DE102006041644B4

DE102006041644B4 - Verfahren zur Detektion von Modifikationen in einem Protein oder Peptid

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Publication number: DE102006041644B4
Application number: DE200610041644
Authority: DE
Inventors: Dr. Bächle Daniel; Dr. Flad Thomas; Alexander Cansier
Original assignee: PANATecs GmbH
Current assignee: PANATecs GmbH
Priority date: 2006-08-23
Filing date: 2006-08-23
Publication date: 2011-12-01
Anticipated expiration: 2026-08-24
Also published as: DE102006041644A1

Abstract

Es wird ein Verfahren zur Detektion von Modifikationen in einem Protein oder Peptid vorgeschlagen, das die folgenden Schritte aufweist: Bereitstellen einer biologischen Probe, die zumindest ein Protein oder Peptid aufweist, Behandeln der Probe mit zumindest einer schnittstellenspezifischen Protease zur Erzeugung einer Mischung aus Fragmeritpeptiden, Analyse der erhaltenen Mischung aus Fragmentpeptiden zur Erzeugung eines Fragmentierungsmusters, Vergleich des erhaltenen Fragmentierungsmusters mit einem Referenzfragmentierungsmuster, das ausgehend von dem Protein oder Peptid ohne die Modifikation erhalten wurde, und Detektieren der Modifikationen an Hand der Unterschiede zwischen dem Fragmentierungsmuster und dem Referenzfragmentierungsmuster.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis von Doping mit Insulin oder einem modifizierten Insulin, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Insulin-Lispro, Insulin-Aspart und Insulin-Glulisin.
Proteine und Peptide sind natürliche Polymere, die aus Aminosäuren gebildet werden, die über Peptidbindungen verknüpft sind. Die Funktion oder Wirkung eines Proteins oder Peptids im Metabolismus eines Organismus wird dabei wesentlich von der Aminosäuresequenz, die auch als Primärstruktur bezeichnet wird, bestimmt. Ferner kann diese Primärstruktur z. B. durch eine Glykosylierung oder eine Phosphorylierung weiter chemisch bzw. biochemisch verändert werden, was zu einer Veränderung der Funktion oder Aktivität des Proteins oder Peptids führen kann.
In einem Protein oder Peptid können nun Modifikationen vorkommen, die dieses Protein oder Peptid von einem Referenzprotein oder -Peptid unterscheiden. Bei diesem Referenzprotein oder -Peptid kann es sich z. B. um den Wildtyp eines Proteins oder Peptids oder auch um ein gezielt hergestelltes Protein oder Peptid handeln. Solche Modifikationen können sowohl beispielsweise zur Erlangung einer besonderen Aktivität des Proteins oder Peptids gegenüber dem Referenzprotein oder -Peptid gewünscht als auch unerwünscht sein. Die unerwünschten Modifikationen können entweder selbst Auslöser für Störungen im Organismus, also Krankheiten, sein oder auch einen Anzeiger für Störungen in einem Organismus darstellen.
Ein Beispiel für eine gewünschte Modifikation in einem Protein oder Peptid ist das Insulin-Analog Lispro, in dem die Aminosäuren Lysin und Prolin an Position 25 und 28 der B-Kette gegenüber humanem Insulin vertauscht sind. Dies führt zu einem Insulin-Analog, das deutlich schneller aufgenommen wird.
Ein Beispiel für eine mit einem krankhaften Zustand eines Organismus assoziierte Modifikation ist die Deiminierung der proteinogenen Aminosäure Arginin zur unnatürlichen Aminosäure Citrullin, bei der die Ureidogruppe des Arginins durch eine Carbamoylgruppe ersetzt wird. Eine solche Deiminierung in Proteinen, die Arginin enthalten, ist häufig mit entzündlichen Krankheiten bzw. Autoimmunkrankheiten wie z. B. multipler Sklerose oder rheumatoider Arthritis assoziiert; vgl. Vossenaar et al. (2004), Arthritis Res. Ther. 6: R142.
Ferner ist es in den letzten Jahren insbesondere im Bereich des Hochleistungssports zu einer vermehrten Einnahme von leistungssteigernden Substanzen auf Basis von Proteinen oder Peptiden (Doping) gekommen. Solche Proteine oder Peptide unterscheiden sich ebenfalls häufig durch Modifikationen von den natürlich im Körper vorkommenden Proteinen oder Peptiden. Beispiele für solche Substanzen sind Erythropoetin, Insulin-Analoga, biotechnologisch hergestellte Wachstumshormone oder zur Aktivitätssteigerung veränderter Insulin-like growth factor (IGF). Zum Nachweis von Doping wären daher Analysemethoden nützlich, mit denen solche modifizierten Substanzen auch in geringen Mengen sicher nachgewiesen werden können.
Da die zuvor beschriebenen Modifikationen häufig nur zu relativ geringen strukturellen Veränderungen in einem Protein oder Peptid führen, werden die modifizierten Proteine selbst von spezifischen Antikörpern oft nicht von den nicht modifizierten Proteinen oder Peptiden unterschieden. Somit ist eine direkte Detektion einer Modifikation mit immunologischen Methoden häufig nicht zuverlässig möglich.
Auch die direkte Detektion von Modifikationen mit massenspektrometrischen Methoden ist oft schwierig, da die Modifikationen häufig zu keiner oder nur zu relativ geringen Masseunterschieden (eine einzige Deiminierung in einem Protein oder Peptid führt z. B. zu einem Massenunterschied von nur 1 Da) führen, so dass das Signal für ein modifiziertes Protein oder Peptid häufig von dem Signal des nicht modifizierten Proteins oder Peptids überdeckt wird. Modifikationen wie der Austausch der Positionen von Aminosäuren in einem Protein oder Peptid haben gar keinen Einfluss auf das Molekulargewicht des Proteins und sind somit mit massenspektrometrischen Verfahren überhaupt nicht direkt nachweisbar.
Die DE 10 2004 051 016 A1 beschreibt ein Verfahren zur Aufklärung der Primärstruktur von Biopolymeren, wie z. B. Proteinen, bei dem die Biopolymere in Fragmente aufgespalten werden und diese Fragmente einer massenspektrometrischen Analyse unterzogen werden, wodurch Massenspektren erhalten werden und bei dem bekannte Algorithmen zu einer ersten Sequenzanalyse der Fragmente verwendet werden, um mittels der Massenspektren eine Primärstruktur des Biopolymers zu erhalten.
Die WO 02/21139 A2 offenbart ein Verfahren zur vollautomatischen benutzerunabhängigen Identifikation von Peptiden, in dem ein erstes Fragmentierungsspektrum, das durch Massenspektrometrie eines experimentelles Peptids erhalten wurde, analysiert wird, um eine Peak-Liste zu bilden. Die Peak-Liste wird durch einen „Spectral-Read”-Algorithmus verarbeitet, um eine oder mehrere Suchsequenzen zu generieren, mit denen dann Datenbanken nach möglichen Suchsequenzen durchsucht werden. Werden ein oder mehrere Kandidaten ermittelt, wird dann ein sog. Backread durchgeführt, um zu prüfen, inwieweit die Kandidaten mit den experimentellen Daten übereinstimmen.
Die WO 03/087805 A2 offenbart ein Verfahren, um automatisch theoretische Massenspektren von Proteinen, die Modifikationen wie posttranslationale Modifikationen aufweisen, präzise und effizient zu berechnen.
Oda et al. (Accurate quantitation of Protein expression and side-specific phosphorylation, Y. Oda, K. Huang, F. R. Cross, D. Cowburn und B. T. Chait, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Band 96 (1999), Seiten 6591–6596, offenbaren ein Verfahren zur genauen Quantifizierung der Proteinexpression und der spezifischen Phosphorylierung unter Verwendung von stabilen Isotopen, wobei eine genaue Quantifizierung durch die Verwendung eines Labelings mit stabilen Isotopen erreicht wird.
Die US 2003/0139885 A1 offenbart ein Verfahren zur Vereinfachung von Massenspektren einer Probe, wobei theoretische Massenspektren von zumindest einem in der Probe enthaltenen Protein berechnet werden und die sich dabei ergebenden Peaks mit experimentellen Spektra korreliert werden.
Die WO 02/39120 A1 offenbart ein Verfahren zur Identifikation des Proteoms von Zellen unter Verwendung einer Antikörper-Libary, wobei die zu untersuchenden Proteine aus dem Gewebe oder Zellen isoliert werden und diese Proteine dazu verwendet werden in einem Wirtstier Antikörper zu erzeugen.
Die DE 101 55 692 A1 offenbart ein Verfahren zum Nachweis bzw. zur Differenzierung von endogenen und exogenen Stoffen, insbesondere zur Doping-Kontrolle, wobei diese Stoffe auf einem Trägermaterial angereichert werden und anschließend über ihre unterschiedlichen Massen nachgewiesen bzw. differenziert werden.
Die US 2002/0048783 A1 betrifft einen Antikörper der ein glycosiliertes rekombinantes Protein oder Peptid, jedoch nicht die native Version des rekombinanten Proteins oder Peptids bindet, sowie einen Antikörper der rekombinantes Human-Erythropoetin, aber nicht natives Human-Erythropoetin bindet, sowie Verfahren zur Detektion der oben genannten Substanzen unter Verwendung solcher Antikörper und Verfahren zur Herstellung solcher Antikörper.
Rose, K. [u. a.], Biochemical Journal (1988), Vol. 250, Seiten 253–259 beschreiben die Identifikation von C-terminalen Peptiden durch eine enzymatische Hydrolyse von Proteinen in Gegenwart von D₂O.
Thevis, M. [u. a.], Rapid Communications in Mass Spectrometry (2005), Vol. 19, Nr. 7, Seiten 928–936 beschreiben die Identifikation von oralen Antibiotika im menschlichen Urin durch Flüssigchromatographie-gekoppelte Massenspektrometrie.
Thevis, M. [u. a.], Analytical Chemistry (2006), Vol. 78, Nr. 6, Seiten 1897–1903 beschreiben die Analyse von Insulin-Analoga im menschlichen Urin durch Flüssigchromatographie-Tandem Massenspektrometrie zur Doping-Kontrolle.
Es ist daher eine Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren zum Nachweis von Doping mit einem Protein oder Peptid bereitzustellen, mit dem Doping einfach und zuverlässig auch bei einer relativ geringen Konzentration an modifiziertem Protein oder Peptid nachgewiesen werden kann.
Erfindungsgemäß wird die Aufgabe durch ein Verfahren zum Nachweis von Doping mit Insulin oder einem modifizierten Insulin, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Insulin-Lispro, Insulin-Aspart und Insulin-Glulisin gelöst, das die folgenden Schritte aufweist:

A. Bereitstellen einer biologischen Probe,
B. Unterziehen der biologischen Probe einem Verfahren zur Detektion von Modifikationen in einem Protein oder Peptid mit den folgenden Schritten: 1. Bereitstellen einer biologischen Probe, die zumindest ein Protein oder Peptid aufweist, 2. Behandeln der Probe mit zumindest einer schnittstellenspezifischen Protease, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Trypsin, Endoprotease GluC und Endoprotease AspN zur Erzeugung einer Mischung aus Fragmentpeptiden, 3. Analyse der in Schritt 2. erhaltenen Mischung aus Fragmentpeptiden mittels eines massenspektrometrischen Verfahrens zur Erzeugung eines Fragmentierungsmusters, 4. Vergleich des in Schritt 3. erhaltenen Fragmentierungsmusters mit einem Referenzfragmentierungsmuster, das ausgehend von Insulin oder einem modifizierten Insulin, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Insulin-Lispro, Insulin-Aspart und Insulin-Glulisin nach den Schritten 1. bis 3. erhalten wurde, und 5. Detektieren von Insulin oder dem modifizierten Insulin an Hand der Unterschiede zwischen dem in Schritt 3. erhaltenen Fragmentierungsmuster und dem Referenzfragmentierungsmuster.
C. Optional ein ein- oder mehrmaliges Wiederholen von Schritt B, und
D. Nachweis des Dopings mit zumindest einem modifizierten Protein oder Peptid basierend auf der Art und dem Ausmaß der in Schritt B. detektierten Modifikationen.

Die Erfinder haben überraschenderweise herausgefunden, dass gewisse Modifikationen von Proteinen und Peptiden zum Wegfallen, Auftreten oder zu einer Verschiebung von Schnittstellen für schnittstellenspezifische Proteasen führen können. Dies kann z. B. durch den Wegfall oder Austausch von Aminosäuren oder eine Änderung der Abfolge von Aminosäuren passieren. Ein weiterer Grund für das Auftreten und Wegfallen von Schnittstellen für schnittstellenspezifische Proteasen können posttranslationale bzw. chemisch eingeführte Modifikationen an den Seitenketten von Aminosäuren sein. Einige dieser Modifikationen und Proteasen, deren Schnittstellen durch die Modifikationen wegfallen, sind nachstehend in Tabelle 1 angegeben. Tabelle 1

Modifikation [modifizierte Aminosäuren]	Betroffene schnitistellenspeziflsche Protease
Deiminierung [Arg] Chemische Modifikation der ε-Amino-gruppe [Lys]	Trypsin bzw. Trypsin in Verbindung mit LysC
N-Glykosylierung [Asn]	Asparaginyl-Endopeptidase
Modifikation am N-Terminus (z. B. Acetylierung, Palmitoylierung, Formylierung)	Aminopeptidase
Modifikation am C-Terminus (z. B. Amidierung, ADP-Ribosylierung)	Carboxyopeptidase
γ-Carboxylierung [Glu]	Endoprotease GluC
Deamidierung [Asn]	Endoprotease AspN
Sulfatisierung [Tyr] Phosphorylierung [Tyr]	Cathepsin D

