CN116699052B - 一种复杂食品基质中虾原肌球蛋白的定量检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种复杂食品基质中虾原肌球蛋白的定量检测方法，所述方法为：在待测食品样品中加入同位素标记的重组全长虾原肌球蛋白作为内标，经过蛋白提取、胰蛋白酶消化成多肽、净化样品后经UPLC‑MS/MS分析，通过非标记的特征肽段与同位素标记的特征肽段峰面积比计算得到待测样品中虾原肌球蛋白的含量。本发明提供的使用与目的蛋白氨基酸序列类似的同位素标记蛋白作为内标，与目的蛋白同时参与酶解、净化过程的方法，可以校正前处理过程中产生的误差，提高检测灵敏度和准确性。
Description
技术领域
本发明属于食品安全检测技术领域，具体涉及一种复杂食品基质中虾原肌球蛋白的定量检测方法。
背景技术
在食品安全领域，过敏患者主要通过避免摄入过敏原以达到保护健康的目的，因此基于食品标签管理的目的，需要对食物内过敏原这类特殊蛋白进行定量。此外，在生物医学领域，当蛋白质作为诊断标记物时，在特定组织、靶器官内的含量与疾病的严重程度挂钩，准确的蛋白定量方法可以准确反映疾病进程的状态。常用的蛋白质检测方法分为基因学检测、免疫学检测和质谱检测三种，其中基因学检测和免疫学检测受复杂基质影响较大，常用于定性检测。
使用质谱方法定量蛋白质的基本策略是将样品中目的蛋白通过胰蛋白酶酶解成肽段后，使用LC-MS/MS对1条或者多条肽段定量，继而通过计算完成对蛋白质的定量。在这一过程中，影响定量准确性的主要因素是未知的酶解效率和复杂的基质效应。现在常用的同位素稀释质谱定量法主要是AQUA，其通过在酶解后的样品中添加同位素重链肽段，再由质谱分析获得肽段非同位素轻链和同位素重链的峰面积比进行定量。这一方法可以在肽段层面完成准确定量，但回溯到蛋白这一步的过程则由于添加的重链肽段不参与酶解，无法校正这一过程产生的损失。因此，使用与目标蛋白氨基酸序列类似的同位素重标蛋白作为内标，与目的蛋白同时参与酶解、净化等过程，可以校正这些步骤产生的误差，提高质谱定量的灵敏度和准确性。
专利文献CN 114578065 A公开一种用于定量的同位素标记的完整蛋白的制备方法及其应用，所述制备方法包括以下步骤：重组质粒的制备；重组蛋白的表达；蛋白性能验证；蛋白纯化；蛋白纯度检测；蛋白定量。该技术使用13C标记的葡萄糖作为大肠杆菌扩大培养唯一的营养来源，表达的蛋白为13C标记的蛋白。缺陷在于，该技术的成本很高，因为同位素13C来自培养基内额外添加的葡萄糖，葡萄糖不仅参与目标蛋白的合成，还参与细胞的其他生理活动，所以该方法将会消耗大量13C标记的葡萄糖，导致标记成本很高。该技术对重组表达的蛋白中所有的C原子进行同位素标记，普适性好，但稳定性并不高，并且大量标记会出现同位素覆盖率较低的缺陷，影响检测结果。
在所有过敏原案例中，由虾原肌球蛋白（TM）导致的约占 16.1%。在中国，研究报告显示虾原肌球蛋白是最危害成年人健康的食物过敏原之一。本发明针对虾原肌球蛋白提出一种使用全长同位素标记的重组蛋白作为内标对复杂食品基质中的虾原肌球蛋白进行准确的UPLC-MS/MS 定量分析方法。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种复杂食品基质中的虾原肌球蛋白含量检测方法，所述检测方法以全长同位素标记的重组虾原肌球蛋白作为内标，建立UPLC-MS/MS定量分析方法；本发明另一个目的是提供一种所述全长同位素标记的重组虾原肌球蛋白的制备方法；本发明还有一个目的是提供一种所述全长同位素标记的重组虾原肌球蛋白在检测食品中天然虾原肌球蛋白的用途。
本发明的目的通过上述技术方案实现：
第一方面，本发明提供一种食品中虾原肌球蛋白的定量检测方法，其特征在于，所述方法为：在待测食品样品中加入同位素标记的重组全长虾原肌球蛋白作为内标，经过蛋白提取、胰蛋白酶消化成多肽、净化样品后经UPLC-MS/MS分析，通过非标记的特征肽段与同位素标记的特征肽段峰面积比计算得到待测样品中虾原肌球蛋白的含量。
所述同位素标记的重组全长虾原肌球蛋白是将重组全长虾原肌球蛋白（氨基酸序列如SEQ ID NO:1）中的赖氨酸和精氨酸进行同位素标记，具体是将赖氨酸（K）和精氨酸（R）中的12C和14N标记为13C和15N。
