DE602005004902T2

DE602005004902T2 - Künstliches Protein, Verfahren für absolute Quantifizierung der Proteine und seine Benutzung

Info

Publication number: DE602005004902T2
Application number: DE602005004902T
Authority: DE
Inventors: Julie M. Wigston Pratt; Robert Prenton Beynon; Simon Altrincham Gaskell
Original assignee: Entelechon GmbH
Current assignee: POLYQUANT GMBH, 93051 REGENSBURG, DE
Priority date: 2005-06-02
Filing date: 2005-06-02
Publication date: 2008-10-16
Anticipated expiration: 2025-06-03
Also published as: EP1904517B1; US20090137050A1; EP1736480B1; EP1736480B9; JP2008545419A; JP5123848B2; DE602005012555D1; EP1736480A1; WO2006128492A1; DE602005004902D1; EP1904517A1

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft die Proteomik und insbesondere die absolute Quantifizierung von Proteinen.
Hintergrund der Erfindung
Der Bedarf einer absoluten Quantifizierung wird in der Proteomik zunehmend dringlich. Das vielversprechendste Verfahren beruht auf stabiler Isotopverdünnung, das die gleichzeitige Bestimmung von repräsentativen proteolytischen Peptiden und stabilen Isotop markierten Analoga einschließt. Die grundsätzliche Begrenzung, die einer weitreichenden Implementierung dieses Ansatzes entgegensteht, ist die Verfügbarkeit von Standardsignaturpeptiden in exakt bekannten Mengen.
Die beiden primären Themen in der Proteomik sind die Proteinidentifizierung und der Vergleich von Proteinexpressionsmengen in zwei physiologischen oder pathologischen Zuständen (vergleichende Proteomik). Das langfristige Ziel, in der Lage zu sein, das gesamte Proteom einer Zelle zu definieren, ist immer noch nicht verwirklicht, aber die Charakterisierung von vielen tausend Proteinen in einer einzelnen Analyse ist jetzt möglich.
Damit die Proteomik eine Plattformtechnologie wird, die dem sich entwickelnden Feld der Systembiologie dient, gibt es einen erdrückenden Bedarf hinsichtlich der Verbesserung der Quantifizierung (Righetti, Eur J Mass Spectrom 10 (2004), 335-348). Die meisten vergleichenden Proteomikstudien liefern relative Quantifizierung, sie drücken die Änderung in der Menge eines Proteins im Kontext eines zweiten zellulären Zustandes aus (zum Beispiel Dunkley, Mol Cell Proteomics (2004); Hoang, J Biomol Tech 14 (2003), 216-233, Ong, Mol Cell Proteomics (2002), 376-386).
Jedoch muss das ultimative Ziel letztlich sein, die zellulären Konzentrationen von Proteinen absolut zu bestimmen, gleichgültig ob als Molaritäten oder als Anzahl von Molekülen pro Zelle. Die absolute Quantifizierung, die eine der größten Herausforderungen in der Proteomik darstellt, stützt sich auf gut etablierte Grundsätze in der analytischen Chemie hervor, und benötigt entweder externe Standards oder interne Standards (Sechi, Curr Opin Chem Biol 7 (2003), 70-77; Julka, J Proteome Res 3 (2004), 350-363). Die externe Standardisierung wird durch Immundetektion typisiert, gleichgültig ob in Flüssigkeitsphase oder auf positionsadressierbaren Antikörperanordnungen (Arrays) (Walter, Trends Mol Med 8 (2002), 250-253; Lopez, J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci 787 (2003), 19-27). Der zweite Ansatz, der sich auf eine innere Standardisierung bezieht, beruht auf Massenspektrometrie (MS), wobei ein hochselekiver Nachweis von Ionen (oder Ionenfragmentierungen), die charakteristisch sind für den Analyten von Interesse, mit der Verwendung von internen Standards kombiniert wird.
In den aussagekräftigsten strengsten MS Analysen werden stabile isotope Varianten der Analyte als interne Standards verwendet. Der Schlüssel des zugrundeliegenden Prinzips ist, dass die Bestimmung von relativen Signalintensitäten während einer massenspektrometrischen Analyse in absolute Mengen des Analyten durch Bezugnahme auf einen authentischen Standard, der in bekannten Mengen bereitgestellt wird, umgerechnet werden kann. Die direkte Anmeldung dieses Ansatzes auf intakte Proteine ist unpraktisch, und für gewöhnlich wird das Prinzip des Surrogats angewendet, das bedeutet, indirekt durch Bezugnahme auf ein proteolytisches Peptid, das von dem interessierenden Protein abgeleitet ist, zu quantifizieren.
Analysen, die auf diesen Prinzipien beruhen, wurden als "AQUA" (absolute Quantifizierung) unter Verwendung interner Standards, die de novo durch chemische Verfahren synthetisiert wurden, bezeichnet (Gerber, PNAS 100 (2003), 6940-6945). Jedoch führt dieser Ansatz selbst nicht gut zur absoluten Quantifizierung von großen Zahlen von Proteinen, weil jedes Q-Peptid chemisch synthetisiert und unabhängig quantifiziert werden müsste.
Die internationale Patentanmeldung PCT/US03/17686, veröffentlicht als WO 03/102220 stellt Verfahren bereit, um die absolute Menge an Proteinen, die in einer biologischen Probe anwesend ist, zu bestimmen. Das Prinzip der WO 03/102220 beruht auf der Bildung einer geordneten Anordnung von differenziell isotopisch markierten Paaren von Peptiden, wobei jedes Paar ein einziges Protein, eine spezifische Proteinisoform oder eine spezifisch modifizierte Form eines Proteins repräsentiert. Ein Element des Peptidpaares ist ein synthetisch gebildeter, externer Standard, und das andere Element des Paares ist ein Peptid, das durch enzymatische Spaltung der Proteine in einem Probengemisch gebildet wurde. Um das Verfahren der WO 03/102220 durchzuführen, werden die Standardpeptide kalibriert, sodass absolute Mengen bekannt sind, und sie werden zum Vergleich und zur Quantifizierung zugegeben. Eine interessierende Probe wird auch mit derselben Isotopmarkierung markiert, wie sie für die Standardpeptide verwendet wird, mit der Ausnahme, dass sie sich in der isotopischen Markierung unterscheiden. Die Signalpaare, die differenziell markierten Proben und Standardpeptiden entsprechen, werden schließlich beobachtet und mit einer Liste von erwarteten Massen, die auf den besonderen eingeschlossenen Standardpeptiden beruhen, in Beziehung gesetzt. Der Nachteil der WO 03/102220 ist, dass die Standardpeptide individuell synthetisiert, gereinigt und quantifiziert werden müssen. Darüber hinaus müssen die Proben- und Standardpeptide getrennt spezifisch markiert werden, was das Potenzial für Variabilität zwischen Experimenten steigert.
Die WO 2004/013636 offenbart Verbindung mit einer Alkylepitop Markierungsstelle und einer Protease Spaltungsstelle und ein Verfahren zum gleichzeitigen Identifizieren und Bestimmen der Expressionsmengen von Cystein enthaltenden Proteinen in normalen und abartigen bzw. gestörten Zellen. Erste und zweite Proteinproben und erste und zweite Peptidproben werden hergestellt und mit der offenbarten Verbindung umgesetzt, ein proteolytischer Spaltschritt wird durchgeführt, und ein Affinitätsreinigungsschritt findet statt.