Durch den Wegfall, die Verschiebung oder das Auftreten von Schnittstellen in einem modifizierten Protein oder Peptid kommt es gegenüber einem nicht modifizierten Protein oder Peptid zu einer Veränderung des durch die Behandlung mit der schnittstellenspezifischen Protease erzeugten Fragmentierungsmusters.
Genauer gesagt liegen im Falle einer solchen Modifikation für die schnittstellenspezifische Protease mehr, weniger, keine oder andere Schnittstellen vor, und somit kommt es zu einer veränderten Fragmentierung. Da die gebildeten Fragmente sich z. B. in ihrer Masse, jedoch auch in anderen Eigenschaften deutlich von den ursprünglichen Proteinen oder Peptiden unterscheiden, lassen sich die Unterschiede in den gebildeten Fragmenten und damit die Modifikationen deutlich einfacher und mit höherer Genauigkeit detektieren.
Gemäß der Erfindung erfolgt die Detektion der Modifikation also nicht mehr durch die direkte Detektion des modifizierten Proteins oder Peptids, sondern indirekt über die Fragmentierung dieses Proteins oder Peptids bei der Umsetzung mit einer schnittstellenspezifischen Protease. Durch die hohe Spezifität von schnittstellenspezifischen Proteasen können Veränderungen an diesen Schnittstellen mit einer hohen Zuverlässigkeit detektiert werden, was eine frühere und genauere Detektion von Modifikationen und damit auch eine Diagnose von Krankheiten, eine Qualitätskontrolle von Biopharmaka oder den Nachweis von Doping möglich macht.
Der Begriff ”biologische Probe”, wie er zuvor und hiernach verwendet wird, schließt jede Probe ein, in der Proteine oder Peptide erwartet werden. Beispielsweise kann diese Probe menschlichen, tierischen, pflanzlichen, mykotischen, bakteriellen oder viralen Ursprungs sein. Dies schließt aber auch Proben nicht-biologischen Ursprungs ein.
Der Begriff ”Peptid”, wie er zuvor und hiernach verwendet wird, beschreibt die Verkettung von zumindest zwei Aminosäuren durch eine Peptidbindung. Bei den Aminosäuren kann es sich sowohl um natürliche, proteinogene als auch um unnatürliche, nicht-proteinogene Aminosäuren und sowohl um L- als auch um D-Aminosäuren handeln. Diese Aminosäuren sowie die Peptide können sowohl synthetisch in vitro als auch in vivo hergestellt sein.
Der Begriff ”Protein”, wie er zuvor und hiernach verwendet wird, beschreibt die Verkettung von zumindest zwei Peptiden durch eine Peptidbindung. Die Proteine können sowohl synthetisch in vitro als auch in vivo hergestellt sein.
Der Begriff ”Fragmentpeptid”, wie er zuvor und hiernach verwendet wird, beschreibt ein Peptid, das durch Behandlung eines Proteins oder Peptids mit einer schnittstellenspezifischen Protease erhalten wurde. Hierbei sind auch Proteine und Peptide eingeschlossen, die aufgrund des Wegfalls aller Schnittstellen keine Veränderung erfahren haben.
Der Begriff ”schnittstellenspezifische Protease” beschreibt eine Substanz, die ein Protein oder Peptid spezifisch und reproduzierbar an einer oder mehreren Stellen innerhalb der Aminosäure-Sequenz des Proteins oder Peptids spaltet. Eine solche Protease ist insbesondere, aber nicht ausschließlich, ein natürliches oder rekombinantes Enzym.
Der Begriff ”schnittstellenspezifische Protease” schließt auch sequenzspezifisch spaltende Chemikalien nicht-biologischen oder nur teilweise biologischen Ursprungs ein. Beispiele für Spaltungen durch schnittstellenspezifische Chemikalien zur chemischen Fragmentierung von Peptiden und Proteinen schließen Folgendes ein, nämlich die Spaltung am Methionin mit Bromcyan, die Spaltung an Asparagin-Prolin-Bindungen durch saure Hydrolyse mit vorzugsweise 70% (v/v) Essigsäure oder Trifluoressigsäure, die Spaltung an Tryptophan mit Iodosobenzoesäure, und die Spaltung von Asparagin-Glycin-Bindungen mit Hydroxylamin.
In einer Ausgestaltung der zuvor genannten Maßnahme sind die massenspektrometrischen Verfahren ausgewählt aus ESI-MS und MALDI-MS.
ESI-MS (Electrospray Ionization Mass Spectrometry) und MALDI-MS (Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry) sind Techniken, die sich besonders gut zur massenspektrometrischen Analyse von Proteinen eignen.
Bevorzugt kommen dabei sog. ”time of flight” (TOF)-Messungen zur Bestimmung der Masse der zu untersuchenden Probe zum Einsatz. Hierbei wird die Masse anhand der Flugzeit eines Ions im Vakuum durch Vergleich mit bekannten Standards bestimmt.
Da in diesem Schritt nicht mehr die intakten Proteine oder Peptide, sondern die Fragmentierungsmuster und ggf. die An- oder Abwesenheit von Fragmentpeaks untersucht werden, ergeben sich die Probleme, die sich aus den geringen Massenunterschieden bei der Unterscheidung von nicht modifizierten und modifizierten Proteinen ergeben, hier nicht mehr.
Aufgrund des Ionisierungsverfahrens kommt es bei diesen Techniken im Allgemeinen bei der massenspektrometrischen Analyse von Proteinen nicht zu Fragmentierungen, die die Analyse verfälschen könnten.
Ferner haben diese Techniken den Vorteil, dass aus den Intensitäten der erhaltenen Peaks Rückschlüsse auf das Verhältnis der Fragmentpeptide und damit den Umfang der Modifikation gezogen werden können. Durch die Verwendung interner Standards kann sogar eine Absolutquantifizierung erfolgen.
Ferner können aus den erhaltenen Informationen über die Masse der Fragmentpeptide Rückschlüsse auf deren Sequenz und die Position der Modifikation gezogen werden.
In einer weiteren Ausgestaltung der Erfindung ist die biologische Probe ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Blut, Serum, Urin, Stuhl, Gewebe, Liquor, Lymphe und Synovialflüssigkeit.
Aufgrund des hohen Gehalts an Proteinen eignen sich diese biologischen Proben besonders gut zum Nachweis von Modifikationen eines Proteins oder Peptids.
In einer weiteren Ausgestaltung der Erfindung folgt nach Schritt 1. ein weiterer Schritt 1.1 des Anreicherns des Proteins oder Peptids in der Probe und/oder nach Schritt 2. folgt ein weiterer Schritt 2.1 des Anreicherns der Fragmentpeptide in der Probe.
Durch das Anreichern der Proteine oder Peptide bzw. der Fragmentpeptide in der Probe kann das für das Fragmentpeptid erhaltene Signal verstärkt werden, was die Diagnose einfacher und sicherer macht. Dies erfolgt unabhängig davon, ob die noch zu fragmentierenden oder die bereits fragmentierten Proteine oder Peptide angereichert werden.
In einer Ausgestaltung der zuvor genannten Maßnahmen erfolgt der Schritt 1.1. und/oder der Schritt 2.2 durch ein Verfahren, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: Zentrifugationsverfahren, Membranverfahren, immunologischen Verfahren, elektrophoretischen Verfahren, chromatographischen Verfahren und Kombinationen davon.
Die Anreicherung erfolgt hierbei durch ein Abtrennen der gewünschten Proteine oder Peptide von unerwünschten Substanzen wie bspw. Lösemitteln oder anderen Peptiden aufgrund von Unterschieden in deren Eigenschaften, wie bspw. Größe, Molekulargewicht, Ladung, Affinitäten oder Löslichkeit.
Bei diesen Verfahren handelt es sich um gut etablierte, sehr zuverlässige Verfahren, um gewünschte Proteine mit einer hohen Spezifität anzureichern. Somit eignen sich diese Verfahren besonders gut zur Anwendung in einem erfindungsgemäßen Verfahren.
In einer Ausgestaltung der zuvor genannten Maßnahme werden die immunologischen Verfahren unter Verwendung eines Protein- oder peptidspezifischen Antikörpers durchgeführt.
Ein immunologisches Verfahren unter Verwendung eines für das Zielprotein oder -peptid bzw. Fragmentpeptid spezifischen Antikörpers stellt aufgrund der hohen Spezifität eine besonders geeignete Methode zur Anreicherung eines gewünschten Proteins oder Peptids bzw. Fragmentpeptids dar.
In einer weiteren Ausgestaltung der oben genannten Maßnahme sind die elektrophoretischen Verfahren ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: 1D- und 2D-Gelelektrophorese und sind insbesondere eine SDS-PAGE-Gelelektrophorese.
Mittels dieser Maßnahmen können Proteine auf einfache Weise getrennt und nach Anfärben über Referenzstandards anhand ihrer Masse einfach identifiziert werden. Die gewünschten Proteine können dann durch Ausschneiden des gewünschten Bandes und selektives Eluieren auf einfache Weise aus dem Elektrophoresegel gewonnen werden. Somit stellt diese Technik einen besonders einfachen, jedoch selektiven Weg zur Anreicherung der gewünschten Proteine oder Peptide bzw. Fragmentpeptide dar.
In einer weiteren Ausgestaltung der oben genannten Maßnahme sind die chromatographischen Verfahren ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: Affinitätschromatographie, Ionenaustauschchromatographie, Umkehrphasenchromatographie und Größenausschlusschromatographie.
Bei solchen Verfahren handelt es sich um besonders schnell durchführbare Verfahren, die ggf. auch ohne größeren instrumentellen Aufwand bewerkstelligt werden können.
In einer weiteren Ausgestaltung der Erfindung liegt das Referenzfragmentierungsmuster in einer Form vor, die ausgewählt ist aus einer Gruppe bestehend aus: Druckerzeugnissen und elektronischen Dateien.
Auf diese Weise können die Referenzfragmentierungsmuster leicht zugänglich bereitgestellt werden, ohne dass bei jedem Mal, bei dem das Verfahren gemäß der Erfindung durchgeführt wird, ein neues Referenzfragmentierungsmuster erzeugt werden muss.
Es versteht sich, dass die vorstehend genannten und die nachstehend zu nennenden Merkmale nicht nur in den angegebenen Kombinationen, sondern auch in anderen Kombinationen oder in Alleinstellung anwendbar sind, ohne den Schutzbereich der Erfindung zu verlassen.
Die Erfindung wird nun beispielhaft anhand der nachstehenden Beispiele in Zusammenhang mit den beiliegenden Figuren näher erläutert. Hierbei stellt lediglich Beispiel 4 ein Verfahren gemäß der Ansprüche dar. Es zeigen:
1 eine stark schematische Darstellung eines Detektionsverfahrens;
2 ein SDS-PAGE-Gel von Proben, die durch die Behandlung von Vimentin mit Peptidylarginin-Deiminase nach verschiedenen Reaktionszeiten erhalten wurden;
3a ein MALDI-MS-Spektrum von Vimentin nach einer Behandlung mit Trypsin;
3b ein MALDI-MS-Spektrum von citrulliniertem Vimentin nach einer Behandlung mit Trypsin;
4a ein RP-HPLC-Chromatogramm des synthetischen Peptids EGTEGRATGA vor der Behandlung mit Trypsin;
4b ein RP-HPLC-Chromatogramm des synthetischen Peptids EGTEGRATGA nach der Behandlung mit Trypsin;
5a ein RP-HPLC-Chromatogramm des synthetischen Peptids EGTEGCitATGA vor der Behandlung mit Trypsin;
5b ein RP-HPLC-Chromatogramm des synthetischen Peptids EGTEGCitATGA nach der Behandlung mit Trypsin;
6 die Aminosäuresequenzen für humanes Insulin sowie 3 Insulin-Analoga, wobei die Veränderungen in der Aminosäuresequenz für die Insulin-Analoga fett dargestellt sind;
7a ein MALDI-MS-Spektrum von humanem Insulin nach einer Behandlung mit Trypsin;
7b ein MALDI-MS-Spektrum von Insulin-Lispro nach einer Behandlung mit Trypsin;
7c ein MALDI-MS-Spektrum von Insulin-Aspartat nach einer Behandlung mit Trypsin; und
7d ein MALDI-MS-Spektrum von Insulin-Glulisin nach einer Behandlung von Trypsin;
8a ein MALDI-MS-Spektrum von humanem Insulin nach Behandlung mit Endoprotease GluC;
8b ein MALDI-MS-Spektrum von Insulin-Aspart nach einer Behandlung mit Endoprotease GluC;
8c ein MALDI-MS-Spektrum von Insulin-Glulisin nach einer Behandlung mit Endoprotease GluC;
9a ein MALDI-MS-Spektrum von humanem Insulin nach einer Behandlung mit Endoprotease AspN;
9b ein MALDI-MS-Spektrum von Insulin-Aspart nach einer Behandlung mit Endoprotease AspN;
9c ein MALDI-MS-Spektrum von Insulin-Glulisin nach einer Behandlung mit Endoprotease AspN;
10a eine Darstellung eines modifizierten Modellpeptids, wobei die Schnittstellen für Trypsin angedeutet sind;
10b ein MALDI-MS-Spektrum des Modellpeptids von 10a nach einer Behandlung mit Trypsin;
11a das MALDI-MS-Spektrum des Modellpeptids NLWNGIVPM nach einer Behandlung mit Endoprotease AspN;
11b ein MALDI-MS-Spektrum des deamidierten Modellpeptids von 11a nach einer Behandlung mit Endoprotease AspN.
Beispiel 1: Prinzip des erfindungsgemäßen Detektionsverfahrens
1 zeigt eine schematische Darstellung des erfindungsgemäßen Detektionsverfahrens.
In Schritt A wird hierbei eine biologische Probe bereitgestellt, die z. B. in Form von Blut, Serum, Urin, Stuhl, Liquor, Lymphe oder Synovialflüssigkeit direkt aus einem Patienten gewonnen werden kann. Diese biologische Probe weist ein Gemisch aus verschiedenen Proteinen und Peptiden auf. In dieser Probe liegt ein Zielprotein vor, das z. B. einen Indikator für einen krankhaften Zustand bildet. In diesem Fall handelt es sich um das Protein Filaggrin, das einen Marker für rheumatoide Arthritis bildet. Es kann sich aber bspw. auch um ein zur Leistungssteigerung eingenommenes Biopharmakum handeln. Dieses Protein liegt sowohl in seinem nicht modifizierten, also gesunden Zustand wie auch in einem modifizierten Zustand in der Probe vor, der mit dem Vorliegen von rheumatoider Arthritis verbunden ist.
In einem Schritt B werden nun die gewünschten Zielproteine in der Probe angereichert. Dies erfolgt hier durch eine Affinitätsanreicherung. Hierbei wird die Probe mit einem oder mehreren Festkörpern, deren Oberflächen so modifiziert sind, dass sie eine Affinität gegenüber dem Zielprotein zeigen, in Kontakt gebracht, diese Festkörper werden abgetrennt und die Zielproteine von den Festkörpern eluiert. Hieraus ergibt sich eine Mischung aus dem nicht modifizierten und dem modifizierten Protein.
In Schritt C wird nun zu dieser Mischung aus dem nicht modifizierten sowie dem modifizierten Protein eine Protease zugegeben, die für eine Schnittstelle spezifisch ist, die durch die Modifikation, die detektiert werden soll, verändert wird. Im Falle der Detektion einer Deiminierung von Filiaggrin ist diese Protease Trypsin, die spezifisch an einem Arginin spaltet. Bei Vorliegen von rheumatoider Arthritis sind einige oder alle der Argininreste des Filiaggrins zu Citrullin deiminiert worden, so dass die ursprünglich vorhandenen Schnittstellen in dem modifizierten Protein nicht mehr vorliegen.
Das nicht modifizierte Zielprotein wird durch die Behandlung mit der Protease an der spezifischen Schnittstelle geschnitten, wodurch, wie hier dargestellt, zwei kleinere Fragmente gebildet wurden. Da in dem modifizierten Zielprotein keine Schnittstelle mehr vorliegt, kommt es auch zu keiner Spaltung, so dass hier noch das vollständige Protein vorliegt. Die Detektion dieser nun vorliegenden verschiedenen Proteine bzw. Peptide kann z. B. durch massenspektrometrische Techniken erreicht werden, da die beiden Fragmente des gesunden Zielproteins deutlich geringere Massen aufweisen als das noch intakte modifizierte Protein, wodurch diese Proteine massenspektrometrisch einfach zu unterscheiden sind.
Es ist auch möglich, diese Unterschiede immunologisch zu detektieren, wobei die in Schritt C erhaltene Mischung mit einem spezifischen Antikörper in Kontakt gebracht wird, der für das intakte Protein spezifisch ist. Liegt in der biologischen Probe ausschließlich nicht modifiziertes Zielprotein vor, wird dieses gespalten und es kommt zu keiner Bindung der Fragmente an den Antikörper, die dann durch dem Fachmann bekannte Methoden detektiert werden könnte. Liegt eine Modifikation zumindest zum Teil vor, kommt es zu einer Bindung des intakten modifizierten Proteins an den Antikörper, die wiederum durch dem Fachmann bekannte Techniken detektiert werden kann.
Das gleiche Verfahren kann auch angewendet werden, um z. B. Insulin-Analoga, die zur Leistungssteigerung im Sport eingesetzt werden, neben naturlich im Körper vorkommendem Insulin nachzuweisen.
Beispiel 2: Detektion einer Deiminierung in Vimentin
Dieses Beispiel zeigt anhand des Modelproteins Vimentin die Detektion einer posttranslationalen Modifikation eines Proteins in Form einer Deiminierung.
Das rekombinante humane Protein Vimentin (rhVim) wurde kommerziell erworben.