本发明所述的同位素标记的重组全长虾原肌球蛋白通过如下方法制备得到：
（A）将大肠杆菌载体中与赖氨酸和精氨酸合成相关的基因敲除，构建大肠杆菌缺失株；
（B）将虾原肌球蛋白目的基因（SEQ ID NO:2）与表达质粒连接，转染进大肠杆菌缺失株感受态细胞中；
（C）挑取阳性转染细胞，在含有13C15N-赖氨酸和13C15N-精氨酸的培养基中进行培养，诱导蛋白表达；
（D）破碎菌体，取上清液与镍柱结合，分离纯化得到同位素标记的重组全长虾原肌球蛋白。
在本发明的具体实施方式中，所述同位素标记的重组全长虾原肌球蛋白的制备方法如下：
S1: 构建大肠杆菌缺失株
用CRISPR将大肠杆菌工程株BL21(DE3)中与赖氨酸和精氨酸合成相关的基因lysA、argA敲除，获得大肠杆菌赖氨酸-精氨酸缺失株（E.coliBL21(DE3)Δlys Δarg），并使用氯化钙法将其制备为感受态细胞；
S2:构建原核表达载体
将表达虾原肌球蛋白的目的基因与表达质粒连接，转染进感受态细胞大肠杆菌赖氨酸-精氨酸缺失工程株内，通过菌液PCR和二代测序确认插入序列的正确性；
S3:蛋白的表达
将插入序列正确的阳性克隆使用LB培养基传代，转入M9液体培养扩增菌种，加入IPTG诱导表达蛋白，所述培养基中均添加13C15N-赖氨酸和13C15N-精氨酸；
S4:蛋白的分离纯化
超声破碎菌体，取菌体上清液与镍柱结合，通过重组蛋白的His标签与镍柱的特异性结合分离纯化得到同位素标记的重组全长虾原肌球蛋白。
本发明所述的特征肽段选自IVELEEELR、ALSNAEGEVAALNR、LAEASQAADESER、LAMVEADLER、MDALENQLK、FLAEEADR、ANIQLVEK中的一种或两种以上的组合。
优选的，所述特征肽段选自IVELEEELR、ALSNAEGEVAALNR、LAEASQAADESER中的一种或两种以上的组合。
在本发明的最优选实施方式中，所述特征肽段为IVELEEELR。
本发明所述的待测食品样品包括所有可能含有虾原肌球蛋白的食品，例如膨化食品、鱼糜制品、酱类食品，具体包括但不限于虾片、玉米片、香菇猪肉丸、虾球、生虾、鸡肉丸、沙茶酱、辣椒酱。
在本发明的具体实施方式中，所述食品中虾原肌球蛋白的定量检测方法包括如下步骤：
（1）制作标准曲线；
（2）将待检测食品粉碎制备成待检样品，加入本发明制备的同位素标记的重组全长虾原肌球蛋白作为内标，加入蛋白提取液超声提取20-30min，离心，取上清；
（3）加入胰蛋白酶对上清液中的蛋白进行酶解；
（4）将酶解后的样品使用HLB premium 3cc柱进行净化，将净化后的样品转移至进样小瓶；
（5）使用UPLC-MS/MS进行分析，根据非标记的特征肽段与同位素标记的特征肽段峰面积比，带入标准曲线中计算得到待测样品中虾原肌球蛋白的含量。
所述标准曲线的制作方法包括如下两个方案：
方案1：使用天然虾原肌球蛋白配制0.2 μg/ml、0.5 μg/ml、1 μg/ml、2 μg/ml、5 μg/ml、10μg/ml、20 μg/ml、50 μg/ml、100 μg/mL 9个梯度的标准工作溶液，加入终浓度为20μg/ml的本发明制备的同位素标记的重组全长虾原肌球蛋白，200mM NH4HCO3作为稀释液，按照本发明提供的方法进行酶解、净化、UPLC-MS/MS分析，横坐标设置为轻链、重链肽段浓度比，纵坐标设置为轻链、重链肽段的峰面积比，绘制标准曲线。
方案2：模拟得到方案1标准曲线中浓度比为1时肽段IVELEEELR的轻链、重链浓度，保持重链工作液浓度不变，使用IVELEEELR轻链配制所得模拟浓度0.01倍、0.025倍、0.05倍、0.1倍、0.25倍、0.5倍、1倍、2.5倍、5倍的标曲工作液，200mM NH4HCO3作为稀释液，经UPLC-MS/MS分析，横坐标设置为轻链、重链肽段浓度比，纵坐标设置为轻链、重链肽段的峰面积比，绘制标准曲线。
由于蛋白购买成本高，且易发生降解，不易保存，所以使用蛋白制作标准曲线的成本很高。在分析检测领域，针对不同批次的样品，或者同批次样品不同检测时间都需要多次制备标准曲线，本发明推荐在需要多次制备标准曲线的情况时，首次制作选择方案1，再次制作均选择方案2。