Die WO 03/102220 stellt Verfahren zum Bestimmen der absoluten Menge an Proteinen, die in einer biologischen Probe anwesend ist, bereit. Eine geordnete Anordnung von differenziell isotopisch markierten Paaren von Peptiden wird bereitgestellt. Ein Element der Peptidpaare ist ein synthetisch gebildeter, externer Standard, und das andere Element des Paares ist ein Peptid, das durch enzymatische Spaltung der Proteine in einem Probengemisch gebildet wird.
Die US 2002/0037532 offenbart ein Verfahren zur Proteinidentifizierung in komplexen Gemischen, welches Affinitätsselektion von konstitutiven bzw. bestehenden proteolytischen Peptidfragmenten, die in einem Proteinanalyt einzigartig sind, verwendet. Diese Peptide werden auch als "Signaturpeptide", die als analytische Surogate wirken, bezeichnet. Mit der Hilfe von massenspektrometrischen Analysen des proteolytischen Gemisches kann ein Protein in einer komplexen Probe ohne Reinigen des Proteins identifiziert werden.
Somit gibt es immer noch einen existierenden Bedarf, einfache und einfach anzuwendende Verfahren für die absolute Quantifizierung in der Proteomik zu entwickeln.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung ist auf ein künstliches Protein gerichtet, das durch eine Gen Gestaltung de novo erzeugt wird, das Konkatamere aus Q-Peptiden umfasst, die Signaturpeptide sind, die durch irgendeine proteolytische oder chemische Fragmentierung erzeugt sind zur quantitativen Analyse des Proteoms einer Probe, einer Zelle oder eines Organismus, umfassend:

(a) mindestens zwei aufeinander folgende Peptide, die durch eine Schnittsequenz zum Trennen der Peptide verknüpft sind;
(b) eine einzelne Markierung auf einem oder mehreren Peptid/en zur Bestimmung der absoluten Menge des Proteins; und
(c) N-terminale und C-terminale Verlängerungen zum Schutz, zur Reinigung und zur Quantifizierung der Peptide;

Zum Zweck der Erfindung wird das künstliche Protein auch QCAT Protein genannt, und die Peptide, die für das QCAT Protein verwendet werden, werden als Q-Peptide bezeichnet.
Die Spaltungssequenz zwischen zwei Q-Peptiden kann eine enzymatische oder eine chemische Spaltungssequenz sein.
Die N-terminalen und C-terminalen Verlängerungen schützen die Quantifizierungspeptide vor der Verarbeitung und der Exoproteolyse. Das künstliche Protein schließt Merkmale ein, die eine einfache Reinigung des QCAT Proteins erlauben.
Jedes der Q-Peptide repräsentiert ein einzelnes Protein der Probe, der Zelle oder des Organismus, und jedes Peptid befindet sich in einer definierten Stöchiometrie, die typischerweise, aber nicht ausschließlich 1:1 beträgt.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin eine Sammlung von Q-Peptiden, die das vollständige Proteom eines Organismus abdecken. Diese Sammlung erlaubt eine schnelle Quantifizierung des Proteoms eines solchen Organismus.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch einen Vektor, der das QCAT Protein umfasst, und einen Kit umfassend den Vektor und/oder das QCAT Protein.
Darüber hinaus ist die Erfindung auf ein Verfahren zur quantitativen Analyse des Proteoms einer Probe, einer Zelle oder eines Organismus gerichtet, umfassend die Schritte:

(a) Quantifizieren der absoluten Menge des künstlichen Proteins nach einem der Ansprüche 1–10, das Konkatamere aus Q-Peptiden und N-terminale und C-terminale Verlängerungen zum Schutz, zur Reinigung und zur Quantifizierung oder ein Peptid umfasst, das die einzelne Markierung enthält;
(b) Erzeugen einer Präparation des zu quantifizierenden Proteins;
(c) Mischen der Produkte der Schritte (a) und (b);
(d) vollständiges Schneiden des künstlichen Proteins nach einem der Ansprüche 1–10 und des in Schritt (b) zu quantifizierenden Proteins an der Schnittsequenz;
(e) Bestimmen der Masse der Peptide und daraus;
(f) Berechnen der absoluten Menge jedes Proteins,

Es ist wichtig anzumerken, dass die Proteine nicht gereinigt werden müssen – eine teilweise Reinigung, gefolgt von hochauflösenden Trennungstechnologien wäre genauso akzeptabel.
Kurzbeschreibung der Figuren
1 zeigt Beispiele von Q-Peptiden, die als Signaturpeptide ausgewählt sind;
2 zeigt die DNA Sequenz, die translatierte Proteinsequenz und Merkmale von QCAT;
3 zeigt die Charakterisierung des QCAT Proteins und der Q-Peptide;
4 zeigt die Quantifizierung unter Verwendung des QCAT Proteins, und
5 zeigt die Verwendung des QCAT für Muskelproteinquantifizierung.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die Erfinder beschreiben hier das Design, die Expression und die Verwendung von künstlichen Proteinen, die Konkatamere von tryptischen Q-Peptiden für eine Reihe von Proteinen sind, die durch Gen Gestaltung de novo erzeugt werden. Das künstliche Protein, ein Konkatamer aus Q-Peptiden ("QCAT") ist derart gestaltet, dass es sowohl N-terminale als auch C-terminale Verlängerungen einschließt. Die Funktion der Verlängerungen ist, die wahren Q-Peptide zu schützen, eine Reinigungsmarkierung (wie eine His-Markierung) und einen einzelnen Cysteinrest für die Quantifizierung des QCAT einzuführen.
Das neue Gen wird in einen Expressionsvektor, der zur Expression großer Mengen in der Lage ist, eingebaut und in einem heterologen Expressionssystem, wie E. coli exprimiert. Innerhalb des QCAT Protein, liegt das Q-Peptid in einer definierten Stöchiometrie (typischerweise, aber nicht exklusiv 1:1) vor, sodass der gesamte Satz der konkatamierten Q-Peptide in molaren Begriffen durch Bestimmung des QCAT Proteins quantifiziert werden kann. Darüber hinaus wird das QCAT Protein einfach in nicht markierter oder markierter Form durch das Wachstum des Expressionsstammes in definiertem Medium, das die gewählte Markierung enthält, gebildet.
Die Erfinder haben erfolgreich ein künstliches Gen gestaltet und konstruiert, das eine Ansammlung von Konkatameren aus tryptischen Peptiden (ein QCAT Protein) aus über 20 Proteinen kodiert. Das Protein schließt weiterhin Merkmale für die Quantifizierung und Reinigung ein. Das künstliche Protein wurde in E. coli exprimiert, und die Synthese des korrekten Produkts wurde durch Massenspektrometrie bewiesen. Das QCAT Protein wird einfach mit Trypsin gespalten; es ist einfach zu quantifizieren, und es kann für die absolute Quantifizierung von Proteinen verwendet werden. Diese Strategie macht die akkurate und absolute Quantifizierung von großen Anzahlen von Proteinen in Proteomstudien erreichbar. Darüber hinaus wurde das QCAT durch selektiven Einbau einer Aminosäure, die mit einem stabilen Isotop markiert war oder durch Einbau von ¹⁵N Stickstoffatomen an jeder Position des Proteins markiert.
