1:2；第三组：二硫苏糖醇和碘乙酰胺的终浓度比例是1:4，反应后，再补加入二硫苏糖醇将碘乙酰胺淬灭；第四组：二硫苏糖醇和碘乙酰胺终浓度比例是是1:4。实验结果见图3A。

从图3A中可以看出来，当反应过程中不加入二硫苏糖醇和碘乙酰胺或二者的终浓度比例是1:2时，鉴定到的未经修饰的肽段种类是相当的，但是含量上有较大的差异，这表明当碘乙酰胺过量时，大部分肽段都发生了副反应，反应还很迅速。碘乙酰胺除了会与半胱氨酸反应外，还会与其他氨基酸反应，比如天冬氨酸或者N-和C-末端氨基酸等的单烷基化，甚至有时会出现二烷基化和三烷基化的情况，但这种可能性往往很低，主要是与半胱氨酸和N-末端氨基酸的反应。GFETVSYLLEGGSMAHEDFCGHTGK、GILHAEMPCSEEPAHGLQLWVNLR这两条肽链含半胱氨酸残基，但氨基酸序列较长，离子化效率低，在质谱中没有鉴定到，且半胱氨酸容易被碘乙酰胺修饰。此外胰蛋白酶含有6个二硫键，二硫苏糖醇会降低胰蛋白酶的活性。从图3A实验结果中也可以反映出在酶解过程当中加入二硫苏糖醇和碘乙酰胺用于还原烷基化的这一步骤并不是必需的，同时还可以避免副反应，缩短工作流程。

图3B优化了酶与底物的比例，从中可以看出来这六条肽在酶与底物比例为1:20时，酶解效率达到最高值，再增加比例时，酶解效率反而下降，而且有两条肽酶解效率下降最多，分别是VTLSVLSR和TPTLYLDFK。这可能是因为胰蛋白酶浓度太大引起自身降解。由此可见，胰蛋白酶浓度对酶解效率有很大的影响，所以在酶解过程中控制酶与底物比例为1:20。

2.2.2固相萃取条件优化

固相萃取是为了除去反应液中对质谱造成污染的物质，同时可以去除实际样品中的磷脂，蛋白质和盐等物质，起到净化样品、富集目标物、降低基质效应的作用。优化了清洗液、洗脱液的成分和清洗液、洗脱液的体积，结果见图4。

固相萃取过程中用到的清洗液中含有1％甲酸，洗脱液中含有0.1％甲酸。从图4可以看出，当清洗液中乙腈的含量超过3％时，TPTLYLDFK开始被洗脱下来了，其余几条肽在固相萃取柱中保留较好；当选用0.8mL清洗液来除杂时，大部分的杂质被洗脱下来，目标物被保留，信噪比较好；当不断增加洗脱液中乙腈的配比时，大部分肽在含80％乙腈的洗脱液中被洗脱下来，洗脱能力最高；洗脱体积在1.2mL时，除了SIGRPELK，其余肽都被洗脱下来了。综合图4信息，确保大部分肽能够最大程度的被洗脱下来，固相萃取的步骤是，先用0.8mL清洗液(含3％乙腈、1％甲酸的水溶液)洗脱杂质，再用1.2mL洗脱液(含0.1％甲酸、80％乙腈的水溶液)洗脱目标物。

二甲基化反应之后也要用固相萃取柱洗去乙酸钠，氰基硼氢化钠等物质。因为二甲基化与未被二甲基化的肽段理化性质较为接近，只是疏水性增加了，所以未被二甲基化的肽段的固相萃取洗脱方法同样适用于二甲基化多肽。

2.2.3二甲基化方法的条件优化

二甲基化是在肽段水平上进行衍生的。发明人也尝试过在蛋白质水平上进行衍生，但是仅观察到了少数几条肽(如VTLSVLSR)被甲醛修饰了，除了可能没有被甲醛修饰或反应转化率较低，还可能是因为二甲基化后，胰蛋白酶对被修饰的赖氨酸的酶切能力减弱，所以还是应该对多肽进行二甲基化衍生。

二甲基化反应是用甲醛和氰基硼氢化钠对多肽进行修饰。反应位点是α-氨基和ε-氨基。氨基先与甲醛反应形成亚胺中间体，在氰基硼氢化钠的作用下，被还原为-N-CH₃。但是，亚胺中间体会与精氨酸等残基的侧链反应，这些副反应增加了样品的复杂性，降低了目标物的含量，影响质谱分析结果。所以，为减少副反应的发生，提前将甲醛和氰基硼氢化钠混匀，加入多肽混合液中。蛋白质被酶解成多肽后，其中的氨基量难以估计，所以对甲醛和氰基硼氢化钠的体积而非摩尔比进行了优化，同时优化了反应时间，结果见图5。

