DE60320207T2

DE60320207T2 - N- oder C-terminale Peptid-Auswahlmethode für Proteomics

Info

Publication number: DE60320207T2
Application number: DE60320207T
Authority: DE
Inventors: Steven M. Hayward Fischer
Original assignee: Agilent Technologies Inc
Current assignee: Agilent Technologies Inc
Priority date: 2003-01-13
Filing date: 2003-12-04
Publication date: 2009-05-14
Anticipated expiration: 2023-12-05
Also published as: JP2004219418A; US7422865B2; EP1437596B1; US20060134723A1; US20040137552A1; US7635573B2; EP1437596A1; DE60320207D1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die Proteomik ist als Schlagwort-Ergänzung zur Genomik in Erscheinung getreten: Sie beinhaltet die qualitative und quantitative Analyse der Genaktivität anhand einer Beurteilung der Proteinkonzentration und/oder der Proteinaktivität statt der RNA-Konzentration und/oder der RNA-Aktivität. Die Proteomik umfasst das Studium von Ereignissen wie z. B. der posttranslationellen Modifikation von Proteinen, Wechselwirkungen zwischen Proteinen, Proteinfunktion sowie die Position von Proteinen in der Zelle. Im Wesentlichen beinhaltet die Proteomik das Studium eines Teils des oder des gesamten Status des Gesamtproteinanteils, der in einer Zelle enthalten ist oder durch eine Zelle abgesondert wird, und bietet somit einen direkten und vielversprechenden Blick auf die biologischen Funktionen einer Zelle. In ihrer einfachsten Form ist die Proteomik eine Übung darin, biologische Proben „zu schürfen", um zu identifizieren, welche Proteine in Einzelnen vorliegen. Die Stärke der angewandten Proteomik in der Arzneimittelforschung liegt jedoch in ihrer Fähigkeit, wesentliche Unterschiede zwischen den Proteomen von beispielsweise normalen und erkrankten Zellen aufzudecken. Im Prinzip kann die angewandte Proteomik eindeutige Proteine oder Proteinexpressions-/-aktivitätsmuster in erkrankten Zellen gegenüber normalen Zellen aufdecken und dadurch der Aufgabe einer molekularen Diagnose einer bestimmten Erkrankung oder Störung dienen. Dieses Ziel könnte jedoch nicht ohne sehr stark parallele Proteinidentifikations- und -charakterisierungstechniken erreicht werden.
Derzeitige Technologien zur Analyse von Proteomen beruhen auf einer Vielzahl von Proteintrennungstechniken, auf die eine Identifizierung der getrennten Proteine folgt. Das meistverbreitete Verfahren beruht auf der 2D-Gelelektrophorese (2DE); siehe beispielsweise Parekh et al., US-Patentschriften Nrn.: 6,064,754 und 6,278,794 . Diese Technik ermöglicht die Trennung von Proteinen auf einem Acrylamidgel gemäß ihrem pI und ihrer relativen Molekülmasse. Durch radioaktives oder fluoreszierendes Markieren oder durch eine Silberfärbung können üblicherweise mehrere hundert Proteine sichtbar gemacht werden. Da die Anzahl von Proteinen in einer Probe jedoch ohne weiteres über 10.000 liegen kann und da die Anzahl von gelösten Polypeptiden, die in veröffentlichten 2DE-Datenbanken gezeigt sind, üblicherweise zwischen etwa 1.000 und 3.000 pro Gel liegt (siehe z. B. Julio Celis Database; http://biobase.dk/cgibin/celis), wurde es bald offensichtlich, dass lediglich die am häufigsten vorkommenden Proteine in einem Rohproteingemisch mittels Gelelektrophorese sichtbar gemacht werden konnten, was das Erfordernis, die Komplexität proteomischer Proben zu verringern und proteomische Erfassungsmethoden zu verbessern, noch verstärkt.
Das Erfordernis sensiblerer, genauerer Technologien mit einem höheren Durchsatz zum Durchführen von Analysen an proteomischem Material, das von einer Vielzahl biologischer Quellen gewonnen wird, führte bisher zu immer ausgereifteren Technologien für eine Identifizierung getrennter Proteine. Ein bedeutender Durchbruch war die massenspektrometrische Identifizierung von mittels eines Gels getrennten Proteinen: zur MS-Analyse können einzelne Proteine (engl.: spots) aus dem Gel herausgeschnitten werden. Identifizierungsstrategien umfassen eine Peptidkartierung (peptide mapping), bei der die Massen von Peptiden, die anhand regiospezifischer Proteolyse erzeugt wurden, mittels Massenspektrometrie (MS) analysiert und mit eindeutigen Massenmustern in Proteindatenbanken korreliert werden. Beispielsweise kann ein proteolytisches Enzym wie z. B. Trypsin (das Polypeptide an Arginin- und Lysinresten spaltet) dazu verwendet werden, das extrahierte Protein in zwei oder mehr Peptide zu zerlegen. Diese Peptide können anschließend mittels matrixunterstützter Laser-Desorption-Ionisations-(MALDI – matrix assisted laser desorption ionization) oder Elektrosprayionisations-(ESI – electrospray ionization)-Massenspektrometrie analysiert werden, um ihre Masse zu ermitteln. Die ermittelten Massen können dann dazu verwendet werden, eine Datenbank zu durchsuchen, um die Aminosäuresequenzen der Peptide zu ermitteln.
Bei einer alternativen Technik liefert eine direkte Analyse von äußerst komplexen Peptidgemischen, die anhand des Aufschlusses von ungetrennten Proteingemischen mittels Flüssigchromatographie (LC)-MS/MS (LC = liquid chromatography) erzeugt wurden, eine Alternative zur zweidimensionalen Elektrophorese, wodurch manche ihrer Beschränkungen (z. B. geringe Erfassungsfähigkeiten von in geringer Häufigkeit auftretenden Proteinen und begrenzte Auflösung bei der Geltrennung) umgangen werden. Beispielsweise werden Peptidaminosäuresequenzdaten mittels Tandemmassenspektrometrie (MS/MS) erhalten und dazu verwendet, Datenbanken nach eindeutigen Proteinsequenzen zu durchsuchen (siehe z. B. Eng et al., J. Am. Soc. Mass Spectrom. (1994) 5: 976; Yates III et al., Anal. Chem. (1995) 67: 3202; Yates III et al., Anal. Chem. (1995) 67: 1426; Figeys et al., Anal. Chem. (1996) 68: 1822). Bei dieser Technik werden ausgewählte Peptidmassen bei der ersten Stufe des Spektrometers isoliert und einer stoßinduzierten chemischen Dissoziation unterzogen, und die Massen der Teilfragmente werden anschließend bei der zweiten Stufe analysiert, um die Aminosäuresequenz abzuleiten. Jedoch ermöglicht diese Technik allein keinen quantitativen Vergleich zwischen zwei ähnlichen Proteomen (z. B. Proteom einer normalen Zelle gegenüber einer erkrankten Zelle). Ferner ist ein bedeutendes Problem, das mit der proteomischen Analyse verbunden ist, das der Probenkomplexität. Wie zuvor erwähnt wurde, kann die Anzahl von Proteinen in einer gegebenen Probe ohne weiteres über 10.000 liegen. Nach einem enzymatischen Aufschluss kann die Anzahl von in einer proteomischen Probe vorliegenden Peptiden den Hunderttausende-Bereich erreichen. Dieses Komplexitätsniveau stellt für den analytischen Prozess eine enorme Belastung dar und erfordert komplexe analytische Techniken in Kombination mit hochentwickelter computergestützter Technologie, um eine andernfalls zeitaufwändige Analyse durchzuführen.
Für eine proteomische Analyse wurden bereits Verfahren zum Vereinfachen der Analyse komplexer Peptidgemische anhand eines Isolierens von Signaturpeptiden, die spezifische Reste aufweisen, vorgeschlagen. Diese umfassen die Derivatisierung von Cysteinen in Proteingemischen mit thiolspezifischen Biotinreagenzien und die Isolierung der biotinylierten Peptide aus tryptischen Aufschlüssen durch ein Binden an Avidin (siehe Gygi et al., „Quantitative analysis of complex protein mixtures using isotope-coded affinity tags", Nature Biotechnology, 17(10): 994–999, 1999). Peptide, die Histidin- oder Glycosylgruppen enthalten, wurden unter Verwendung von immobilisierten Metallaffinität-Sorptionsmitteln bzw. Lektinsäulen ebenfalls bereits isoliert (Ji et al., „Strategy for qualitative and quantitative analysis in proteomics based an signature peptides", J Chromatogr. B. Biomed. Sci. Appl. 745(1): 197–210, 2000). Diese Verfahren wurden mit isotoper Markierung und MS-Analyse verwendet, um spezifische Proteine in komplexen Gemischen zu identifizieren und quantitativ zu bestimmen. Ein Durchsuchen von Datenbanken ist in diesen Fällen auf diejenigen Peptide beschränkt, die die Zielaminosäure oder -modifikation enthalten. Überdies sind diese Lösungsansätze nicht unbedingt umfassend, da Proteine, denen der Zielanteil fehlt, in dem isolierten Peptidgemisch nicht vertreten sind.
Die internationale Patentveröffentlichung WO 02/077016 beschreibt ein Verfahren zur Isolierung eines Teilsatzes von gekennzeichneten Peptiden aus einer proteomischen Probe, das die Schritte des Bereitstellens eines oder mehrerer Proteine, des Schützens des N-Terminus von Proteinen mit einem Isothiocyanat-Derivat, des Spaltens der modifizierten Proteine mit Trypsin, des Sortierens der gekennzeichneten Peptide unter Verwendung von RP-Chromatographie-(RP = re versed phase, Umkehrphase) oder Ionenaustauschchromatographieprozeduren sowie des Analysierens der Peptide unter Verwendung von MALDI-PSD, ESI-CID oder MALDI-CID umfasst.
Es besteht weiterhin ein Bedarf an verbesserten Verfahren zum effizienten und zuverlässigen Identifizieren und quantitativen Bestimmen von in einer proteomischen Probe vorgefundenen Proteinen, und vorzugsweise auch zum Verringern der Probenkomplexität.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Verringerung der Probenkomplexität
Die vorliegende Erfindung offenbart ein neues und verbessertes System zum Verringern der Komplexität von proteomischen Proben, das gleichzeitig eine Identifizierung einzelner Proteine in den Proben ermöglicht. Das System beruht auf einem Verfahren zum Verringern der Analyse der ursprünglichen proteomischen Probe auf die eines einzigen Peptids pro Protein in der ursprünglichen Probe, wobei jedes Peptid von dem N-Terminus (oder C-Terminus) eines in der Probe vorliegenden Proteins abgeleitet ist. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung wird das Verfahren dort, wo eine Proteinidentifikation auf der Charakterisierung eines Peptids beruht, das von dem N-Terminus eines einzelnen Proteins abgeleitet ist, als „Verfahren zur Auswahl von N-terminalen Peptiden" bezeichnet. Desgleichen wird das Verfahren hierin dort, wo eine Proteinidentifikation auf der Charakterisierung eines Peptids beruht, das von dem C-Terminus eines einzelnen Proteins abgeleitet ist, als „Verfahren zur Auswahl von C-terminalen Peptiden" bezeichnet. Allgemeiner wird der Begriff „Auswahlverfahren für terminale Peptide" verwendet, um sich auf eines der beiden Verfahren zu beziehen. Wenn der erfindungsgemäße Ansatz mit hin reichend bekannten Massenspektrometrieverfahren und computergestützten Datenbanksuchsystemen kombiniert wird, ermöglicht er eine Identifizierung von Proteinen in einer Probe, indem ein einziges N-terminal oder C-terminal geschütztes Peptid, das für jedes Protein erzeugt wird, charakterisiert wird. In der Technik bekannte Verfahren können angewendet werden, um Proteine in einer Probe aus den Aminosäuresequenzen von N-terminalen oder C-terminalen Peptiden zu identifizieren, die anhand chemischer oder enzymatischer Mittel für jedes Protein erzeugt wurden. Somit liefert die vorliegende Erfindung ein effizientes Verfahren zum Verringern der Komplexität einer proteomischen Probe und zum Identifizieren von Proteinen in einem komplexen Gemisch durch ein Reduzieren des analytischen Schritts auf die Charakterisierung eines einzigen Peptids für jedes Protein.
In Bezug auf einen Aspekt umfasst die Erfindung Verfahren zum Verringern der Komplexität einer proteomischen Probe gemäß der Darlegung im Patentanspruch 1. Bei bestimmten Ausführungsbeispielen umfasst das erfindungsgemäße Verfahren (i) Bereitstellen eines oder mehrerer Proteine; (ii) Schützen der N- oder C-Termini des Proteins mit einem geeigneten Schutzmittel; (ii) Spalten der terminal geschützten Proteine mit einem geeigneten Spaltungsmittel, wodurch ein Gemisch aus terminal geschützten Peptiden und nicht-terminal geschützten Peptiden, die freie Amino- und Carboxylgruppen aufweisen, die den Spaltungsstellen entsprechen, erzeugt wird; und (iv) Trennen der terminal geschützten Peptide von dem Peptidgemisch, wodurch die Probenkomplexität auf ein terminales Peptid pro Probenprotein verringert wird.
Bei bestimmten Ausführungsbeispielen wird eine Trennung von terminal geschützten Peptiden von dem Proteinspaltungsgemisch durch (i) selektives Immobilisieren der nicht-terminal geschützten Peptide auf einem festen Träger; (ii) Waschen des festen Trägers mit einem geeigneten Lösungsmittel; und (iii) Auffangen derjenigen Lösungsmittelfraktio nen, die die terminal geschützten Peptide enthalten, bewerkstelligt.
Bei einem Ausführungsbeispiel werden nicht-N-terminal geschützte Peptide immobilisiert, und der feste Träger weist reaktive Gruppen auf, die mit reaktiven freien Aminogruppen eine kovalente Bindung eingehen können. Bei einem anderen Ausführungsbeispiel werden nicht-C-terminal geschützte Peptide immobilisiert, und der feste Träger weist reaktive Gruppen auf, die mit freien Carboxylgruppen eine kovalente Bindung eingehen können.
Bei einem anderen Ausführungsbeispiel umfasst die zum Schützen von Proteintermini verwendete Schutzgruppe eine reaktive Gruppe oder eine latente reaktive Gruppe, die mit einem festen Träger eine kovalente Bindung eingehen kann. Somit wird eine Trennung der gewünschten terminal geschützten Peptide von dem Gemisch durch ein Immobilisieren der terminal geschützten Peptide auf dem festen Träger bewerkstelligt. Die unerwünschten Peptide können aus dem festen Träger herausgewaschen werden, und die terminal geschützten Peptide können freigesetzt werden, indem der feste Träger mit einem geeigneten Freisetzungsmittel in Kontakt gebracht wird. Somit wird bei bestimmten anderen Ausführungsbeispielen eine Trennung von terminal geschützten Peptiden von dem Proteinspaltungsgemisch durch (i) selektives Immobilisieren der terminal geschützten Peptide auf einem festen Träger; (ii) Waschen des festen Trägers, um Peptide zu beseitigen, die nicht kovalent an den festen Träger angelagert sind; und (iii) Freisetzen der terminal geschützten Peptide aus dem festen Träger bewerkstelligt.
Bezüglich eines weiteren Aspekts umfasst die Erfindung Verfahren zum Identifizieren von Proteinen in einer proteomischen Probe. Bei bestimmten Ausführungsbeispielen umfasst das erfindungsgemäße Verfahren (i) Bereitstellen eines oder mehrerer Proteine; (ii) Schützen der terminalen Aminogruppen des Proteins mit einem geeigneten Schutzmittel; (iii) Spalten der terminal geschützten Proteine mit einem geeigneten Spaltungsmittel, wodurch ein Gemisch aus terminal geschützten Peptiden und Peptiden, die freie Amino- und Carboxylgruppen, die den Spaltungsstellen entsprechen, aufweisen, erzeugt wird; (iv) Trennen der terminal geschützten Peptide von dem Peptidgemisch, wodurch die Probenklomplexität auf ein terminales Peptid pro Probenprotein reduziert wird; und (v) Erfassen der terminal geschützten Peptide.
Bei bestimmten Ausführungsbeispielen werden die Schritte (ii)–(iv) gemäß einem Verfahren ausgeführt, das ähnlich demjenigen ist, das für Verfahren zum Verringern der proteomischen Probenkomplexität beschrieben wird.
Bei einem Ausführungsbeispiel werden die oben beschriebenen Verfahren mit einer massenspektrometrischen Technik zum Charakterisieren von N-terminal oder C-terminal geschützten Peptiden und zum Identifizieren der Proteine in der Probe, von der die N-terminal oder C-terminal geschützten Peptide stammten, kombiniert. Bei bestimmten Ausführungsbeispielen verwendet der Schritt des Erfassens eine massenspektrometrische Technik. Bei einem Ausführungsbeispiel ist die massenspektrometrische Technik eine Tandemmassenspektrometrie, und die Terminal-Geschütztes-Peptid-MS-Fragmentierungsmuster werden dazu verwendet, verfügbare Datenbanken zu durchsuchen, um die Aminosäuresequenz der terminalen Peptide zu ermitteln. Bei bestimmten anderen Ausführungsbeispielen werden die Aminosäuresequenzinformationen dazu verwendet, Proteindatenbanken zu durchsuchen, um die Mutterproteine, von denen die terminalen Peptide stammen können, zu identifizieren. Bei einem anderen Ausführungsbeispiel ist die massenspektrometrische Technik mit einer Trennungstechnik wie z. B. Hochdruck-Flüssigchromatographie (HPLC – high pressure liquid chromatography), Gelelektrophorese oder Kapillarelektrophorese (CE – capillary electrophoresis) gekoppelt, und das Gemisch aus N-terminal oder C-terminal geschützten Peptiden wird vor der MS-Analyse einem Trennungsschritt unterzogen.
Quantitative Proteomik
Bezüglich eines weiteren Aspekts umfasst die Erfindung Verfahren zum quantitativen Vergleich von Proteinkonzentrationen, die differentiell zwischen zwei Proben vorhanden sind, oder eines Protein (von Proteinen), das (die) in manchen, aber nicht in allen Proben vorliegt (vorliegen). Wenn er mit Verfahren zum differentiellen isotopischen Markieren kombiniert wird, kann der Ansatz der vorliegenden Erfindung einer Auswahl von N-terminalen oder C-terminalen Peptiden dazu verwendet werden, relative Mengen von Peptiden und entsprechenden Proteinen in verschiedenen Proben quantitativ zu bestimmen.
Bei bestimmten Ausführungsbeispielen umfasst das erfindungsgemäße Verfahren zur quantitativen Bestimmung ein (i) Bereitstellen zweier oder mehrerer Proben, von denen jede ein oder mehrere Proteine enthält; (ii) Schützen, in jeder Probe, der Protein-N- oder -C-Termini mit einem geeigneten Schutzmittel; (iii) Spalten, in jeder Probe, der terminal geschützten Proteine mit einem geeigneten Spaltungsmittel, wodurch für jede Probe ein Gemisch aus terminal geschützten Peptiden und Peptiden, die freie Amino- und Carboxylgruppen aufweisen, die den Spaltungsstellen entsprechen, erzeugt wird; (iv) Trennen, für jede Probe, der terminal geschützten Peptide aus dem Peptidgemisch, wodurch die Probenkomplexität für jede der zwei oder mehr Proteinproben auf ein terminales Peptid pro Probenprotein reduziert wird; (v) differentielles Markieren der terminal geschützten Peptide jeder Probe mit einem geeigneten Reagens, das eine erfassbare Markierung aufweist, wodurch zwei oder mehr Sätze von differentiell markierten terminalen Peptiden erzeugt werden; und (v) Messen relativer Konzentrationen an differentiell markierten terminal geschützten Peptiden.
Bei einem anderen Ausführungsbeispiel umfasst das Verfahren zum quantitativen Vergleichen von Proteinkonzentrationen in zwei oder mehr Proben folgende Schritte: (i) Bereitstellen zweier oder mehrerer Proben, die jeweils ein oder mehrere Proteine enthalten; (ii) differentielles Markieren der Protein-N- oder -C-Termini jeder Probe mit einem geeigneten Schutzmittel, das eine erfassbare Markierung aufweist, wodurch zwei oder mehr Sätze differentiell markierter terminal geschützter Proteine erzeugt werden; (iii) Spalten der differentiell markierten terminal geschützten Proteine mit einem geeigneten Spaltungsmittel, wodurch zwei oder mehr Gemische von differentiell markierten terminal geschützten Peptiden und Peptiden, die freie Amino- und Carboxylgruppen aufweisen, die den Spaltungsstellen entsprechen, erzeugt werden; (iv) Trennen, für jedes der zwei oder mehr Peptidgemische, der differentiell markierten terminal geschützten Peptide von den nicht-terminal geschützten Peptiden, wodurch die Probenkomplexität effektiv auf ein differentiell markiertes terminales Peptid pro differentiell markiertem Probenprotein verringert wird; und (v) Messen der relativen Konzentrationen an differentiell markierten terminal geschützten Peptiden.
Bei jeglichem der obigen beiden Ausführungsbeispiele kann eine Kombination von proteomischen Proben zu einem beliebigen Zeitpunkt nach dem Schritt des differentiellen Markierens von terminalen Peptiden oder Proteinen in jeder Probe, jedoch vor dem Messen der relativen Konzentrationen an markierten Peptiden in dem Gemisch erfolgen. Dadurch wird gewährleistet, dass jedes Paar/jeder Satz von differentiell markierten Peptiden gleichzeitig analysiert wird, wodurch eine relative quantitative Bestimmung ermöglicht wird (im Gegensatz zu einer absoluten quantitativen Bestimmung, die die Erzeugung einer Kalibrierungskurve erforderlich macht).
Bei bestimmten exemplarischen Ausführungsbeispielen umfasst das direkt oberhalb beschriebene Verfahren ferner einen Schritt des Kombinierens der Sätze von differentiell markierten terminal geschützten Proteinen vor dem Schritt des Spaltens, und das Verfahren umfasst folgende Schritte: (i) Bereitstellen zweier oder mehrerer Proben, die jeweils ein oder mehrere Proteine enthalten; (ii) differentielles Markieren der Protein-N- oder -C-Termini jeder Probe mit einem geeigneten Schutzmittel, das eine erfassbare Markierung aufweist, wodurch zwei oder mehr Sätze differentiell markierter terminal geschützter Proteine erzeugt werden; (iii) Kombinieren der Sätze von differentiell markierten terminal geschützten Proteinen; (iv) Spalten der differentiell markierten terminal geschützten Proteine mit einem geeigneten Spaltungsmittel, wodurch ein kombiniertes Gemisch aus differentiell markierten terminal geschützten Peptiden und Peptiden, die freie Amino- und Carboxylgruppen aufweisen, die den Spaltungsstellen entsprechen, erzeugt wird; (v) Trennen der differentiell markierten terminal geschützten Peptide von den nicht-terminal geschützten Peptiden, wodurch die Probenkomplexität auf ein differentiell markiertes terminales Peptid pro differentiell markiertem Probenprotein verringert wird; und (vi) Messen der relativen Konzentrationen an differentiell markierten terminal geschützten Peptiden.
Bei bestimmten Ausführungsbeispielen sind die zum differentiellen Markieren von Protein-N- oder -C-Termini jeder Probe verwendeten erfassbaren Markierungen differentiell isotopisch markiert. Bei bestimmten exemplarischen Ausführungsbeispielen werden die erfassbaren Markierungen unter Verwendung von Deuterium differentiell isotopisch markiert.
Bei bestimmten Ausführungsbeispielen beinhaltet der Schritt des differentiellen Markierens der terminal geschützten Peptide oder Proteine ein differentielles Markieren der N-terminal geschützten Peptide, und das Reagens, das eine erfassbare Markierung aufweist, wird mit den C-terminalen freien Carboxylgruppen der N-terminal geschützten Peptide zur Reaktion gebracht.
Bei bestimmten Ausführungsbeispielen beinhaltet der Schritt des differentiellen Markierens der terminal geschützten Peptide oder Proteine ein differentielles Markieren der C- terminal geschützten Peptide, und das Reagens, das eine erfassbare Markierung aufweist, wird mit den N-terminalen freien Aminogruppen der C-terminal geschützten Peptide zur Reaktion gebracht.