Es ist deshalb ein Ziel der vorliegenden Erfindung, ein künstliches Protein für die quantitative Analyse des Proteoms einer Probe, einer Zelle oder eines Organismus bereitzustellen, umfassend:

In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das künstliche Protein 20-60 Peptide, am meisten bevorzugt 60 Peptide. Es ist möglich, vielschichtige Instanzen von spezifischen Peptiden einzuschließen, um die Stöchiometrie zu modifizieren.
In noch einer anderen Ausführungsform wird die Spaltungssequenz durch eine Protease, vorzugsweise durch Trypsin gespalten, und die einzelne Markierung ist ein Cysteinrest.
Darüber hinaus werden eines oder mehrere Peptide des künstlichen Proteins identisch mindestens einmal, vorzugsweise einmal oder mehrere Male wiederholt, um eine besondere Stöchiometrie zwischen allen Peptidsequenzen zu erreichen.
Es ist bevorzugt, eine Affinitätsmarkierung (z. B. eine Histidinmarkierung) für die Reinigung des Proteins einzuschließen. Es ist besonders bevorzugt, die Affinitätsmarkierung in entweder die N-terminale oder die C-terminale Verlängerung des Proteins einzuschließen.
In einer weiteren Ausführungsform wird das Protein durch ein Isotop markiert, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus ¹³C, ¹⁵N, ²H und ¹⁸O.
In noch einer weiteren Ausführungsform umfasst jedes Peptid zwischen ungefähr 3 und 40 Aminosäuren, vorzugsweise ungefähr 15 Aminosäuren.
Das Protein kann ein Molekulargewicht von ungefähr 10–300 kDa, vorzugsweise ungefähr 150–200 kDa, am meisten bevorzugt ungefähr 150 kDa umfassen, und es wird vorzugsweise in E. coli exprimiert.
Der Ursprung des Proteoms, d. h. der Probe der Zelle oder des Organismus, ist vorzugsweise eine Maus, eine Ratte, ein Affe oder ein Mensch, aber kann von irgendeiner proteinösen Quelle stammen.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung stellen die Peptide verschiedene konformationelle, metabolische oder Modifizierungszustände des Proteins dar, um alle Proteine zu quantifizieren, die posttranslational von einem solchen Protein abstammen.
Darüber hinaus weisen die Petide des künstlichen Proteins vorzugsweise eine definierte Molekulargewichtsverteilung und quantitative Verhältnisse auf. Ein Massenspektrometer kann kalibriert werden, vorzugsweise mit Molekulargewichten, die zu äquidistanten bzw. gleich weit entfernten Massenspektrometriesignalen führen. Vorzugsweise wird eines oder mehrere Peptide zweimal repräsentiert, um unzweideutig ein Referenzmolekulargewicht für die Kalibrierung zu markieren.
Die Erfindung ist weiterhin auf eine Sammlung von Konkatameren von Q-Peptiden gerichtet, wie in Anspruch 1 definiert ist, die das vollständige Proteom eines Organismus abdeckt. Alle exprimierten Proteine eines Organismus werden als das Proteom eines solchen Organismus definiert. Dies erlaubt die schnelle Quantifizierung des Proteoms eines solchen Organismus.
Darüber hinaus ist in die Offenbarung der vorliegenden Erfindung die absolute Quantifizierung der Proteinmengen eines bestimmten Referenzstammes eingeschlossen, die anschließend verwendet werden können, um die Proteinmengen dieses bestimmten Stamms oder ähnlicher Stämme unter variierten experimentellen Bedingungen zu vergleichen.
Die Erfindung ist auch auf einen Vektor gerichtet, der eine Nukleinsäure umfasst, die das künstliche Protein umfasst, und auf ein Kit, welches das künstliche Protein und/oder die Nukleinsäure umfasst, die das künstliche Protein kodiert. Darüber hinaus ist die Erfindung auf ein Verfahren zur quantitativen Analyse des Proteoms eines Organismus gerichtet, die oben im Detail beschrieben ist.
Die vorliegende Erfindung wird besser durch die eingeschlossenen Beispiele und Ergebnisse unter Bezugname auf die angehängten Figuren verstanden.
Detaillierte Beschreibung der Figuren
1. Beispiele von Q-Peptiden, die als Signaturpeptide ausgewählt sind.
Für eine Reihe von Proteinen wurden Peptide von Proteinen ausgewählt (unter Verwendung multipler Kriterien), die als die vielfältigen Proteine in einer löslichen Fraktion von Hühnerskelettmuskel identifiziert wurden, und sie wurden zu einem künstlichen Protein, oder QCAT, zusammengesetzt. Linke Seite: Coomassie blau gefärbte, SDS-PAGE Analyse von löslichen Hühnermuskelproteinen. Mitte: MALDI-TOF Spektrum der tryptischen Spaltung von Gelstücken, die ausgewählten Proteinbanden entsprechen. Das Peptidion, das mit einem ovalen Symbol markiert ist, stellt das Peptid dar, das für den Einbau in das QCAT Protein ausgewählt wurde. Rechte Seite: Masse und Position der angezeigten Signaturpeptide innerhalb des erzeugten QCAT Proteins. Die Details der Peptide sind in Tabelle 1 angegeben.
2. Die DNA Sequenz, translatierte Proteinsequenz und Merkmale von QCAT.
Die DNA Sequenz des synthetischen Gens, mit den relevanten Klonierungsstellen, ist in der oberen Linie gezeigt, und die davon abgeleitete Aminosäuresequenz ist unten gezeigt. Die grau markierten Bereiche zeigen das Ausmaß der tryptischen Peptide an, wobei die Spenderhühnerproteine, das tryptische Peptidassignment (T1-T25) und die Peptidmasse (in DA) angegeben sind. Eine nicht spaltbare Arg- Pro tryptische Stelle innerhalb der Phosphoglyceratkinase (Kästchen) ist eingeschlossen, um die Nichtspaltbarkeit dieser Stelle zu bestätigen. Die Peptide (weiße Kästchen) kodieren das initiale Methionin, die N-terminale Opfer- bzw. Rettungssequenz (engl.: sacrificial sequence) und Spacersequenzen, und sie sind nicht von den Proteinen von Interesse abgeleitet. Die schwarzen Kästchen stellen die Sequenzen dar, welche den einzigen Cysteinrest für die Quantifizierung und die His₆ Markierung für die Reinigung tragen. T1 und T2 sind Rettungssequenzen, die derart gestaltet sind, um den N-Terminus des ersten wirklichen Q-Peptids (T3) zu schützen.