步骤（2）所述的蛋白提取液优选为含有6-7M尿素的浓度为200-220 mM的Tris-HCl溶液。
第二方面，一种用于定量的同位素标记的重组全长虾原肌球蛋白的制备方法，所述方法包括如下步骤：
（A）将大肠杆菌工程株中与赖氨酸和精氨酸合成相关的基因敲除，构建大肠杆菌缺失株；
（B）将虾原肌球蛋白目的基因（SEQ ID NO:2）与表达质粒连接，转染进大肠杆菌缺失株感受态细胞中；
（C）挑取阳性转染细胞，在含有13C15N-赖氨酸和13C15N-精氨酸的培养基中进行培养，诱导蛋白表达；
（D）破碎菌体，取上清液与镍柱结合，分离纯化得到同位素标记的重组全长虾原肌球蛋白。
在本发明的具体实施方式中，所述同位素标记的重组全长虾原肌球蛋白的制备方法如下：
S1: 构建大肠杆菌缺失株
用CRISPR将大肠杆菌工程株BL21(DE3)中与赖氨酸和精氨酸合成相关的基因敲除，获得大肠杆菌赖氨酸-精氨酸缺失株，并使用氯化钙法将其制备为感受态细胞；
S2:构建原核表达载体
将表达虾原肌球蛋白的目的基因与表达质粒连接，转染进大肠杆菌赖氨酸-精氨酸缺失株内，通过菌液PCR和二代测序确认插入序列的正确性；
S3:蛋白的表达
将插入序列正确的阳性克隆使用固体培养基传代，转入基础培养基M9液体培养扩增菌种，加入IPTG诱导表达蛋白，所述基础培养基中添加13C15N-赖氨酸和13C15N-精氨酸；
S4:蛋白的分离纯化
超声破碎菌体，取菌体上清液与镍柱结合，通过重组蛋白的His标签与镍柱的特异性结合分离纯化得到同位素标记的重组全长虾原肌球蛋白。
第三方面，一种同位素标记的重组全长虾原肌球蛋白在食品中非标记虾原肌球蛋白定量分析中的应用。
SEQ ID NO:1
MGSSHHHHHHSSGLVPRGSHMMHHHHHHMDAIKKKMQAMKLEKDNAMDRADTLEQQNKEANNRAEKSEEEVHNLQKRMQQLENDLDQVQESLLKANIQLVEKDKALSNAEGEVAALNRRIQLLEEDLERSEERLNTATTKLAEASQAADESERMRKVLENRSLSDEERMDALENQLKEARFLAEEADRKYDEVARKLAMVEADLERAEERAETGESKIVELEEELRVVGNNLKSLEVSEEKANQREEAYKEQIKTLTNKLKAAEARAEFAERSVQKLQKEVDRLEDELVNEKEKYKSITDELDQTFSELSGY
SEQ ID NO:2
ATGGGCAGCAGCCATCATCATCATCATCACAGCAGCGGCCTGGTGCCGCGCGGCAGCCATATGATGCATCACCATCATCATCACATGGACGCGATTAAAAAGAAGATGCAGGCGATGAAACTGGAGAAGGACAATGCGATGGATCGCGCGGATACCCTGGAACAGCAAAATAAAGAAGCGAATAATCGCGCGGAAAAAAGCGAAGAAGAAGTGCATAATCTGCAGAAACGCATGCAGCAGCTGGAAAATGATCTGGATCAGGTGCAGGAAAGCCTGCTGAAAGCGAATATTCAGCTGGTGGAAAAAGATAAGGCGCTGAGCAATGCGGAAGGCGAAGTGGCGGCGTTGAATCGCCGTATTCAGCTGTTGGAAGAAGATCTGGAACGCAGCGAAGAACGCCTGAATACCGCGACCACCAAACTGGCGGAAGCGAGCCAAGCGGCGGATGAAAGTGAACGCATGCGTAAAGTGCTGGAAAATCGCAGCCTGAGCGATGAAGAACGCATGGATGCGCTGGAAAATCAGCTGAAAGAAGCGCGCTTTCTGGCGGAAGAAGCGGATCGCAAATATGATGAAGTGGCGCGCAAACTGGCGATGGTGGAAGCGGATTTAGAACGCGCGGAAGAACGCGCGGAAACCGGCGAAAGCAAAATTGTGGAACTGGAAGAAGAACTGCGCGTGGTGGGCAATAATCTGAAAAGCCTGGAAGTGAGCGAAGAAAAAGCGAATCAGCGCGAAGAAGCGTATAAAGAACAGATTAAAACCCTGACCAATAAGCTGAAAGCGGCGGAAGCGCGCGCGGAATTTGCGGAACGTAGCGTTCAGAAACTGCAGAAAGAAGTGGATCGCCTGGAAGATGAACTGGTGAATGAAAAAGAAAAGTACAAGAGCATCACCGACGAGCTGGATCAGACCTTTAGCGAACTGAGCGGCTATTAA