Bei bestimmten Ausführungsbeispielen werden die oben beschriebenen quantitativen Verfahren mit einer massenspektrometrischen Technik zum Charakterisieren der N-terminal oder C-terminal geschützten Peptide und zum Identifizieren der Proteine in der Probe, aus der die N-terminal oder C-terminal geschützten Peptide stammten, kombiniert. Bei bestimmten Ausführungsbeispielen verwendet der Schritt des Erfassens eine massenspektrometrische Technik. Bei einem anderen Ausführungsbeispiel ist die massenspektrometrische Technik die Tandemmassenspektrometrie, und die Peptid-MS-Fragmentierungsmuster werden dazu verwendet, verfügbare Datenbanken zu durchsuchen, um die Aminosäuresequenz der N- oder C-terminalen Peptide zu ermitteln. Bei bestimmten anderen Ausführungsbeispielen werden die Aminosäuresequenzinformationen dazu verwendet, Proteindatenbanken zu durchsuchen, um die Mutterproteine, von denen die terminalen Peptide stammen können, zu identifizieren. Bei einem anderen Ausführungsbeispiel wird die massenspektrometrische Technik mit einer Trennungstechnik, z. B. Hochdruck-Flüssigchromatographie (HPLC), Gelelektrophorese oder Kapillarelektrophorese gekoppelt, und das Gemisch aus N-terminal oder C-terminal geschützten Peptiden wird vor der MS-Analyse einem Trennungsschritt unterworfen.
Bei einem exemplarischen Ausführungsbeispiel werden die erfassbaren Markierungen in verschiedenen Proben differentiell isotopisch markiert, und ein quantitativer Vergleich von Konzentrationen an N-terminal oder C-terminal geschützten Peptiden (somit Konzentrationen an entsprechenden Proteinen) in verschiedenen Proben wird bewerkstelligt, indem die relativen Mengen der differentiell isotopisch markierten Markierungen in den verschiedenen Proben verglichen werden.
Der quantitative Ansatz der Erfindung ermöglicht beispielsweise einen Vergleich einer Proteinexpression oder -modifikation bei Proben, die durch eine Veränderung der Beschaffenheit oder des Zellzustands (z. B. Krankheitszustand, Bösartigkeit) einer Zelle, eines Gewebes oder eines Organismus, von der bzw. dem die Probe stammte, oder durch einen Stimulus (z. B. eine Verabreichung eines Medikaments oder einen Kontakt mit einem potentiell toxischen Material) oder eine Veränderung der Umgebung (z. B. Nährstoffgehalt, Temperatur, verstrichene Zeit) differentiell beeinflusst werden, oder bei Proben, die überhaupt von verschiedenen Quellen stammen (z. B. von verschiedenen Zelltypen oder verschiedenen Organismen oder von transformierten und/oder genetisch veränderten Zellen wie z. B. Zellen, die aus gezielten Mutations- oder Gen-Knockout-Experimenten gewonnen werden).
Hilfsmittel der Erfindung
Nachstehend werden Hilfsmittel beschrieben, die nützlich dabei sind, ein Verfahren gemäß der Erfindung auf zweckmäßige Weise durchzuführen. Um die Vielseitigkeit der vorliegenden Erfindung zu erhöhen, können die Reagenzien und/oder Materialien in einer in Form eines Pakets vorliegenden Kombination, in denselben oder in getrennten Behältern bereitgestellt werden, je nach der gegenseitigen Reaktionsfreudigkeit und Stabilität der Reagenzien und/oder Materialien.
Bei einem Ausführungsbeispiel umfasst ein Hilfsmittel, das nützlich dabei ist, einzelne Proteine in einer proteomischen Probe zu identifizieren, Folgendes: (i) ein oder mehrere Schutzmittel zum Schützen der Protein-N- oder -C-Termini und zum Erzeugen von N- oder C-terminal geschützten Proteinen; (ii) ein oder mehrere Spaltungsmittel zum Spalten der terminal geschützten Proteine zu einem Gemisch aus terminal geschützten Peptiden und Peptiden, die freie Ami no- und Carboxylgruppen aufweisen; und (iii) eine Einrichtung zum Trennen der terminal geschützten Peptide von dem Gemisch.
Bei bestimmten Ausführungsbeispielen sind die Spaltungsmittel chemische Spaltungsmittel. Bei exemplarischen Ausführungsbeispielen sind die Spaltungsmittel Enzyme zum Erzeugen von Proteinaufschlussprodukten.
Bei bestimmten Ausführungsbeispielen umfasst das (umfassen die) Hilfsmittel ferner ein sekundäres Schutzmittel zum selektiven Schützen der Lysin-Seitenkettenreste in den Proteinen.
Bei einem Ausführungsbeispiel ist zumindest ein Schutzmittel ein Aminschutzmittel zum N-terminalen Schützen von Proteinen in der Probe. Bei einem anderen Ausführungsbeispiel ist zumindest ein Schutzmittel ein Carboxylschutzmittel zum C-terminalen Schützen von Proteinen in der Probe. Bei einem wieder anderen Ausführungsbeispiel umfasst das Schutzmittel eine reaktive Gruppe oder eine latente reaktive Gruppe, die mit einem festen Träger eine kovalente Bindung eingehen kann.
Bei einem anderen Ausführungsbeispiel umfasst ein Mittel zum Trennen von terminal geschützten Peptiden einen festen Träger. Ein oder mehrere feste Träger können mit den Hilfsmitteln versehen sein, wobei sie identisch oder unterschiedlich sind. Bei einem Ausführungsbeispiel umfasst der feste Träger reaktive Gruppen, die sich kovalent an Amine binden können (beispielsweise um nicht-N-terminal geschützte Peptide zu immobilisieren). Bei einem anderen Ausführungsbeispiel umfasst der feste Träger reaktive Gruppen, die sich kovalent an Carboxylgruppen binden können (beispielsweise um nicht-C-terminal geschützte Peptide zu immobilisieren). Bei einem wieder anderen Ausführungsbeispiel dient der feste Träger zum Immobilisieren von terminal geschützten Peptiden, und der feste Träger umfasst reaktive Gruppen, die sich kovalent an die Schutzgruppe binden können, die an terminal geschützten Peptiden vorliegt.
Bei bestimmten Ausführungsbeispielen umfassen die Hilfsmittel ein Reagens zum Freisetzen immobilisierter Peptide aus dem festen Träger, falls gewünscht.
Bei einem anderen Ausführungsbeispiel umfassen die Hilfsmittel einen Linker zum Immobilisieren von terminal geschützten oder nicht-terminal geschützten Peptiden auf dem festen Träger.
Bei einem wieder anderen Ausführungsbeispiel sind die Hilfsmittel nützlich für einen quantitativen Vergleich von Proteinkonzentrationen, die zwischen zwei oder mehr Proben differentiell vorhanden sind, und sie umfassen ferner ein oder mehr Reagenzien zum differentiellen Markieren von N-terminalen oder C-terminalen Peptiden, die von Proteinen, die in verschiedenen Proben vorliegen, stammen. Bei einem Ausführungsbeispiel sind die Reagenzien differentiell isotopisch markiert und werden dazu verwendet, die freie Carboxylgruppe von N-terminal geschützten Peptiden (oder die freie Aminogruppe von C-terminal geschützten Peptiden) kovalent zu modifizieren. Bei einem exemplarischen Ausführungsbeispiel umfassen die Schutzgruppen, die dazu verwendet werden, Protein-N-Termini oder -C-Termini in verschiedenen Proben zu schützen, differentiell isotopisch markierte erfassbare Markierungen. Somit wird ein quantitativer Vergleich von Konzentrationen an N-terminal oder C-terminal geschützten Peptiden (somit Konzentrationen der entsprechenden Proteine) in verschiedenen Proben dadurch bewerkstelligt, dass die relativen Mengen der differentiell isotopisch markierten Markierungen in den verschiedenen Proben verglichen werden.
DEFINITIONEN
„Proteomische Probe": Gemäß seiner Verwendung in dem vorliegenden Dokument bezieht sich der Begriff proteomische Probe auf eine Probe, die eine Mehrzahl von Proteinen aufweist. Vorzugsweise ist die Probe das Gesamtproteinkomplement einer Zelle, eines Gewebes oder eines Organismus. Bei bestimmten Ausführungsbeispielen ist die proteomische Probe eine biologische Probe, und sie bezieht sich auf jegliche Feststoff- oder Fluidprobe, die von einem beliebigen lebenden Organismus gewonnen oder durch einen solchen abgesondert oder sekretiert wird, einschließlich einzelliger Mikroorganismen (beispielsweise Bakterien und Hefen) und vielzelliger Organismen (z. B. Pflanzen und Tiere, beispielsweise ein Wirbeltier oder ein Säugetier, und insbesondere ein gesundes oder anscheinend gesundes menschliches Subjekt oder ein menschlicher Patient, der durch einen Zustand oder eine Krankheit, die diagnostiziert oder untersucht werden soll, beeinträchtigt wird). Die biologische Probe kann in jeglicher Form vorliegen, einschließlich eines Feststoffs wie z. B. eines Gewebes, Zellen, eines Zellpellets, eines Zellextrakts, von Zellhomogenaten oder Zellfraktionen; oder einer Biopsie oder eines biologischen Fluids. Das biologische Fluid kann von einer beliebigen Stelle (z. B. Blut, Speichel (oder einem Mundwasser, das Bukkalzellen enthält), Tränen, Plasma, Serum, Urin, Galle, cerebrospinaler Flüssigkeit, Amnionflüssigkeit, Peritonealflüssigkeit und Pleuralflüssigkeit oder Zellen aus diesen, wässriger oder glasiger Körperflüssigkeit oder jeglicher Körpersekretion), einem Transsudat, einem Exsudat (z. B. Fluid, das aus einem Abszess oder einer anderen Infektions- oder Entzündungsstelle gewonnen wird) oder einem Fluid, das aus einem Gelenk (z. B. einem normalen Gelenk oder einem Gelenk, das durch eine Krankheit wie z. B. rheumatoide Arthritis, Osteoarthritis, Gicht oder septische Arthritis beeinträchtigt wird), gewonnen wird. Die biologische Probe kann aus einem beliebigen Organ oder Gewebe (einschließlich eines Biopsie- oder Autopsieprobestücks) gewonnen werden oder kann Zellen (ob Primärzellen oder Kulturzellen) oder ein Medium, das durch eine beliebige Zelle, ein beliebiges Gewebe oder Organ konditioniert ist, umfassen. Biologische Proben können auch Stücke von Geweben wie z. B. gefrorene Stücke, die für histologische Zwecke genommen werden, umfassen. Biologische Proben umfassen auch Gemische biologischer Moleküle einschließlich Proteine, Lipide, Kohlenhydrate und Nucleinsäuren, die durch eine teilweise oder vollständige Fraktionierung von Zell- oder Gewebehomogenaten erzeugt wurden. Obwohl die Probe vorzugsweise von einem nicht-embryonischen menschlichen Subjekt gewonnen wird, können biologische Proben von beliebigen Tieren, Pflanzen, Bakterien, Viren, Hefen stammen. Der Begriff Tier bezieht sich gemäß seiner Verwendung in dem vorliegenden Dokument auf Menschen sowie auf nicht-menschliche Tiere auf jeglicher Entwicklungsstufe, einschließlich z. B. Säugetiere, Vögel, Reptilien, Amphibien, Fische, Würmer und Einzeller, jedoch ausschließlich menschlicher Embryonalzellen. Proben von Zellkulturen und lebendem Gewebe werden als mehrere Tiere erachtet. Bei bestimmten exemplarischen Ausführungsbeispielen ist das nicht-menschliche Tier ein Säugetier (z. B. ein Nagetier, eine Maus, eine Ratte, ein Kaninchen, ein Affe, ein Hund, eine Katze, ein Schaf, ein Rind, ein Primat oder ein Schwein). Ein Tier kann ein transgenes nicht-menschliches Tier sein. Falls gewünscht, kann die biologische Probe einer vorbereitenden Aufbereitung unterzogen werden, einschließlich vorbereitender Trennungstechniken. Beispielsweise können Zellen oder Gewebe zum Zweck einer separaten Analyse von Biomolekülen in gesonderten subzellularen Fraktionen, beispielsweise Proteinen, die in verschiedenen Teilen der Zelle zu finden sind, extrahiert und einer subzellularen Fraktionierung unterzogen werden. Siehe Deutscher (ed.), Methods In Enzymology, 182: 147–238, 1990. Desgleichen kann eine Immunpräzipitation durchgeführt werden, um Biomoleküle, die bezüglich ihrer Antigene verwandt sind, z. B. Proteine, zu identifizieren. Siehe Firestone & Winguth In Deutscher, Methods In Enzymology, 182: 688–699, 1990. Die biologische Probe kann von einem gesunden Subjekt oder einem Subjekt, das an einem pathologischen Zustand leidet, gewonnen werden. Die biologische Probe kann aus Zellen unterschiedlicher genetischer Hintergründe, Gewebeursprünge und/oder Entwicklungsstufen gewonnen werden und kann beispielsweise Bakterien-, Hefe-, Pflanzen-, Insekten- und Säugetierzellen umfassen. Die proteomische Probe kann aus normalen, transformierten (z. B. Zellen, die nicht von einem Krebs stammten, sondern anhand einer Laborbehandlung normaler Zellen erzeugt wurden), erkrankten oder genetisch veränderten Zellen (z. B. aus gezielten Mutations- oder Gen-Knockout-Experimenten); oder einer Zelle gewonnen werden, die zuvor einem äußeren Stimulus ausgesetzt wurde (z. B. Verabreichung eines Medikaments; Kontakt mit einem potentiell toxischen Material; Änderung des Nährstoffgehalts, Temperatur oder verstrichene Zeit).
„Protein": Gemäß seiner Verwendung in dem vorliegenden Dokument bezieht sich der Begriff Protein auf eine Peptid-gebundene Kette von Aminosäuren, ungeachtet einer posttranslationellen Modifikation, z. B. Glykosylierung oder Phosphorylierung. Somit bezieht sich der Begriff Protein nicht auf eine einzelne Entität, sondern er umfasst vielmehr Proteine, die sich aus posttranslationellen Modifikationen und einer N- und/oder C-terminalen Aufbereitung desselben Genprodukts ergeben. Üblicherweise ist ein Protein eine Aminosäurekette, die eine Länge von mehr als 25 Aminosäureresten aufweist.
„Peptid": Gemäß seiner Verwendung in dem vorliegenden Dokument bezieht sich der Begriff Peptid auf eine Aminosäurekette einer Länge von weniger als etwa 25 Aminosäureresten. Beispielsweise wird eine Mehrzahl von Peptiden anhand einer proteolytischen Fragmentierung eines Proteins erzeugt.
„Differentiell vorhanden": Gemäß seiner Verwendung in dem vorliegenden Dokument bezeichnet der Begriff differentiell vorhanden, wenn er sich auf ein Protein in verschiedenen proteomischen Proben bezieht, ein Protein, das in verschiedenen Proben vorliegt, jedoch mit einer Änderung einer Eigenschaft, die dem Protein inhärent ist, auftritt. Gemäß seiner Verwendung in dem vorliegenden Dokument umfasst der Begriff Eigenschaft Expressionspegel, Proteinmodifikation (z. B. posttranslationelle Modifikationen), Proteinsequenz (d. h. Mutationen) oder Proteinfunktion. Beispielsweise kann der Begriff differentiell vorhanden verwendet werden, wenn ein oder mehrere Proteine in einem Teilsatz der Proben im Vergleich zu den übrigen Proben in einer höheren relativen Menge vorliegt bzw. vorliegen. Der Begriff kann auch verwendet werden, wenn Proteine, die nicht in den übrigen Proben vorliegen, in einem Teilsatz der Proben vorliegen. Selbstverständlich kann es der Fall sein, dass Proteine in einem Teilsatz der Proben im Vergleich zu den übrigen Proben in einer höheren relativen Menge vorliegen, während andere Proteine, die nicht in den übrigen Proben vorliegen, in einem Teilsatz der Proben vorliegen.
„Affinitätsmarkierung": Gemäß seiner Verwendung in dem vorliegenden Dokument bezieht sich der Begriff Affinitätsmarkierung auf eine Gruppe, einen Anteil oder eine Entität, die bzw. der mit einer Gegenstück-Entität (z. B. Einfangmittel) auf spezielle Weise interagiert/assoziiert. Das Paar aus Affinitätsmarkierung und Einfangmittel wird oft als „Affinitätspaar" bezeichnet. Das Affinitätspaar kann ein biochemisches Paar sein. Beispiele von biochemischen Paaren umfassen Antikörper/Antigen, Enzym/Hemmstoff, Hormon/Rezeptor, Zucker/Lektin und komplementäre Nukleinsäurekomponenten.
„Affinitätschramatographie": Gemäß seiner Verwendung in dem vorliegenden Dokument bezieht sich der Begriff Affinitätschromatographie auf ein Trennungsverfahren, das die spezifische Wechselwirkung zwischen Affinitätspaarkomponenten nutzt, indem es eine Komponente des Paares auf einem festen Träger immobilisiert, sie in eine Säule packt und anschließend die Säule bei herkömmlichen HPLC-Systemen zur spezifischen Analyse von Entitäten, die das Gegenstück des Komponentenpaares aufweisen, verwendet. Das Affinitätspaar kann ein Paar aus Antikörper und Antigen sein, und der feste Träger kann immobilisierte Antikörper aufweisen. Ein Vorteil von Antikörper/Antigen-Affinitätspaaren besteht darin, dass anhand dieser Technik jegliche Verbindung ermittelt werden kann, da spezifische Antikörper zu jeglicher chemischen Struktur gezogen werden können. Das Affinitätspaar kann ein Enzym/Hemmstoff-Paar sein wie z. B. Avidin/Biotin. In diesem Fall kann das zu trennende Substrat kovalent an Avidin angelagert werden, und das resultierende Konjugat kann durch eine Affinitätsbindung zwischen Avidin und Biotin an einen biotinylierten festen Träger immobilisiert werden. Alternativ dazu kann Avidin an den festen Träger angelagert werden, und der zu isolierende Analyt kann zur Reaktion gebracht werden, um Biotinyl-Terminationen zur Immobilisierung auf dem festen Träger, an den Avidin angelagert wurde, zu liefern.
„Assoziiert mit" oder „Assoziieren mit": Wenn zwei Entitäten miteinander assoziiert sind oder miteinander assoziieren, wie hierin beschrieben ist, sind sie durch eine direkte oder indirekte kovalente oder nicht-kovalente Interaktion verbunden. Vorzugsweise ist die Assoziation kovalent. Wünschenswerte nicht-kovalente Interaktionen umfassen Wasserstoffbrückenbindung, Van-der-Waals-Interaktionen, hydrophobe Interaktionen, magnetische Interaktionen, elektrostatische Interaktionen, Affinitätsinteraktionen oder Kombinationen derselben usw.
„Spaltungsmittel": Gemäß seiner Verwendung in dem vorliegenden Dokument bezieht sich der Begriff Spaltungsmittel auf ein Reagens, das ein Protein unter geeigneten Bedingungen in zwei oder mehr Fragmente spaltet. Vorzugsweise ist das Spaltungsmittel ein Enzym, am stärksten bevorzugt eines, das die Hauptkette des Polypeptids spaltet. Vorzugsweise ist das Enzym Trypsin, das Proteine an dem C-terminalen Ende vieler Lysine und Arginine spaltet. Andere Enzyme können verwendet werden, um die Erfindung zu praktizieren, beispielsweise Chymotrypsin, Pepsin, Papain, Prolinendopeptidase, Staph.-Protease, Elastase, Protease K, AspN, lys-C, arg-C oder glu-C. Das Spaltungsmittel ist nicht auf Enzyme beschränkt, sondern kann ein chemisches Reagens, beispielsweise Cyanbromid (CNBr), 2-Nitro-5-thiocyanbenzoesäure, N-Bromsuccinamid und andere reaktive Halogenverbindungen, Hydroxylamin, 1-2M-Ameisen- oder -Essigsäure, Periodatoxidation, 2-(2-Nitrophenylsulfenyl)-3-methyl-3-bromindolenin oder o-Iodosobenzoesäure sein (siehe z. B. Hermodson et al., „Methods in Protein Sequence Analysis", Ed. Elzinga, Humons Press, Clifton, NJ, S. 313–323, 1982). Das Spaltungsmittel kann mit einem festen Träger assoziiert sein, um eine Reinigung nach einer Proteinspaltung und eine Analyse der resultierenden Proteinaufschlussprodukte zu erleichtern. Beispielsweise kann das Enzym in den Poren von porösen Kügelchen eines hydrophilen polymeren Materials physisch eingeschlossen sein. Alternativ dazu kann das Enzym mittels einer Affinitätsbindung an ein geeignetes Einfangmittel, das auf dem festen Träger vorhanden ist, an den festen Träger immobilisiert werden. Somit könnte das Enzym kovalent an Avidin angelagert werden, und das resultierende Konjugat könnte mittels einer Affinitätsbindung zwischen Avidin und Biotin an eine biotinylierte Membran angelagert werden. Alternativ könnte Avidin an die Membran angelagert werden, und das Enzym könnte zur Reaktion gebracht werden, um Biotinylterminationen zur Reaktion mit einer Membran, an die Avidin angelagert wurde, zu liefern.
„N-terminales Peptid": Gemäß seiner Verwendung in dem vorliegenden Dokument bezieht sich der Begriff N-terminales Peptid auf Peptide, die von Protein-N-Termini in einer proteomischen Probe gemäß dem Verfahren zur Auswahl von N-terminalen Peptiden der vorliegenden Erfindung stammen. Alternativ dazu werden derartige Peptide als N-terminal geschützte Peptide bezeichnet.
„Nicht-N-terminales Peptid": Gemäß seiner Verwendung in dem vorliegenden Dokument bezieht sich der Begriff nicht-N-terminales Peptid auf Peptide, die nicht N-terminale Peptide gemäß der Definition in dem vorliegenden Dokument sind und die in einem Gemisch vorzufinden sind, das aus der chemischen und/oder enzymatischen Fragmentierung einer Proteinprobe gemäß dem Verfahren zur Auswahl von N-terminalen Peptiden der vorliegenden Erfindung resultiert. Alternativ werden derartige Peptide als nicht-N-terminal geschützte Peptide bezeichnet.
„C-terminales Peptid": Gemäß seiner Verwendung in dem vorliegenden Dokument bezieht sich der Begriff C-terminales Peptid auf Peptide, die von den Protein-C-Termini stammen, die in einer proteomische Probe identifiziert werden sollen, gemäß dem Verfahren zur Auswahl von C-terminalen Peptiden der vorliegenden Erfindung. Alternativ werden derartige Peptide als C-terminal geschützte Peptide bezeichnet.
„Nicht-C-terminales Peptid": Gemäß seiner Verwendung in dem vorliegenden Dokument bezieht sich der Begriff nicht-C-terminales Peptid auf Peptide, die nicht C-terminale Peptide gemäß der Definition in dem vorliegenden Dokument sind und die in einem Gemisch vorzufinden sind, das aus der chemischen und/oder enzymatischen Fragmentierung einer Proteinprobe gemäß dem Verfahren zur Auswahl von C-terminalen Peptiden der vorliegenden Erfindung resultiert. Alternativ werden derartige Peptide als nicht-C-terminal geschützte Peptide bezeichnet.
„Latente reaktive Gruppe": Der Begriff latente reaktive Gruppe bezieht sich gemäß seiner Verwendung in dem vorliegenden Dokument auf eine Gruppe, die bezüglich einer Reaktion aktiviert werden muss. Beispielsweise kann es sich da bei um eine Gruppe handeln, die eine Schutzgruppe trägt und die auf ein Beseitigen der Schutzgruppe hin reaktiv wird.
„Reaktive freie Amiaogruppe": Der Begriff reaktive freie Aminogruppe bezieht sich gemäß seiner Verwendung in dem vorliegenden Dokument auf eine Gruppe der Formel -NR₁R₂, wobei R₁ und R₂ unabhängig voneinander Wasserstoff oder ein substituierter oder nicht-substituierter, zyklischer oder azyklischer, linearer oder verzweigter, gesättigter oder ungesättigter aliphatischer, alizyklischer, heteroaliphatischer oder heteroalizyklischer Anteil sind. Vorzugsweise ist zumindest eines von R₁ und R₂ Wasserstoff. Stärker bevorzugt ist das aliphatische oder alizyklische Amin ein primäres Amin und sind sowohl R₁ als auch R₂ Wasserstoff. Am stärksten bevorzugt nimmt das einsame Stickstoffpaar von Elektronen nicht an einer Elektronendelokalisierung (beispielsweise Resonanz-, aromatische oder tautomere Delokalisierung) teil und wird durch andere elektronische Effekte (z. B. induktive/Feldeffekte), die andernfalls seine nucleophile Reaktionsfreudigkeit wesentlich verringern würden, minimal beeinflusst. Bei bestimmten Ausführungsbeispielen bezieht sich der Begriff reaktive freie Aminogruppe auf die freie N-terminale Aminogruppe eines Proteins und/oder Peptids.