3. Charakterisierung des QCAT Proteins und der Q-Peptide
Das pEP21a/QCAT Plasmid wurde in E. coli DE3 Zellen transformiert, und nach einer Zeitspanne des exponentiellen Wachstums, wurde die Expression des QCAT mit IPTG induziert. Die Zelllysate aus Zellen vor und nach der Induktion wurden auf einer SDS-PAGE (Bildeinschub) verglichen. Nach Solubilisierung des Pellets und Affinitätschromatographie auf einer NiNTA Säule war das gereinigte QCAT Protein homogen, und es wurde in einer Lösung mit Trypsin gespalten. Die Peptide wurden auf MALDI-TOF Massenspektrometrie analysiert. Die eingeschobene Karte zur tryptischen Spaltung ist grau unterlegt, um die relativen Intensitäten der Signale, die jedem Peptid in dem Massenspektrum entsprechen, anzuzeigen; Peptide, die kleiner sind als 900 Da, die aus den "Rettungs"-Teilen des QCAT stammen, sind weniger einfach in dieser Art von Massenspektrometrieanalyse aufgrund der interferierenden Ionen nachweisbar.
4. Quantifizierung unter Verwendung des QCAT Proteins
Das QCAT Protein wurde in unmarkierter Form (L: "leicht") (engl.: "light") und in einer Form, die einheitlich mit ¹⁵N (H: "schwer") (engl.: "heavy") markiert war, hergestellt. Die H und L QCAT Protein wurden getrennt gereinigt, quantifiziert und in verschiedenen Verhältnissen vor der tryptischen Spaltung und der Messung der Peptidintensitäten durch MALDI-TOF Massenspektrometrie gemischt. Abschnitt a) stellt das Massenspektrum für die Q-Peptide für Adenylatkinase (GFLIDGYPR, 12 Stickstoffatome) dar. In Abschnitt b) sind die gemessenen L:H Verhältnisse relativ zu dem Mischverhältnis, in einer dreifachen Reihe von Experimenten, für die individuelle Punkte gezeigt sind, aufgetragen. In dem unteren Abschnitt sind die Daten für sieben Peptide gesammelt und als Durchschnitt ± SD (n = 18 – 21) ausgedrückt. Die gepunktete Linie definiert die 95% der Sicherheitsgrenzen entsprechenden Linie.
5. Verwendung des QCAT für die Muskelproteinquantifizierung.
Eine Präparation aus löslichen Proteinen aus Skelettmuskel von Hühnern am Tag 1 und Tag 27 wurde mit [¹⁵N] QCAT gemischt, mit Trypsin gespalten und durch MALDI-TOF MS analysiert. Für eine Untergruppe von Proteinen war es möglich, die Intensitäten des endogenen und eines Standardpeptids zu bestimmen, und daraus die absoluten Mengen (in nmol/g Gewebe) jedes Proteins zu berechnen. Drei Tiere wurden zu jedem Zeitpunkt verwendet, die Fehlerbalken sind SEM (n = 3). Die Proteine waren AK: Adenylatkinase, ApoA1: Apolipoprotein A1, LDHB: Lactatdehydrogenase B, Beta Trop: Betatropomyosin, Beta Eno: Betaenolase, GP: Glykogenphosphorylase, ALDO B: Aldolase B, TPI: Triosephosphatisomerase, GAPDH: Glyceraldehyd 3-Phosphatdehydrogenoase, Aktin, API: Aktinpolymerisationsinhibitor, PK: Pyruvatkinase und CK: Kreatinkinase.
1. Gestaltung des Gens, welches das Q-Protein Konkatamer kodiert

Eines der Hauptinteresse der Erfinder liegt in der Proteomdynamik (Prat, Mol Cell Proteomics 1 (2002), 579-591) und in den Veränderungen in der Proteinexpression während der Muskelentwicklung (Doherty, Proteomics 4 (2004), 2082-2093; Doherty, Proteomics in press (2005)). Ein System, das dramatische Veränderungen während der Entwicklung von unmittelbar nach dem Schlüpfen bis zur erwachsenen Form zeigt, ist die Proteinexpression des Hühner Pectoralis Skelettmuskel. Folglich wählten die Erfinder für die Demonstration des QCAT Sets zwanzig Hühnerproteine, von denen zuvor bestimmt wurde, dass sie die Expressionsmenge im sich entwickelnden Skelettmuskel verändern (Doherty, Proteomics 4 (2004), 2082-2093). Ein einzelnes tryptisches Fragment wurde ausgewählt, um jedes Protein zu repräsentieren (ein "Q-Peptid"), obwohl ein Peptid, das reproduzierbar durch irgendeine proteolytische oder chemische Fragmentierung gebildet wird, verwendet werden könnte, und in diesem Beispiel beruhte die Q-Peptidselektion auf theoretischen und experimentellen Kriterien. Das erste Kriterium war, dass die Q-Peptide keinen Cysteinrest aufweisen sollten, weil der Cysteinrest für die Quantifizierung des QCAT verwendet werden könnte, und die Abwesenheit von Cysteinen sollte komplexe intra- und intermolekulare Disulfidbrückenbildung in dem exprimierten Protein verhindern. Zweitens sollten die gewählten Proteine einzigartig innerhalb des Sets von Q-Peptiden sein. Drittens wurden die Q-Peptide mit Massen zwischen 1000 Da und 2000 Da ausgewählt, was dem Bereich in MALDI-TOF Massenspektren entspricht, wo die Sensitivität des Nachweises typischerweise hoch ist und interferierende Signale niedrig sind. Schließlich wurde ein Durchführungskriterium hinzugefügt, dahingehend dass die Erfinder Peptide auswählten, von denen bereits gezeigt wurde, dass sie ein starkes Signal in der MALDI-TOF Massenspektrometrie zeigen; 75% (15 von 20) waren Arg-terminierte tryptische Peptide – die Neigung von solchen Peptiden, dass sie stärkere Signale in der MALDI-TOF Massenspektrometrie ergeben, ist gut dokumentiert (Brancia, Electrophoresis 22 (2001), 552-559). Ein letztes, weniger wichtiges Kriterium war, dass die Q-Peptide mindestens ein Beispiel einer abundanten und chemisch beständigen Aminosäure, wie Leucin oder Valin enthalten sollten, weil dies die metabolische Markierung mit Aminosäuren für die Herstellung von stabil isotop markierten Q-Peptiden erleichtern würde. Die Peptide sind in Tabelle 1 zusammengefasst: Tabelle 1: Peptide, die für das QCAT Protein ausgewählt wurden.