从图5中可以看出，当用40μL甲醛和40μL 600mM氰基硼氢化钠和多肽反应时，反应达到极值；从反应时间看，二甲基化反应迅速，在80分钟后，反应完成且趋于稳定。

从图6中可以看出来，二甲基化多肽比未经二甲基化的多肽离子化效率明显增强，并且保留时间延长，提高了分离效果。此外在质谱监测过程中也监测了没有经过二甲基化的肽段信号，发现转化率接近100％。

2.3评估抗干扰性

生物体是一个极其复杂的体系，里面包含着不同丰度的多种蛋白质，容易产生干扰。为了评估干扰程度，选用了两种样品(血浆、牛血清白蛋白)进行抗干扰实验，结果见表3。

表3

从表3中可以看出来，这五条肽都受到了一定程度的基质效应的影响，在不同浓度的牛血清白蛋白消化液中，这5条多肽都受到了基质效应，表现为离子增强，但是与无基质相比都在20％以内。而在不同浓度的血浆消化液中，VTLSVLSR受到了严重的离子抑制的影响，而HSQPIPK、SIGRPELK、EQSEGVGAR、TPTLYLDFK抗干扰性良好，可用于实际样品分析。

2.4酶解产物的综合分析

在低能碰撞室中，质子化肽有着高片段化效率，产生互补序列信息，骨架中的酰胺键断裂，形成典型的b离子和y离子。b离子是包含N末端氨基酸残基，y离子则是包含C末端氨基酸残基。鉴定到的14种hPirin蛋白酶切产物及离子类型见表4。从离子转换离子流图发现大部分肽的质谱响应较差，后续对多肽进行二甲基化修饰提高离子化效率。

表4

2.5二甲基化产物分析

二甲基化是在多肽水平上进行修饰的，主要针对N末端的氨基酸和C末端的赖氨酸，所以除了质量发生差异之外二甲基化肽断裂规律是一样的。鉴定到的hPirin蛋白二甲基化产物及离子类型见表5。

表5

鉴定到了12条肽，其中有2条肽在未进行二甲基化修饰之前并没有检测到，分别是IEPHHTAVLGEGDSVQVENK、NLDPFLLFDEFK，这也反映了二甲基化之后离子化效率有了明显地提升。表5中标注了被修饰的氨基酸，二甲化位点是α-氨基和ε-氨基，因为酸都有α-氨基，所以肽的N-末端氨基酸都能被甲醛修饰，酶切位点中只有赖氨酸有ε-氨基，所以肽的C-末端氨基酸中只有赖氨酸能被甲醛修饰。

2.6液质方法的条件优化

选择a1离子作为定量离子，建立多反应监测方法，并对部分质谱参数如碰撞电压、质荷比进行了优化，优化结果见表6。

表6

2.7鉴定肝细胞中hPirin

对肝细胞样品进行质谱分析，结果见图7。鉴定到了两条肽，A图是HSQPIPK，B图是EQSEGVGAR，保留时间与hPirin的二甲基化产物一致且离子对一样。这表明肝细胞中含有hPirin，与文献相符，也说明建立的hPirin二甲基化质谱方法是可行的，可以用于分析实际样品。

3.实验结论

本实施例首先在大肠杆菌中表达并纯化了hPirin蛋白质，以hPirin为研究对象，优化了酶解条件，通过质谱法鉴定到了14条酶解产物，并结合Blast分析确立了hPirin的特征肽。由于酶解液中含有大量的Tris缓冲盐及尿素，这些物质会对质谱造成污染，若不除去再进行质谱分析，时间久了，容易堵住喷雾针，影响样品分析，所以为了除去这些污染物，加入了固相萃取步骤并优化了相关条件。为了提高hPirin酶解产物的离子化效率，引入了二甲基化标记法对酶解产物进行衍生，该方法是通过甲醛和氰基硼氢化钠标记多肽的α-氨基和ε-氨基，延长了保留时间，提高了离子化效率和分离度。此外，该方法试剂简单、成本低且转化效率高。本实施例建立了一种鉴定二甲基化标记hPirin酶解产物的质谱方法，并且已经成功用于鉴定肝细胞中的hPirin蛋白质。

实施例2

本实施例以猪为特定物种，运用上述质谱法探究了Pirin同源蛋白的组织表达差异。

1.实验步骤

1.1实验试剂

高效RIPA组织/细胞裂解液、BCA法蛋白浓度测定试剂盒购于北京索莱宝有限公司；胎牛血清胰酶均为细胞级，购于赛默飞世尔科技有限公司。猪的组织样品(肝脏、心脏、瘦肉、肾脏、舌头)购于当地市场。实验过程中所用的其他试剂与实施例1相同。