„Substituiert": Allgemein bezieht sich der Begriff substituiert auf die Ersetzung von Wasserstoffradikalen bei einer gegebenen Struktur durch das Radikal eines festgelegten Substituenten. Wenn mehr als eine Position bei einer beliebigen gegebenen Struktur durch mehr als einen Substituenten substituiert werden kann, der aus einer festgelegten Gruppe ausgewählt ist, kann der Substituent in jeder Position entweder derselbe oder unterschiedlich sein. Gemäß seiner Verwendung in dem vorliegenden Dokument ist beabsichtigt, dass der Begriff „substituiert" alle zulässigen Substituenten von organischen Verbindungen umfasst. Bezüglich eines breit gefassten Aspekts umfassen die zulässigen Substituenten azyklische und zyklische, verzweigte und unverzweigte, carbozyklische und heterozyklische, aromatische und nichtaromatische Substituenten von organischen Verbindungen. Heteroatome wie z. B. Stickstoff können Wasserstoffsubstituenten und/oder jegliche zulässige Substituenten von hierin beschriebenen organischen Verbindungen aufweisen, die die Wertigkeiten des Heteroatoms erfüllen. Beispiele von Substituenten umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, aliphatisch; alizyklisch; heteroaliphatisch; heteroalizyklisch, Aryl, Heteroaryl; Alkylaryl; Alkylheteroaryl; Alkoxy, Aryloxy; Heteroalkoxy; Heteroaryloxy; Alkylthio; Arylthio; Heteroalkylthio; Heteroarylthio; F; Cl; Br; I; -OH; -NO₂; -CN; -CF₃; -CH₂CF₃; -CHCl₂; -CH₂OH; -CH₂CH₂OH; -CH₂NH₂; -CH₂SO₂CH₃; -C(O)R_x; -CO₂(R); -CON(R_x)₂; -OC(O)R_x; -OCO₂R_x; -OCON(R_x)₂; -N(R_x)₂; -S(O)₂R_x; -NR_x(CO)R_x, wobei jeder Auftretensfall von R_x unabhängig voneinander aliphatisch, alizyklisch, heteroaliphatisch, heteroalizyklisch, Aryl, Heteroaryl, Alkylaryl oder Alkylheteroaryl umfasst, jedoch nicht beschränkt ist hierauf, wobei jegliche der oben und hierin beschriebenen aliphatischen, alizyklischen, heteroaliphatischen, heteroalizyklischen, Alkylaryl- oder Alkylheteroaryl-Substituenten substituiert oder nicht-substituiert, verzweigt oder unverzweigt, zyklisch oder azyklisch sein können und wobei jegliche der oben und hierin beschriebenen Aryl- oder Heteroaryl-Substituenten substituiert oder nicht-substituiert sein können.
„Aliphatisch": Allgemein umfasst der Begriff aliphatisch gemäß seiner Verwendung in dem vorliegenden Dokument sowohl gesättigte als auch ungesättigte, geradkettige (d. h. unverzweigte) oder verzweigte aliphatische Kohlenwasserstoffe, die optional mit einer oder mehreren funktionellen Gruppen substituiert sind, wie zuvor definiert wurde. Wie Fachleuten einleuchten wird, soll „aliphatisch" hierin Alkyl-, Alkenyl-, Alkynyl-Anteile umfassen, ist jedoch nicht hierauf beschränkt. Somit umfasst der Begriff „Alkyl" gemäß seiner Verwendung in dem vorliegenden Dokument gerade und verzweigte Alkylgruppen. Eine analoge Konvention gilt für andere generische Begriffe wie z. B. „Alkenyl", „Alkynyl" und dergleichen. Ferner umfassen die Begriffe „Alkyl", „Alkenyl", „Alkynyl" und dergleichen gemäß ihrer Verwendung in dem vorliegenden Dokument sowohl substituierte als auch nicht-substituierte Gruppen. Bei bestimmten Ausführungsbeispielen wird „niederes Alkyl" gemäß seiner Verwendung in dem vorliegenden Dokument dazu verwendet, diejenigen Alkylgruppen (substituiert, nicht-substituiert, verzweigt oder unverzweigt) anzugeben, die 1–6 Kohlenstoffatome aufweisen. Bei bestimmten Ausführungsbeispielen enthalten die bei der Erfindung verwendeten Alkyl-, Alkenyl- und Alkynylgruppen 1–20 aliphatische Kohlenstoffatome. Bei bestimmten anderen Ausführungsbeispielen enthalten die bei der Erfindung verwendeten Alkyl-, Alkenyl- und Alkynylgruppen 1–10 aliphatische Kohlenstoffatome. Bei wieder anderen Ausführungsbeispielen enthalten die bei der Erfindung verwendeten Alkyl-, Alkenyl- und Alkynylgruppen 1–8 aliphatische Kohlenstoffatome. Bei wieder anderen Ausführungsbeispielen enthalten die bei der Erfindung verwendeten Alkyl-, Alkenyl- und Alkynylgruppen 1–6 aliphatische Kohlenstoffatome. Bei wieder anderen Ausführungsbeispielen enthalten die bei der Erfindung verwendeten Alkyl-, Alkenyl- und Alkynylgruppen 1–4 Kohlenstoffatome.
Veranschaulichende aliphatische Gruppen umfassen somit beispielsweise Methyl-, Ethyl-, n-Propyl-, Isopropyl-, Allyl-, n-Butyl-, sec-Butyl-, Isobutyl-, tert-Butyl-, n-Pentyl-, sec-Pentyl-, Isopentyl-, tert-Pentyl-, n-Hexyl-, sec-Hexyl-Anteile und dergleichen, die wiederum einen oder mehrere Substituenten aufweisen können, wie zuvor definiert wurde. Alkenylgruppen umfassen beispielsweise Ethenyl, Propenyl, Butenyl, 1-Methyl-2-buten-1-yl und dergleichen, sind jedoch nicht hierauf beschränkt. Repräsentative Alkynylgruppen umfassen Ethynyl, 2-Propynyl (Propargyl), 1-Propynyl und dergleichen, sind aber nicht hierauf beschränkt.
„Alizyklisch": Der Begriff alizyklisch bezieht sich gemäß seiner Verwendung in dem vorliegenden Dokument auf Verbindungen, die die Eigenschaften von aliphatischen und zyklischen Verbindungen kombinieren und umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, zyklische oder polyzyklische aliphatische Kohlenwasserstoffe und überbrückte Cycloalkylverbindungen, die optional mit einer oder mehreren funktionellen Gruppen substituiert sind. Wie Fachleuten einleuchten wird, soll „alizyklisch" hierin Cycloalkyl-, Cycloalkenyl- und Cycloalkynyl-Anteile umfassen, die optional mit einer oder mehreren funktionellen Gruppen substituiert sind, ist jedoch nicht beschränkt hierauf. Veranschaulichende alizyklische Gruppen umfassen somit, sind aber nicht beschränkt auf, beispielsweise Cyclopropyl-, -CH₂-Cyclopropyl-, Cyclobutyl-, -CH₂-Cyclobutyl-, Cyclopentyl-, -CH₂-Cyclopentyln-, Cyclohexyl-, -CH₂-Cyclohexyl-, Cyclohexenylethyl-, Cyclohexanylethyl-, Norborbyl-Anteile und dergleichen, die wiederum einen oder mehrere Substituenten aufweisen können.
„Heteroaliphatisch": Der Begriff „heteroaliphatisch" bezieht sich gemäß seiner Verwendung in dem vorliegenden Dokument auf aliphatische Anteile, bei denen ein oder mehrere Kohlenstoffatome in der Hauptkette mit einem Heteroatom substituiert wurden. Somit bezieht sich eine heteroaliphatische Gruppe auf eine aliphatische Kette, die ein oder mehrere Sauerstoff- Schwefel-, Stickstoff-, Phosphor- oder Siliziumatome, z. B. anstelle von Kohlenstoffatomen, enthält. Heteroaliphatische Anteile können gesättigt oder ungesättigt, verzweigt oder linear (d. h. unverzweigt) und substituiert oder nicht-substituiert sein. Substituenten umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, jegliche der zuvor erwähnten Substituenten, d. h. der oben angeführten Substituenten, die zur Bildung einer stabilen Verbindung führen.
„Heteroalizyklisch": Der Begriff heteroalizyklisch bezieht sich gemäß seiner Verwendung in dem vorliegenden Dokument auf Verbindungen, die die Eigenschaften heteroaliphatischer und zyklischer Verbindungen kombinieren und gesättigte und ungesättigte mono- oder polyzyklische heterozyklische Verbindungen wie z. B. Morpholino, Pyrrolidinyl, Furanyl, Thiofuranyl, Pyrrolyl usw., die optional mit einer oder mehreren funktionellen Gruppen substituiert sind, umfassen, jedoch nicht auf diese beschränkt sind. Substituenten umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, jegliche der zuvor erwähnten Substituenten, d. h. der oben angeführten Substituenten, die zur Bildung einer stabilen Verbindung führen.
„Carbodiimid": Der Begriff Carbodiimid unterscheidet sich gemäß seiner Verwendung in dem vorliegenden Dokument nicht beträchtlich von der üblichen Bedeutung dieses Begriffs in der Technik und bezieht sich auf einen Anteil einer Struktur R₁-N=C=N-R₂, wobei R₁ und R₂ unabhängig voneinander ein substituierter oder nicht-substituierter, zyklischer oder azyklischer, linearer oder verzweigter, gesättigter oder ungesättigter aliphatischer, alizyklischer, heteroaliphatischer, heteroalizyklischer, Aryl- oder Heteroaryl-Anteil sind.
„Aryl": Allgemein bezieht sich der Begriff Aryl gemäß seiner Verwendung in dem vorliegenden Dokument auf stabile mono- oder polyzyklische, ungesättigte Anteile, die vorzugsweise 3–14 Kohlenstoffatome aufweisen, von denen jedes substituiert oder nicht-substituiert sein kann. Substituenten umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, jegliche der zuvor erwähnten Substituenten, d. h. der oben angeführten Substituenten, die zur Bildung einer stabilen Verbindung führen. Der Begriff Aryl kann sich auf ein mono- oder bizyklisches carbozyklisches Ringsystem beziehen, das einen oder zwei aromatische Ringe aufweist, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, Phenyl, Naphthyl, Tetrahydronaphthyl, Indanyl, Indenyl und dergleichen.
„Heteroaryl": Der Begriff Heteroaryl bezieht sich gemäß seiner Verwendung in dem vorliegenden Dokument auf ein stabiles heterozyklisches oder polyheterozyklisches, ungesättigtes Radikal, das fünf bis zehn Ringatome aufweist, von denen ein Ringatom aus S, O und N ausgewählt ist; null, ein oder zwei Ringatome zusätzliche Heteroatome sind, die unabhängig voneinander aus S, O und N ausgewählt sind; und die übrigen Ringatome Kohlenstoff sind, wobei das Radikal über eines der Ringatome an das restliche Molekül angebunden ist, beispielsweise Pyridyl, Pyrazinyl, Pyrimidinyl, Pyrrolyl, Pyrazolyl, Imidazolyl, Thiazolyl, Oxazolyl, Isooxazolyl, Thiadiazolyl, Oxadiazolyl, Thiophenyl, Furanyl, Chinolinyl, Isochinolinyl und dergleichen. Heteroaryl-Anteile können zusätzlich dazu substituiert oder nicht-substituiert sein.
Ferner wird man erkennen, dass Aryl- und Heteroaryl-Anteile gemäß der Definition in dem vorliegenden Dokument über einen aliphatischen, alizyklischen, heteroaliphatischen, heteroalizyklischen, Alkyl- oder Heteroalkyl-Anteil angelagert sein können und somit auch -(aliphatisches)Aryl-, -(heteroaliphatisches)Aryl-, -(aliphatisches)Heteroaryl-, -(heteroaliphatisches)Heteroaryl-, -(Alkyl)aryl-, -(Heteroalkyl)aryl-, -(Heteroalkyl)aryl- und -(Heteroalkyl)Heteroaryl-Anteile umfassen. Somit sind die Ausdrücke „Aryl oder Heteroaryl" und „Aryl, Heteroaryl, -(aliphatisches)Aryl, -(heteroaliphatisches)Aryl, -(aliphatisches)Heteroaryl, -(heteroaliphatisches)Heteroaryl, -(Alkyl)aryl, -(Heteroalkyl)aryl, -(Heteroalkyl)aryl und -(Heteroalkyl)heteroaryl" gemäß ihrer Verwendung in dem vorliegenden Dokument austauschbar.
„Carboxyl": Der Begriff Carboxyl bezieht sich gemäß seiner Verwendung in dem vorliegenden Dokument auf eine Gruppe der Formel -CO₂H.
„Amid": Der Begriff Amid unterscheidet sich gemäß seiner Verwendung in dem vorliegenden Dokument nicht wesentlich von der üblichen Bedeutung dieses Begriffs in der Technik und bezieht sich auf einen Anteil der Struktur -C(O)NR₁R₂, wobei R₁ und R₂ unabhängig voneinander Wasserstoff oder ein substituierter oder nicht-substituierter, zyklischer oder azyklischer, linearer oder verzweigter, gesättigter oder ungesättigter aliphatischer, alizyklischer, heteroaliphatischer, heteroalizyklischer, Aryl- oder Heteroaryl-Anteil sind oder R₁ und R₂ zusammengenommen einen substituierten oder nicht-substituierten heterozyklischen oder Heteroaryl-Anteil bilden.
„Carboxylester": Der Begriff Carboxylester unterscheidet sich gemäß seiner Verwendung in dem vorliegenden Dokument nicht wesentlich von der üblichen Bedeutung dieses Begriffs in der Technik und bezieht sich auf einen Anteil der Struktur -C(O)OR₁, wobei R₁ ein substituierter oder nicht-substituierter, zyklischer oder azyklischer, linearer oder verzweigter, gesättigter oder ungesättigter aliphatischer, alizyklischer, heteroalipathischer, heteroalizyklischer, Aryl- oder Heteroaryl-Anteil ist.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNG
1 veranschaulicht ein Ausführungsbeispiel des Verfahrens zur Auswahl von N-terminalen Peptiden der Erfindung.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG BESTIMMTER EXEMPLARISCHER AUSFÜHRUNGSBEISPIELE DER ERFINDUNG
Bestimmte exemplarische Ausführungsbeispiele der Erfindung werden nun im folgenden Text ausführlicher beschreiben und hervorgehoben.
Strategien für eine zielorientierte Arzneimittelforschung und eine vernünftige Arzneimittelgestaltung erfordern eine Identifikation von zellularen Schlüsselkomponenten wie z. B. Proteinen, die in einem kausalen Zusammenhang mit Erkrankungsvorgängen stehen, und die Verwendung derartiger Komponenten als Ziele für eine therapeutische Intervention. Jedoch sind derzeitige Verfahren zum Analysieren von Biomolekülen wie z. B. Proteinen zeitaufwändig und teuer sowie ineffizient in Bezug auf Erfassung, Bilderzeugung, Reinigung und Analyse. Deshalb ist es offensichtlich, dass die vorliegende Erfindung ein riesiges Potential bezüglich der automatisierten Identifizierung und/oder Teilcharakterisierung von Proteinen, z. B. in der Proteomikforschung, in sich birgt.
Wie oben erörtert wurde, stützen sich derzeitige Technologien zum Identifizieren und Charakterisieren von Proteinen in komplexen Proben üblicherweise auf die zweidimensionale Gelelektrophorese (2DE) in Kombination mit der Massenspektrometrie (MS). Auf Grund von Einschränkungen, die der 2DE innewohnen (begrenzte Gelauflösungsfähigkeiten für komplexe Gemische und Schwierigkeiten beim Erfassen (und somit quantitativen Bestimmen) von Proteinen einer geringen Häufigkeit), verschob sich jedoch das Hauptaugenmerk auf MS als Technologiebasis für quantitative Proteomik. MS-basierte Proteomik stützt sich auf die Analyse von zu Peptiden aufgeschlossenen Proteinen anhand von sequenzspezifischen Proteasen wie z. B. Trypsin. In Anbetracht dessen, dass die Anzahl von Proteinen in einer gegebenen Probe ohne weiteres über 10.000 liegen kann, kann erwartet werden, dass ein enzymatischer Aufschluss Peptide liefert, deren Zahl in die Hunderttausende geht. Dieses Komplexitätsniveau stellt für den analytischen Prozess eine enorme Belastung dar und erfordert komplexe analytische Techniken in Kombination mit hochentwickelter computergestützter Technologie, und die zeitaufwändige Analyse durchzuführen.
Die vorliegende Erfindung wendet sich diesem schwierigen Problem zu und liefert ein einfaches und doch äußerst effizientes Verfahren zum Identifizieren von Proteinen in einer proteomischen Probe durch Charakterisieren eines einzigen (ausgewählten) Peptids pro Protein, wodurch die Probenkomplexität drastisch verringert wird. Außerdem liefert die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum quantitativen Bestimmen einer Proteinexpression in verschiedenen Proben.
Verringerung der Probenkomplexität
Über ein Verfahren, das sich dem Problem der Proteinprobenkomplexität zuwendet, wurde vor kurzem von Foote et al. (siehe US-Patentanmeldung Nr. 2002/0106700) berichtet. Kurz gesagt offenbart Foote ein Verfahren zum Charakterisieren von Proteinen in einer gegebenen Probe, das ein Isolieren und Analysieren von C-terminalen und/oder N-terminalen Peptiden aus einem Gemisch aus Peptiden, das aus dem enzymatischen Aufschluss eines Proteingemisches resultiert, umfasst. Üblicherweise beinhaltet das Verfahren ein enzymatisches Aufschließen eines komplexen Proteingemischs zu einem Gemisch aus Peptiden, ein Trennen der terminalen Peptide von den nicht-terminalen Peptiden in dem Gemisch, und ein Charakterisieren der terminalen Peptide anhand herkömmli cher Verfahren wie z. B. 2D-Säulentrennungen gekoppelt mit MS. Informationen, die aus der Charakterisierung der terminalen Peptide gewonnen werden, können mit Datenbanken, die Proteincharakterisierungsdaten umfassen, verglichen werden, um ein gegebenes terminales Peptid mit einem gegebenen Protein zu korrelieren.
Bei einer Variation von Footes Verfahren umfasst der Schritt des Trennens terminaler Peptide von nicht-terminalen Peptiden in dem Trypsinaufschluss ein Inberührungbringen des Gemischs aus terminalen und nicht-terminalen Peptiden mit immobilisiertem Anhydrotrypsin, einer katalytisch inaktiven Form von Trypsin, die sich an Peptide bindet, die einen Arginin- oder Lysinrest an dem C-Terminus aufweisen. Eine Einschränkung dieses Verfahrens besteht darin, dass nicht alle Proteine erfasst werden können. Genauer gesagt sind Proteine, die ein C-terminales Lysin oder Arginin aufweisen, nicht vertreten, da ihr entsprechendes C-terminales Peptid an den Anhydrotrypsin-Träger gebunden bleibt, zusammen mit den nicht-terminalen Peptiden. Ein Isolieren und Charakterisieren der C-terminalen Peptide von Proteinen, die ein Arginin oder Lysin an dem C-Terminus aufweisen, erfordert ein zusätzliches Experiment, bei dem ein Enzym verwendet wird, das an diesen Resten nicht spaltet. Eine weitere Einschränkung besteht darin, dass eine Anhydrotrypsin-Trennung die Verwendung von Trypsin als ortsspezifische Protease, um das Peptidgemisch zu erzeugen, impliziert. Eine Anhydrotrypsin-Säulentrennung ist nicht auf Peptidgemische anwendbar, die aus einer Fragmentierung resultieren, die mit anderen Proteasen (oder chemischen Reagenzien) bewirkt wird, die nicht auf der Carboxylseite von Arginin- und/oder Lysinresten spalten.
Bei einer anderen Variation von Footes Verfahren können nicht-terminale Peptide anhand einer Biotinylierung der nicht-terminalen Peptide, auf die eine Immobilisierung an einer Avidin- oder Steptavidin-Affinitätssäule folgt, von den gewünschten terminalen Peptiden getrennt werden. Alter nativ dazu können die N- oder C-Termini von Proteinen in der Probe biotinyliert werden, und die N- oder C-terminalen Peptide können nach der Fragmentierung an einer Avidin- oder Steptavidin-Affinitätssäule isoliert werden. Jedoch können anhand dieses alternativen Verfahrens keine Proteine erfasst werden, die an dem N- oder C-Terminus auf natürliche Weise blockiert werden. Außerdem ist die Biotinylierungsreaktion bezüglich des N-terminalen Amins oder des C-terminalen Carboxyls wahrscheinlich nicht vollständig selektiv, und an Seitenkettenamino- oder -carboxylgruppen kann eine Biotinylierung erfolgen. Da die Biotin/Avidin- oder Streptavidin-Wechselwirkung nicht zu 100% spezifisch ist, ist außerdem eine vollkommene Trennung von terminalen und nicht-terminalen Peptiden anhand der Biotin/Avidin-Affinitätschromatographie nicht wahrscheinlich. Vielmehr tritt wahrscheinlich eine Verunreinigung von terminalen Peptiden mit nicht-terminalen Peptiden auf. Außerdem ist Biotin eine große funktionelle Gruppe und kann zu Interpretationsproblemen bei der Analysestufe (z. B. MS) führen.
Die vorliegende Erfindung wendet sich diesen Einschränkungen zu und offenbart ein neues und verbessertes System zum Reduzieren der Komplexität einer proteomischen Probe, wobei sie gleichzeitig eine Identifizierung einzelner Proteine in der Probe ermöglicht. Der erfindungsgemäße chemische Ansatz weist einen breiten Anwendungsumfang auf und kann auf Gemische von in der Natur vorkommenden Proteinen oder Peptiden sowie auf Gemische von Proteinen oder Peptiden, die aus rekombinanten oder synthetischen Verfahren stammen, angewendet werden.
Das System verringert die Analyse der ursprünglichen proteomischen Probe auf die eines einzigen Peptids pro Protein in der ursprünglichen Probe, wobei jedes Peptid von dem N-Terminus (oder C-Terminus) von in der Probe vorliegenden Proteinen stammt. Diese 1:1 betragende Stöchiometrie von Peptid zu Mutterprotein ermöglicht eine unkomplizierte Charakterisierung und/oder quantitative Bestimmung von Protei nen in proteomischen Proben (z. B. quantitative Bestimmung von zellularen Genexpressionsniveaus). Wenn er mit hinreichend bekannten Massenspektrometrie-Verfahren und Systemen einer computergestützten Datenbanksuche kombiniert wird, ermöglicht der erfindungsgemäße Ansatz einer Terminales-Peptid-Auswahl eine Identifizierung von Proteinen in der Probe anhand einer Charakterisierung eines einzigen N- oder C-terminalen Peptids, das für jedes Protein erzeugt wird. In der Technik bekannte Verfahren können angewendet werden, um Proteine in einer Probe aus den Sequenzen von N-terminalen oder C-terminalen Peptiden zu identifizieren, die anhand eines chemischen oder enzymatischen Mittels für jedes Protein erzeugt wurden. Somit liefert die vorliegende Erfindung ein effizientes System zum Identifizieren individueller Proteine in einem komplexen Gemisch durch ein Reduzieren des analytischen Schrittes auf die Charakterisierung eines einzigen Peptids pro Protein.
Lösungsatz einer Auswahl von N- oder C-terminalen Peptiden
Bezüglich eines Aspekts umfasst die Erfindung Verfahren zum Reduzieren der Komplexität einer proteomischen Probe. Bei bestimmten Ausführungsbeispielen umfasst das erfindungsgemäße Verfahren ein (i) Bereitstellen eines oder mehrerer Proteine; (ii) Schützen der N- oder C-Termini des Proteins mit einem geeigneten Schutzmittel; (iii) Spalten der terminal geschützten Proteine mit einem geeigneten Spaltungsmittel, wodurch ein Gemisch aus terminal geschützten Peptiden und nicht-terminal geschützten Peptiden, die freie Amino- und Carboxylgruppen aufweisen, die den Spaltungsstellen entsprechen, erzeugt wird; und (iv) Trennen der terminal geschützten Peptide von dem Peptidgemisch, wodurch die Probenkomplexität auf ein terminales Peptid pro Probenprotein reduziert wird.