	Petidmasse (Da)	Sequenz	N Atome	zugrundeliegendes Protein
T1	405,2	MAGK	5	Konstrukt, rettend
T2	386,25	VIR	6	Konstrukt, rettend
T3	1035,52	GFLIDGYPR	12	Adenylatkinase
T4	1601,87	VVLAYEPVWAIGTGK	16	Triosephosphatisomerase
T5	1176.57	NLAPYSDELR	14	Apolipoprotein A1
T6	1193,56	GDQLFTATEGR	15	Myosin bindendes Protein C
T7	1789,88	SYELPDGQVITIGNER	21	Alpha Aktin
T8	1291,67	QVVESAYEVIR	15	Lactatdehydrogenase B
T9	1390,74	LITGEQLGEIYR	16	Betaenolase
T10	1361,63	ATDAESEVASLNR	17	Alphatropomyosin
T11	1160,58	SLEDQLSEIK	12	Myosin schwere Kette (embryonal)
T12	1441,68	VLYPNDNFFEGK	15	Glykogenphosphorylase
T13	1489,71	GILAADESVGTMGNR	19	Aldolase B
T14	1345,65	ATDAEAEVASLNR	17	Betatropomyosin
T15	1687,5	LQNEVEDLMVDVER	19	Myosin schwere Kette (adult)
T16	1748,77	LVSWYDNEFGYSNR	19	Glyceraldehyd 3-Phosphatdehydrogenase
T17	1767,98	ALESPERPFLAILGGAK	21	Phosphoglyceratkinase
T18	1249,65	QVVDSAYEVIK	13	Lactatdehydrogenose A
T19	1803,93	AAVPSGASTGIYEALELR	21	Alphaenolase
T20	1823,97	LLPSESALLPAPGSPYGR	21	Aktinpolymerisationsinhibitor
T21	1857,9	FGVEQNVDMVFASFIR	25	Pyruvatkinase
T22	1991,95	GTGGVDTAAVGAVFDISNADR	25	Kreatinkinase
T23	274,15	AGK	4	Konstrukt, retent
T24	892,42	VICSAEGSK	10	Konstrukt, Quantifizierung
T25	1408,68	LAAALEHHHHHH	24	Konstrukt, Reinigungsmarkierung

Nachdem das Kandidatenset festgelegt war, wurden die Q-Peptide zusammengesetzt, und ein Gen wurde konstruiert, das die zusammengesetzten Q-Peptide unter Verwendung von Codons für die maximale Expression in E. coli kodierte. Am C-Terminus wurde eine Verlängerung hinzugefügt, um einen Cysteinrest und ein His Markierungsreinigungsmotiv bereitzustellen (das zuletzt genannte wurde in diesem Fall durch den Vektor pET21a bereitgestellt). Eine zusätzliche Reihe von Aminosäuren wurde an den N-Terminus angehängt, um einen anfänglichen Methioninrest und ein Rettungspeptid bereitzustellen, die, wenn sie abgespalten werden, ein tatsächliches Q-Peptid (1) exponieren würden. Dies vermied Komplikationen aufgrund der N-Formylierung oder des Entfernens von Methionin von dem N-Terminus von QCAT. Das Transkript, das durch das anfängliche QCAT Gen kodiert wurde, wurde anschließend in silico hinsichtlich Merkmalen wie Haarnadelschleifen untersucht, welche die Translation beeinträchtigen könnten. Wenn ein solches Merkmal bemerkt wurde, wurde die Reihenfolge der Q-Peptide vertauscht, bis eine akzeptable mRNA Struktur erhalten wurde – die Sequenz der Q-Peptide innerhalb eines QCAT ist nicht relevant für ihre Verwendung als Quantifizierungsstandards, und die Ordnung ist somit einer solchen Manipulation zugänglich. Das Gen wurde aus einer Reihe von überlappenden Oligonukleotiden konstruiert und durch DNA Sequenzierung bestätigt.
2. Expression des QCAT
Das QCAT Gen wurde mit Restriktionsstellen konstruiert, sodass es in eine Reihe von Expressionsvektoren (2) eingebaut werden konnte. In diesem Fall wurde das Gen (das durch DNA Sequenzierung bestätigt war) in pET21a in die NdeI und HindIII Stellen eingebaut und wurde anfänglich in E. coli (NovaBlue (DE3)), die in angereichertem Medium wuchsen, exprimiert. Nach der Induktion durch IPTG bestätigte eine SDS-PAGE Analyse eine Expression eines Proteins der erwarteten Masse (~35 KDa) in einer großen Menge. Dieses Protein lag in der unlöslichen Fraktion der sonifizierten Zellen vor, und es wurde angenommen, dass es das QCAT Protein war, das in Einschlusskörpern vorlag. Aus dieser Präparation reinigten wir das QCAT Protein durch Affinitätschromatographie unter Verwendung von Ni-NTA Harz, was zu einer homogenen Präparation führte (2, Einschub). Die intakte durchschnittliche Masse dieses Proteins, gemessen durch ESI-MS, betrug 33036 ± 2 Da (Daten nicht gezeigt), im Vergleich zu der vorhergesagten Masse von 33167 Da für das QCAT Protein, eine Differenz von 131 Da, die exakt übereinstimmt mit dem Verlust des Methioninrestes von dem N-Terminus. Die ca. 35 KDa Gelbande wurde einer Spaltung im Gel mit Trypsin unterzogen und durch MALDI-TOF MS analysiert. Alle vorhergesagten QCAT Peptide wurden einfach in dem MALDI-TOF Massenspektrum beobachtet, obwohl das N- und C-terminale rettungspeptidische Material aufgrund der Gestaltung zu Fragmenten führte, die zu klein waren als dass sie in dem MALDI-TOF Massenspektrum gesehen werden konnten (3). Obwohl die Peptide derart ausgewählt wurden, dass sie gute Signale in der MALDI-TOF erzielten, waren einige Peptide bemerkenswert weniger intensiv als andere. Dies schloss alle der Lysin terminierten Peptide, mit der Ausnahme von T17 ein, das eine nicht spaltbare Arg-Pro Stelle einschloss, das, obwohl es durch Lysin terminiert wurde, immer noch ein starkes Signal in der MALDI-TOF Massenspektrometrie ergab. Dies war besonders offensichtlich in den Isoform spezifischen Q-Peptiden T8 und T18, die von Lactatdehydrogenase A und B (jeweils QVVESAYEVIR und QVVDSAYEVIK) abgeleitet waren; das Lysin terminierte Peptid enthielt weniger als 10% der Intensität des Arginin terminierten Peptids, was nahe legt, dass die Q-Peptide entweder hauptsächlich von Arginin terminierten Peptiden gezogen werden sollten, oder alternativ, dass ein Schritt, wie eine Guanidinierung verwendet werden sollte, um Lysinreste in Homoargininreste umzuwandeln, was die Neigung verstärkt, starke Signal zu ergeben (Brancia, Electrophoresis 22 (2001), 552-559). Das QCAT Protein wurde durch Trypsin sehr wirksam gespalten, und es gab keine Anzeichen für teilweise proteolytische Produkte der Q-Peptide, was selbstverständlich den Quantifizierungsschritt beeinträchtigen würde. Die Erfinder exprimierten anschließend das Protein in Minimalmedium mit ¹⁵NH₄Cl als einzige Stickstoffquelle. Wenn es mit Trypsin gespalten wurde, war das resultierende MALDI-TOF Massenspektrum von hoher Qualität, und alle Q-Peptide waren an dem entsprechenden Massenshift, welche der Anzahl von Stickstoffatomen in dem Peptid entspricht, nachweisbar (Daten nicht gezeigt).