1.2序列比对

通过NCBI查询人、小鼠、牛、猪、马、羊、拟南芥、番茄、大肠杆菌中的Pirin同源蛋白序列，通过cluster(https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/)进行序列对齐筛选特征肽。

1.3组织样品前处理

1.3.1内标肽的合成

移取20μg hPirin进行酶解反应，反应完成后，用固相萃取柱洗去杂质，将收集到的洗脱液挥干，用100mM乙酸钠溶液复溶，加入40μL 4％氘代甲醛溶液和40μL 600mM氰基硼氢化钠溶液，反应80分钟。用固相萃取柱纯化目标物，将洗脱液挥干，用含3％乙腈、0.1％甲酸的水溶液复溶。

1.3.2提取实际样品的总蛋白

组织样品中总蛋白的提取方法如下：首先用0.9％的生理盐水清洗组织样品，再对样品进行匀浆。匀浆之后，称取约300mg样品，加入3mL RIPA裂解液，涡旋混匀，静置10分钟，4℃离心(8000rpm)，取上清液进行BCA定量(提取总蛋白的过程都在冰上进行)。

1.3.3二甲基化衍生总蛋白

取300μg总蛋白，用50mM NH₄HCO₃稀释至100μL，提前预冷丙酮，以4倍体积沉淀蛋白，4-6小时后对其离心30分钟(15000rpm，4℃)，舍弃上清液，再依次用500μL冷丙酮、500μL70％冷乙醇、500μL冷丙酮，各洗一次，离心，弃上清液。最后将丙酮挥干，用9M尿素复溶。按实施例1中的方法一进行酶解。

用固相萃取柱纯化样品，挥干洗脱液，加入100μL乙酸钠缓冲液(pH 5.8)复溶，加入40μL 4％甲醛溶液和40μL 600mM氰基硼氢化钠溶液于室温振荡反应80分钟，加入5μL氨水终止反应。先用1mL甲醇活化C18小柱，再加入1mL水置换甲醇，将反应液稀释两倍上样至固相萃取柱，用0.8mL清洗液(含1％甲酸、3％乙腈的水溶液)除去杂质，最后再加入1.2mL洗脱液(含0.1％甲酸、80％乙腈的水溶液)将目标物洗脱并收集。将溶剂挥干，用含3％乙腈、0.1％甲酸的水溶液复溶。过0.22μm滤膜，液质分析。

1.4方法学验证

对hPirin酶解肽段进行二甲基化衍生，浓度梯度为100、200、300、400、500、700、1000ng/mL，内标浓度为400ng/mL，平行三组。

方法学验证主要是进行了日内和日间精密度、加标回收率、检测限、定量限。评估了特异性、线性、灵敏度、重复性。

1.5液质条件

对样品进行分离分析的仪器为岛津三重四极杆液质联用仪(仪器型号LC-MS8050)。用于分离样品的色谱柱为Accucore Polar Premium C18(150mm×3mm，粒径2.6μm，Thermo)。流动相A相是含0.1％甲酸的水溶液，流动相B相是含0.1％甲酸的乙腈溶液，流速为0.3mL/min，进样体积2μL，洗脱方式是梯度洗脱。时间程序：0-1min，5％-9％；1-3min，9％-14.5％；3-4min，14.5％-90％；4-5min，90％-90％；5-6min，90％-5％；6-12min，5％-5％。质谱采用正离子采集模式，采用电喷雾离子源，雾化气流速是3L/min，干燥气和加热气流速是10L/min，脱溶剂管温度250℃，加热模块温度400℃，离子源温度300℃，离子源接口电压3kV，扫描模式是多反应监测。

2.实验结果

2.1不同物种间Pirin同源蛋白的序列比对

如图8所示，这五种蛋白质均为Pirin同源蛋白，物种依次是人、小鼠、猪、牛、羊，“|”代表胰蛋白酶酶切位点。从中可以看出来，在人、小鼠、猪、牛、羊这几个物种之间的Pirin同源蛋白序列相似度非常高，也比较了大肠杆菌的Pirin同源蛋白YhhW(P46852)、拟南芥(Q9LX49)以及番茄(Q9SEE4)，发现在植物以及原核生物中与人、小鼠、猪、牛和羊这几个物种之间的Pirin同源蛋白序列同一性都很低。

如表7所示，分析了不同物种间的特征肽，部分肽在物种当中唯一，如SEEIPKPTK只在小鼠当中存在，而人体Pirin同源蛋白中SEEIPKPSK只有一个位点发生了变化，却在人体中唯一，所以可以通过这些不同的肽区分物种。鉴于采样的方便性，组织差异实验的物种选择猪，其Pirin同源蛋白的特征肽序列中与人体hPirin相比没有发生变化的有IEPHHTAVLGEGDSVQVENK、GGRPGGFPDHPHR、NLDPFLLFDEFK、HSQPIPK、SIGRPELK。从质谱响应强度来看，定性定量离子对选择SIGRPELK、HSQPIPK。