Bei bestimmten Ausführungsbeispielen umfasst das Schutzmittel keine Affinitätsmarkierung. Bei bestimmten anderen Aus führungsbeispielen beinhaltet der Schritt des Trennens der terminal geschützten Peptide von dem Gemisch keine Affinitätschromatographie (z. B. Biotin/Avidin-Affinitätschromatographie).
Bei bestimmten Ausführungsbeispielen umfasst bei dem Schritt des Schützens der Protein-N- oder -C-Termini mit einem geeigneten Schutzmittel das Schutzmittel eine Radiomarkierung, eine fluoreszente Markierung, eine kolorimetrische Markierung oder eine isotope Markierung.
Bei bestimmten Ausführungsbeispielen werden bei dem Schritt des Schützens der Protein-N- oder -C-Termini mit einem geeigneten Schutzmittel Seitenkettenamino- oder -carboxylgruppen gleichzeitig geschützt. Bei bestimmten anderen Ausführungsbeispielen werden Seitenkettenamino- oder -carboxylgruppen mit einem geeigneten sekundären Schutzmittel geschützt. Bei bestimmten exemplarischen Ausführungsbeispielen werden bei einer Verwendung des erfindungsgemäßen Ansatzes einer Auswahl von N-terminalen Peptiden die Protein-Lysinreste vorzugsweise und vor dem Protein-N-terminalen Schutz selektiv mit einem geeigneten sekundären Schutzmittel geschützt, ohne die Fähigkeit der Proteine, mittels lysinspezifischer Proteasen (z. B. Trypsin) enzymatisch gespalten zu werden, zu beeinflussen. Beispiele derartiger zweiter Schutzmittel umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, O-Methylisoharnstoff oder O-Methylimidazol und seine chemischen Derivate (z. B. substituiertes O-Methylimidazol). In der Technik ist bekannt, dass diese Reagenzien selektiv mit Lysinresten reagieren und diese schützen, ohne freie N-terminale Aminogruppen zu beeinflussen, um lysingeschützte Proteine zu erzeugen, die mittels Trypsin spaltbar sind (siehe beispielsweise Beardsley et al., „Enhancing the intensities of lysine-terminated tryptic Peptide ions in matrix-assisted laser desorption/ionization spectrometry", Rapid Commun. Mass Spectrom., 14: 2147–2153, 2000; und Peters et al., „A novel multifunctional labeling agent for enhanced Protein characterization with mass spectrometry", Rapid Commun. Mass Spectrom., 15: 2387–2392, 2001).
Bei einem Ausführungsbeispiel stützt sich das Verfahren der vorliegenden Erfindung auf die Charakterisierung eines einzigen N-terminal geschützten Peptids für jedes Protein in der Probe, und es umfasst folgende Schritte: (i) Bereitstellen eines oder mehrerer Proteine; (ii) Schützen der Protein-N-terminalen Aminogruppen mit einem geeigneten Schutzmittel; (iii) Spalten der N-terminal geschützten Proteine mit einem geeigneten Spaltungsmittel, wodurch ein Gemisch aus N-terminal geschützten Peptiden und nicht-N-terminal geschützten Peptiden, die freie Amino- und Carboxylgruppen aufweisen, die den Spaltungsstellen entsprechen, erzeugt wird; und (iv) Trennen der N-terminal geschützten Peptide von dem Peptidgemisch, wodurch die Probenkomplexität auf ein N-terminales Peptid pro Probenprotein reduziert wird.
Bei einem anderen Ausführungsbeispiel stützt sich das erfindungsgemäße Verfahren auf die Charakterisierung eines einzigen C-terminal geschützten Peptids für jedes Protein in der Probe, und es weist die folgenden Schritte auf: (i) Bereitstellen eines oder mehrerer Proteine; (ii) Schützen der Protein-C-terminalen Carboxylgruppen mit einem geeigneten Schutzmittel; (iii) Spalten der C-terminal geschützten Proteine mit einem geeigneten Spaltungsmittel, wodurch ein Gemisch aus C-terminal geschützten Peptiden und Peptiden, die freie Amino- und Carboxylgruppen aufweisen, die den Spaltungsstellen entsprechen, erzeugt wird; und (iv) Trennen der C-terminal geschützten Peptide von dem Peptidgemisch, wodurch die Probenkomplexität auf ein C-terminales Peptid pro Probenprotein reduziert wird.
Bei exemplarischen Ausführungsbeispielen reagiert das Schutzmittel selektiv in einer guten Ausbeute, um ein N- oder C-terminal geschütztes Protein zu liefern, das gegenüber den geplanten Reaktionen oder experimentellen Bedin gungen stabil ist. Vorzugsweise, jedoch nicht notwendigerweise wird das Schutzmittel so ausgewählt, dass es durch ohne weiteres erhältliche, vorzugsweise nicht-toxische Reagenzien, die die anderen funktionellen Gruppen nicht angreifen, in einer guten Ausbeute selektiv beseitigt werden kann. Vorzugsweise, jedoch nicht notwendigerweise weist das Schutzmittel ein Mindestmaß einer zusätzlichen Funktionalität auf, um weitere Reaktionsstellen zu vermeiden.
Bei bestimmten exemplarischen Ausführungsbeispielen ist das Schutzmittel ein Aminschutzmittel. Beispiele von geeigneten Aminschutzmitteln umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, diejenigen, die zur Entstehung von Carbamaten (einschließlich Methyl, Ethyl, tert-Butyl (z. B. Boc) und 9-Fluorenylmethylcarbamaten (z. B. Fmoc), um einige zu nennen), Amiden, zyklisches-Imid-Derivaten, N-Alkyl- und N-Aryl-Aminen, Iminderivaten und Enaminderivaten, um einige zu nennen, führen. Bei bestimmten exemplarischen Ausführungsbeispielen ist das Schutzmittel Essigsäureanhydrid, di-tert-Butyldicarbonat (d. h. Boc-Anhydrid) oder 9-Fluorenylmethoxycarbonyl-Reagens (d. h. Fmoc-Reagens), das auf eine Reaktion mit einem reaktiven freien Amin hin ein 9-Fluorenylmethoxycarbamat erzeugt. Beispiele von Fmoc-Reagenzien, die zum Praktizieren der Erfindung geeignet sind, umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, Fmoc-Cl, Fmoc-N₃, Fmoc-OBt (Bt = Benzotriazol-1-yl), Fmoc-OSu (Su = Succinimidyl) und Fmoc-OC₆F₅.
Bei bestimmten Ausführungsbeispielen ist das Schutzmittel ein Carboxylschutzmittel. Beispiele von geeigneten Schutzmitteln umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, diejenigen, die zur Bildung von Carboxylestern (beispielsweise Methanol oder anderem niederen aliphatischen oder alizyklischen Alkohol, Diazomethan, MeI, Me₃SiCHN₂, Me₂C(OMe)₂, CH₃OCH₂Cl, CH₃SCH₂Cl, Dihydropyran, CH₃₀CH₂CH₂OCH₂Cl, PhCH₂OCH₂Cl, Me₃SiCl, Et₃SiCl, Me₂PhSiCl), Amiden (beispielsweise Methylamin, Ethylamin, Me₂NH, Pyrrolidin, Piperidin) und Hydrazid-(beispielsweise Phenylhydrazin- )Derivaten, um einige zu nennen, führen. Die Erzeugung von Carboxylesterderivaten kann eine (i) Carboxylat-Aktivierung mit einer guten Abgangsgruppe, gefolgt von einer Substitution mit einem geeigneten Nucleophil oder (ii) eine nucleophile Substitution des Carboxylats an einem Alkylhalid oder Sulfonat beinhalten. Bei bestimmten exemplarischen Ausführungsbeispielen ist das Schutzmittel Methyliodid. Bei anderen Ausführungsbeispielen beinhaltet der Schutz der Protein-C-Termini eine Carbodiimid-Aktivierung vor einer Reaktion mit einem geeigneten Schutzmittel. Beispielsweise ist ein Schutzmittel, das zur Reaktion mit einer Carbodiimid-aktivierten Carboxylgruppe geeignet ist, ein aliphatisches Amin. Bei bestimmten Ausführungsbeispielen ist das aliphatische Amin Methylamin oder Ethylamin.
Man wird erkennen, dass die vorliegende Erfindung nicht auf die hierin beschriebenen Schutzmittel beschränkt sein soll; vielmehr kann unter Verwendung der obigen Kriterien eine Vielzahl zusätzlicher äquivalenter Schutzgruppen ohne weiteres identifiziert und bei der vorliegenden Erfindung verwendet werden, wie hierin angegeben ist. Außerdem ist eine Vielzahl von Schutzgruppen bei „Protecting groups in Organic Synthesis" Third Ed. Greene, T. W. und Wuts, P. G., Eds., John Wiley & Sons, New York: 1999, beschrieben.
Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung ist ein Spaltungsmittel ein beliebiges Reagens, das ein Protein unter geeigneten Bedingungen in zwei oder mehr Fragmente umwandelt. Vorzugsweise ist das Spaltungsmittel eines, das die Hauptkette des Polypeptids spaltet. Peptide, die anhand einer Proteinspaltung erzeugt werden, weisen üblicherweise eine Länge von etwa 1 bis etwa 50 Aminosäureresten auf und sind stärker bevorzugt größenmäßig so ausgelegt, eine Peptidsequenzierung unter Verwendung von tandemmassenspektrometrischen Verfahren zu ermöglichen. Stärker bevorzugt weisen die Peptide eine Größe zwischen etwa 5 und 50 Aminosäuren auf. Am stärksten bevorzugt weisen die Peptide eine Größe zwischen etwa 5 und 20 Aminosäuren auf. Proteine kön nen anhand vieler Verfahren, einschließlich z. B. chemischer Verfahren oder enzymatischer Verfahren, oder einer Kombination der beiden, ohne weiteres in bevorzugte Längen gespalten werden. Repräsentative chemische Verbindungen, die zum Spalten von Proteinen verwendet werden können, umfassen Cyanbromid (CNBr), 2-Nitro-5-thiocyanbenzoesäure, N-Bromsuccinamid und andere reaktive Halogenverbindungen, Hydroxylamin, 1-2M-Ameisen- oder -Essigsäure, Periodatoxidation, 2-(2-Nitrophenylsulfenyl)-3-methyl-3-bromindolenin oder o-Iodosobenzoesäure. Repräsentative Enzyme umfassen beispielsweise Trypsin, Chymotrypsin, Pepsin, Papain, Prolinendopeptidase, Staph.-Protease, Elastase, Protease K, AspN, Lys-C, Arg-C und Glu-C. Bei bestimmten exemplarischen Ausführungsbeispielen ist das Spaltungsmittel ein Enzym. Am stärksten bevorzugt ist das Enzym Trypsin, das Proteine an dem C-terminalen Ende vieler Lysine und Arginine spaltet. Proteine können unter Verwendung beliebiger geeigneter Verfahren, die in der Technik bekannt sind, aufgeschlossen werden. Fachleute können ein Proteinaufschlussprotokoll auswählen, das zur Verwendung bei den interessierenden Proteinproben geeignet ist.
1. Trennung von gewünschten N- oder C-terminalen Peptiden anhand einer Immobilisierung von nicht-terminalen Peptiden auf einem festen Träger
Bei bestimmten Ausführungsbeispielen umfasst der Trennungsschritt des erfindungsgemäßen Verfahrens: (i) selektives Immobilisieren der nicht-terminal geschützten Peptide auf einem festen Träger; (ii) Waschen des festen Trägers mit einem geeigneten Lösungsmittel; und (iii) Auffangen derjenigen Lösungsmittelfraktionen, die die terminal geschützten Peptide enthalten.
Bei exemplarischen Ausführungsbeispielen, wenn der Ansatz einer Auswahl von N-terminalen Peptiden verwendet wird, wird eine Trennung der N-terminal geschützten Peptide von dem Gemisch dadurch bewerkstelligt, dass die Peptide, die eine reaktive freie Aminogruppe enthalten (d. h. nicht-N-terminal geschützte Peptide) durch einen Linker direkt oder indirekt auf einem festen Träger immobilisiert werden, der feste Träger mit einem geeigneten Lösungsmittel gewaschen wird und die Lösungsmittelfraktionen, die die gewünschten N-terminal geschützten Peptide enthalten, aufgefangen werden.
Bei einem Ausführungsbeispiel umfasst der feste Träger reaktive Gruppen, die eine kovalente Bindung mit freien Aminogruppen eingehen können und somit nicht-N-terminal geschützte Peptide, die in dem Gemisch vorliegen, immobilisieren können. Somit wird eine Trennung der gewünschten N-terminal geschützten Peptide von dem Gemisch durch ein Immobilisieren der nicht-N-terminal geschützten Peptide auf dem festen Träger bewirkt.
Bei bestimmten anderen Ausführungsbeispielen, wenn der Ansatz einer Auswahl von C-terminalen Peptiden verwendet wird, wird eine Trennung der C-terminal geschützten Peptide von dem Gemisch dadurch bewerkstelligt, dass die Peptide, die eine freie Carboxylgruppe enthalten, direkt oder indirekt durch einen Linker auf einem festen Träger immobilisiert werden, der feste Träger mit einem geeigneten Lösungsmittel gewaschen wird und diejenigen Lösungsmittelfraktionen, die die gewünschten C-terminal geschützten Peptide enthalten, aufgefangen werden. Bei einem Ausführungsbeispiel umfasst der feste Träger reaktive Gruppen, die mit den freien Peptid-Carboxylgruppen eine kovalente Bindung eingehen können.
Bei einem Ausführungsbeispiel umfasst der feste Träger reaktive Gruppen, die mit freien Carboxylgruppen eine kovalente Bindung eingehen können und somit nicht-C-terminal geschützte Peptide, die in dem Gemisch vorliegen, immobilisieren können. Vorzugsweise, jedoch nicht notwendigerweise wird die freie Carboxylgruppe eines nicht-C-terminalen Pep tids vor der Immobilisierung auf dem festen Träger mit einem Carbodiimid-Reagens aktiviert. Somit wird eine Trennung der gewünschten C-terminal geschützten Peptide von dem Gemisch bewirkt, indem die nicht-C-terminal geschützten Peptide auf dem festen Träger immobilisiert werden.
Eine Vielzahl von funktionalisierten Feststoffphasenmaterialien, die reaktive Gruppen aufweisen, die mit freien Aminogruppen oder freien Carboxylgruppen reagieren können (zur Immobilisierung von unerwünschten nicht-N-terminalen bzw. nicht-C-terminalen Peptiden), sind von Chemikalienlieferanten ohne weiteres erhältlich. Beispielsweise bietet novaBiochem eine große Vielzahl an funktionalisierten Harzen, die diese Kriterien erfüllen. Beispielsweise können zum Immobilisieren von nicht-N-terminalen Peptiden Br-, Cl-, Carbonat-, CHO- oder CO₂H-Harze verwendet werden. Ein exemplarisches Feststoffphasenmaterial ist eine mit Diisocyanat (DITC) modifizierte Feststoffphasenoberfläche. Alternativ dazu können zum Immobilisieren von nicht-C-terminalen Peptiden NH₂-, OH- oder SH-Harze verwendet werden. Fachleuten werden ohne weiteres andere geeignete Feststoffphasenmaterialien einleuchten. Fachleute werden erkennen, dass die Feststoffphasenmaterialien, die zum Praktizieren der Erfindung verwendet werden können, nicht auf die hierin beschriebenen beschränkt sind. Vielmehr kann jegliches Feststoffphasenmaterial, das in der Technik verfügbar ist, in dem Maße verwendet werden, dass es nicht mit den Lehren der Erfindung unkompatibel ist.
Bei bestimmten Ausführungsbeispielen, bei denen eine weitere Analyse der nicht-N-terminalen Peptide gewünscht wird, kann deren Freisetzung aus dem festen Träger unter geeigneten Bedingungen bewerkstelligt werden. Dort, wo beispielsweise ein DITC-modifizierter fester Träger verwendet wird, kann eine Freisetzung der nicht-N-terminalen Peptide aus dem festen Träger dadurch bewerkstelligt werden, dass der feste Träger mit einer starken wasserfreien Säure wie z. B. Trifluoressigsäure (TFA – trifluoroacetic acid), Salzsäure (HCl – hydrochloric acid) oder Heptafluorbutansäure (HFBA – heptafluorobutanoic acid) in Berührung gebracht wird.
2. Trennung der gewünschten N- oder C-terminalen Peptide durch Immobilisierung auf einem festen Träger
Bei bestimmten Ausführungsbeispielen umfasst der Trennungsschritt des erfindungsgemäßen Verfahrens: ein (i) selektives Immobilisieren der terminal geschützten Peptide auf einem festen Träger; (ii) Waschen des festen Trägers mit einem geeigneten Lösungsmittel, um Peptide zu beseitigen, die nicht kovalent an den festen Träger angelagert sind; und (iii) Freisetzen der terminal geschützten Peptide aus dem festen Träger.
Bei einem anderen Ausführungsbeispiel umfasst die Schutzgruppe, die zum Schützen der Protein-N- oder -C-Termini in der interessierenden Probe verwendet wird, eine reaktive Gruppe oder eine latente reaktive Gruppe, die durch einen Linker direkt oder indirekt eine kovalente Bindung mit einem festen Träger eingehen kann (oder dazu gebracht werden kann, eine solche einzugehen). Somit wird eine Trennung der gewünschten terminal geschützten Peptide von dem Gemisch dadurch bewirkt, dass sie auf dem festen Träger immobilisiert werden. Die unerwünschten Peptide können unter Verwendung eines geeigneten Lösungsmittels aus dem festen Träger weggewaschen werden, und die terminal geschützten Peptide können freigesetzt werden, indem der feste Träger mit einem geeigneten Freisetzungsmittel in Berührung gebracht wird.
Vorzugsweise verwendet die an der Immobilisierung der terminal geschützten Peptide durch die N- oder C-terminale Schutzgruppe beteiligte Chemie keine Amin- oder Carboxylchemie. Somit sollten freie Aminogruppen und Carboxylgruppen allgemein nicht durch die Immobilisierungsbedingungen beeinflusst werden, und/oder sie gehen keine kovalenten Bindungen mit den reaktiven Gruppen des festen Trägers ein.
Proteinidentifikation
Bezüglich eines weiteren Aspekts umfasst die Erfindung Verfahren zum Identifizieren von Proteinen in einer proteomischen Probe. Bei bestimmten Ausführungsbeispielen umfasst das erfindungsgemäße Verfahren ein (i) Bereitstellen eines oder mehrerer Proteine; (ii) Schützen der terminalen Protein-Aminogruppen mit einem geeigneten Schutzmittel; (iii) Spalten der terminal geschützten Proteine mit einem geeigneten Spaltungsmittel, wodurch ein Gemisch aus terminal geschützten Peptiden und Peptiden, die freie Amino- und Carboxylgruppen aufweisen, die den Spaltungsstellen entsprechen, erzeugt wird; (iv) Trennen der terminal geschützten Peptide von dem Peptidgemisch, wodurch die Probenkomplexität auf ein terminales Peptid pro Probenprotein reduziert wird; und (v) Erfassen der terminal geschützten Peptide.
Bei bestimmten Ausführungsbeispielen werden die Schritte (ii)–(iv) gemäß den oben beschriebenen Verfahren zur Auswahl von N- oder C-terminalen Peptiden ausgeführt.
Bei einem Ausführungsbeispiel werden die oben beschriebenen Verfahren mit einer massenspektrometrischen Technik zum Charakterisieren von N-terminal oder C-terminal geschützten Peptiden und zum Identifizieren der Proteine in der Probe, von denen die N-terminal oder C-terminal geschützten Peptide stammten, kombiniert. Bei bestimmten Ausführungsbeispielen verwendet der Schritt des Erfassens eine massenspektrometrische Technik. Bei einem Ausführungsbeispiel ist die massenspektrometrische Technik Tandemmassenspektrometrie, und die Terminal-Geschütztes-Peptid-MS-Fragmentierungsmuster werden dazu verwendet, verfügbare Datenbanken zu durchsuchen, um die Aminosäuresequenz der terminalen Peptide zu ermitteln. Bei bestimmten anderen Ausführungsbeispie len werden die Aminosäuresequenzinformationen dazu verwendet, Proteindatenbanken zu durchsuchen, um die Mutterproteine, von denen die terminalen Peptide stammen können, zu identifizieren. Bei einem anderen Ausführungsbeispiel wird die massenspektrometrische Technik mit einer Trennungstechnik wie z. B. Hochdruck-Flüssigchromatographie (HPLC), Gelelektrophorese oder Kapillarelektrophorese (CE) gekoppelt, und das Gemisch aus N-terminal oder C-terminal geschützten Peptiden wird vor der MS-Analyse einem Trennungsschritt unterzogen.
Allgemeine Überlegungen hinsichtlich Verfahren zur Peptidimmobilisierung
Bei bestimmten Ausführungsbeispielen können Peptide (entweder terminale oder nicht-terminale, je nachdem, welcher Peptidtrennungsansatz verwendet wird) durch eine kovalente Bindung an einen festen Träger entweder direkt (wie oben beschrieben) oder indirekt durch einen Linker von dem Chemische- und/oder Enzymatische-Proteinspaltung-Gemisch getrennt werden. Beispielsweise kann ein fester Träger vor der Immobilisierung der beabsichtigten Peptide chemisch modifiziert werden, indem er mit einem Linker, der zwei reaktive Gruppen aufweist, zur Reaktion gebracht wird. Eine der reaktiven Gruppen ist derart, dass sie mit den auf dem festen Träger vorhandenen reaktiven Gruppen eine kovalente Bindung eingehen kann. Die zweite reaktive Gruppe an dem Linkeranteil ist derart, dass sie mit einer vorbestimmten Funktionalität, die an den zu immobilisierenden Peptiden vorliegt, eine kovalente Bindung eingehen kann. Alternativ dazu können die Peptide vor der Immobilisierung auf dem festen Träger mit dem Linker zur Reaktion gebracht werden, und das Peptid/Linker-Konjugat kann anschließend anhand einer Reaktion der übrigen reaktiven Gruppe an dem Linker mit den auf der Oberfläche des festen Trägers vorhandenen reaktiven Gruppen auf dem festen Träger immobilisiert werden.
Vorzugsweise ist der Linkeranteil im Wesentlichen chemisch inert (z. B. stört nachfolgende chemische Reaktionen minimal). Wenn er in dem zu analysierenden terminalen Peptid oder in der zu analysierenden Peptidlösung vorliegt, stört der Linkeranteil vorzugsweise die Massenspektralanalyse und das Sequenzieren der Peptide anhand von tandemmassenspektrometrischen Verfahren nicht beträchtlich. Beispielsweise wird der Linkeranteil vorzugsweise während der massenspektrometrischen Analyse minimal ionisiert und erfährt vorzugsweise keine peptidähnliche Fragmentierung. Wenn er in dem zu analysierenden terminalen Peptid vorliegt, unterdrückt er vorzugsweise die Ionisation der Peptide nicht beträchtlich. Am stärksten bevorzugt umfasst der Linker funktionelle Gruppen oder Anteile, die eine Ionisation der Peptide, die ihn enthalten, erleichtert. Beispiele von Funktionalitäten, die zum Verbessern der Ionisation geeignet sind, umfassen säurehaltige Gruppen (z. B. COOH), basische Gruppen (z. B. Aminogruppen) oder geladene Gruppen (z. B. Ammonium- oder Phosphoniumgruppen). Bei exemplarischen Ausführungsbeispielen ist der Linkeranteil chemisch, photochemisch oder enzymatisch spaltbar. Photolabile Linker sind in der Technik hinreichend bekannt und umfassen beispielsweise diejenigen, die einen o-Nitrobenzylanteil aufweisen (siehe beispielsweise www.innovachem.com/Reference.htm). Siehe auch Garigipati et al., „Photolytically cleavable encoding and linking agents for use in combinatorial chemistry", US-Patentschrift Nr. 6,075,166 . Spaltbare Linker umfassen ferner Anteile, die Disulfidbindungen und säure- oder basenlabile Gruppen umfassen (beispielsweise Silylether, Carbamate und Thioester, um einige zu nennen). Beispiele von enzymatisch spaltbaren Linkern finden sich bei Lebl et al., „Topologically segregated, encoded solid Phase libraries comprising linkers having an enzymatically susceptible bond", US-Patentschrift Nr. 6,090,912 .