2.1 Deiminierung von Vimentin Ein Teil des rekombinanten humanen Vimentins wurde in vitro unterschiedlich lang bei 37°C mit dem Enzym Peptidylarginin-Deiminase (PAD) umgesetzt. Die Reaktion wurde durch Schockfrieren bei –80°C beendet. Die erhaltenen Fraktionen wurden gelchromatographisch mittels SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis) aufgetrennt. Das SDS-PAGE-Gel ist in 2 dargestellt. Eine Deiminierung von Proteinen führt zum Verlust einer positiven Ladung pro umgesetztes Arginin. je mehr Arginin innerhalb eines Proteins in Citrullin umgesetzt wurden, desto geringer ist die Nettoladung des Proteins. Der mit zunehmendem Deiminierungsgrad steigende Ladungsverlust führt dazu, dass Banden von citrullinierten Proteinen im SDS-PAGE zu größeren Molekulargewichten hin verschoben sind. Nicht modifiziertes Vimentin (rhVim) wandert bei ~55 kDa, wohingegen citrulliniertes Vimentin (cit-rhVim) eine Bande bei ~59 kDa zeigt. Da es allerdings bei einem SDS-PAGE-Gel z. B. durch eine ungleiche Spannungsverteilung zu Verschiebungen kommen kann, eignet sich diese Technik nicht für eine zuverlässige direkte Detektion von Modifikationen von Proteinen oder Peptiden. Die einzelnen Banden wurden ausgeschnitten, zerkleinert, mit 30 μl Acetonitril versetzt und für 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Das Acetonitril wurde anschließend im Vakuum abgezogen. Die einzelnen Gel-Banden wurden zweimal mit jeweils 50 μl 30% (v/v) Acetonitril in 50 mM NH₄HCO₃ gewaschen und dann wieder mit 30 μl Acetonitril versetzt, für 10 Minuten inkubiert und im Vakuum getrocknet. Zur Reduktion der Proteine wurden die Banden mit 10 μl einer 10 mM Dithiothreitol-Lösung in 30% (v/v) Acetonitril in 50 mM NH₄HCO₃ versetzt und bei 56°C für 45 Minuten inkubiert. Die Proben wurden dann mit 30 μl Acetonitril für 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert und anschließend im Vakuum getrocknet. Für die Alkylierung der Proteine wurden jeweils 10 μl einer 40 mM Iodacetamid-Lösung in 30%, (v/v) Acetonitril in 50 mM NH₄HCO₃ zu den einzelnen Gel-Banden gegeben. Nach zwei weiteren Waschschritten mit 30% (v/v) Acetonitril in 50 mM NH₄HCO₃ wurden die Gel-Banden mit 30 μl Acetonitril versetzt, für 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert und im Vakuum getrocknet.
2.2 Verdau des Vimentins und des citrullinierten Vimentins mit Trypsin Die Banden wurden mit 20 μl einer Trypsin-Lösung (12.5 μg/ml) versetzt und für 12 Stunden bei 37°C inkubiert. Die Überstände wurden anschließend massenspektrometrisch vermessen.
2.3 Analyse des Fragmentierungsmusters aus dem Trypsin-Verdau von Vimentin und von citrulliniertem Vimentin mit MALDI-MS Proben der in 2.2 erhaltenen Mischung aus Fragmentpeptiden von Vimentin bzw. citrulliniertem Vimentin wurden mit MALDI-MS analysiert. Ein Aliquot (0.5 μl) der einzelnen Verdauansätze wurde auf einem Goldtarget mit 0.5 μl Dihydroxybenzoesäure-Matrix gemischt, kristallisiert und mittels MALDI-ReTOF vermessen (Bruker Daltonik, REFLEX IV). Die Auswertung der MS-Daten erfolgte über die gerätespezifischen Programme (Bruker Data Analysis, Flex Analysis).