本发明提供的使用同位素标记的重组全长虾原肌球蛋白作为内标，定量检测食品中非标记虾原肌球蛋白含量的方法具有如下技术优势：
（1）本发明制备的同位素标记的重组全长虾原肌球蛋白是对目标蛋白进行直接定量，将同位素标记蛋白作为内标直接添加到目标蛋白中，可直接对样品进行酶切进质谱分析，由于试验误差能够无差别的应用于这两种蛋白，可以校正前处理产生的误差；因此在未知浓度的目标蛋白中添加同位素标记的全长蛋白是一种高效、简便、可靠的测量方法，可为其他血清样品中蛋白质的定值提供参考。
（2）根据本发明提供的方法制备的同位素标记的重组全长虾原肌球蛋白同位素标记率超过99%，蛋白纯度高，可直接用于UPLC-MS/MS 定量分析。
（3）本发明进一步对MS分析中的目标肽段进行优化，最终确定IVELEEELR作为定量肽，该肽段的检测限和定量限分别为0.5μg/g和1μg/g，平均回收率为89.5-115.3%，日内和日间RSD小于8.7%。
（4）细胞培养物中氨基酸的稳定同位素标记 (SILAC) 被认为是定量蛋白质组学的合适技术。该技术最初应用于哺乳动物细胞，因为真核细胞不能合成必需氨基酸来满足基本需求，必须利用外部环境中的这些氨基酸，但是利用这种方法需要细胞传代至少5次以上才能得到较好的标记率，成本高，耗时长。本发明使用大肠杆菌赖氨酸-精氨酸缺失株原核表达系统制备得到具有高同位素标记率的重组全长虾原肌球蛋白，耗时短，产量高，再使用所述同位素标记的重组全长虾原肌球蛋白作为内标，进行UPLC-MS/MS定量分析，在蛋白质水平上准确检测复杂食品基质中虾原肌球蛋白的污染水平。
附图说明
图1 虾原肌球蛋白定量检测方法流程图；
图2 pET 28a-TM质粒结构图；
图3 大肠杆菌赖氨酸-精氨酸缺失株-TM重组表达系统PCR鉴定结果；
图4 （A）同位素标记蛋白SDS-PAGE 胶的考马斯亮蓝染色结果；（B）SDS-PAGE 胶的western-blot结果；
图5 同位素标记蛋白表征结果，（A）毛细管电泳检测结果；（B）MALDI-TOF检测结果；（C）de novo测序同位素蛋白全长氨基酸序列覆盖图；（D）de novo测序同位素蛋白覆盖率；
图6 标准曲线及其对应的化学合成肽模拟的肽标准曲线；
图7 不同食品基质中特征肽段的含量；
图8 不同酶解时间下特征肽段的 MS 峰面积。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的部分实施例，而不是全部。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
试剂及仪器
13C6 15N4-精氨酸、13C6 15N2-赖氨酸、M9 培养基肉汤、卡那霉素、咪唑、二硫苏糖醇(DTT)、碘乙酰胺 (IAA)、氢氧化铯、十二烷基硫酸钠(SDS)、盐酸硫胺素（维生素 B1）、尿素、碳酸氢铵、异丙基 β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷 (IPTG)、氯化钙、赖氨酸酶和来自猪的胰蛋白酶由 Sigma-Aldrich (美国St. Louis) 提供；PierceTMBCA 蛋白测定试剂盒购自 ThermoFisher Scientific Inc.（美国卡尔斯巴德）；Oasis HLB 固相萃取柱（3cc，60 mg）购自Waters（美国米尔福德）；葡萄糖、硫酸镁和甲酸 (FA) 购自 J&K Scientific Ltd（中国北京）；LC-MS 级乙腈 (ACN) 购自默克公司（德国达姆施塔特）；三(羟甲基)氨基甲烷-盐酸（Tris-HCl）缓冲液（pH 8.0）购自索莱宝生物科技有限公司（中国北京）；Ni-NTA 琼脂糖购自 Qiagen（美国旧金山）；氯化钠、硼酸钠和磷酸购自国药集团化学试剂有限公司（中国上海）；天然虾原肌球蛋白（纯度>95%）购自 Indoor biotechnologies（Charlottesville，USA）；定量肽IVELEEELR（摩尔质量1128.6027，纯度>98%）和相应的稳定同位素标记肽IVELEEELR*（R*，13C6，15N4，纯度>98%）（摩尔质量1138.6109）由金斯瑞生物技术有限公司合成。