Bei bestimmten Ausführungsbeispielen, bei denen eine Trennung der gewünschten N- oder C-terminalen Peptide durch ei ne Immobilisierung (von terminalen oder nicht-terminalen Peptiden) auf einem festen Träger bewirkt wird, kann ein Waschen der ungebundenen Peptide aus der Oberfläche des festen Trägers erwünscht sein. Vorzugsweise wird das Waschlösungsmittel so ausgewählt, dass es mit der Bindung (Verkettung), die die Peptide auf den festen Träger immobilisiert, kompatibel ist und nicht die Freisetzung der gebundenen Peptide aus dem festen Träger bewirkt. Vorzugsweise sollte die Bindung (Verkettung) zwischen gebundenen Peptiden und der Oberfläche des festen Trägers ausgedehnten und zahlreichen Waschvorgängen mit einer Vielzahl von Lösungsmitteln bei geringem oder gänzlich fehlendem „Ausbluten" der gebundenen Peptide aus dem festen Träger standhalten (z. B. ist die Bindung (Verkettung) Peptid/fester Träger im Wesentlichen gegenüber mehreren Lösungsmittelwaschvorgängen stabil). Fachleuten wird einleuchten, wie ein geeignetes Lösungsmittel in Abhängigkeit von der chemischen Beschaffenheit der Bindung (Verkettung) zwischen den nicht-terminalen Peptiden und dem festen Träger auszuwählen ist.
Bei bestimmten Ausführungsbeispielen kann eine Freisetzung gebundener Peptide aus dem festen Träger erwünscht sein, und die Peptidfreisetzung wird mit einem geeigneten Freisetzungsmittel erzielt. Die Auswahl des Freisetzungsmittels hängt von der chemischen Beschaffenheit der Bindung (Verkettung) zwischen den Peptiden und dem festen Träger ab. Vorzugsweise, jedoch nicht notwendigerweise werden das Freisetzungsmittel und/oder die Bedingungen, die zum Bewirken einer Freisetzung der Peptide aus dem festen Träger verwendet werden, so ausgewählt, dass jegliche Modifikationen der Peptide, die auf eine Freisetzung aus dem festen Träger hin zurückgehalten werden, eine Massenspektralanalyse und Sequenzierung des Peptids anhand von tandemmassenspektrometrischen Verfahren nicht beträchtlich stören. Bei bestimmten Ausführungsbeispielen sind das Freisetzungsmittel und/oder die Bedingungen, die zum Bewirken einer Freisetzung der Peptide aus dem festen Träger verwendet werden, so ausgewählt, dass jegliche Modifikationen an den Peptiden, die auf eine Freisetzung aus dem festen Träger hin zurückgehalten werden, eine Ionisation der Peptide erleichtern. Beispiele von geeigneten Modifikationen sind hierin beschrieben und werden Fachleuten ohne weiteres einleuchten.
Wenn die Peptide beispielsweise terminale Peptide sind, die kovalent an den festen Träger gebunden sind, ist das Freisetzungsmittel vorzugsweise, jedoch nicht notwendigerweise so ausgewählt, dass es die Freisetzung der terminalen Peptide aus dem festen Träger bewirkt, wodurch die N- oder C-terminale Schutzgruppe an den Peptiden zurückgehalten wird. Alternativ dazu setzt das Freisetzungsmittel gleichzeitig die terminalen Peptide aus dem festen Träger frei und bewirkt die Beseitigung der Schutzgruppe an dem Terminus der gewünschten Peptide. Analog dazu gilt, dass dort, wo die terminalen Peptide indirekt durch einen Linker kovalent auf dem festen Träger immobilisiert werden, das Freisetzungsmittel so gewählt werden kann, dass es die Freisetzung der terminalen Peptide aus dem festen Träger dort bewirkt, wo sowohl die terminale Schutzgruppe als auch der Linker an den Peptiden zurückgehalten werden. Alternativ dazu kann das Freisetzungsmittel so gewählt werden, dass es die Freisetzung der terminalen Peptide aus dem festen Träger dort, wo lediglich die terminale Schutzgruppe an den Peptiden zurückgehalten wird (der Linkeranteil von den Peptiden abgespalten wird), bewirkt. Alternativ dazu kann das Freisetzungsmittel so gewählt werden, dass es gleichzeitig die terminalen Peptide aus dem festen Träger freisetzt und die Beseitigung der Schutzgruppe an dem Terminus (somit auch dem Linker) der gewünschten Peptide bewirkt. Fachleute wissen, wie das Freisetzungsmittel zu wählen ist, um die gewünschte Spaltungsreaktion zu bewirken.
Vorzugsweise sind chemische Transformationen von Peptiden, die für den speziellen Zweck des Trennens von terminal geschützten Peptiden von nicht-terminal geschützten Peptiden durchgeführt werden, mit der Chemie, die an dem Trennungs vorgang beteiligt ist, kompatibel. Wenn beispielsweise eine Trennung von N-terminal geschützten Peptiden mittels einer Immobilisierung der entsprechenden nicht-N-terminal geschützten Peptide beabsichtigt ist, sind chemische Transformationen an der freien Aminogruppe der nicht-N-terminalen Peptide für eine Immobilisierung auf einem festen Träger, entweder direkt oder indirekt durch einen Linker, mit der N-terminalen Schutzgruppe an den gewünschten N-terminalen Peptiden kompatibel und ändern dieselbe nicht. Vorzugsweise, aber nicht notwendigerweise sind die chemischen Transformationen, die an der reaktiven freien Aminogruppe der nicht-N-terminalen Peptide zur Immobilisierung auf einem festen Träger, entweder direkt oder indirekt durch einen Linker, durchgeführt werden, mit der freien Carboxylgruppe an dem C-Terminus der gewünschten N-terminalen Peptide kompatibel und ändern dieselbe nicht. Alternativ dazu kann der freie C-terminale Carboxylanteil der Peptide in dem Gemisch vor jeglicher Transformation der freien Aminogruppe der unerwünschten Peptide oder im Anschluss an Transformationen der reaktiven freien Aminogruppe der unerwünschten Peptide, jedoch vor der Immobilisierung der unerwünschten nicht-N-terminalen Peptide auf dem festen Träger; mit einem geeigneten Schutzmittel geschützt werden. In der Technik sind eine Vielzahl von Amino- und Carboxylschutzgruppen bekannt, wie sie hierin erwähnt werden, und sie werden für den Leser, der die Erfindung praktizieren möchte, ohne weiteres ersichtlich sein. Vorzugsweise stören chemische Transformationen, die die gewünschten N- oder C-terminalen Peptide vor, während oder nach der Trennung von dem Probengemisch durchlaufen, die Massenspektralanalyse und Sequenzierung des Peptids mittels tandemmassenspektrometrischer Verfahren nicht beträchtlich.
Fachleuten wird einleuchten, dass die Verfahren, die zum Trennen der N-terminalen oder (C-terminalen) Peptide von dem Peptidgemisch, das sich aus der chemischen oder enzymatischen Fragmentierung der interessierenden proteomischen Probe ergibt, verwendet werden, nicht auf die hierin ange führten beschränkt sind. Vielmehr können beliebige verfügbare Techniken verwendet werden, die dazu geeignet sind, eine Trennung der gewünschten terminalen Peptide von dem Fragmentierungsgemisch zu bewirken.
Massenspektrometrische Verfahren
Bei einem Ausführungsbeispiel wird das oben beschriebene Verfahren zur Auswahl von N- oder C-Peptiden mit einer massenspektrometrischen Technik zum Charakterisieren der N-terminal oder C-terminal geschützten Peptide und zum Identifizieren der Proteine in der Probe, von der die N-terminal oder C-terminal geschützten Peptide stammen, kombiniert. Die isolierten Peptide sind für das Vorliegen eines Proteins in der ursprünglichen Probe charakteristisch. Insbesondere kann die Sequenz von isolierten Peptiden unter Verwendung von Tandem-MS-Techniken ermittelt werden, und durch eine Anwendung von in der Technik bekannten Sequenzdatenbanksuchtechniken kann das Protein, von dem das sequenzierte Peptid stammte, identifiziert werden.
Im Rahmen von Bemühungen, den Stand der Technik, auf den sich die Erfindung bezieht, umfassender zu beschreiben, folgen nun Referenzen, die sich auf die Anwendung von massenspektrometrischen Techniken auf die Proteinidentifizierung und Proteomanalyse beziehen: Akhilesh P. et al., „Proteomics to study genes and genomes", Nature, 405: 837–846, 2000; Dutt M. J. et al., „Proteomic analysis", Curr Opin Biotechnol., 11: 176–179, 2000; Gygi SP, et al., „Mass spectrometry and proteomics", Curr Opin Chem Biol., 4 (5): 489–94, 2000; Gygi SP, et al., Goodlett DR, et al, „Protein identification with a single accurate mass of a cysteinecontaining peptide and constrained database searching", Anal Chem., 72 (6): 1112–8, 2000; Anderson N. L. et al., „Proteomics" applications in basic and applied biology", Curr Opin Biotechnol., 11: 408–412, 2000; und Little et al., US-Patentschrift Nr. 6,322,970 .
Geeignete Massenspektrometrietechniken umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, matrixunterstützte Laser-Desorption/Ionisation in Kombination mit Flugzeit-Massenanalyse (MALDI-TOF-MS; TOF = time of flight = Flugzeit) oder Elektrosprayionisation-Massenspektrometrie (ESI-MS; ESI = electrospray ionization). Siehe beispielsweise Patterson & Aebersold, Electrophoresis, 16: 1791–1814, 1995; und Figeys et al., Anal. Chem., 68: 1822–1828, 1996. Matrixunterstützte Laser-Desorption-Ionisation (MALDI), die in Verbindung mit einem Flugzeit(TOF)-Massenanalysator verwendet wird, birgt auf Grund ihres relativ großen Massenbereichs, ihrer hohen Auflösung (10.000 bei einer Masse von 5.000) und Abtastrate (bis zu 1 Probe/Sekunde) ein großes Potential bezüglich eines Identifizierens von Peptiden in sich. Bezüglich eines Aspekts bietet MALDI insofern einen potentiellen Vorteil gegenüber ESI und FAB, als Biomoleküle einer großen Masse ohne weiteres ionisiert und analysiert werden können. Ferner erzeugt MALDI im Gegensatz zu ESI vorwiegend einfach geladene Spezies. Bei einem Ausführungsbeispiel werden die aus der Proteinprobe erzeugten N-terminalen oder C-terminalen Peptide mittels MALDI-TOF-MS gemäß in der Technik bekannten Verfahren analysiert. Üblicherweise beinhaltet dies ein Bilden einer Matrix auf der Membran mit einem Mittel, das das einfallende Licht bei der jeweiligen verwendeten Wellenlänge stark absorbiert. Die Probe wird durch UV- oder IR-Laserlicht in die Dampfphase in dem MALDI-Massenspektrometer angeregt. Durch die Verdampfung werden Ionen erzeugt, die eine Ionenfahne bilden. Die Ionen werden in einem elektrischen Feld beschleunigt und gemäß der Zeit, die sie zum Zurücklegen einer gegebenen Strecke benötigen, getrennt, was eine Masse/Ladung-Ablesung (m/z-Ablesung) liefert, die sehr sensibel ist.
Die gemäß den Lehren der Erfindung verwendeten Schutzmittel sind vorzugsweise so ausgewählt, dass sie die Massenspektralanalyse und das Sequenzieren des Peptids anhand von tandemmassenspektrometrischen Verfahren nicht beträchtlich stören. Vorzugsweise, jedoch nicht notwendigerweise sind die Schutzmittel so gewählt, dass sie der Analyse wünschenswerte Charakteristika verleihen. Beispiele derartiger Charakteristika umfassen ein Verringern der Laserenergie, die zum Verdunsten des Peptids benötigt wird, Erleichtern der Ionisation, Erzeugen von vorwiegend einfach geladenen Ionen, Verringern der Peakbreite und Erhöhen der Sensibilität und/oder Selektivität des gewünschten Analyseprodukts. Wenn der gewünschte N-Terminus oder C-Terminus der Erfindung anhand einer Immobilisierung auf einem festen Träger über eine kovalente Bindung der Schutzgruppe an den festen Träger, entweder direkt oder indirekt durch einen Linker, isoliert werden, sind die bei diesem Verfahren verwendeten Schutzmittel vorzugsweise so gewählt, dass jegliche Modifikationen des Peptids, die bei einer Freisetzung aus dem festen Träger zurückbehalten werden, die Massenspektralanalyse und Sequenzierung des Peptids anhand von tandemmassenspektrometrischen Verfahren nicht beträchtlich stören.
Ein interessantes Merkmal der MS-Analyse von Peptiden ist die Fähigkeit, verschiedene Arten von strukturellen Informationen über ein bestimmtes interessierendes Peptid zu erzeugen. Beispielsweise kann das Massenspektrometer ohne weiteres Informationen über die Masse eines bestimmten Peptids bereitstellen und kann auch dazu verwendet werden, DeNovo-Aminosäuresequenzinformationen aus Tandemmassenspektren zu erzeugen, die entweder anhand eines Nach-Quellen-Verfalls (postsource decay) oder anhand einer stoßinduzierten Dissoziation erhalten wurden. Siehe beispielsweise End et al., „An Approach to Correlate Tandem Mass Spectral Data of Peptides with Amino Acid Sequences in a Protein Database", J. Am. Soc. Mass Spectrom., 5: 976–989, 1994; Swiderek K. et al. "The identification of peptide modifications derived from gel-separated Proteins using electrospray triple quadrupole and ion trag analyses", Electrophoresis, 19: 989–997, 1998; und Keough T. et al. "A method for high-sensitivity peptide sequencing using postsource decay matrix-assisted laser desorption ionization mass spectrome try", Proc. Natl. Acad. Sci USA, 96: 7131–7136, 1999. Beispielsweise kann eine Peptidsequenzierung mit einer computergestützten Sequenzierungstechnik durchgeführt werden, bei der die Molekularmasse des Peptids anhand von MS genau ermittelt wird. Ein Computer wird dazu verwendet, alle möglichen Kombinationen von Aminosäuren zu ermitteln, die zu der gemessenen Masse des Peptids summiert werden können (Parameter, die auf einen Wasserverlust beim Bilden von Peptidbindungen bezogen sind, Protonierung, andere Faktoren, die die gemessene Masse von Aminosäuren verändern oder die zulässigen Kombinationen von Aminosäuren auf andere Weise beschränken, können in Betracht gezogen werden). Anschließend wird eine Bibliothek aller zulässigen linearen Permutationen von Aminosäuren erstellt. Der Algorithmus kann dann theoretische Fragmentierungsspektren für jedes Teilelement der zulässigen Bibliothek von Permutationen berechnen und sie mit einem anhand von Massenspektrometrie erhältlichen experimentellen Fragmentierungsspektrum des unbekannten Peptids vergleichen. Das theoretische Fragmentierungsspektrum, das am besten zu dem, experimentellen Fragmentierungsmuster passt, offenbart die Aminosäuresequenz des unbekannten Peptids.
Bei einem Ausführungsbeispiel ist die massenspektrometrische Technik Tandemmassenspektrometrie, und die Aminosäuresequenz der N-terminal oder C-terminal geschützten Peptide wird ermittelt. Üblicherweise wird ein beliebiges gegebenes Peptid, das in das Tandemmassenspektrometer eintritt, ausgewählt und einer stoßinduzierten Dissoziation (CID – collision induced dissoziation) unterzogen. Die Spektren eines resultierenden Fragmentions werden in der zweiten Stufe der Massenspektrometrie als so genanntes CID-Spektrum aufgezeichnet. Dieser Vorgang wird mit anderen (idealerweise allen) in der Probe vorliegenden Peptiden wiederholt. Da der CID-Vorgang üblicherweise eine Fragmentierung an Peptidbindungen bewirkt, und verschiedene Aminosäuren größtenteils Spitzen unterschiedlicher Massen ergeben, liefert ein CDI-Spektrum allein oft genügend Informationen, um eine Peptid sequenz zu bestimmen. Alternativ dazu können die Peptide getrennt und gereinigt werden, und ihre Sequenzen können mit einem automatisierten Sequenzer ermittelt werden. Viele Verfahren, die Fachleuten hinreichend bekannt sind, können dazu verwendet werden, die Peptide vor einer Bestimmung ihrer Aminosäuresequenz zu reinigen. Repräsentative Beispiele umfassen Hochdruck-Flüssigchromatographie (HPLC – high pressure liquid chromatography), Umkehrphasen-Hochdruck-Flüssigchromatographie (RP-HPLC – reverse-phase high pressure liquid chromatography), Gelelektrophorese, Kapillarelektrophorse (CE – capillary electrophoresis) oder andere geeignete chromatographische Techniken. Außerdem sind automatisierte Sequenatoren in der Technik bekannt (beispielsweise Applied Biosystems ABI 470). Üblicherweise führt der automatisierte Sequenzer einen Edman-Abbau durch, bei dem die Aminosäuren derivatisiert und sequentiell von dem N-Terminus des Peptids oder Proteins entfernt werden. Die Aminosäurederivate werden anschließend nach der HPLC-Trennung identifiziert, was ermöglicht, dass auf die Aminosäuresequenz des Proteins/Peptids geschlossen wird. In diesem Fall können die N-terminal geschützten Peptide der Erfindung vor der automatisierten Sequenzierung entschützt werden, da der Edman-Abbau nicht erfolgt, wenn der N-terminale Rest des Peptids blockiert ist. Bei exemplarischen Ausführungsbeispielen wird die Tandemmassenspektrometrie dazu verwendet, die Aminosäuresequenz der Peptide zu bestimmen.
Bei einem anderen Ausführungsbeispiel ist die massenspektrometrische Technik direkt oder indirekt mit einer Flüssigchromatographietechnik wie z. B. HPLC, RP-HPLC, CE oder Gelelektrophorese gekoppelt, um die N-terminal oder C-terminal geschützten Peptide vor der MS-Analyse weiter aufzulösen. Das ist besonders beim Auflösen von Peptiden einer identischen oder ähnlichen relativen Molekülmasse sinnvoll. HPLC und CE sind exemplarische chromatographische Verfahren zum Praktizieren der Erfindung. CE weist ein extrem hohes Auflösungsvermögen auf (es wurden bereits Trennungen mit mehreren Millionen theoretischen Platten dokumentiert), der Lösungsmittelfluss bei CE-Trennungen ist sehr langsam und wird durch den elektroosmotischen Effekt bewirkt. Somit ist der Fluss von dem pH-Wert des Lösungsmittels abhängig. Außerdem weist er keinerlei „Wand"- oder Diffusionseffekte auf, die die Trennung negativ beeinflussen könnten. Siehe Aebersold R. H, US-Patentschrift Nr. 5,240,859 ; Clauser et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92: 50720–5076, 1995; Ducret et al., Electrophoresis, 17: 866–876, 1996; Gevaert et al., Electrophoresis, 17: 918–924, 1996.
Nachdem die Aminosäuresequenz der isolierten N-terminalen oder C-terminalen Peptide experimentell bestimmt wurde, kann ein Computerprogramm dazu verwendet werden, verfügbare Datenbanken nach passenden Aminosäuresequenzen zu durchsuchen und die ursprünglichen Proteine, von denen die Peptide stammten, zu identifizieren. In der Technik kennt man diverse Informatikhilfsmittel, die diese Aufgabe ausführen können. Beispielsweise ist eine wertvolle Quelle für im Internet zugängliche Proteomdatenbanken das Expert Protein Analysis System (ExPASy), das online bei http://www.expasy.ch/ verfügbar ist. Auf mehrere Datenbanken im FASTA(ASCII-Text)-Format mit Proteinsequenzinformationen kann mit standardmäßiger Web-Browser-Software über das World Wide Web (WWW) zugegriffen werden. Diese umfassen beispielsweise die Datenbank SWISS-PROT (http:/www.expasy.ch/sprot/) und die Datenbank OWL (http:/www.biochem.ucl.ac.uk/bsm/dbbrowser/OWL/OWL.html). Andere Proteindatenbanken umfassen Incyte Genomics' Yeast Protein Database (YPD), WormPD, HumanPSD und G-Protein Coupled Receptor Protein Database (GPCR-PD), um einige zu nennen (siehe: http://www.incyte.com/sequence/proteome/index.shtml).
Die Sequenzdatenbank kann eine Protein- oder eine Nucleinsäuresequenz-Datenbank sein. Wie Fachleute erkennen werden, kann eine Nucleinsäuresequenz-Datenbank unter Verwendung des standardmäßigen genetischen Codes durchsucht werden, um die möglichen Nucleinsäuresequenzen, die die Signaturpeptide codieren, zu bestimmen. Beispiele von Nucleotiddatenbanken umfassen beispielsweise Expressions-sequenzkennungs-Datenbanken (EST-Datenbanken, EST = express sequence tag) und Rohgenomsequenz-Datenbanken (raw genomic sequence data bases). Beispielsweise kann die Aminosäuresequenz rückübersetzt werden, um eine cDNA-Sonde zu erzeugen. Die Sonden können dann dazu verwendet werden, eine cDNA-Bibliothek zu durchsuchen, und resultierende cDNA-Klone können dazu verwendet werden, eine genomische Bibliothek zu durchsuchen. Das das Protein codierende Gen kann anschließend anhand einer Sequenzanalyse identifiziert werden. Die Identität des Gens kann bestätigt werden, indem die Intron-Exon-Struktur des Gens ermittelt wird, die Exone zu einem Vektor geklont werden und eine in vitro erfolgende Transkription/Translation durchgeführt wird, um das Protein zu exprimieren, oder indem das Protein in vivo exprimiert wird. Das exprimierte Protein kann anschließend gemäß dem Verfahren der Erfindung analysiert werden, und die Ergebnisse können mit denen, die für das unbekannte Protein erhalten wurden, verglichen werden. Es wird bestätigt, dass das Gen das ursprüngliche Protein codiert, falls die Analyseergebnisse zwischen dem exprimierten Protein und dem ursprünglichen Protein im Wesentlichen dieselben sind. Prozeduren für all diese Manipulationen sind hinreichend eingeführt und Fachleuten bekannt und/oder werden hierin beschrieben. Fachleute werden erkennen, dass Überlegungen bezüglich der Spezies angestellt werden können, von der das Protein gewonnen wurde, und die cDNA-Sonde kann dahin gehend entworfen sein, lediglich Codons zu umfassen, die bei der relevanten Spezies bevorzugt sind (z. B. Codons, die bei Menschen bevorzugt sind, wenn das Protein ein menschliches Protein ist). Nucleotidsequenzdatenbanken enthalten Sequenzen für exprimierte Sequenzmarkierungen (ESTs), die exprimierten Genen und Genfragmenten entsprechen. Auf EST-Sequenzdatenbanken wie z. B. die ESTdb am National Center for Biotechnology Information (http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/dbEST/index.html) kann auf dieselbe Weise zugegriffen werden wie auf Protein sequenzdatenbanken. Eine Datenbanksuche kann mit Hilfe von computergestützten Datenbanksuchprogrammen wie z. B. SEQUEST (Trademark, University of Washington, Seattle WA) durchgeführt werden. Siehe beispielsweise McCormack, A. L. et al. „Direct Analysis and Identification of Proteins in Mixtures by LC/MS/MS and Database Searching at the Low-Femtomole Level", Anal. Chem., 69: 767–776, 1996; Eng, J. K. et al. "An Approach to Correlate Tandem Mass Spectral Data of Peptides with Amino Acid Sequences in a Protein Database" J. Amer. Soc. Mass. Spectrom., 5: 976–989, 1994: Yates, III et al., US-Patentschrift Nr. 5,538,897 ; und Aebersold et al., WO 01/96869 . Beispielsweise kann ein derartiges Programm dahin gehend fungieren, alle bekannten genomischen Sequenzen zu nehmen, alle möglichen theoretischen CID-Spektren zu berechnen und sie bezüglich Übereinstimmungen und zum Zweck einer Sequenzidentifizierung mit experimentellen CID-Spektren zu vergleichen. Außerdem können bei der Computeranalyse bestimmte bekannte Informationen (z. B. Massenmodifikation des C-Terminus, Glutaminsäure, Asparaginsäuren und beliebige andere saure Seitengruppen sowie Massenänderungen, die auf eine Phosphorylierung oder andere posttranslationelle Modifikationen zurückzuführen sind) berücksichtigt werden.