In 3a ist ein MALDI-Spektrum von Vimentin nach der Behandlung mit Trypsin dargestellt. In 3b ist ein MALDI-MS-Spektrum von citrulliniertem Vimentin nach der Behandlung mit Trypsin dargestellt.

Aus diesen Spektren geht hervor, dass bei der Umsetzung von Vimentin acht Peptidfragmente gebildet werden, die bei der citrullinierten Form nicht entstehen. Diese acht Peptide werden nur während des Verdaus von Vimentin gebildet, da Trypsin Peptidbindungen C-Terminal nach Lysin und Arginin, jedoch nicht nach Citrullin spaltet. Diese acht Peptide sind nochmals in der nachstehenden Tabelle 2 dargestellt. Tabelle 2

	Position im Protein	theoretisch [M+H]⁺	detektiert [M+H]⁺
Arginin-spezifische Peptide
R.FLEQQNK	122–128	906.47	906.57
K.FADLSEAANR	294–303	1093.53	1093.69
R.FANYIDKVR	113–121	1125.61	1125.77
R.LGDLYEEEMR	145–154	1254.57	1254.73
R.SLYASSPGGVYATR	50–63	1428.71	1428.89
R.TYSLGSALRPSTSR	36–49	1495.75	1495.97
R.HLREYQDLLNVK	378–389	1527.83	1528.05
R.ISLPLPNFSSLNLR	410–423	1570.90	1571.15

Aus den beiden Spektren sind die Unterschiede in den Fragmentierungsmustern deutlich sichtbar.
Aus diesem Beispiel wird klar, dass durch den Verdau von Vimentin mit Trypsin und anschließender Analyse des Fragmentierungsmusters auf einfache Weise festgestellt werden kann, ob und in welchem Umfang Modifikationen in Vimentin vorliegen.
Beispiel 3: Nachweis einer Sequenzmodifikation in dem synthetischen Peptid EGTEGRATGA
Dieses Beispiel demonstriert die Detektion einer Sequenzmodifikation in einen Peptid in Form eines Aminosäureaustauschs (R → Cit) anhand eines Modelpeptids.