大肠杆菌缺失株的构建
用CRISPR将大肠杆菌工程株BL21(DE3)中与赖氨酸和精氨酸合成相关的基因lysA、argA敲除，获得大肠杆菌赖氨酸-精氨酸缺失株，并使用氯化钙法将其制备为感受态细胞。实验步骤均需要在无菌环境下进行。将大肠杆菌赖氨酸-精氨酸缺失株划线于无抗LB琼脂上，37˚C过夜培养后，挑选单克隆接种于3ml无抗LB肉汤中，过夜培养后，按照1:100的比例于100mlLB肉汤中扩大培养至对数增长期。将菌液分装于预冷的50ml离心管中，并放置于冰上10min，在4℃，4000rpm离心10min，弃上清。用25ml预冷的75mM氯化钙重悬后，于冰上静置20min后，在4℃，4000rpm离心10min收集菌体，加入预冷的含有20%甘油的氯化钙溶液重悬，分装并保存于-80℃冰箱内待用。
原核表达载体的构建
将表达目的蛋白TM的核酸序列（SEQ ID NO:2）与pET 28a质粒连接，获得重组质粒pET28a-TM，如图2。将制备的100μl大肠杆菌赖氨酸-精氨酸缺失株感受态细胞置于冰上融化，与10ng的pET 28a-TM轻柔混匀，放于冰上静置30min。将混合物放入预加热的42˚C水浴锅中热激90s后，快速将离心管转移至冰浴，冷却3min，加入500μl的SOC培养基后，置于37˚C恒温摇床培育45min。将菌液均匀涂布在含有50μg/ml卡那霉素LB固体培养基上，于37˚C恒温培养箱内倒置24h后即可观察到白色菌落。通过菌液PCR和二代测序，选择插入片段准确的阳性克隆用于后续蛋白表达。
对构建的大肠杆菌赖氨酸-精氨酸缺失株-TM重组表达系统进行菌液PCR鉴定，并使用琼脂糖对其产物进行鉴定，结果如图3所示，图中M表示DNA Marker；1-12条带分别表示肠杆菌赖氨酸-精氨酸缺失株-TM的12个克隆。不同克隆都在其所在泳道有一条1164bp的明亮条带，目标带的碱基数符合编码重组蛋白的855bp碱基加上使用t7/t7ter.rev引物产生的残基的总数。将PCR产物测序后的结果与设计序列比对，结果显示其相似度为100%。证明重组质粒成功进入大肠杆菌赖氨酸-精氨酸缺失株，且质粒内插入基因的序列正确。
同位素标记的重组全长虾原肌球蛋白的表达
将构建的大肠杆菌赖氨酸-精氨酸缺失株-TM表达载体挑选较大的菌落，接种于LB固体培养基，在37˚C培养箱内倒置培养48h，挑选较大的菌落接种于3ml M9液体培养基（额外添加13C15N-赖氨酸和13C15N-精氨酸）内，于37˚C，200rpm震荡培养过夜，接种于200ml M9液体培养基（额外添加13C15N-赖氨酸和13C15N –精氨酸），37˚C培养至混合菌液的OD600=0.5时，加入终浓度1mM的 IPTG，于19˚C，150rpm低温摇床诱导表达过夜，收集菌体。
同位素标记的重组全长虾原肌球蛋白的纯化
表达后的菌液低温离心（8000rpm，30min）后弃上清，加入10ml预冷的结合缓冲液（内含10mM咪唑）均匀重悬菌体沉淀。在冰浴下超声破碎（100W，工作时间2s，间隙时间3s）至菌体溶液呈现均质，半透明状，低温离心并收集上清液，与镍柱于4˚C缓慢结合过夜。将镍柱蛋白质混合液重新加入柱子使液体自然流出后，用30ml 清洗缓冲液（内含20mM咪唑）分次通过镍柱，去除未结合的杂蛋白，之后堵住柱口。加入3ml的洗脱缓冲液（内含500mM咪唑）静置2min后通过镍柱并收集洗脱液，重复5次，分批收集总共15ml的洗脱液。将洗脱液直立于-80˚C冰箱中冷冻，后使用冻干机将其冻干保存。
同位素标记的重组全长虾原肌球蛋白（TM-i）的表征
分别使用毛细管电泳、MALDI-Tof和de novo 测序表征TM-I蛋白的纯度、总分子量、氨基酸序列覆盖率和同位素氨基酸标记率。