Die unmarkierten und ¹⁵N-markierten QCAT Proteine wurden anschließend in verschiedenen Verhältnissen gemischt, und mit Trypsin gespalten, bevor die resultierenden begrenzten Peptide durch MALDI-TOF Massenspektrometrie analysiert wurden. Die schweren und leichten Varianten der Peptide wurden einfach erkannt (3a), und ihre Intensitäten wurden für eine Reihe von Peptiden gemessen (3b). In allen Fällen waren die Daten von hoher Qualität, und das Verhältnis zwischen dem Anteil des Materials und den schwer:leicht Verhältnissen war linear, mit einer Steigung von Eins (durchschnittlich ± SD (n = 6) = 1,008 ± 0,008), und sehr hohe Korrelationskoeffizienten (r² größer als 0,99 für alle Fälle) wurden erreicht. Die kombinierten Daten (3c) zeigen die Daten für sieben Peptide; die geschlossenen Grenzen, definiert durch die 95% Konfidenzgrenzen, zeigen die Qualität der Quantifizierung.
Zusammenfassung der Ergebnisse
Die Erfinder haben dieses bestimmte QCAT in der Analyse der Proteinexpression in dem Hühnerskelettmuskel am 1. und 27. Tag nach dem Schlüpfen (4) verwendet. Zwölf Proteine, die in dieser Präparation anwesend waren, waren auch in dem QCAT repräsentiert. MALDI-TOF Daten der tryptischen Peptide wurden einfach erhalten, und die Änderungen in den Proteinmengen, die über die ersten drei oder vier Wochen nach dem Schlüpfen auftreten, wurden bestimmt.
Weil die Proteine absolut quantifiziert wurden, waren die Erfinder in der Lage, die Proteine als nmol pro g Nassgewicht des Gewebes auszudrücken. Die Varianz der Dreifachanalysen war gering; die Erfinder wiesen diese Varianz eher einer biologischen als einer analytischen Varianz zu. Die Erfinder hatten kürzlich die Mengen von sieben dieser Proteine durch 2D Gelelektrophorese und Densitometrie gemessen, und die Korrelation zwischen der Quantifizierung unter Verwendung beider Verfahren betrug 0,82 (r², p > 0,001). Unter Beachtung, dass die beiden Verfahren verschiedene Darstellung des Proteoms messen, wie ladungsvariante Isoformen oder Gesamtproteinkomplement, und dass das densitometrische Verfahren unvermeidlich unpräzise ist, ist die Korrelation gut.
Die Erfinder haben die Machbarkeit des QCAT Ansatzes für die Erzeugung eines konkatameren Sets von Q-Peptiden gezeigt. Das QCAT, das entworfen wurde, unter sowohl theoretischer als auch experimenteller Betrachtungen, wurde in hohen Mengen exprimiert, selbst wenn es auf Minimalmedium angezogen wurde, und das Produkt wurde erfolgreich gereinigt. Weil das QCAT ein vollständig künstliches Konstrukt ist, erwarteten die Erfinder nicht, dass es sich zu irgendeiner erkennbaren dreidimensionalen Struktur falten würde, und, wie erwartet, aggregierte das Protein in Einschlusskörpern. Dies ist ein Vorteil, weil die anschließende Reinigung einfacher ist, und sie nur die Resolubilisierung des Pellets in einem stark chaotropen Mittel vor der Affinitätsreinigung benötigt. Darüber hinaus würde der Mangel an einer höheren Ordnungsstruktur des QCAT sicherstellen, dass das QCAT mindestens so schnell gespalten wurde, wie die Zielproteine, die quantifiziert werden sollen.
Verwendung des künstlichen Proteins und der QCAT Peptide
Es gibt zwei Wege, in denen die Konkatamere verwendet werden. Zunächst werden in dem direkten Q-Peptid Verfahren die Konkatamere als ein interner Standard verwendet. Das stabil isotop markierte Konkatamer kann direkt zu einer Probe oder einer Zellpräparation vor dem proteolytischen Schritt zugegeben werden. Alternativ dazu, kann die Konkatamerquantifizierung, für einige Zellsysteme, ver wendet werden, um eine absolute Quantifizierung eines Referenzstammwachstums unter vorsichtig definierten Bedingungen zu erreichen – der indirekte Q-Peptid Ansatz. Dieser Referenzstamm kann anschließend, in stabil isotop markierter Form, als ein absoluter Quantifizierungsstandard für alle zukünftigen Proteom Quantifizierungsstudien unter Verwendung dieses Organismus, verwendet werden. Sobald ein Referenzstamm akkurat quantifiziert wurde, kann irgendein Peptid verwendet werden, um über ein Protein Auskunft zu geben, anstelle des begrenzten Satzes, der als Q-Peptide verwendet wird, und dies ist eindeutig ein sehr attraktiver Vorschlag. Dies erweitert die Generalität von verschiedenen Proteomstrategien und kretiert eine neue Nische für Markierungsverfahren, wie ICAT (Gygi, J Proteoms Res 1 (2002), 47-54 und ITRAQ (Ross, Molecular and Cellular Proteomics im Druck (2004)) in einer vergleichenden Proteomanalyse eines unbekannten gegenüber einem vollständig quantifizierten Stamm.
Jedoch bemerken die Erfinder, dass es viele Fälle gibt, wo dieser Ansatz nicht geeignet ist, und wo ein stabiles Isotop markiertes Konkatamer selbst (der direkte Q-Peptid Ansatz) den geeigneten Standard darstellen wird. Dies ist insbesondere in Proteomstudien unter Verwendung von biologischem Material angebracht, das nicht einfach zuvor markiert werden kann, zum Beispiel in tierischen Geweben oder in Biomarkerstudien.
Besondere Vorteile
Die Strategie, welche die Erfinder empfehlen, ist der chemischen Synthese jedes einzelnen Q-Peptids, für gewöhnlich in einer stabilen Isotopform, überlegen. Während die chemische Synthese in einmaligen Anwendungen verwendet wurde, ist der Vorgang der Peptidsynthese nicht ausreichend "sauber", um eine gründliche Reinigung des Produkts zu umgehen. Zweitens würde in mehrschichtigen bzw. Multiplex Assays jedes Peptid einzeln vor der Verwendung quantifiziert werden müssen. Schließlich sind chemisch synthetisierte Q-Peptide eine begrenzte Quelle, wohingegen die wiederholte Expression des QCAT Gens einfach ist. Absolute Quantifikation mit hoher Qualität kann ein wirksamer Weg sein, um die Schwierigkeiten zu überwinden, die mit den gegenwärtigen Verfahren für die vergleichende Proteomik assoziiert sind, gleichgültig ob sie auf einer Gelanalyse oder auf Massenspektrometrie beruhen. Eine Reihe von vergleichenden Studien von bestimmten zellulären Systemen, jede durch Vergleich mit einer QCAT quantifizierten Referenz, würde nicht nur einzeln quantifiziert werden, sondern sollte auch ausreichend drastisch sein, dass, wenn die Datensätze wachsen, irgendein paarweiser Vergleich robust und transferierbar zwischen individuellen Labors und stabil über die Zeit wäre.
Es sollte möglich sein, die Neigung der Peptide zu ionisieren, zu berücksichtigen, und ein gutes Signal in dem Massenspektrometer zu erzeugen. Zur Zeit werden die Ionenintensitäten nicht erschöpfend in der Analyse von Massenspektren verwendet, obwohl es einige kürzliche Versuche gab, eine Intensität unter Verwendung von wissensbasierten Ansätzen vorherzusagen (Krause, Anal Chem 71 (1999), 4160-4165; Gay, Proteomics 2 (2002), 1374-1391; Baumgart, Rapid Commun Mass Spectrom 18 (2004), 863-868).