Wie Fachleute erkennen werden, sind die Vorteile des vorliegenden Verfahrens zahlreich, einschließlich Einfachheit und Zeit- und Kosteneffizienz. Ein bedeutendes Merkmal ist die drastische Verringerung der Probenkomplexität im Vergleich zu Verfahren, die derzeit auf dem Gebiet eingesetzt werden: Der analytische Schritt wird auf die Charakterisierung eines einzigen Peptids pro Protein in der ursprünglichen Probe reduziert. Außerdem ist die Position des Zielpeptids an dem ursprünglichen Protein inhärent bekannt: Sie ist entweder N-terminal oder C-terminal, je nachdem, ob das Verfahren zur Auswahl von N-terminalen oder C-terminalen Peptiden verwendet wird. Eine Kenntnis sowohl der Peptidaminosäuresequenz als auch ihrer Position in dem Protein, von dem sie stammt, ermöglicht eine Identifizierung des Proteins mit einem sehr hohen Maß an Gewissheit, vorausgesetzt, dass das Protein bekannt ist und Informationen, die für seine Struktur relevant sind, in anhand von Computern durchsuchbaren Datenbanken zur Verfügung stehen. Ferner kann das Verfahren kostengünstige Reagenzien und eine hinreichend bekannte Chemie verwenden. Das Verfahren ist auch mit einer Disulfidbindungsreduktion und einer Alkylierung von Cystein kompatibel. Außerdem wird die Gemischkomplexität, die auf posttranslationelle Modifikationen zurückzuführen ist, (die nicht an dem terminalen Peptid vorliegen) verringert, wodurch die Analyse und der Charakterisierungsvorgang vereinfacht wird. Ferner können in der Natur vorkommende N- oder C-blockierte Proteine entdeckt werden.
Bei bestimmten Ausführungsbeispielen können zusätzliche Informationen erzeugt werden, z. B. Kenntnis darüber, welche Proteine in der ursprünglichen proteomischen Probe N-terminal (oder C-terminal) blockiert sind. Die Verwendung eines sinnvoll gewählten Schutzmittels bei dem anfänglichen Schritt eines N-terminalen (oder C-terminalen) Schutzes ermöglicht diese Bestimmung: N-terminale (oder C-terminale) Peptide, die die spezifische Schutzgruppe nicht aufweisen, müssen anfänglich blockiert worden sein. Dies kann dadurch bewerkstelligt werden, dass ein N-terminales (oder C-terminales) Schutzmittel gewählt wird, das eine erfassbare (und charakteristische) Markierung trägt, beispielsweise eine radioaktive Markierung, eine kolorimetrische Markierung, eine isotopisch markierte Markierung oder eine fluoreszente Markierung.
Bei anderen Ausführungsbeispielen liefert die Sequenz der ersten 10–20 Reste an dem N-Terminus eines Proteins allgemein ausreichend Informationen, um (i) ein Zuweisen der Stelle der proteolytischen Reifung, (ii) ein Synthetisieren von Oligonucleotidsonden für eine Isolierung einer spezifischen cDNA und (iii) ein Identifizieren des Proteins in Datenbanken (wie oben erörtert wurde) und (iv) ein anschließendes Ausrichten des Proteins gegen DNA-Sequenzen zu er möglichen. Die Einführung der Massenspektrometrie ermöglicht ferner einen Zugriff auf Informationen wie beispielsweise Glykosylierungsmuster, Phosphorylierung und andere posttranslationelle Modifikationen an den Proteintermini.
Bei wieder anderen Ausführungsbeispielen kann die vorliegende Erfindung Sequenzinformationen des C-Terminus von Proteinen liefern und erweist sich somit als sinnvoll darin, die Integrität des C-Terminus von Proteinen zu bestätigen. Dies hat eine wichtige Bedeutung bezüglich der Qualitätskontrolle bei der Feststellung der Treue der Proteinexpression, insbesondere bezüglich rekombinanter Proteine von biotechnologischer Bedeutung (z. B. Produkte für die Lebensmittelbranche, die Landwirtschaft und die Medizin). C-terminales Aufbereiten wird als wichtige posttranslationelle Modifikation erkannt, die manchmal die Struktur und Aktivität eines Proteins wesentlich beeinflusst. Somit kann das erfindungsgemäße Verfahren dazu beitragen, einen Einblick in die C-terminales-Protein-Struktur und in Aufbereitungsmechanismen sowie in Erkrankungen und/oder Krankheitszustände, die bisher mit einer beeinträchtigten Proteinaufbereitung verbunden waren, zu liefern.
Bei wieder anderen Ausführungsbeispielen ist das Verfahren der Erfindung mit einer quantitativen Bestimmung kompatibel, was wiederum einen Zugang zu globalen Studien der Proteinexpression ermöglicht.
Quantitative Proteomik
Eine bedeutende Arbeit auf dem Gebiet der Proteomik beinhaltet die Charakterisierung von Proteomen biologischer Proben: beispielsweise ein Nachverfolgen der Veränderungen eines Proteoms über die Zeit hinweg (dynamische Analyse) oder ein Identifizieren von Unterschieden bei der Proteinexpression oder Modifikation zwischen Proben oder Probenbehandlungen. Das Vorliegen oder die relative Häufigkeit ei nes bestimmten Proteins, das in einer Probe, aber nicht in einer anderen, vorgefunden wird, kann die Basis für diagnostische Tests sein oder zur Identifizierung von Zielen für eine Medikamentenentwicklung führen. Allgemeine Studien der Proteinexpression bei Proben unterschiedlicher genetischer Hintergründe, Erkrankungszustände usw. ermöglichen die Auswertung mehrerer Faktoren, die möglicherweise zum Auftreten von Erkrankungen beitragen. Beispielsweise kann die Identifizierung von Proteinen (und Wegen), die durch eine bestimmte Krankheit beeinflusst werden, dazu verwendet werden, bessere Medikamentenziele zu identifizieren. Außerdem bietet ein proteomisches Herangehen an die Arzneimittelforschung die Möglichkeit, die Eignung einer Medikamententherapie für einen bestimmten Phänotyp zu beurteilen. Dies hebt die Bedeutung der Proteomik in der Arzneimittelforschung hervor und unterstreicht den Wert analytischer Verfahren, die in der Lage sind, Proteine in proteomischen Proben auf kostengünstige, zuverlässige und effiziente Weise quantitativ zu bestimmen.
Wie hierin erörtert wird, stützt sich die quantitative Proteomik traditionell auf die zweidimensionale Gelelektrophorese, um Proteine zu identifizieren, die auf eine erkrankungsspezifische Weise nach oben oder nach unten reguliert werden, wobei das letztendliche Ziel darin besteht, diejenigen Proteine zu verwenden, die differentiell als diagnostische Marker oder therapeutische Ziele vorliegen. Jedoch beschränken technische Herausforderungen, die mit diesem Verfahren verbunden sind, den Umfang seiner Anwendungen beträchtlich. Derartige Einschränkungen resultieren aus der Tatsache, dass (i) hydrophobe und große Proteine üblicherweise nicht in die zweite Dimension des Gels eintreten, und (ii) Dynamikbereiche es schwierig machen, alle außer den am häufigsten auftretenden Proteinen sichtbar zu machen, vor allem in Körperflüssigkeiten wie Serum oder cerebrospinaler Flüssigkeit, bei dem bzw. bei der mehr als 99% des Proteinanteils aus Serumalbumin und Globulinen besteht.
Ein alternativer Ansatz der quantitativen Proteomik ist der sogenannte Protein-Chip-Ansatz, bei dem eine Vielzahl von „Köder"-Proteinen wie z. B. Antikörpern in einem Arrayformat auf speziell behandelte Oberflächen immobilisiert werden (siehe Wagner et al., US-Patentschrift Nr. 6,329,209 und Lueking A. et al., „Protein microarrays for gene expression and antibody screening", Anal. Biochem., 270: 103–111, 1999). Üblicherweise wird die Oberfläche mit der interessierenden Probe in Berührung gebracht, und die Proteine, die sich speziell an die relevanten Antikörper binden, werden auf der Chipoberfläche immobilisiert. Beispielsweise wird das Protein-Chip mit fluoreszent markierten Proteinen aus zwei unterschiedlichen Zellzuständen in Berührung gebracht: die Zelllysate werden anhand verschiedener Fluorophore markiert und gemischt, so dass die Farbe als Ablesewert der Veränderung der Häufigkeit des an den Antikörper auf dem Chip gebundenen Proteins fungiert. Jedoch hängt diese Technik von der Verfügbarkeit spezifischer und hinreichend charakterisierter Antikörper zur Identifizierung und quantitativen Bestimmung von Proteinen ab und gilt nicht allgemein für alle Proteine in einer gegebenen Probe.
Vor kurzem wurde mit Techniken wie z. B. denjenigen, die auf isotopcodierten Affinitätskennungen (ICAT – isotope-coded affinity tags) basieren, eine MS-basierte quantitative proteomische Analyse ermöglicht. Siehe Aebersold et al., internationale Patentanmeldungen Nrn. WO 01/96869 und WO 00/11208 ; Gygi S. P. et al. „Quantitative analysis of protein mixtures using isotope coded affinity tags", Nat. Biotechnol., 17: 994–999, 1999. ICAT beinhaltet eine regiospezifische, kovalente Markierung von Protein mit isotopisch normalen oder schweren ICAT-Reagenzien, die, wie nachstehend gezeigt wird, üblicherweise aus (1) einer thiolreaktiven Gruppe, die bezüglich Cysteinen selektiv ist, (2) einem Ethylenglykollinker, der in deuterierten und isotopisch normalen Formen auftritt und die Basis für eine quantitative Bestimmung liefert, und (3) Biotin, das eine Affinitäts kennung für die selektive Isolierung von mit einer Kennung versehenen Peptiden liefert, bestehen.
X=D oder H
Somit werden die stabilen Isotope nach der Isolierung anhand einer selektiven Alkylierung von Cysteinen mit einem schweren (d8) oder normalen (d0) Reagens integriert. Die zwei Proteingemische aus unterschiedlichen proteomischen Proben werden anschließend gemischt, mit Trypsin aufgeschlossen und über eine monomere Avidin-Agarose-Säule geführt (Avidinaffinitätschromatographie). Da die ICAT-Markierung eine Biotinkennung enthält, werden ICAT-markierte (Cystein enthaltende) Peptide zum Zweck einer Analyse selektiv isoliert. Charakterisierung und quantitative Bestimmung werden anhand von Massenspektrometrie, die mit einer chromatographischen Technik gekoppelt ist (üblicherweise anhand einer Mikrokapillar-LC-Elektrosprayionisation (ESI)-MS/MS) bewerkstelligt. Das Verhältnis von Ionenintensitäten aus ko-eluierenden ICAT-markierten Paaren ermöglicht die Quantifizierung, während eine anschließende MS/MS-Abtastung eine Proteinidentifizierung ermöglicht.
Obwohl dieser Ansatz die quantitative Bestimmung von Proteinen beträchtlich erleichtert, weist ICAT bedeutende Einschränkungen auf. Beispielsweise stützt es sich auf ein spezifisches Markieren von Cysteinresten, und obwohl Cystein in den meisten Proteinen (etwa 93%) vorliegt, kön nen Proteine, die keine Cysteinreste aufweisen, anhand dieses Verfahrens nicht erfasst werden. Somit werden nicht alle Proteine dargestellt. Obwohl jegliches gegebene Protein im Durchschnitt eine relativ geringe Anzahl an Cysteinresten enthält, ist ICAT außerdem in der Lage, mehrere Peptide für manche Proteine zu erzeugen, und es tut dies auch, was den analytischen Vorgang verkomplizieren kann. Somit werden manche Proteine mehrmals dargestellt. Deshalb kann das ICAT-Verfahren anders als die vorliegende Erfindung die 1:1-Stöchiometrie von Peptid zu Mutterprotein, die bei der vorliegenden Erfindung verwendet wird, nicht nutzen. Ferner kann die Biotin/Avidin-Bindung einer von Probenmatrizen ausgehenden Störung unterworfen werden, und somit kann die avidinaffinitätschromatographische Trennung negativ beeinflusst werden. Da die Avidin/Biotin-Bindung nicht zu 100% spezifisch ist, enthält die nach der affinitätschromatographischen Trennung des Aufschlusses erhaltene Probe wahrscheinlich Verunreinigungen, was den analytischen Vorgang verkompliziert.
Die vorliegende Erfindung widmet sich mehreren Einschränkungen von Verfahren, die in der Technik bekannt sind, und liefert ein hocheffizientes Verfahren zur quantitativen Bestimmung der relativen Mengen von Proteinen in verschiedenen Proben, während sie gleichzeitig die Probenkomplexität drastisch verringert (d. h. eine Analyse ist auf die eines einzigen Peptids pro Protein in der ursprünglichen proteomischen Probe reduziert).
Bezüglich eines Aspekts liefert die vorliegende Erfindung ein System zum Bestimmen, ob ein Protein in einer ersten und einer zweiten biologischen Probe differentiell vorliegt (z. B. differentiell exprimiert oder modifiziert ist): wenn es mit Verfahren zum differentiellen Markieren der Peptide kombiniert wird, kann das Verfahren der vorliegenden Erfindung zur Auswahl von N-terminalen oder C-terminalen Peptiden dazu verwendet werden, relative Mengen von Peptiden und entsprechenden Proteinen in verschiedenen Proben zu quanti fizieren. Bei bestimmten exemplarischen Ausführungsbeispielen werden die N-terminalen (oder C-terminalen) Peptide zweier oder mehrerer proteomischer Proben mittels einer erfassbaren Markierung differentiell markiert, und die relativen Mengen von differentiell markierten Peptiden werden unter Verwendung eines quantitativen analytischen Verfahrens gemessen.
Die erfassbare Markierung, auf die hierin Bezug genommen wird, soll jegliche Gruppe, Entität oder jeglichen Anteil bezeichnen, der bzw. die anhand in der Technik verfügbarer quantitativer analytischer Verfahren erfasst werden kann. Derartige quantitative analytische Verfahren umfassen Massenspektrometrie, kernmagnetische Resonanzspektroskopie (NMR – nuclear magnetic resonance), Fluoreszenzspektroskopie, UV-vis-Absorptionsspektroskopie und Fourier-Transform-IR-Spektroskopie (FTIR), sind aber nicht auf diese beschränkt. Eine Wahl einer erfassbaren Markierung, die zur Analyse mit einem beliebigen dieser Verfahren geeignet ist, wird Fachleuten ohne weiteres einleuchten. Vorzugsweise wird jede proteomische Probe unabhängig voneinander mit verschiedenen erfassbaren Markierungen markiert. Optional wird das kombinierte Probengemisch vor der Analyse einem Trennungsschritt unterzogen, wodurch eine teilweise oder vollständige Trennung der differentiell markierten Peptide, die in dem Gemisch vorliegen, bewirkt wird. Beispiele von Trennungstechniken, die für die Praxis der Erfindung geeignet sind, sind HPLC, Gelelektrophorese, Kapillarelektrophorese oder andere geeignete chromatographische Techniken. Bei einem Ausführungsbeispiel werden die differentiell markierten Proben kombiniert, und die differentiell markierten N-terminalen (oder C-terminalen) Peptide werden miteinander analysiert und quantitativ bestimmt, um eine direkte quantitative Bestimmung zu ermöglichen. Alternativ dazu werden die differentiell markierten Proben separat analysiert: die N-terminalen (oder C-terminalen) Peptide in jedem differentiell markierten Peptidgemisch werden im Vergleich zu einem Standard, der vor der Analyse in jede Peptidprobe eingebracht wird, quantitativ bestimmt.
Bei bestimmten exemplarischen Ausführungsbeispielen werden die N-terminalen (oder C-terminalen) Peptide der Erfindung differentiell isotopisch markiert, um Paare oder Sätze von Peptiden zu erzeugen, die im Wesentlichen chemisch identisch sind, die jedoch anhand ihrer Masse unterscheidbar sind. Beispielsweise kann ein Paar von Schutzgruppenreagenzien, von denen eines isotopisch schwer ist und das andere isotopisch leicht ist, zum Vergleich zweier Proben verwendet werden, von denen eine eine Referenzprobe sein kann, die ein oder mehrere bekannte Proteine in bekannten Mengen enthält. Beispielsweise kann bzw. können eines oder mehrere der Wasserstoff-, Stickstoff-, Sauerstoff- oder Schwefelatome, die in der Schutzgruppe, die bei dem Terminales-Peptid-Auswahlverfahren verwendet wird, vorliegen können, durch ihre isotopisch stabilen Isotope (beispielsweise ²H, ¹³C, ¹⁵N, ¹⁷O, ¹⁸O, oder ³⁴S) ersetzt werden. Ein differentielles isotopisches Markieren wird vorzugsweise, jedoch nicht notwendigerweise durch die freie Carboxylgruppe der N-terminalen Peptide in die Peptide der vorliegenden Erfindung eingebracht. Bei einem anderen Ausführungsbeispiel wird eine differentielle isotope Markierung durch die freie Aminogruppe der C-terminalen Peptide in die Peptide der vorliegenden Erfindung eingebracht.
Bei einem Ausführungsbeispiel werden die oben beschriebenen quantitativen Verfahren mit einer massenspektrometrischen Technik zum Charakterisieren der N-terminal oder C-terminal geschützten Peptide und zum Identifizieren der Proteine in der Probe, von der die N-terminal oder C-terminal geschützten Peptide stammten, kombiniert. Beispiele geeigneter massenspektrometrischer Techniken wurden oben erörtert und werden Fachleuten, die die Erfindung praktizieren möchten, ohne weiteres einleuchten. Bei einem Ausführungsbeispiel ist die massenspektrometrische Technik die Tandemmassenspektrometrie, und die Aminosäuresequenz der N-terminal oder C-terminal geschützten Peptide wird ermittelt. Bei einem anderen Ausführungsbeispiel wird die massenspektrometrische Technik mit einer Trennungstechnik wie z. B. HPLC, Gelelektrophorese oder CE gekoppelt, und das Gemisch aus N-terminal oder C-terminal geschützten Peptiden wird vor der MS-Analyse einem Trennungsschritt unterzogen. Bei einem exemplarischen Ausführungsbeispiel sind die erfassbaren Markierungen in unterschiedlichen Proben differentiell isotopisch markiert, und ein quantitativer Vergleich von Konzentrationen an N-terminal oder C-terminal geschützten Peptiden (somit die Proteinkonzentrationen) in den verschiedenen Proben wird durch ein Vergleichen der relativen Mengen der differentiell isotopisch markierten Markierungen in den verschiedenen Proben bewirkt.
Im Rahmen von Bemühungen, den Stand der Technik, auf den sich die Erfindung bezieht, umfassender zu beschreiben, finden sich nachstehend Referenzen, die sich auf die Anwendung von massenspektrometrischen Techniken auf die quantitative Proteomik beziehen: Gygi S. P. et al., „Measuring gene expression by quantitative proteome analysis", Curr Opin Biotechnol., 11 (4): 396–401, 2000; Mann M., „Quantitative proteomics?", Nature Biotechnology, 17: 954–955, 1999; Hutchens et al., US-Patentschrift Nr. 6,225,047 ; und Waldman et al., veröffentlichte US-Patentanmeldung Nr. 2001/0039016.
Fachleute werden erkennen, dass die Massendifferenz zwischen differentiell isotopisch markierten Peptiden von der isotopischen Massendifferenz unter den ausgewählten erfassbaren Markierungen und dem Ladungszustand der Peptide, der auf der Basis der natürlichen Isotopenverteilung in dem Massenspektrometer selbst ermittelt werden kann, abhängt. Wenn das Massenspektrometer mit einer chromatographischen Trennungstechnik gekoppelt wird, wird das differentiell markierte Peptidgemisch vor der Massenanalyse einem Trennungsschritt unterzogen. Die isotopisch verwandten Peptide ko-eluieren im Wesentlichen aus der chromatographischen Einheit (beispielsweise HPLC), während sie in die MS-Ionisationskammer eintreten. Auf Grund jedes differentiell markierten Peptids erscheint ein gegebenes Peptid als mehrere Peaks (z. B. ein Dublett für zwei Proben, die mit Methylamin-(d0) und Methylamin-(d3) differentiell markiert sind). Bei dem MS-Spektrum werden die Peaks anhand einer m/z, die gleich der Massendifferenz zwischen der an den Peptiden vorhandenen normalen (d0) und schweren (d3) Markierung ist, getrennt. Wenn beispielsweise Methylamin-(d0) und Methylamin-(d3) dazu verwendet werden, die freien Carboxylgruppen von N-terminal geschützten Peptiden in jeder Probe zu markieren, liegen die Peaks, die für dasselbe Peptid in differentiell isotopisch markierten Proben erfasst werden, 3 m/z-Einheiten auseinander. Die relative Intensität der Peaks in dem Satz aus mehreren Peaks (z. B. Dublett) von demselben Peptid in differentiell isotopisch markierten Proben reflektiert direkt die relativen Konzentrationen dieses Peptids in den verschiedenen Proben. Das zu Grunde liegende Prinzip dieses Quantifizierungsverfahrens besteht darin, dass isotopisch verwandte Peptide chemisch identisch sind und somit einen perfekten gegenseitigen internen Standard darstellen. Die Intensität der Signale, die in dem Massenspektrometer aus den differentiell isotopisch markierten Peptiden aus verschiedenen Proben erzeugt werden, reflektiert jeweils genau relative Quantitäten der in diesen Proben vorhandenen Peptidemoleküle.
Differentielle Markierung von N- oder C-terminalen Peptiden an den freien C- bzw. N-Termini
sBei bestimmten Ausführungsbeispielen umfasst das erfindungsgemäße quantitative Verfahren (i) ein Bereitstellen zweier oder mehrerer Proben, von denen jede ein oder mehrere Proteine enthält; (ii) Schützen, in jeder Probe, des Protein-N- oder -C-Terminus mit einem geeigneten Schutzmittel; (iii) Spalten, in jeder Probe, der terminal geschützten Proteine mit einem geeigneten Spaltungsmittel, wodurch für jede Probe ein Gemisch aus terminal geschützten Peptiden und Peptiden, die freie Amino- und Carboxylgruppen aufweisen, die den Spaltungsstellen entsprechen, erzeugt wird; (iv) Trennen, für jede Probe, der terminal geschützten Peptide von dem Peptidgemisch, wodurch die Probenkomplexität für jede der zwei oder mehr Proteinproben auf ein terminales Peptid pro Probenprotein reduziert wird; (v) differentielles Markieren der terminal geschützten Peptide jeder Probe mit einem geeigneten Reagens, das eine erfassbare Markierung aufweist, wodurch zwei oder mehr Sätze von differentiell markierten terminalen Peptiden erzeugt werden; und (v) Messen relativer Konzentrationen an differentiell markierten, terminal geschützten Peptiden.
Bei einem Ausführungsbeispiel verwendet das erfindungsgemäße Verfahren zur quantitativen Bestimmung den hierin beschriebenen Ansatz einer Auswahl von N-terminalen Peptiden und umfasst (i) ein Bereitstellen zweier oder mehrerer Proben, die jeweils ein oder mehrere Proteine enthält bzw. enthalten; (ii) Schützen, in jeder Probe, der Protein-N-terminalen Aminogruppen mit einem geeigneten Schutzmittel; (iii) Spalten, in jeder Probe, der N-terminal geschützten Proteine mit einem geeigneten Spaltungsmittel, wodurch für jede Probe ein Gemisch aus N-terminal geschützten Peptiden und Peptiden, die freie Amino- und Carboxylgruppen aufweisen, die den Spaltungsstellen entsprechen, erzeugt wird; (iv) Trennen, für jede Probe, der N-terminal geschützten Peptide von dem Peptidgemisch, wodurch die Probenkomplexi tät für jede der zwei oder mehr Proteinproben auf ein N-terminales Peptid pro Probenprotein reduziert wird; (v) differentielles Markieren der N-terminal geschützten Peptide jeder Probe mit einem geeigneten Reagens, das eine erfassbare Markierung aufweist, wodurch zwei oder mehr Sätze von differentiell markierten N-terminalen Peptiden erzeugt werden; und (vi) Messen relativer Konzentrationen von differentiell markierten N-terminal geschützten Peptiden.