2.2组织样品液质定量结果的综合分析

2.2.1BCA法定量总蛋白

BCA法兼容性强，不受RIPA蛋白提取剂中的十二烷基磺酸钠、Triton X100和Tween的影响。实验中选择牛血清白蛋白(BSA)为标准蛋白质，对标准曲线进行线性拟合，线性方程为y＝0.00488x+0.07841，相关系数(R²)为0.9985，线性良好。BCA定量组织样品结果见表7。从中可知总蛋白含量差异：肝脏＞肾脏＞瘦肉＞心脏＞舌头。

表7

2.2.2液质定量结果

选择多肽SIGRPELK建立标准曲线，对其进行线性回归分析，如表8所示，相关系数(R²)是0.9988，有着良好的线性关系。检测限和定量限达到了fmol级，表明建立的方法灵敏度较高且具有可行性，可以用于组织样品的定性定量。

表8

2.2.3精密度

五种实际样品的日内和日间精密度和准确度结果见表9，五种实际样品的日内和日间精密度RSD均小于10.42％和19.61％。

表9

2.2.4回收率

由表10可知，五种实际样品的加标回收率在93.4％-115.9％之间。综合上述方法学验证结果显示数据有着较好的稳定性和重现性，也表明用这种方法具有可信度。

表10

2.2.5实际样品检测

从表11中可以看出Pirin同源蛋白在猪的不同组织中表达差异：肝脏＞肾脏＞心脏＞舌头＞瘦肉，与已知文献结果类似，也是在肝脏和心脏中表达量居高。

3.实验结论

本实施例运用前述方法对猪的不同组织(心脏、肾脏、肝脏、瘦肉、舌头)进行了Pirin定量实验。以SIGRPELK建立标准曲线，相关系数(R²)为0.9988，线性关系良好，检测限和定量限均达到了fmol级，日内和日间精密度RSD均小于10.42％和19.60％，样品加标回收率在93.4％-115.9％之间，确定了Pirin同源蛋白在猪的不同组织中表达差异：肝脏＞肾脏＞心脏＞舌头＞瘦肉。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110> 湖南师范大学

<120> Pirin同源蛋白的特征肽及其应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

His Ser Gln Pro Ile Pro Lys

1 5

<210> 2

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Ser Ile Gly Arg Pro Glu Leu Lys

1 5

<210> 3

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Glu Gln Ser Glu Gly Val Gly Ala Arg

1 5

<210> 4

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Thr Pro Thr Leu Tyr Leu Asp Phe Lys

1 5

Claims

1.一种Pirin同源蛋白的特征肽，其特征在于，所述特征肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4所示。

2.权利要求1所述的特征肽在Pirin同源蛋白的检测中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，通过液质联用检测方法对待测样品中所述特征肽的含量进行检测。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，Pirin同源蛋白的检测方法包括以下步骤：

将待测样品进行酶解处理，得到酶解产物；

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述酶解处理包括以下步骤：将待测样品加热以使蛋白变性，冷却后加入尿素进行反应，然后加入胰蛋白酶处理，所述胰蛋白酶与所述待测样品中蛋白质的质量比为1:(18～22)。

6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述二甲基化衍生处理包括以下步骤：将甲醛溶液和氰基硼氢化钠溶液混合，然后再与所述酶解产物混合，反应70～90分钟后终止反应。

7.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，在所述二甲基化衍生处理之前还包括以下步骤：将所述酶解产物上样至C18固相萃取柱，加入含0.8wt％～1.2wt％甲酸和2wt％～4wt％乙腈的水溶液进行清洗，然后加入含0.08wt％～0.12wt％甲酸、78wt％～82wt％乙腈的水溶液进行洗脱，收集洗脱液，得到纯化的酶解产物。

8.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述液质联用检测中液相色谱的条件为：色谱柱为Accucore Polar Premium C18，流动相A相为甲酸水溶液，流动相B相为甲酸乙腈溶液，流速为0.1mL/min～0.5mL/min，进样体积为1μL～5μL，洗脱方式为梯度洗脱。

9.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述液质联用检测中质谱的条件为：离子源为电喷雾离子源，雾化气流速为2.5L/min～3.5L/min，干燥气流速为8L/min～12L/min，脱溶剂管温度为240℃～260℃，加热模块温度为380℃～420℃，离子源接口电压为3.8kV～4.2kV，扫描模式为多反应监测。

10.一种Pirin同源蛋白的检测试剂盒，其特征在于，包括酶解试剂和权利要求1所述的特征肽或内标肽，所述内标肽为权利要求1所述的特征肽经过同位素标记得到。