3.1 Herstellung der Peptide EGTEGRATGA und EGTEGCitATGA Die Modellpeptide EGTEGRATGA und EGTEGCitATGA wurden an der Festphase nach dem TBTU/HOBT-Kupplungsprotokoll (siehe: Baechle D, Flad T, Cansier A, Steffen H, Schittek B, Tolson J, Herrmann T, Dihazi H, Beck A, Mueller GA, Mueller M, Stevanovic S, Garbe C, Mueller CA, Kalbacher H, Cathepsin D is present in human eccrine sweat and involved in the postsecretory processing of the antimicrobial Peptide DCD-1L, J Biol Chem. 2006 Mar 3; 281 (9): 5406–15. Der Inhalt dieses Dokuments ist durch Bezugnahme Bestandteil dieser Anmeldung.) mit einem 7-fachen Überschuss an Fmoc-geschützten-Aminosäuren synthetisiert. Die temporäre Fmoc-Schutzgruppe wurde mit einer 40%igen (v/v) Piperidin-Lösung in DMF entfernt. Die Abspaltung der Seitenketten-Schutzgruppen sowie der Peptide vom Harz erfolgte mit einer 95%igen (v/v) TFA-Lösung mit 2.5% (v/v) Wasser, 2.5% (v/v) Ethandithiol und 5% (w/v) Phenol für zwei Stunden bei Raumtemperatur. Die Rohpeptide wurden in kaltem Diethylether ausgefällt, zentrifugiert und das Pellet in 25% (v/v) tert.-Butanol in Wasser gelöst und lyophilisiert. Die Rohpeptide wurden mittels präparativer C18-RP-HPLC (RP-HPLC-Bedingungen: von 0% System B (80% (v/v) Acetonitril in Wasser mit 0,05% Trifluoressigsäure) auf 100% System B in System A (0,05% (v/v) Trifluoressigsäure in Wasser) in 25 Minuten; Säule: C18, 2 cm, Porengröße 5 μm) gereinigt (Reinheit > 95%) und mittels Massenspektrometrie identifiziert.
3.2 Verdau der Peptide EGTEGRATGA und EGTEGCitATGA mit Trypsin Jeweils 10 μl der Peptid-Lösungen (1 mM in Wasser) wurden mit 80 μl Trypsin-Lösung (3.125 μg/ml) in 50 mM NH₄HCO₃ versetzt und für vier Stunden bei 37°C inkubiert.
3.3 Analyse des Fragmentierungsmusters Die mit Trypsin verdauten Modellpeptide EGTEGRATGA und EGTEGCitATGA wurden mittels RP-HPLC analysiert (RP-HPLC-Bedingungen: von 5% System B (80% (v/v) Acetonitril in Wasser mit 0,05% Trifluoressigsäure) auf 80% System B in System A (0,05% (v/v) Trifluoressigsäure in Wasser) in 30 Minuten; Säule: C18, 2 mm, Porengröße 5 μm) und die einzelnen Fraktionen mittels MALDI-MS identifiziert. Dazu wurde jeweils ein Aliquot (0.5 μl) der einzelnen Fraktionen auf einem Goldtarget mit 0.5 μl Dihydroxybenzoesäure-Matrix gemischt, kristallisiert und mittels MALDI-ReTOF vermessen (Bruker Daltonik, REFLEX IV). Die Auswertung der MS-Daten erfolgte über die gerätespezifischen Programme (Bruker Data Analysis, Flex Analysis). Die ermittelten Massen sind den entsprechenden Peptidfragmenten zugeordnet.

In 4a ist ein RP-HPLC-Chromatogramm von EGTEGRATGA vor der Behandlung mit Trypsin dargestellt, während in 4b ein RP-HPLC-Chromatogramm nach der Behandlung mit Trypsin dargestellt ist. Aus diesen Spektren wird klar ersichtlich, dass durch die Behandlung mit Trypsin das Peptid EGTEGRATGA vollständig in zwei Fragmentpeptide, nämlich ATGA und EGTEGR, aufgespalten wurde. Der Substanzpeak für das ursprüngliche Peptid ist in dem in 4b dargestellten Chromatogramm fast vollständig verschwunden. Das in 4b dargestellte Fragmentierungsmuster bildet hier das Referenzfragmentierungsmuster für das Peptid ohne die Modifikation.
In 5a ist ein RP-HPLC-Chromatogramm des citrullinierten Peptids EGTEGCitATGA vor der Behandlung mit Trypsin dargestellt. In 5b ist ein RP-HPLC-Chromatogramm des citrullinierten Peptids EGTEGCitATGA nach der Behandlung mit Trypsin dargestellt.
Hieraus wird ersichtlich, dass die Behandlung mit Trypsin überhaupt keine Auswirkungen auf das citrullinierte Peptid hat. Dies ist verständlich, da Trypsin lediglich Peptidbindungen C-Terminal nach Lysin und Arginin spaltet, jedoch nicht nach Citrullin. Durch das Fehlen eines Lysins oder eines Arginins in dem citrullinierten Peptid kommt es hier nicht zu einer Spaltung. Durch den Vergleich der Spektren von 4b und 5b ist sofort ersichtlich, dass in der Probe mit dem citrullinierten Peptid eine Modifikation stattgefunden haben muss.
Sollte in einer Probe nur ein Teil des Peptids in der citrullinierten Form vorliegen, ergäbe sich ein Chromatogramm, das sowohl die in 4b als auch die in 5b gezeigten Peaks enthält. Aufgrund der deutlichen Unterschiede in der Retentionszeit lassen sich die Peaks dennoch einfach unterscheiden und identifizieren.
Im Falle einer Mischung aus citrulliniertem und nicht-citrulliniertem Peptid kann ferner aus den Peaks das Verhältnis zwischen dem citrullinierten und nicht-citrullinierten Peptid bestimmt werden. Diese Information lässt dann Rückschlüsse auf das Ausmaß der Modifikationen und ggf. eines krankhaften Zustands zu.
Beispiel 4: Unterscheidung von verschiedenen Insulin-Analoga mittels verschiedener schnittstellenspezifischer Proteasen
Dieses Beispiel zeigt die Detektion von Sequenzmodifikationen anhand von 3 Insulin-Analoga im Vergleich mit humanem Insulin.