Ein zusätzlicher Faktor, der in Betracht gezogen werden muss, ist die Wahl der Vorläufermarkierung. Während eine gleichmäßige Markierung mit [¹³C] oder [¹⁵N] sicherstellt, dass jedes Peptid umfangreich markiert wird, kann es vorteilhaft sein, Kopeptide derart auszuwählen, dass jedes dieselbe Aminosäure enthält, die anschließend als der stabile Isotop markierte Vorläufer verwendet wird. Weil von den meisten QCAT Proteinen angenommen würde, dass sie aus tryptischen Peptiden zusammengesetzt sind, würde eine Strategie des Einbaus von [¹³C₆]-Lysin und [¹³C₆]-Arginin ebenfalls sicherstellen, dass die meisten Q-Peptide einfach markiert wären, und dass die Massendifferenz zwischen den schweren und leichten Peptiden bei konstant 6 Da läge. Darüber hinaus könnte ein unmarkiertes QCAT in vitro unter Verwendung von Reagenzien markiert werden, die für die vergleichende Proteomik befürwortet werden, was alle diese Technologien für die absolute Quantifizierung verbessert.
Ohne durch irgendeine bestimmte Theorie gebunden zu sein, glauben die Erfinder, dass die Zahl der Kopeptide, die in einem einzelnen QCAT zusammengesetzt werden könnten, durch die Fähigkeit begrenzt ist, eine heterologe Expression gro ßer Proteine in einer großen Menge zu erreichen. in dem hier angegebenen Beispiel wählten die Erfinder 20 Peptide mit einer durchschnittlichen Menge von 15 Aminosäuren und einem durchschnittlichen Molekulargewicht von 1,5 kDa. Wenn 100 Proteine in einem einzelnen QCAT repräsentiert wären, wäre das resultierende rekombinante Protein 150 kDa groß, das sich einfach exprimieren lassen sollte. Das vollständige Hefeproteom, aus ungefähr 6000 Proteinen, könnte dann innerhalb von ungefähr 60 QCAT Konstrukten definiert werden.
Die Möglichkeit bis zu 100 Proteine in einem einzigen Konstrukt zu quantifizieren, stellt die Herausforderung des optimalen Zusammenbaus von individuellen Q-Peptiden in QCATs. Verschiedene Kriterien sind vorstellbar. Zuerst würde eine Gruppe von Q-Peptiden die absolute Quantifizierung einer bestimmten subzellulären Fraktion oder eines spezifischen Untersatzes von Proteinen, zum Beispiel Transkriptionsfaktoren oder Proteinkinasen, erlauben. Zweitens, und vielleicht noch wichtiger, könnte die Konkatamerisierung durch die Abundanz der Zielproteine in der Zelle gesteuert sein. Es wäre schwierig, zwei verschiedene Proteine mit sehr verschiedenen Expressionsmengen in demselben QCAT Experiment zu quantifizieren, und es mag bevorzugt sein, stark abundante Proteine in einem Konstrukt, das sich von jenem unterscheidet, das niedrig abundante Proteine kodiert, zusammenzusetzen.
Andere Anwendungen für QCATs sind einfach vorstellbar, insbesondere in den breiten Bereichen der klinischen Biologie und Toxikologie und Diagnostik. Die absolute Quantifizierung wird eine neue Dimension zu den vorhersagbaren Analysewerten in klinischen und anderen Biomarkerüberwachungssystemen hinzufügen, und sie wird absolut die stöchiometrischen Verhältnisse von einzelnen Proteinen innerhalb eines subzellulären Kompartiments oder eines Multiproteinkomplexes definieren.
Material und Methoden
Materialien.
[¹⁵N]H₄Cl (99% Atomprozentüberschuss) wurde von CK Gas Products Ltd., Hampshire, UK bereitgestellt. Die meisten Reagenzien, außer sie sind hier aufgelistet, wurden zuvor beschrieben (Doherty, Proteomics 4 (2004) 2082-2093; Pratt, Proteomics 2 (2002), 157-160). Hühner (Schicht, Hi-Sex Braun) Skelettmuskelproteine wurden aus 1 und 27 Tagen alten Hühnern als ein 20.000 g Überstand eines 10% (w/v) Homogenats hergestellt (Doherty, Proteomics 4 (2004) 2082-2093; Doherty, Proteomics 5 (2005) 5, 522-533).
QCAT Gen Gestaltung und Konstruktion.
Die Q-Peptide wurden hinsichtlich der Einzigartigkeit von der Masse, der Neigung zu ionisieren und der Nachweisbarkeit in der Massenspektrometrie, der Anwesenheit von spezifischen Aminosäureresten (zum Beispiel Leucin oder Valin), der Abwesenheit von anderen Aminosäureresten (Cystein, Histidin, Methionin) ausgewählt. Die Peptidsequenzen wurden anschließend zufällig in silico konkatamerisiert und verwendet, um die Gestaltung eines Gens zu steuern, und für die Expression in E. coli Kodonoptimiert. Das vorhergesagte Transkript wurde hinsichtlich RNA Sekundärstruktur analysiert, welche die Expression verringern könnte, und falls diese anwesend war, wurde die Reihenfolge der Peptide verändert. N- und C-terminale Sequenzen wurden als Rettungsstrukturen hinzugefügt, welche den Zusammenbau der tatsächlichen Q-Peptide vor dem exoproteolytischen Angriff während der Expression schützen. Zusätzliche Peptidsequenzen wurden hinzugefügt, um ein Initiatormethionin und einen C-terminalen Cysteinrest für die Quantifizierung bereitzustellen. Das künstliche Gen wurde de novo (von der Entelechon GmbH, Deutschland) aus einer Reihe von überlappenden Oligonukleotiden synthetisiert, durch DNA Sequenzierung verifiziert und in die NdeI und HindIII Stellen des pET21a Expressionsvektors ligiert, um das QCAT Peptid, pET21a QCAT, zu erhalten. Eine His₆ Reinigungsmarkierung wurde durch Fusion mit dem Vektor bereitgestellt.
QCAT Gen Expression und Markierung mit ¹⁵N.
Das QCAT Plasmid, pET21a QCAT, wurde verwendet, um NovaBlue (DE3) (K-12 endA1, hsdR17(r_K12 ^–m_K12 ⁺) supE44, thi-1, recA1, gyrA9, relA1, lac, F'[proA⁺B⁺, lac/^qZM15::Tn10(Tc^R)] Zellen mit Ampicillin Resistenz zu transformieren. Die Zellen wurden bei 37°C in Luria Broth, 100 μg/ml Ampicillin auf eine OD₆₀₀ von 0,4–0,6 angezogen, und IPTG wurde zu 1 mM hinzugefügt. Die Inkubation wurde für weitere fünf Stunden fortgesetzt, als die Zellen durch Zentrifugation (5000 g, 4 min., 4°C) pelletiert, in 10 ml 20 mM Tris/HCl Puffer, pH 8,0 resuspendiert wurden, und Lysozym wurde für zehn Minuten bei Raumtemperatur zugegeben (100 μg/ml). Die Zellen wurden anschließend auf Eis sonifiziert (drei Beschallungen von 30 s) und bei 14.000 g für 10 min zentrifugiert. Die Pellets und die Überstände von induzierten und nicht induzierten Kulturen wurden durch 12,5% (w/v) SDS PAGE/Coomassie Blaufärbung analysiert. Für die ¹⁵N Markierung wurden die Zellen in M9 Minimalmedium angezogen, das unter Verwendung von [¹⁵N]H₄Cl (20 mM) hergestellt wurde, und sie wurden induziert und verarbeitet wie oben angegeben.