图4(A)为同位素标记蛋白SDS-PAGE 胶的考马斯亮蓝染色结果；M：蛋白 Marker；1.诱导表达前的细菌蛋白；2. 诱导表达后的细菌蛋白；3.裂解后上清液中的蛋白；4.Ni-柱结合的蛋白。箭头所指处为目的蛋白(TM-i) 。 (B) SDS-PAGE 胶的western-blot结果，每个泳道内的样品与 (A)内的一致。
根据考马斯亮蓝染色的结果可以看到，诱导后样品明显在35kD处多了目的蛋白的条带，且裂解后目的蛋白主要处于上清液中，即重组蛋白主要是可溶性表达，Ni柱纯化后的样品只有一条明亮的条带，重组蛋白可以特异性和Ni柱结合。（B）中使用Anti-hi抗体作为一抗，由于在重组蛋白的C端增加了his标签，可以特异性显示含有His标签的重组蛋白的表达情况。
图5中，（A）为毛细管电泳检测重组蛋白纯度，7分钟左右的峰为目标蛋白峰，6分钟左右的是系统峰，故不计入纯度计算。根据毛细管电泳的结果，纯化后虾原肌球同位素蛋白的纯度在98.86%。
图5中，（B) MALDI-TOF基于基质辅助激光解析方式的软电离产生更少的多电荷离子，用于蛋白样本的全谱分析，目的蛋白的精确分子量经计算为36,075.9823Da，而赖氨酸、精氨酸同位素（13C15N-赖氨酸和13C15N-精氨酸）蛋白的精确分子量为36,538.5843Da，MALDI-TOF的结果为36509.1Da，检测结果在同位素蛋白的分子量的误差范围内。
对于分子量较大的蛋白质，平均质量与准确质量差别很大。所以大于25kDa分子量的蛋白质类物质分子量鉴定推荐高分辨率质谱鉴定策略。De novo测序使用胰蛋白酶镜像酶- LysargiNase获取酶解后的肽段，并和胰蛋白酶酶解的肽段共同与蛋白指纹图谱进行比对，可以更完整地获得已知氨基酸序列的覆盖度。在图5中，（C）中可以看到，与Uniprot上目的蛋白序列比对，氨基酸覆盖率可以达到91.98%，可以判断为重组同位素标记的虾原肌球蛋白。De novo测序同时可以获得同位素氨基酸的覆盖度，图5中，（D）显示制备的全长虾原肌球蛋白的13C15N-赖氨酸和13C15N –精氨酸覆盖率均 >99.18%。
标准曲线的制备
标准品溶液选择0.9mg/ml天然虾原肌球蛋白，内标选择本发明制备的同位素标记的重组全长虾原肌球蛋白，标准曲线不添加基质。
使用天然虾原肌球蛋白配制0.2 μg/ml、0.5 μg/ml、1 μg/ml、2 μg/ml、5 μg/ml、10μg/ml、20 μg/ml、50 μg/ml、100 μg/mL 9个梯度的标准工作溶液，加入20μg/ml的本发明制备的同位素标记的重组全长虾原肌球蛋白作为内标，200mM NH4HCO3作为稀释液，使用本发明提供的方法进行酶解、净化、UPLC-MS/MS分析。横坐标设置为轻链、重链肽段浓度比，纵坐标设置为轻链、重链肽段的峰面积比，绘制标准曲线，获得线性方程和相关系数，结果如图6所示。
由于每次使用蛋白制作标准曲线成本较高，本发明的发明人创造性的应用化学合成肽段IVELEEELR和IVELEEELR*（R*，13C6，15N4）模拟制作标准曲线。模拟得到方案1标准曲线中浓度比为1时肽段IVELEEELR的轻链、重链浓度，保持重链工作液浓度不变，使用IVELEEELR轻链配制所得模拟浓度0.01倍、0.025倍、0.05倍、0.1倍、0.25倍、0.5倍、1倍、2.5倍、5倍的标曲工作液，200mM NH4HCO3作为稀释液，经UPLC-MS/MS分析，横坐标设置为轻链、重链肽段浓度比，纵坐标设置为轻链、重链肽段的峰面积比，绘制标准曲线。结果如图6所示。
从图中可以看出，使用蛋白制作的标准曲线与发明人根据肽段模拟的标准曲线重合度很高。由于蛋白制作标准曲线的成本较高，本发明推荐在需要多次制备标准曲线的情况时，首次制作选择方案1，再次制作均选择方案2。
食品中虾原肌球蛋白的定量检测
S1：蛋白提取
称量0.2g待检样品放入2ml离心管内，同时加入本发明制备的TM-I至终浓度为20μg/ml，浓度大的样品在加入内标前应稀释到标准曲线范围内。往2ml离心管内加入1ml 含有6M尿素的200mM Tris-HCl提取液（pH=8）。在200rpm的摇床内提取30min，超声提取20min，通过 BCA 测定法测试全蛋白浓度，8000g离心10min，取500μl上清转移到新的2ml离心管内。