4.1. Verdau von Insulin und 3 Insulin-Analoga mit drei verschiedenen schnittstellenspezifischen Proteasen Humanes Insulin, Insulin-Lispro, Insulin-Aspart und Insulin-Glulisin (s. 6) wurden kommerziell erworben. 1 μl der jeweiligen Insulin-Stammlösung (10 mg/ml in 2% (v/v) Essigsäure) wurde mit je 1 μl Trypsin (0,5 mg/ml), bzw. 1 μl Endoprotease GluC (0,5 mg/ml) bzw. 1 μl Endoprotease AspN (40 ng/ml) in 48 μl 50 mM NH₄HCO₃-Puffer bei 37° für 15 Stunden umgesetzt. Die Versuchsansätze wurden anschließend mittels MALDI-MS vermessen.
4.2 Analyse der Fragmentierungsmuster Proben der in 4.1 erhaltenen Mischung aus Fragmentpeptiden wurden mittels MALDI-MS analysiert. Ein Aliquot (0,5 μl der einzelnen Verdauansätze wurde auf einem Goldtarget mit 0,5 μl Dihydroxybenzoesäurematrix gemischt, kristallisiert und mittels MALDI-ReTOF vermessen (Bruker Daltonik, Reflex IV). Die Auswertung der Daten erfolgte über die gerätespezifischen Programme (Bruker Data Analysis, Flex Analysis).

In 7a–d sind jeweils die MALDI-MS-Spektren für den Verdau von humanem Insulin bzw. den verschiedenen Insulin-Analoga mit Trypsin dargestellt.
Wie aus 7a hervorgeht, entstehen bei der Umsetzung von humanem Insulin mit Trypsin drei Peptide, während für Insulin-Lispro und Insulin-Aspart nur zwei Fragmentpeptide gebildet werden (7b und 7c). Beim Verdau von Insulin-Glulisin mit Trypsin werden wiederum drei Fragmentpeptide (7d) gebildet.
Für Insulin-Lispro geht das unterschiedliche Fragmentierungsmuster darauf zurück, dass die Endoprotease Trypsin Peptide spezifisch C-terminal nach den Aminosäuren Arginin und Lysin spaltet, jedoch nicht, wenn diesen Aminosäuren die Aminosäure Prolin vorausgeht. Im humanem Insulin folgt die Aminosäure Prolin vom C-terminalen Ende der B-Kette aus gesehen auf die Aminosäure Lysin, so dass hier eine Schnittstelle für Trypsin vorliegt. In Insulin-Lispro sind die Positionen von Lysin und Prolin vertauscht, so dass in diesem Protein in der B-Kette vom C-terminalen Ende aus gesehen Prolin dem Lysin vorausgeht, wodurch hier keine Schnittstelle für Trypsin mehr vorliegt und daher im Fragmentierungsmuster nur noch zwei Peptidfragmente vorhanden sind.
Im Spektrum für Insulin-Glulisin, das in 7d dargestellt ist, erscheint ein zusätzlicher Peak, der dadurch verursacht wird, dass in diesem Protein an Position 3 der B-Kette ein Lysin vorliegt, was eine zusätzliche Schnittstelle für Trypsin generiert. Aufgrund der verschiedenen Fragmentierungsmuster lassen sich die Insulin-Analoga Insulin-Lispro und Insulin-Glulisin leicht von humanem Insulin unterscheiden.
Aus den in 8a–c dargestellten Spektren geht hervor, dass sich für den Verdau mit Endoprotease GluC keine Änderungen im Fragmentierungsmuster zwischen humanem Insulin und Insulin-Aspart und Insulin-Glulisin ergeben. Die beobachteten Massenunterschiede gehen lediglich auf die Massenunterschiede der Ausgangspeptide zurück. Dies zeigt, dass die Auswahl der richtigen schnittstellenspezifischen Protease für das Verfahren essentiell ist.
In 9a–c sind die Fragmentmuster für Insulin, Insulin-Aspart und Insulin-Glulisin nach dem Verdau mit AspN dargestellt. Hierbei wird ein für Insulin-Aspartat deutlich anderes Fragmentmuster sichtbar, da lediglich dieses Protein Asparginsäure enthält, welche eine für Endoprotease AspN spezifische Schnittstelle erzeugt. Auf diese Weise ist Insulin-Aspart sehr einfach z. B. von humanem Insulin zu unterscheiden. Somit wäre z. B. nachzuweisen, ob ein Sportler unter Verwendung von Insulin-Aspart Insulin-Doping betrieben hat, auch wenn die Molekulargewichte der Proteine selbst sich mit 18 Dalton nur geringfügig voneinander unterscheiden.
Beispiel 5: Nachweis einer Seitenketten-Modifikation anhand eines Modellpeptids
Dieses Beispiel zeigt die Auswirkungen von Seitenketten-Modifikationen auf die Fragmentierung mit schnittstellenspezifischen Proteasen.

5.1 Herstellung des Modellpeptids Die Synthese des Modellpeptids AC-RRRRRRRRRK(Tamra)APISFFRLGK(Fluo)-CONH₂ (siehe 10a) erfolgte entsprechend Fischer R, Bachle D, Fotin-Mleczek M, Jung G, Kalbacher H, Brock R, A Targeted Protease Substrate for a Quantitative Determination of Protease Activities in the Endolysosomal Pathway, Chembiochem. 2006 Jul 26 (in press). Der Inhalt dieses Dokuments ist durch Bezugnahme Bestandteil dieser Anmeldung. Tamra(5(6)-Carboxytetramethylrhodamin) und Fluo(5(6)-Carboxyfluorescein) sind Fluorophore und sind über eine Amidbindung an die ε-Aminogruppe von Lysin gekoppelt.
5.2 Verdau des Modellpeptids mit Trypsin Das in 5.1 erhaltene Peptid (1μl einer 10 mM Lösung in Dimethylsulfoxid) wurde mit 1 μl Trypsin (0,5 mg/l) in 50 mM NH₄HCO₃ Puffer 15 Stunden bei 37°C umgesetzt. Der Reaktionsansatz wurde anschließend massenspektrometrisch vermessen. In diesem Fall wurde das Referenzfragmentierungsmuster nicht durch Fragmentierung eines Referenzpeptids, sondern anhand theoretischer Überlegungen erzeugt.
5.3 Analyse des Fragmentierungsmusters aus dem Trypsin-Verdau des Modellpeptids Eine Probe der in 5.2 erhaltenen Mischung aus Fragmentpeptiden wurde mit MALDI-MS analysiert. Ein Aliquot (0,5 μl) des Reaktionsansatzes wurde auf einem Goldtarget mit 0,5 μl Dihydroxybenzoesäurematrix gemischt, kristallisiert und mittels MALDI-ReTOF vermessen (Bruker Daltonik, Reflex IV). Die Auswertung der MS-Daten erfolgte über gerätespezifische Programme (Bruker Data Analysis, Flex Analysis).