Reinigung und Analyse des QCAT Proteins.
Die Pellets von den beschallten Zellen wurden in 20 mM Phosphatpuffer (pH 7,5) enthaltend 20 mM Imidazol und 8 M Harnstoffe (Puffer A) gelöst, bevor sie auf eine NiNTA Säule (GE Healthcare) aufgetragen wurden. Nach dem Waschen mit 10 Säulenvolumina desselben Puffers wurde das gebundene Material mit Puffer A mit einer steigenden Konzentration von Imidazol (500 mM) eluiert. Dieses Material wurde auf Sephadex G25 "Zentrifugationssäulen" entsalzt, und die Masse des eluierten Proteins wurde durch Elektrospray Ionisierungsmassenspektrometrie unter Verwendung eines Waters-Micromass Q-ToF Mikromassenspektrometers bestimmt. Die Massenspektren wurden unter Verwendung des MaxEnt I Algorithmus verarbeitet. Das gereinigte entsalzte Protein wurde mit Trypsin gespalten, und die resultierenden Proteine wurden unter Verwendung eines Waters-Micromass MALDI-TOF Massenspektrometers massenbestimmt (Doherty, Proteomics 4 (2004) 2082-2093). Um das Antwortverhältnis von schweren und leichten Varianten des QCAT zu bestimmen, wurden die gereinigten "schweren" und "leichten" Proteine in verschiedenen Verhältnissen vor der Spaltung mit Trypsin und der MALDI-TOF Massenspektrometrie gemischt. Die Intensitäten der [¹⁴N]- und [¹⁵N]-Peptide wurden auf Schwerpunktspektren gemessen.
Verwendung des QCAT, um die Muskelproteinexpression zu quantifizieren.
Die Überstandfraktion, die lösliche Proteine vom Huhn enthielt, die aus 100 mg Gewebe stammten, wurden mit 290 μg [¹⁵N] QCAT gemischt, durch Proteinassay quantifiziert und mit Trypsin über Nacht gespalten – das QCAT wurde mit einer größeren Rate bzw. Geschwindigkeit gespalten als endogene Muskelproteine (Er gebnisse nicht gezeigt). Das Experiment wurde für drei Tiere zu jedem Zeitpunkt wiederholt. Anschließend wurden die [¹⁴N]-(Muskel) und [¹⁵N]-(QCAT) Peptide durch die Masse identifiziert, und ihre relativen Intensitäten wurden durch MALDI-TOF Massenspektrometrie bestimmt.
Massenspektrometrische Analyse.
Die Analyse in diesem Beispiel wurde unter Verwendung eines MALDI-TOF Massenspektrometers durchgeführt, aber dieses Verfahren ist genauso auf alle anderen massenspektrometrischen Verfahren anwendbar, die für die Analyse von Peptiden geeignet sind.
Literaturzitate

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WO 03/102220 (Aebersold, R.)

SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Künstliches Protein, das durch eine Gen Gestaltung de novo erzeugt wird, das Konkatamere aus Q-Peptiden umfasst, die Signaturpeptide sind, die durch irgendeine proteolytische oder chemische Fragmentierung erzeugt sind zur quantitativen Analyse des Proteoms einer Probe, einer Zelle oder eines Organismus, umfassend: (a) mindestens zwei aufeinander folgende Peptide, die durch eine Schnittsequenz zum Trennen der Peptide verknüpft sind; (b) eine einzelne Markierung auf einem oder mehreren Peptid/en zur Bestimmung der absoluten Menge des Proteins; und (c) N-terminale und C-terminale Verlängerungen zum Schutz, zur Reinigung und zur Quantifizierung der Peptide; wobei jedes Peptid ein einziges Protein der Probe, der Zelle oder des Organismus darstellt, das Peptid innerhalb der Reihe von Q-Peptiden einzigartig ist und jedes Peptid in einer definierten Stöchiometrie vorliegt, und wobei das Protein 20-60 Peptide umfasst.
Künstliches Protein nach Anspruch 1, wobei das Protein aus 60 Peptiden besteht.
Künstliches Protein nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Schnittsequenz durch eine Protease geschnitten wird, vorzugsweise durch Trypsin.
Künstliches Protein nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die einzelne Markierung ein Cysteinrest ist.
Künstliches Protein nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei ein oder mehrere Peptid/e ein oder mehrere Male identisch wiederholt sind, um eine besondere Stöchiometrie zwischen allen Peptidarten zu erreichen.
Künstliches Protein nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Protein eine Affinitätsmarkierung zur Reinigung des Proteins umfasst.
Künstliches Protein nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Protein durch ein Isotop markiert ist.
Künstliches Protein nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei jedes Peptid etwa zwischen 3 und 40 Aminosäuren, vorzugsweise etwa 15 Aminosäuren umfasst.
Künstliches Protein nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Peptide unterschiedliche konformative, metabolische oder modifikatorische Zustände des Proteins darstellen.
Künstliches Protein nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Peptide eine definierte Verteilung des Molekulargewichts und quantitative Verhältnisse aufweisen.
Sammlung von Konkatameren aus Q-Peptiden, wie in Anspruch 1 definiert, die das vollständige Proteom eines Organismus abdeckt, um die schnelle Quantifizierung des Proteoms eines solchen Organismus zu ermöglichen.
Vektor, umfassend eine Nukleinsäure, die das künstliche Protein nach einem der Ansprüche 1–10 kodiert.
Kit, umfassend den Vektor nach Anspruch 12 und/oder das künstliche Protein nach einem der Ansprüche 1–10.
Verfahren zur quantitativen Analyse des Proteoms einer Probe, einer Zelle oder eines Organismus, umfassend die Schritte: (a) Quantifizieren der absoluten Menge des künstlichen Proteins nach einem der Ansprüche 1–10, das Konkatamere aus Q-Peptiden und N-terminale und C-terminale Verlängerungen zum Schutz, zur Reini gung und zur Quantifizierung oder ein Peptid umfasst, das die einzelne Markierung enthält; (b) Erzeugen einer Präparation des zu quantifizierenden Proteins; (c) Mischen der Produkte der Schritte (a) und (b); (d) vollständiges Schneiden des künstlichen Proteins nach einem der Ansprüche 1–10 und des in Schritt (b) zu quantifizierenden Proteins an der Schnittsequenz; (e) Bestimmen der Masse der Peptide und daraus; (f) Berechnen der absoluten Menge jedes Proteins, wobei das künstliche Protein und/oder die Peptide isotopisch markiert sind.