S2：胰蛋白酶酶解
采用液体酶解，在500μl提取液中加入500μL 200mM NH4HCO3，加入终浓度为5mM的DTT后置于37˚C摇床中反应1h，加入终浓度为10mM的IAA在避光条件下静置30min，再以胰蛋白酶与原肌球蛋白1:20的质量比加入管内，37˚C，200rpm酶解18h后，用1μl的甲酸终止酶解反应。
S3：样本净化
酶解后的蛋白使用HLB premium 3cc柱进行净化，首先用1ml的80%乙腈和1ml的超纯水平衡柱子，之后将酶解后的肽段样品通过柱床，用2ml的0.1%甲酸水淋洗后，用1ml含0.1%甲酸的80%乙腈进行洗脱并用2ml 离心管收集洗脱液，氮吹吹干后用200 μl 0.1%甲酸水复溶，并转移到带自带内衬管的进样小瓶内。
S4：UPLC-MS/MS分析
消化后的肽段的数据通过 UPLC 系统（Shimadzu，Kyoto，Japan）与三重四极质谱仪UPLC-8060（Shimadzu，Kyoto，Japan）联用获得。在 Waters ACQUITY Peptide CSH C18色谱柱（2.1 mm × 100 mm；1.7 μm；美国马萨诸塞州）上分离肽段。流动相由0.1%甲酸-H2O（A）和0.1%甲酸-ACN（B）组成，梯度洗脱程序为：0-6.5 分钟，5%-30% B； 6.5-8.0 分钟,30%-95% B; 8.0-10 分钟，95% B； 10-10.1分钟，95%-5%B； 10.1-13 分钟，5% B。流速设置为 0.3 mL/min，每个样品的进样量为 5 μL。
质谱仪配备了电喷雾电离探针，以正离子模式运行，具有多反应监测 (MRM)。电离源参数设置如下：界面温度，300℃；脱溶剂线温度，250℃；雾化温度，400℃；雾化气体（氮气）流速，180 L/h；干燥气体，600 L/h；加热气体流速，600 L/h。目标肽段的 MS/MS 参数如表 1 所示。
表1 UPLC-MS/MS分析蛋白重链肽段和轻链肽段的保留时间及质谱参数
备注：带“*”的是同位素肽段。
按照上述方法分别对香菇猪肉丸、沙茶酱、虾片、虾条等食品中的虾原肌球蛋白进行定量检测，结果如下表所示：
表2 实际样品中虾原肌球蛋白的定量检测数据
备注：“-”为未标记 TM 过敏原或未检测到 TM 过敏原的样品，
a(μg/g) 表示 μg TM 蛋白/g 样品。
表2显示虾球和生虾中的TM 含量分别为 2388.93 μg/g 和 2632.64 μg/g；沙茶酱中检出的TM含量为34.29 μg/g；虾片和虾条中TM的浓度分别为1.61和1.29 μg/g，与TM过敏原标签一致。辣椒酱、鸡丸和玉米片中未检测到含有TM，该产品包装中没有食品标签。从上表数据可以看到，本发明提供的方法可以准确检测食品中虾原肌球蛋白的准确含量。
定量肽段选择和优化
将目的蛋白（TM）的氨基酸序列模拟胰蛋白酶酶切，选择肽段氨基酸的长度为7-16，获得全蛋白序列的理论酶切肽段，选择固定修饰为SILAC-K（8）R（10），获得酶解后各轻链肽段和重链肽段母离子和子离子的理论质荷比。
蛋白样品经胶内酶解后使用 HPLC-Q/TOF高分辨质谱采集肽段信息，将实验采集到的数据和计算的母离子质荷比进行比对，选择响应高、没有杂峰且具有特异性的肽段作为候选肽段。最后选择IVELEEELR（SEQ ID NO:3）、ALSNAEGEVAALNR（SEQ ID NO:4）、LAEASQAADESER（SEQ ID NO:5）、LAMVEADLER（SEQ ID NO:6）、MDALENQLK（SEQ ID NO:7）、FLAEEADR（SEQ ID NO:8）、ANIQLVEK（SEQ ID NO:9）七条肽段作为目标肽段。
按照本发明提供的方法，以上述七条肽段作为目标肽段分别检测膨化食品（玉米片）、鱼糜制品（虾丸）、酱类食品（辣椒酱）中的虾原肌球蛋白。结果如图7所示，从图中可以看出，上述七条肽段中可用于复杂食品基质中虾原肌球蛋白的定量，且定量结果可以相互映证，其中IVELEEELR、ALSNAEGEVAALNR、LAEASQAADESER在膨化食品、鱼糜制品和酱类食品中的丰度均相对较高，稳定性好，选择作为定量的特征肽段。