Bei einem wieder anderen Ausführungsbeispiel stützt sich das Verfahren zum quantitativen Vergleichen von Proteinkonzentrationen in zwei oder mehr Proben auf C-terminale Peptide der Probenproteine zur quantitativen Bestimmung und umfasst (i) ein Bereitstellen zweier oder mehrerer Proben, die jeweils ein oder mehrere Proteine enthält bzw. enthalten; (ii) Schützen, in jeder Probe, der Protein-C-terminalen Carboxylgruppen mit einem geeigneten Schutzmittel; (iii) Spalten, in jeder Probe, der C-terminal geschützten Proteine mit einem geeigneten Spaltungsmittel, wodurch für jede Probe ein Gemisch aus C-terminal geschützten Peptiden und Peptiden, die freie Amino- und Carboxylgruppen aufweisen, die den Spaltungsstellen entsprechen, erzeugt wird; (iv) Trennen, für jede Probe, der C-terminal geschützten Peptide von dem Peptidgemisch, wodurch die Probenkomplexität für jede der zwei oder mehr Proteinproben auf ein C-terminales Peptid pro Probenprotein reduziert wird; (v) differentielles Markieren der C-terminal geschützten Peptide jeder Probe mit einem geeigneten Reagens, das eine erfassbare Markierung aufweist, wodurch zwei oder mehr Sätze von differentiell markierten C-terminalen Peptiden erzeugt werden; und (vi) Messen relativer Konzentrationen von differentiell markierten C-terminal geschützten Peptiden.
Bei einer Variation der drei obigen Ausführungsbeispiele werden die Sätze von differentiell markierten terminalen Peptiden, die im Schritt (iv) gebildet wurden, vor dem Mes sen der relativen Konzentrationen von differentiell markierten terminal geschützten Peptiden kombiniert.
Es versteht sich, dass die Schritte (ii)–(iv) bei jedem der drei obigen Ausführungsbeispiele gemäß dem hierin beschriebenen Ansatz einer Auswahl von N- oder C-terminalen Peptiden durchgeführt werden können. Somit werden Fachleuten ausgehend von den Lehren des hierin beschriebenen Verfahren zur Auswahl von N-terminalen (oder C-terminalen) Peptiden experimentelle Bedingungen und allgemeine Methodologien zum Schützen und Spalten der N-Termini (oder C-Termini) der Probenproteine und zum Trennen der resultierenden N-terminal (oder C-terminal) geschützten Peptide von dem Gemisch einleuchten.
Bei exemplarischen Ausführungsbeispielen ist das Reagens, das eine erfassbare Markierung aufweist, eine carboxylreaktive Gruppe, und es reagiert selektiv in einer guten Ausbeute, um ein C-terminal markiertes Peptid zu liefern, das gegenüber den geplanten Reaktionen oder experimentellen Bedingungen stabil ist. Bei anderen Ausführungsbeispielen ist das Reagens, das eine erfassbare Markierung aufweist, eine aminoreaktive Gruppe, und es reagiert selektiv in einer guten Ausbeute, um ein N-terminal markiertes Peptid zu liefern, das gegenüber den geplanten Reaktionen oder experimentellen Bedingungen stabil ist.
Vorzugsweise, jedoch nicht notwendigerweise, weist das markierte Reagens ein Mindestmaß an zusätzlicher Funktionalität auf, um weitere Reaktionsstellen zu vermeiden. Bei bestimmten Ausführungsbeispielen ist das markierte Reagens ein Carboxylschutzmittel. Beispiele von geeigneten Carboxylschutzmitteln sind an anderer Stelle hierin beschrieben und werden Fachleuten ohne weiteres einleuchten. Beispielsweise können geeignete Schutzmittel diejenigen umfassen, die Carboxylester bilden (beispielsweise Methanol oder ein anderer niederer aliphatischer Alkohol, Diazomethan, MeI, Me₃SiCHN₂, Me₂C(OMe)₂, CH₃OCH₂Cl, CH₃SCH₂Cl, Dihydropyran, CH₃OCH₂CH₂OCH₂Cl, PhCH₂OCH₂Cl, Me₃SiCl, Et₃SiCl, Me₂PhSiCl), Amide (beispielsweise Methylamin, Ethylamin, Me₂NH, Pyrrolidin, Piperidin) und Hydrazid-(z. B. Phenylhydrazin)Derivate, um einige zu nennen. Vorzugsweise ist das Carboxylschutzmittel ein aliphatisches Amin. Bei exemplarischen Ausführungsbeispielen beinhaltet eine Funktionalisierung der freien Carboxylgruppe eine Carbodiimid-Aktivierung vor einer Reaktion mit einem geeigneten Schutzmittel (beispielsweise einem aliphatischen Amin wie z. B. Methylamin oder Ehtylamin). Bei bestimmten Ausführungsbeispielen ist das markierte Reagens ein Aminschutzmittel. Wie oben erörtert wurde, umfassen Beispiele geeigneter Schutzgruppen, sind aber nicht beschränkt, auf, Carbamate (einschließlich Methyl, Ethyl, tert-Butyl (z. B. Boc) und 9-Fluorenylmethylcarbamate (z. B. Fmoc), um einige zu nennen) Amide, Zyklisches-Imid-Derivate, N-Alkyl- und N-Aryl-Amine, Iminderivate und Enaminderivate, um einige zu nennen. Bei bestimmten exemplarischen Ausführungsbeispielen ist das Schutzmittel Essigsäureanhydrid, di-tert-Butyldicarbonat (d. h. Boc-Anhydrid), 2-tert-Butyloxycarbonylamino-2-phenylacetonitril (d. h. BOC-ON) oder ein 9-Fluorenylmethoxycarbonylreagens (d. h. Fmoc-Reagens), das auf eine Reaktion mit einem reaktiven freien Amin hin ein 9-Fluorenylmethoxycarbamat erzeugt.
Man wird erkennen, dass die vorliegende Erfindung nicht auf die hierin beschriebenen Schutzmittel beschränkt sein soll; vielmehr kann unter Verwendung der obigen Kriterien eine Vielzahl zusätzlicher äquivalenter Schutzgruppen ohne weiteres identifiziert und bei der vorliegenden Erfindung verwendet werden, wie hierin angegeben ist.
Bei bestimmten exemplarischen Ausführungsbeispielen ist das markierte Reagens in verschiedenen isotopischen Formen erhältlich oder kann in verschiedenen isotopischen Formen hergestellt werden. Wenn beispielsweise der Ansatz einer Auswahl von N-terminalen Peptiden verwendet wird und die Markierung an den N-terminalen freien Carboxylgruppen des Peptids beabsichtigt ist, können Methylamin und Methylamin-(d3) (oder Ethylamin und Ethylamin-(d5)) verwendet werden, um die Peptide differentiell zu markieren. Bei einer Probe können die freien Carboxylgruppen des N-terminalen Peptids mit Methylamin-(d0) unter geeigneten Bedingungen zur Reaktion gebracht werden, um das entsprechende Amid zu erzeugen. Bei einer anderen Probe können die freien Carboxylgruppen des N-terminalen Peptids mit Methylamin-(d3) unter geeigneten Bedingungen zur Reaktion gebracht werden, um das entsprechende deuterierte Amid zu erzeugen. Vorzugsweise wird eine Bildung der Amide durch eine Carbodiimid-Aktivierung der Carboxylgruppe bewerkstelligt.
Bei anderen Ausführungsbeispielen, bei denen der Ansatz einer Auswahl von C-terminalen Peptiden verwendet wird und eine Markierung an den Peptid-C-terminalen freien Aminogruppen beabsichtigt ist, können Boc-Anhydrid-(d0) und BOC-ON-(d9) oder Essigsäureanhydrid-(d0) und Essigsäureanhydrid-(d6) verwendet werden, um die Peptide differentiell zu markieren. Beispielsweise können bei einer Probe die freien Aminogruppen des C-terminalen Peptids unter geeigneten Bedingungen mit BOC-ON-(d0) zur Reaktion gebracht werden, um das entsprechende Carbamat zu erzeugen. Bei einer anderen Probe können die freien Aminogruppen des C-terminalen Peptids unter geeigneten Bedingungen mit BOC-ON-(d9) zur Reaktion gebracht werden, um das entsprechende deuterierte Carbamat zu erzeugen. Bei einem wieder anderen Ausführungsbeispiel können bei einer Probe die freien Aminogruppen des C-terminalen Peptids unter geeigneten Bedingungen mit Essigsäureanhydrid-(d0) zur Reaktion gebracht werden, um das entsprechende Amid zu erzeugen. Bei einer zweiten Probe können die freien Aminogruppen des C-terminalen Peptids unter geeigneten Bedingungen mit Essigsäureanhydrid-(d6) zur Reaktion gebracht werden, um das entsprechende deuterierte Amid zu erzeugen.
Man wird erkennen, dass die vorliegende Erfindung nicht auf die hierin beschriebenen differentiell markierten Schutz mittel beschränkt sein soll; vielmehr kann unter Verwendung der obigen Kriterien eine Vielzahl zusätzlicher äquivalenter Schutzgruppen ohne weiteres identifiziert und bei der vorliegenden Erfindung verwendet werden, wie hierin angegeben ist.
Differentielles Markieren von Protein-N- oder -C-Termini von Proteinen
Bei einem anderen Ausführungsbeispiel umfasst das Verfahren zum quantitativen Vergleichen von Proteinkonzentrationen in zwei oder mehr Proben ein (i) Bereitstellen zweier oder mehrerer Proben, von denen jede ein oder mehrere Proteine enthält; (ii) differentielles Markieren der Protein-N- oder -C-Termini jeder Probe mit einem geeigneten Schutzmittel, das eine erfassbare Markierung aufweist, wodurch zwei oder mehr Sätze von differentiell markierten terminal geschützten Proteinen erzeugt werden; (iii) Spalten der differentiell markierten terminal geschützten Proteine mit einem geeigneten Spaltungsmittel, wodurch zwei oder mehr Gemische von differentiell markierten terminal geschützten Peptiden und Peptiden, die freie Amino- und Carboxylgruppen aufweisen, die den Spaltungsstellen entsprechen, erzeugt werden; (iv) Trennen, für jedes der zwei oder mehr Peptidgemische, der differentiell markierten terminal geschützten Peptide von den nicht-terminal geschützten Peptiden, wodurch die Probenkomplexität effektiv auf ein differentiell markiertes terminales Peptid pro differentiell markiertem Probenprotein reduziert wird; und (v) Messen der relativen Konzentrationen von differentiell markierten terminal geschützten Peptiden.
Bei einer Variation des obigen Ausführungsbeispiels können die Sätze von differentiell markierten terminalen Peptiden, die beim Schritt (ii) gebildet wurden, zu einem beliebigen Zeitpunkt vor dem Messen der relativen Konzentrationen von differentiell markierten terminal geschützten Peptiden kombiniert werden.
Bei einer bestimmten exemplarischen Variation des obigen Ausführungsbeispiels werden die Sätze von differentiell markierten terminalen Peptiden, die beim Schritt (ii) gebildet wurden, vor dem Schritt des Spaltens kombiniert, und das Verfahren umfasst folgende Schritte: (i) Bereitstellen zweier oder mehrerer Proben, von denen jede ein oder mehrere Proteine enthält; (ii) differentielles Markieren der Protein-N- oder -C-Termini jeder Probe mit einem geeigneten Schutzmittel, das eine erfassbare Markierung aufweist, wodurch zwei oder mehr Sätze von differentiell markierten terminal geschützten Proteinen erzeugt werden; (iii) Kombinieren der Sätze von differentiell markierten terminal geschützten Protein; (iv) Spalten der differentiell markierten terminal geschützten Proteine mit einem geeigneten Spaltungsmittel, wodurch ein kombiniertes Gemisch von differentiell markierten terminal geschützten Peptiden und Peptiden, die freie Amino- und Carboxylgruppen aufweisen, die den Spaltungsstellen entsprechen, erzeugt werden; (v) Trennen der differentiell markierten terminal geschützten Peptide von den nicht-terminal geschützten Peptiden, wodurch die Probenkomplexität auf ein differentiell markiertes terminales Peptid pro differentiell markiertem Probenprotein reduziert wird; und (vi) Messen der relativen Konzentrationen von differentiell markierten terminal geschützten Peptiden.
Es versteht sich, dass alle vor dem Messen der relativen Konzentrationen von differentiell markierten terminal geschützten Peptiden erfolgenden Schritte bei jedem der obigen Ausführungsbeispiele und angeführten Variationen derselben gemäß dem hierin beschriebenen Ansatz der Auswahl von N- oder C-terminalen Peptiden ausgeführt werden können. Somit werden spezifische Ausgangsmaterialien, experimentelle Bedingungen und allgemeine Methodologien zum Schützen und Spalten der N- oder C-Termini der Proteine und zum Trennen der resultierenden terminal geschützten Peptiden von dem Gemisch Fachleuten auf der Basis der Lehren des hierin beschriebenen Ansatzes einer Auswahl von terminalen Peptiden ohne weiteres einleuchten.
Ob ein differentielles Markieren von terminalen Peptiden an den freien Termini oder ein differentielles Markieren von Proteintermini (d. h. vor einer enzymatischen oder chemi schen Fragmentierung) verwendet wird, die Kombination von proteomischen Proben kann zu jeglichem Zeitpunkt nach dem Schritt des differentiellen Markierens der terminalen Peptide oder Proteine in jeder Probe, jedoch vor dem Messen der relativen Konzentrationen von markierten Peptiden in dem Gemisch erfolgen. Dadurch wird gewährleistet, dass jedes differentiell markierte Peptidpaar/jeder differentiell markierte Peptidsatz gleichzeitig analysiert wird, wodurch eine relative quantitative Bestimmung ermöglicht wird (im Gegensatz zu einer absoluten quantitativen Bestimmung, die die Erstellung einer Kalibrierungskurve erfordert). Vorzugsweise werden dann, wenn der Proteinmarkierungsansatz verwendet wird (z. B. differentielles Markieren vor einer enzymatischen oder chemischen Spaltung), die differentiell markierten Proben unmittelbar nach dem Schritt des differentiellen Markierens der Proteinproben kombiniert. Somit können die Schritte des Spaltens der differentiell markierten terminal geschützten Proteine und des Trennens der resultierenden differentiell markierten Peptide von dem Peptidgemisch gleichzeitig, mit den kombinierten Proben, ausgeführt werden.
Bei exemplarischen Ausführungsbeispielen, bei denen der Ansatz einer Auswahl von N-terminalen Peptiden verwendet wird, ist das Schutzmittel eine aminreaktive Gruppe, und es reagiert selektiv in einer guten Ausbeute, um ein markiertes N-terminal geschütztes Protein zu ergeben, das gegenüber den geplanten Reaktionen oder experimentellen Bedingungen stabil ist. Bei anderen Ausführungsbeispielen, bei denen der Ansatz einer Auswahl von C-terminalen Peptiden verwendet wird, ist das Schutzmittel eine carboxylreaktive Gruppe, und es reagiert selektiv in einer guten Ausbeute, um ein markiertes C-terminal geschütztes Protein zu ergeben, das gegenüber den geplanten Reaktionen oder experimentellen Bedingungen stabil ist. Vorzugsweise, jedoch nicht notwendigerweise weist das Schutzmittel ein Mindestmaß an zusätzlicher Funktionalität auf, um weitere Reaktionsstellen zu vermeiden.
Bei bestimmten Ausführungsbeispielen ist das Schutzmittel eine Aminschutzgruppe. Beispiele von geeigneten Aminschutzgruppen wurden oben beschrieben und werden Fachleuten ohne weiteres einleuchten. Bei bestimmten exemplarischen Ausführungsbeispielen ist das Schutzmittel Essigsäureanhydrid, di-tert-Butyldicarbonat (d. h. Boc-Anhydrid) oder 9-Fluorenylmethoxycarbonyl-Reagens (d. h. Fmoc-Reagens), das auf eine Reaktion mit einem reaktiven freien Amin hin ein 9-Fluorenylmethoxycarbamat erzeugt. Beispiele von Fmoc-Reagenzien, die zum Praktizieren der Erfindung geeignet sind, umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, Fmoc-Cl, Fmoc-N₃, Fmoc-OBt (Bt = Benzotriazol-1-yl), Fmoc-OSu (Su = Succinimidyl) und Fmoc-OC₆F₅. Bei anderen Ausführungsbeispielen ist das Schutzmittel eine Carboxylschutzgruppe. Beispiele von geeigneten Carboxylschutzgruppen wurden oben beschrieben und werden Fachleuten ohne weiteres einleuchten. Bei exemplarischen Ausführungsbeispielen beinhaltet eine Funktionalisierung der freien Carboxylgruppe eine Carbodiimid-Aktivierung vor einer Reaktion mit einem geeigneten Schutzmittel (beispielsweise einem aliphatischen Amin, z. B. Methylamin oder Ethylamin).
Man wird erkennen, dass die vorliegende Erfindung nicht auf die hierin beschriebenen Schutzmittel beschränkt sein soll; vielmehr kann unter Verwendung der obigen Kriterien eine Vielzahl zusätzlicher äquivalenter Schutzgruppen ohne weiteres identifiziert und bei der vorliegenden Erfindung verwendet werden, wie hierin angegeben ist.
Bei anderen exemplarischen Ausführungsbeispielen können die Schutzmittel (zum Markieren der N- oder C-Termini der Proteine) dahin gehend gewählt werden, differentielle isotope Markierungen aufzuweisen, die für eine quantitative Peptidanalyse mittels Massenspektrometrie nützlich sind. Vorzugsweise ist das Schutzmittel dort, wo der Ansatz zur Auswahl von N-terminalen Peptidenverwendet wird, ein Aminschutz mittel, und es ist in verschiedenen isotopischen Formen erhältlich oder kann in verschiedenen isotopischen Formen hergestellt werden. Beispiele von Aminschutzgruppen, die zum differentiellen isotopischen Markieren von N-terminalen Peptiden geeignet sind, umfassen 2-tert-Butyloxycarbonylamino-2-phenylacetonitril-(d0) oder -(d9) (d. h. BOC-ON-(d0) oder -(d9)), Acetylchlorid-(d0) oder -(d3) und Benzoylchlorid-(d0) oder (d5), die alle von ISOTEC, Miamisburg, Ohio, erhältlich sind, oder Essigsäureanhydrid-(d0) oder -(d6). Beispielsweise können die N-terminalen freien Aminogruppen des Proteins bei einer Probe unter geeigneten Bedingungen mit BOC-ON-(d0) zur Reaktion gebracht werden, um das entsprechende Carbamat zu erzeugen. Bei einer anderen Probe können die N-terminalen freien Aminogruppen des Proteins unter geeigneten Bedingungen mit BOC-ON-(d9) zur Reaktion gebracht werden, um das entsprechende deuterierte Carbamat zu erzeugen. Alternativ dazu können die Proteine in jeder Probe differentiell markiert werden, indem die N-terminalen Aminogruppen bei einer Probe mit Essigsäureanhydrid-(d0) und bei einer anderen Probe mit Essigsäureanhydrid-(d6) geschützt werden. Wie zuvor hierin erörtert wurde, kann vor einer N-terminalen Markierung ein selektiver Schutz der Protein-Lysinreste durchgeführt werden. Der Lysinschutz kann mit einem Reagens wie z. B. O-Methylisoharnstoff oder O-Methylimidazol bewerkstelligt werden, wobei Proteinproben erzeugt werden, die mittels Trypsin spaltbar sind.
Bei anderen Ausführungsbeispielen ist das Schutzmittel dort, wo der Ansatz zur Auswahl von C-terminalen Peptiden verwendet wird, ein Carboxylschutzmittel, und es ist in verschiedenen isotopischen Formen erhältlich, oder kann in verschiedenen isotopischen Formen hergestellt werden. Beispiele von Carboxylschutzgruppen, die zum isotopischen differentiellen Markieren von C-terminalen Peptiden geeignet sind, sind aliphatische oder alizyklische Amine, die in normalen und schweren isotopischen Formen (beispielsweise Methylamin(d0 und d3) und Ethylamin(d0 und d5)) erhältlich sind. Beispielsweise können die freien Carboxylgruppen des Proteins bei einer Probe unter geeigneten Bedingungen mit Methylamin-(d0) zur Reaktion gebracht werden, um das entsprechende Amid zu erzeugen. Bei einer weiteren Probe können die freien Carboxylgruppen des Proteins unter geeigneten Bedingungen mit Methylamin-(d3) zur Reaktion gebracht werden, um das entsprechende deuterierte Amid zu erzeugen. Vorzugsweise wird die Bildung der Amide durch eine Carbodiimid-Aktivierung der Carboxylgruppe bewerkstelligt.
Es wird einleuchten, dass die vorliegende Erfindung nicht auf die hierin beschriebenen differentiell isotopisch markierten Schutzmittel beschränkt sein soll. Fachleuten, die die Erfindung praktizieren wollen, werden ohne weiteres andere stabile isotopisch markierte Reagenzien, die von anderen Chemikalienlieferanten erhältlich sind, einfallen.
Bei einem Ausführungsbeispiel liefert ein differentielles Markieren der Proteintermini (N- oder C-Termini) Informationen darüber, welche Proteine in der ursprünglichen proteomischen Probe terminal blockiert sind. Beispielsweise müssen dann, wenn ein differentielles Markieren der Protein-N-Termini verwendet wird, die N-terminalen Peptide, die die gewählte erfassbare Markierung nicht aufweisen, anfänglich blockiert worden sein. Alternativ dazu weist dann, wenn ein differentielles Markieren der Protein-C-Termini verwendet wird, das Fehlen der gewählten erfassbaren Markierung an bestimmten C-terminalen Peptiden infolge einer enzymatischen oder chemischen Spaltung der proteomischen Proben darauf hin, dass diese Peptide (somit die entsprechenden ursprünglichen Proteine) anfänglich blockiert worden sein müssen.
Wenn die gewünschten terminalen Peptide durch eine Immobilisierung auf einem festen Träger entweder direkt oder indirekt durch einen Linker von dem Gemisch getrennt werden, sind experimentelle Freisetzungsbedingungen vorzugsweise derart, dass eine selektive Freisetzung der terminalen Pep tide aus dem festen Träger ohne eine Spaltung der markierten terminalen Schutzgruppen erfolgt. Beispielsweise können dann, wenn eine differentielle Markierung der Protein-N-Termini verwendet wird, die gewünschten N-terminalen Peptide auf einem geeigneten festen Träger immobilisiert (somit von dem restlichen Peptidgemisch getrennt) und anschließend aus dem Träger freigesetzt werden. Auf eine Freisetzung aus dem festen Träger hin werden die N-terminalen Schutzgruppen, die eine geeignete erfassbare Markierung aufweisen, an den Peptiden zurückgehalten. Unter derartigen Bedingungen kann das N-terminale Schutzmittel zum differentiellen isotopischen Markieren zur MS-Quantifizierung verwendet werden. In der Technik sind eine Vielzahl von Amino- oder Carboxylschutzgruppen erhältlich, die zur Immobilisierung auf verschiedenen festen Trägern geeignet sind. Fachleute können ein Schutzmittel, optional einen Linker, einen festen Träger und Freisetzungsbedingungen auswählen, die ein Zurückhalten der Schutzgruppe an den Peptidtermini auf eine Freisetzung der terminalen Peptide aus dem festen Trägermaterial hin ermöglichen.
Allgemein ist die Anzahl von proteomischen Proben, die zur differentiellen Proteinexpression und/oder -modifikation quantitativ analysiert werden können, nicht begrenzt. Bei bestimmten Ausführungsbeispielen beträgt die Anzahl von proteomischen Proben 2 bis 100, stärker bevorzugt 2 bis 25, noch stärker bevorzugt 2 bis 10. Bei exemplarischen Ausführungsbeispielen beinhaltet die quantitative proteomische Analyse zwei Proben.