Aus dem in 10b dargestellten Spektrum geht hervor, dass Trypsin den Nona-Arginin-N-Terminus abspaltet, jedoch das übrige Peptidfragment intakt lässt. In einem nicht modifizierten Peptid dieser Sequenz würde Trypsin dieses Peptid nach dem mittleren Lysin spalten und es wäre ein Spektrum zu erwarten, das zwei Peaks für kleinere Fragmente zeigt.
Aus diesem Experiment geht hervor, dass Trypsin nicht nach einem Lysin spaltet, das an seiner ε-Aminogruppe chemisch modifiziert wurde. Somit kann auf einfache Weise nachgewiesen werden, ob ein Protein gewünscht oder ungewünscht an einer ε-Aminogruppe des Lysins chemisch modifiziert wurde.
Beispiel 6: Nachweis einer chemischen Deamidierung von Asparagin in einem Modellpeptid

6.1 Herstellung des Modellpeptids Das Modellpeptid NLWNGIVPM wurde an der Festphase nach dem TBTU/HOBT-Kupplungsprotokoll (siehe: Baechle D, Flad T, Cansier A, Steffen H, Schittek B, Tolson J, Herrmann T, Dihazi H, Beck A, Mueller GA, Mueller M, Stevanovic S, Garbe C, Mueller CA, Kalbacher H, Cathepsin D is present in human eccrine sweat and involved in the postsecretory processing of the antimicrobial peptide DCD-1L, J Biol Chem. 2006 Mar 3; 281 (9): 5406–15. Der Inhalt dieses Dokuments ist durch Bezugnahme Bestandteil dieser Anmeldung.) mit einem 7-fachen Überschuss an Fmoc-geschützten-Aminosäuren synthetisiert. Die temporäre Fmoc-Schutzgruppe wurde mit einer 40%igen (v/v) Piperidin-Lösung in DMF entfernt. Die Abspaltung der Seitenketten-Schutzgruppen sowie des Peptids vom Harz erfolgte mit einer 95%igen (v/v) TFA-Lösung mit 2.5% (v/v) Wasser, 2.5% (v/v) Ethandithiol und 5% (w/v) Phenol für zwei Stunden bei Raumtemperatur. Das Rohpeptid wurde in kaltem Diethylether ausgefällt, zentrifugiert und das Pellet in 25% (v/v) tert.-Butanol in Wasser gelöst und lyophilisiert. Das Rohpeptid wurde mittels präparativer C18-RP-HPLC (RP-HPLC-Bedingungen: von 0% System B (80% (v/v) Acetonitril in Wasser mit 0,05% Trifluoressigsäure) auf 100% System B in System A (0,05% (v/v) Trifluoressigsäure in Wasser) in 25 Minuten; Säule: C18, 2 cm, Porengröße 5 μm) gereinigt (Reinheit > 95%) und mittels Massenspektrometrie identifiziert.
6.2 Chemische Deamidierung des Modellpeptids Ein Teil des unter 6.1 erhaltenen Peptids wurde in einer Konzentration von 10 mg/ml in 50 mM NH₄HCO₃ 48 Stunden bei 37° inkubiert, wobei ein Teil des Peptids deamidiert wurde.
6.3 Verdau des nicht modifizierten Modellpeptids und des deamidierten Modellpeptids mit Endoprotease AspN Das nicht modifizierte Peptid sowie das in 6.2 erhaltene deamidierte Peptid wurden mit Endoprotease AspN (1 μl einer 40 ng/ml-Lösung) für 24 Stunden bei 37°C inkubiert und die Ansätze wurden massenspektrometrisch vermessen.
6.4 Analyse der Fragmentierungsmuster aus dem Endoprotease AspN Verdau des nicht modifizierten Modellpeptids und des deamidierten Modellpeptids Proben der in 6.3 erhaltenen Mischungen aus Fragmentpeptiden des nicht modifizierten Peptids sowie des deamidierten Peptids wurden mit MALDI-MS analysiert. Ein Aliquot der einzelnen Verdauungsansätze wurde auf einem Goldtarget mit 0,5 μl Dihydroxybenzoesäurematrix gemischt, kristallisiert und mittels MALDI-ReTOF vermessen (Bruker Daltonik, REFLEX IV). Die Auswertung der Daten erfolgte über die gerätespezifischen Programme (Bruker Data Analysis, Flex Analysis).

Das deamidierte Peptid enthält im Vergleich zum nicht modifizierten Peptid eine Asparaginsäure und somit eine Schnittstelle für die Endoprotease AspN. Der Massenunterschied zwischen den beiden Peptiden per se beträgt lediglich ein einziges Dalton. Aus den Spektren gehen jedoch für das deamidierte Peptid neue Massenpeaks insbesondere bei 432,244 und 631,312 hervor. Diese Peaks repräsentieren jeweils Fragmentpeptide, die durch die Spaltung des deamidierten Peptids durch Endoprotease AspN erzeugt wurden. Dadurch lässt sich einfach das Vorliegen von deamidiertem Peptid nachweisen.

Claims

Verfahren zum Nachweis von Doping mit zumindest einem Protein oder Peptid, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Insulin oder einem modifizierten Insulin, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Insulin-Lispro, Insulin-Aspart und Insulin-Glulisin mit den folgenden Schritten: A. Bereitstellen einer biologischen Probe, B. Unterziehen der biologischen Probe einem Verfahren zur Detektion von Modifikationen in einem Protein oder Peptid mit den folgenden Schritten: 1. Bereitstellen einer biologischen Probe, die zumindest ein Protein oder Peptid aufweist, 2. Behandeln der Probe mit zumindest einer schnittstellenspezifischen Protease, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Trypsin, Endoprotease GluC und Endoprotease AspN zur Erzeugung einer Mischung aus Fragmentpeptiden, 3. Analyse der in Schritt 2. erhaltenen Mischung aus Fragmentpeptiden mittels eines massenspektrometrischen Verfahrens zur Erzeugung eines Fragmentierungsmusters, 4. Vergleich des in Schritt 3. erhaltenen Fragmentierungsmusters mit einem Referenzfragmentierungsmuster, das ausgehend von Insulin oder einem modifizierten Insulin, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Insulin-Lispro, Insulin-Aspart und Insulin-Glulisin nach den Schritten 1. bis 3. erhalten wurde, und 5. Detektieren von Insulin oder dem modifizierten Insulin an Hand der Unterschiede zwischen dem in Schritt 3. erhaltenen Fragmentierungsmuster und dem Referenzfragmentierungsmuster, C. Optional ein ein- oder mehrmaliges Wiederholen von Schritt B., und D. Nachweis des Dopings mit zumindest einem modifizierten Protein oder Peptid basierend auf der Art und dem Ausmaß der in Schritt B. detektierten Modifikationen,
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die massenspektrometrischen Verfahren ausgewählt sind aus ESI-MS und MALDI-MS.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die biologische Probe ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: Blut, Serum, Urin, Stuhl, Gewebe, Liquor, Lymphe und Synovialflüssigkeit.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass nach Schritt 1. ein weiterer Schritt 1.1. des Anreichern des Proteins oder Peptids in der Probe folgt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass nach Schritt 2. ein weiterer Schritt 2.1. des Anreicherns der Fragmentpeptide in der Probe folgt.
Verfahren nach Anspruch 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, dass der Schritt 1.1. und/oder der Schritt 2.1. durch ein Verfahren erfolgt, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: Zentrifugationsverfahren, Membranverfahren, immunologischen Verfahren, elektrophoretischen Verfahren, chromatographischen Verfahren und Kombinationen davon.
Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die immunologischen Verfahren unter Verwendung eines Protein- oder peptidspezifischen Antikörpers durchgeführt werden.
Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die elektrophoretischen Verfahren ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus: 1D- und 2D-Gelelektrophorese.
Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die 1D- und 2D-Gelelektrophorese eine SDS-PAGE-Gelelektrophorese ist.
Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die chromatographischen Verfahren ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus: Affinitätschromatographie, Ionenaustauschchromatographie, Umkehrphasenchromatographie und Größenausschlusschromatographie.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass das Referenzfragmentierungsmuster in einer Form vorliegt, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: Druckerzeugnissen, elektronischen Dateien.