进一步的，选择IVELEEELR、ALSNAEGEVAALNR、LAEASQAADESER作为目标肽段，探究最佳的酶解时间，在2-24h之间，3种目标肽段的峰面积逐渐增加，但在内标的校正下，定量结果均具有高稳定性，结果如图8所示。因此，对于高浓度的样品，短酶解时间也可用于定量，缩短检测时间。其中，高响应的肽段可以用于更低浓度样品的检测，IVELEEELR肽段的响应程度最好，最终优选IVELEEELR作为定量肽段。
方法的准确度和精密度
空白基质称量后在2ml 离心管内添加低（2.5、5、10μg/g）、中（50μg/g）、高（250μg/g）三个浓度的标准目的蛋白溶液和20μg/ml的同位素蛋白，每个浓度做3个重复，实验方法与优化后的前处理方法一致，每个样品做三次重复，连续三日重复实验、计算回收率和变异系数。如表3所示，在5-250μg/g的浓度范围内，用这3条肽段的定量结果可以相互映证，证明本方法具有高准确度的特点。
表3 不同肽段定量的准确度与灵敏度
从上表可以看出，IVELEEELR肽段的检测限和定量限分别为0.5μg/g和1μg/g，平均回收率为89.46-115.30%，日内和日间RSD小于8.67%，用于UPLC-MS/MS 定量分析的响应最灵敏，因此，本发明优选IVELEEELR肽段作为定量肽。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
Claims (2)
1.一种食品中虾原肌球蛋白的定量检测方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
（1）制作标准曲线；
（2）将待检测食品粉碎制备成待检样品，加入同位素标记的重组全长虾原肌球蛋白作为内标，加入蛋白提取液超声提取，离心，取上清，所述蛋白提取液为含有6-7M尿素的浓度为200-220 mM的Tris-HCl溶液；
（3）加入胰蛋白酶对上清液中的蛋白进行酶解；
（4）将酶解后的肽段样品进行净化，将净化后的样品转移至进样小瓶；
（5）使用UPLC-MS/MS进行分析，根据非标记的特征肽段与同位素标记的特征肽段峰面积比，带入标准曲线中计算得到待测样品中虾原肌球蛋白的含量，所述特征肽段选自IVELEEELR；
所述标准曲线的制作方法为首次制作选择方案1，再次制作均选择方案2；
方案1：使用天然虾原肌球蛋白配制0.2 μg/ml、0.5 μg/ml、1 μg/ml、2 μg/ml、5 μg/ml、10μg/ml、20 μg/ml、50 μg/ml、100 μg/mL 9个梯度的标准工作溶液，加入终浓度为20μg/ml的同位素标记的重组全长虾原肌球蛋白，200mM NH4HCO3作为稀释液，加入胰蛋白酶进行酶解、净化、UPLC-MS/MS分析，横坐标设置为轻链、重链肽段浓度比，纵坐标设置为轻链、重链肽段的峰面积比，绘制标准曲线；
方案2：模拟得到方案1标准曲线中浓度比为1时肽段IVELEEELR的轻链、重链浓度，保持重链工作液浓度不变，使用IVELEEELR轻链配制所得模拟浓度0.01倍、0.025倍、0.05倍、0.1倍、0.25倍、0.5倍、1倍、2.5倍、5倍的标曲工作液，200mM NH4HCO3作为稀释液，经UPLC-MS/MS分析，横坐标设置为轻链、重链肽段浓度比，纵坐标设置为轻链、重链肽段的峰面积比，绘制标准曲线；
所述同位素标记的重组全长虾原肌球蛋白通过如下方法制备得到：
（A）将大肠杆菌载体中与赖氨酸和精氨酸合成相关的基因敲除，构建大肠杆菌缺失株；
（B）将虾原肌球蛋白目的基因与表达质粒连接，转染进大肠杆菌缺失株感受态细胞中；
（C）挑取阳性转染细胞，在含有13C15N-赖氨酸和13C15N-精氨酸的培养基中进行培养，诱导蛋白表达；
（D）破碎菌体，取上清液与镍柱结合，分离纯化得到同位素标记的重组全长虾原肌球蛋白。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于， 步骤（2）中超声提取时间为20-30min；步骤（4）使用HLB premium 3cc柱进行净化。
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