Das quantitative System der Erfindung ermöglicht einen Vergleich einer Proteinexpression oder -modifikation in Proben, die durch eine Änderung einer Bedingung oder eines Zellzustands differentiell beeinflusst werden. Derartige Proteine können als Marker für den veränderten Zustand fungieren und eine Basis für „Pharmakoproteomik" (z. B. Identifizierung von Proteinerkrankungsmarkern und Proteinarzneimitteltargets und/oder Charakterisierung von Ansprechver halten auf pharmakologische Therapie) liefern. Bei einem Ausführungsbeispiel dient das System dazu, zu bestimmen, ob ein Protein differentiell vorhanden ist oder zwischen zwei verschiedenen Zellen unterschiedlichen genetischen Hintergrunds, Gewebeursprungs und/oder unterschiedlicher Entwicklungsstufen modifiziert ist, einschließlich z. B. Bakterien-, Hefe-, Pflanzen-, Insekten- und Säugetierzellen. Bei einem anderen Ausführungsbeispiel stammt eine biologische Probe von einem gesunden Subjekt, und eine andere biologische Probe stammt von einem Subjekt, das an einem pathologischen Befund leidet. Bei einem Ausführungsbeispiel kann eine biologische Probe von normalen Zellen stammen, und eine andere biologische Probe stammt von transformierten (z. B. Zellen, die nicht von einem Krebs stammten, jedoch anhand einer im Labor erfolgten Behandlung normaler Zellen erzeugt wurden), erkrankten oder genetisch veränderten Zellen (z. B. von gezielten Mutations- oder Gen-Knockout-Experimenten). Bei einem Ausführungsbeispiel können die biologischen Proben von Zellen stammen, die zuvor verschiedenen externen Stimuli (z. B. einer Verabreichung eines Medikaments; einem Kontakt mit einem potentiell toxischen Material; einer Veränderung des Nährstoffgehalts, Temperatur oder verstrichene Zeit) ausgesetzt wurden. Die Probe kann beispielsweise aus Zellhomogenaten; Zellfraktionen; biologischen Flüssigkeiten einschließlich Urin, Blut und cerebrospinaler Flüssigkeit; Gewebehomogenaten; Tränen; Fäkalien; Speichel; Gemischen von biologischen Molekülen, einschließlich Proteinen, Lipiden, Kohlenhydraten und Nucleinsäuren, die anhand einer teilweisen oder vollständigen Fraktionierung von Zell- oder Gewebehomogenaten erzeugt wurden, ausgewählt sein.
Bei bestimmten Ausführungsbeispielen wird die proteomische Probe dadurch erhalten, dass Proteine aus einer interessierenden biologischen Probe extrahiert werden. Vorzugsweise ist das Extraktionsverfahren derart, dass zwischen mehreren Proteinextraktionsdurchgängen derselben Probe eine geringe oder keinerlei Variation der Proteinexpression beobachtet wird (z. B. ist die Proteinextraktion vorzugsweise äußerst gut reproduzierbar). Reproduzierbarkeit bei Proteinextraktionsverfahren ist wichtig, wenn eine komparative differentielle Proteinexpression und/oder -modifikation zwischen zwei oder mehr Proben ausgewertet werden soll, da Variationen, die auf experimentelle Protokolle zurückzuführen sind, entweder echte Unterschiede bei der Proteinexpression und/oder -modifikation maskieren oder fälschliche Unterschiede nahe legen könnten. Verfahren zum Extrahieren von Proteinen aus Zellen beispielsweise sind in der Technik hinreichend bekannt, und eine Proteinextraktion gemäß diesen Verfahren ist von Probe zu Probe ausreichend reproduzierbar, um aussagekräftige Analysen der Differentialproteinexpression/-modifikation bei zwei oder mehr Proben zu ermöglichen. Beispielsweise könnten Fachleute ausgehend von bekannten Verfahren, um Proteinproben beispielsweise zur Gelelektrophorese oder 2D-SDS-PAGE herzustellen, Extraktionsverfahren ersinnen oder ein bekanntes Verfahren modifizieren, um es an eine bestimmte interessierende Probe anzupassen. Siehe beispielsweise Bollag D. M. et al., „Protein Methods", Wiley-Liss Publishing, 1996; Walsh et al., ABRFnews, 9: 11–21, 1998; Link et al., Electrophoresis 18: 1314–1334, 1998; und Ducret et al., Protein Sci. 7: 706–719, 1998.
Ferner wird ein Suchverfahren zum Bestimmen, ob eine Testverbindung eine Proteinexpression oder -modifikation in einem bestimmten biologischen System moduliert, beschrieben. Bei einem Ausführungsbeispiel dient das Verfahren dazu, zu bestimmen, ob eine Testverbindung die Expression oder Modifikation eines Proteins in einer biologischen Probe moduliert, und das Verfahren umfasst ferner einen Schritt eines Beigebens der Testverbindung (z. B. eines Medikaments oder einer toxischen Substanz) zu einer ersten biologischen Probe, aber nicht zu einer zweiten biologischen Probe (Kontrollprobe). Fachleute werden erkennen, dass das quantitative Verfahren ohne weiteres für ein Format einer Untersuchung mit hohem Durchsatz geeignet ist und dass das Verfah ren somit bei kombinatorischen Verfahren zur Arzneimittelforschung verwendet werden könnte. Viele Verbindungen können bezüglich ihrer Fähigkeit, eine Proteinexpression gemäß der vorliegenden Erfindung zu beeinflussen, überprüft werden. Das Verfahren umfasst ein quantitatives Vergleichen von Proteinkonzentrationen in verschiedenen proteomischen Proben, die aus biologischen Systemen erhalten wurden, die mit verschiedenen Testverbindungen in Berührung gebracht wurden, mit denen einer Kontrollprobe (z. B. die nicht mit Testverbindungen in Berührung gebracht wurde). Ein Unterschied zwischen der gemessenen Menge und der Kontrollmenge liefert einen Hinweis darauf, dass die jeweilige Testverbindung ein bestimmtes Proteinexpressionsmuster moduliert. Proteine, bei denen man feststellt, dass sie durch ein Inberührungbringen mit bestimmten Testverbindungen beeinflusst werden, sind in Frage kommende diagnostische Marker und/oder Arzneimitteltargets. Proteine und Peptide aus jeglicher in der Natur vorkommenden Umgebung oder künstlich kontrollierten Umgebung können durch das System hierin ausgewertet werden.
Hilfsmittel der Erfindung
Nachstehend werden Hilfsmittel (Werkzuge) beschrieben, die nützlich dabei sind, ein Verfahren gemäß der Erfindung auf zweckmäßige Weise durchzuführen. Um die Vielseitigkeit der vorliegenden Erfindung zu erhöhen, können die Reagenzien und/oder Materialien in einer in Form eines Pakets vorliegenden Kombination, in denselben oder in getrennten Behältern bereitgestellt werden, je nach der gegenseitigen Reaktionsfreudigkeit und Stabilität der Reagenzien und/oder Materialien.
Bei einem Ausführungsbeispiel umfasst ein Hilfsmittel, das nützlich dabei ist, einzelne Proteine in einer proteomischen Probe zu identifizieren, Folgendes: (i) ein oder mehrere Schutzmittel zum Schützen der Protein-N- oder -C- Termini und zum Erzeugen von N- oder C-terminal geschützten Proteinen; (ii) ein oder mehrere Spaltungsmittel zum Spalten der terminal geschützten Proteine zu einem Gemisch aus terminal geschützten Peptiden und Peptiden, die freie Amine- und Carboxylgruppen aufweisen; und (iii) eine Einrichtung zum Trennen der terminal geschützten Peptide von dem Gemisch.
Bei bestimmten Ausführungsbeispielen sind die Spaltungsmittel chemische Spaltungsmittel. Bei exemplarischen Ausführungsbeispielen sind die Spaltungsmittel Enzyme zum Erzeugen von Proteinaufschlussprodukten.
Bei bestimmten Ausführungsbeispielen umfassen die Hilfsmittel ferner ein sekundäres Aminschutzmittel zum selektiven Schützen der Lysin-Seitenkettenreste in den Proteinen. Bei einem exemplarischen Ausführungsbeispiel umfassen die Hilfsmittel O-Methylisoharnstoff, O-Methylimidazol oder ihre verwandten chemischen Entitäten oder eine Kombination derselben.
Bei einem anderen Ausführungsbeispiel umfassen die Hilfsmittel zumindest ein Aminschutzmittel zum N-terminalen Schützen von Proteinen in der Probe. Bei einem exemplarischen Ausführungsbeispiel umfassen die Hilfsmittel Essigsäureanhydrid, Boc-Anhydrid, ein Fmoc-Reagens oder eine Kombination derselben.
Bei einem wieder anderen Ausführungsbeispiel ist zumindest ein Schutzmittel ein Carboxylschutzmittel, und die Hilfsmittel umfassen ein oder mehr Carboxylschutzmittel zum C-terminalen Schützen von Proteinen in der Probe. Bei einem weiteren Ausführungsbeispiel umfassen die Hilfsmittel ein Reagens zum Aktivieren von Proteincarboxylgruppen vor dem Schutz. Bei einem Ausführungsbeispiel umfassen die Hilfsmittel ein Carbodiimid-Reagens. Bei einem Ausführungsbeispiel umfassen die Hilfsmittel ein oder mehr aliphatische oder alizyklische Amine zum Zurreaktionbringen mit den Car bodiimid-aktivierten Carboxylgruppen des Proteins. Bei einem exemplarischen Ausführungsbeispiel umfassen die Hilfsmittel Methylamin.
Bei einem Ausführungsbeispiel ist zumindest ein Schutzmittel ein Aminschutzmittel zum N-terminalen Schützen von Proteinen in der Probe. Bei einem anderen Ausführungsbeispiel ist zumindest ein Schutzmittel ein Carboxylschutzmittel zum C-terminalen Schützen von Proteinen in der Probe. Bei einem wieder anderen Ausführungsbeispiel umfasst das Schutzmittel eine reaktive Gruppe oder eine latente reaktive Gruppe, die mit einem festen Träger eine kovalente Bindung eingehen kann.
Bei einem anderen Ausführungsbeispiel umfassen die Hilfsmittel einen festen Träger zum Trennen der gewünschten terminal geschützten Peptide von nicht-terminalen Peptiden in dem Proteinspaltungsgemisch.
Ein oder mehrere feste Träger können mit den Hilfsmitteln versehen sein, wobei sie identisch oder unterschiedlich sind. Bei einem Ausführungsbeispiel umfasst der feste Träger reaktive Gruppen, die sich kovalent an Amine binden können (beispielsweise um nicht-N-terminal geschützte Peptide zu immobilisieren). Beispielsweise kann der feste Träger ein Br-, Cl-, Carbonat-, CHO- oder CO₂H-funktionalisiertes Harz sein. Bei einem exemplarischen Ausführungsbeispiel ist der feste Träger ein fester Träger mit einer DITC-modifizierten Oberfläche. Bei einem anderen Ausführungsbeispiel umfasst der feste Träger reaktive Gruppen, die sich kovalent an Carboxylgruppen binden können (beispielsweise um nicht-C-terminal geschützte Peptide zu immobilisieren). Beispielsweise kann der feste Träger ein NH₂-, OH- oder SH-funktionalisiertes Harz sein. Bei einem exemplarischen Ausführungsbeispiel binden sich die reaktiven Gruppen des festen Trägers über ein Carbodiimid-Zwischenprodukt kovalent an die Carboxylgruppen. Bei einem wieder anderen Ausführungsbeispiel dient der feste Träger zum Immobilisieren von terminal geschützten Peptiden, und der feste Träger weist reaktive Gruppen auf, die sich kovalent an die an den Peptiden vorliegende Schutzgruppe binden können.
Bei bestimmten Ausführungsbeispielen umfassen die Hilfsmittel ein Reagens zum Freisetzen immobilisierter Peptide aus dem festen Träger, falls gewünscht. Beispielsweise können die Hilfsmittel dann, wenn Peptide durch eine Amidbindung auf dem festen Träger immobilisiert werden, eine starke wasserfreie Säure wie z. B. Trifluoressigsäure (TFA – trifluoro acetic acid), Salzsäure (HCl – hydrochloric acid) oder Heptafluorbuttersäure (HFBA – heptafluorobutyric acid) umfassen.
Bei einem anderen Ausführungsbeispiel umfassen die Hilfsmittel einen Linker zum Immobilisieren von terminal geschützten oder nicht-terminal geschützten Peptiden auf dem festen Träger. Der Linker umfasst vorzugsweise zwei reaktive Gruppen: eine, die mit einer vorbestimmten Funktionalität an den zu immobilisierenden Peptiden eine kovalente Bindung eingehen kann, eine andere, die mit den auf der Oberfläche des festen Trägers vorliegenden reagierenden Gruppen eine kovalente Bindung eingehen kann.
Bei einem wieder anderen Ausführungsbeispiel umfassen die Hilfsmittel: (i) ein oder mehr Schutzmittel, die mit Amingruppen reagieren, um die Protein-N-Termini zu schützen; (ii) ein oder mehr Schutzmittel, die mit Carboxylgruppen reagieren, um die Protein-C-Termini zu schützen; (iii) ein oder mehr Spaltungsmittel zum Spalten der N-terminal oder C-terminal geschützten Proteine zu einem Gemisch aus N-terminal oder C-terminal geschützten Peptiden und Peptiden, die freie Amino- und Carboxylgruppen aufweisen; und (iv) eine Einrichtung zum Trennen der N-terminal oder C-terminal geschützten Peptide von dem Gemisch.
Bei bestimmten Ausführungsbeispielen sind die Spaltungsmittel Enzyme zum Erzeugen von Proteinaufschlussprodukten. Bei bestimmten Ausführungsbeispielen ist das Enzym Trypsin, Chymotrypsin, Pepsin, Papain, Prolinendopeptidase, Staph.-Protease, Elastase, Protease K, AspN, Lys-C, Arg-C oder Glu-C. Bei einem exemplarischen Ausführungsbeispiel umfassen die Hilfsmittel Trypsin.
Bei bestimmten Ausführungsbeispielen sind die Spaltungsmittel chemische Verbindungen zum Fragmentieren von Proteinen. Bei bestimmten Ausführungsbeispielen ist die chemische Verbindung Cyanbromid (CNBr), 2-Nitro-5-thiocyanbenzoesäure, N-Bromsuccinamid oder andere reaktive Halogenverbindungen, Hydroxylamin, 1-2M-Ameisen- oder -Essigsäure, Periodatoxidation, 2-(2-Nitrophenylsulfenyl)-3-methyl-3-bromindolenin oder o-Iodosobenzoesäure.
Bei einem wieder anderen Ausführungsbeispiel sind die Hilfsmittel der Erfindung nützlich für einen quantitativen Vergleich von Proteinkonzentrationen, die zwischen zwei oder mehr Proben differentiell vorliegen, und sie umfassen ferner ein oder mehrere Reagenzien zum differentiellen Markieren der N-terminalen und/oder C-terminalen Peptide, die von Proteinen stammen, die in verschiedenen Proben vorliegen.
Bei einem exemplarischen Ausführungsbeispiel werden die Reagenzien differentiell isotopisch markiert und dazu verwendet, die freie COOH-Gruppe von N-terminal geschützten Peptiden und/oder die freie Aminogruppe von C-terminal geschützten Peptiden kovalent zu modifizieren.
Bei einem Ausführungsbeispiel umfassen die Hilfsmittel der Erfindung ein aliphatisches oder alizyklisches Amin in seiner normalen und in seiner deuterierten Form zum selektiven und differentiellen Markieren der freien Carboxylgruppe von N-terminal geschützten Peptiden in verschiedenen Proben. Bei einem exemplarischen Ausführungsbeispiel ist das a liphatische Amin Methylamin oder Ethylamin, und die Hilfsmittel der Erfindung umfassen Methylamin-(d0) und Methylamin-(d3) oder Ethylamin(d0) und Ethylamin-(d5). Vorzugsweise umfassen die Hilfsmittel ferner ein Carbodiimid-Reagens zum Aktivieren der freien Carboxylgruppe vor einem Koppeln mit dem aliphatischen oder alizyklischen Amin.
Bei einem anderen Ausführungsbeispiel umfassen die Hilfsmittel ein ein Carbamat bildendes Reagens in seiner normalen und in seiner deuterierten Form zum selektiven und differentiellen Markieren der freien Aminogruppe von C-terminal geschützten Peptiden in verschiedenen Proben als den entsprechenden Carbamat-Anteil. Bei einem exemplarischen Ausführungsbeispiel ist das ein Carbamat bildende Reagens 2-tert-Butyloxycarbonylamin-2-phenylacetonitril (d. h. BOC-ON), und die Hilfsmittel umfassen BOC-ON-(d0) und BOC-ON-(d9). Bei einem wieder anderen Ausführungsbeispiel umfassen die Hilfsmittel ein ein Amid bildendes Mittel in seiner normalen und in seiner deuterierten Form zum selektiven und differentiellen Markieren der freien Aminogruppe von C-terminal geschützten Peptiden in verschiedenen Proben als den entsprechenden Amid-Anteil. Bei einem exemplarischen Ausführungsbeispiel ist das ein Amid bildende Reagens Essigsäureanhydrid, und die Hilfsmittel umfassen Essigsäureanhydrid-(d0) und Essigsäureanhydrid-(d6).
Bei einem weiteren Ausführungsbeispiel umfassen die Hilfsmittel ein oder mehr Schutzmittel zum Schützen der Protein-N-Termini oder -C-Termini in verschiedenen Proben, und die Schutzmittel umfassen differentiell isotopisch markierte erfassbare Markierungen. Somit wird ein quantitativer Vergleich von Konzentrationen von N-terminal oder C-terminal geschützten Peptiden (somit Konzentrationen der entsprechenden Proteine) in verschiedenen Proben dadurch bewirkt, dass die relativen Mengen der differentiell isotopisch markierten erfassbaren Markierungen in verschiedenen Proben verglichen werden.
Bei einem Ausführungsbeispiel umfassen die Hilfsmittel ein ein Carbamat bildendes Reagens in seiner normalen und in seiner deuterierten Form zum selektiven und differentiellen Markieren der freien N-terminalen freien Aminogruppen der Proteine in verschiedenen Proben als den entsprechenden Carbamat-Anteil. Bei einem exemplarischen Ausführungsbeispiel ist das ein Carbamat bildende Reagens 2-tert-Butyloxycarbonylamin-2-phenylacetonitril (d. h. BOC-ON), und die Hilfsmittel umfassen BOC-ON-(d0) und BOC-ON-(d9). Bei einem wieder anderen Ausführungsbeispiel umfassen die Hilfsmittel ein ein Amid bildendes Mittel in seiner normalen und in seiner deuterierten Form zum selektiven und differentiellen Markieren der N-terminalen freien Aminogruppen der Proteine in verschiedenen Proben als den entsprechenden Amid-Anteil. Bei einem exemplarischen Ausführungsbeispiel ist das ein Amid bildende Reagens Essigsäureanhydrid, und die Hilfsmittel umfassen Essigsäureanhydrid-(d0) und Essigsäureanhydrid-(d6).
Bei einem Ausführungsbeispiel umfassen die Hilfsmittel ein aliphatisches oder alizyklisches Amin in seiner normalen und in seiner deuterierten Form zum selektiven und differentiellen Markieren der C-terminalen freien Carboxylgruppen der Proteine in verschiedenen Proben. Bei einem exemplarischen Ausführungsbeispiel ist das aliphatische Amin Methylamin oder Ethylamin, und die Hilfsmittel umfassen Methylamin-(d0) und Methylamin-(d3) oder Ethylamin(d0) und Ethylamin-(d5). Vorzugsweise umfassen die Hilfsmittel ferner ein Carbodiimid-Reagens zum Aktivieren der freien Carboxylgruppe vor einem Koppeln mit dem aliphatischen oder alizyklischen Amin.
VERANSCHAULICHUNG ANHAND VON BEISPIELEN
Der Praktizierende kann auf fundierte Literatur über Peptidchemie in Kombination mit den in dem vorliegenden Dokument enthaltenen Informationen zurückgreifen, um Anleitung über synthetische Strategien, Schutzgruppen und andere Materialien und Verfahren zu erhalten, die zur Herstellung der terminalen Peptide der vorliegenden Erfindung nützlich sind. Überdies wird der Praktizierende auf die in dem vorliegenden Dokument bereitgestellte(n) spezifische(n) Anleitung und Beispiele verwiesen, die sich auf verschiedene exemplarische Verfahren zum Gewinnen derartiger terminaler Peptide und zum Verwenden derselben für Proteinidentifikations- und Quantifizierungszwecke beziehen. Die Verfahren der vorliegenden Erfindung werden anhand der Beispiele, die manche der Prozesse, anhand derer die erfindungsgemäßen terminalen Peptide hergestellt oder verwendet werden, veranschaulichen, besser verständlich. Jedoch wird man erkennen, dass diese Beispiele die Erfindung nicht einschränken. Variationen der Erfindung, die derzeit bekannt sind oder weiterentwickelt werden, gelten als in dem Schutzumfang der vorliegenden Erfindung, wie er hierin beschrieben und an späterer Stelle beansprucht wird, enthalten.
Gemäß der vorliegenden Erfindung können beliebige verfügbare Techniken dazu verwendet werden, die terminalen Peptide der Erfindung herzustellen oder bereitzustellen. Beispielsweise können eine Vielzahl von synthetischen Lösungsphase-Verfahren wie z. B. die anschließend ausführlich erörterten verwendet werden.
Die beim Herstellen der terminalen Peptide der Erfindung verwendeten Ausgangsmaterialien und Reagenzien sind entweder von gewerblichen Herstellern wie z. B. Aldrich Chemical Company (Milwaukee, WI), Bachem (Torrance, CA), Sigma (St. Louis, MO) erhältlich oder werden mittels Verfahren hergestellt, die Fachleuten hinreichend bekannt sind und bei denen Prozeduren befolgt werden, die beispielsweise in Dokumenten wie Fieser und Fieser 1991, „Reagents for Organic Synthesis", Bd. 1–17, John Wiley and Sons, New York, NY, 1991; Rodd 1989 „Chemistry of Carbon Compounds", Bd. 1–5 und Anhänge, Elsevier Science Publishers, 1989; „Organic Reactions", Bd. 1–40, John Wiley and Sons, New York, NY, 1991; März 2001, „Advanced Organic Chemistry", 5. Ausgabe John Wiley and Sons, New York, NY; und Larock 1990, „Comprehensive Organic Transformations: A Guide to Functional Group Preparations", 2. Ausgabe VCH Publishers, beschrieben sind.
1. Ansatz der Auswahl von N-terminalen Peptiden – allgemeines Verfahren
Ein Schutz der ε-Lysin- und -Arginin-Aminogruppen wird erzielt, indem eine Proteinprobe unter geeigneten Bedingungen mit O-Methylisoharnstoff behandelt wird (beispielsweise kann eine Reaktion, die bei Beardsley et al., „Enhancing the intensities of lysine-terminated tryptic peptide ions in matrix-assisted laser desorption/ionization spectrometry", Rapid Commun. Mass Spectrom., 14: 2147–2153, 2000, beschrieben ist, an eine Proteinprobe angepasst werden). Die Probenproteine werden anschließend durch eine Reaktion mit einem geeigneten Schutzmittel (z. B. Essigsäureanhydrid) unter geeigneten Bedingungen N-terminal geschützt. Die Probe kann in dieser Stufe gereinigt werden. Beispielsweise kann überschüssiges Lysin zugegeben werden, um Restchemikalien zu quenschen. Das Rohgemisch kann anschließend einem Trypsinaufschluss unterzogen werden, wodurch ein Gemisch aus N-terminal geschützten Peptiden und Peptiden, die freie Amino- und Carboxylgruppen aufweisen, die den Spaltungsstellen entsprechen, erzeugt wird. Das Peptidgemisch kann anschließend auf einen DITC-modifizierten festen Träger gegeben werden, der Anteile, die reaktive freie Amine aufweisen, einfängt (alternativ kann eine mit Gluteraldehyd modifizierte Oberfläche verwendet werden), wodurch eine Immobilisierung der nicht-N-terminal geschützten peptidischen Fragmente in dem Gemisch bewirkt wird. Nach einem Waschen des festen Trägers können die gewünschten N-terminal geschützten Peptide aufgefangen und anhand von MS, vorzugsweise Tandem-MS, analysiert werden. Die Peptide werden fragmentiert, und ihre MS-Fragmentierungsmuster werden dazu verwendet, verfügbare Datenbanken zu durchsuchen, um die Aminosäuresequenz der terminalen Peptide zu bestimmen. Die Aminosäuresequenzinformationen können anschließend dazu verwendet werden, Proteindatenbanken zu durchsuchen, um die Mutterproteine, von denen die terminalen Peptide stammen können, zu identifizieren.
2. Ein Ausführungsbeispiel des Ansatzes der Auswahl von N-terminalen Peptiden
Bei einem exemplarischen Ausführungsbeispiel wird eine Proteinprobe aus einer biologischen Probe erhalten. Die Probe wird zwei Stunden lang mit einem molaren Überschuss von 100–1000 an O-Methylisoharnstoff in H₂O bei einem pH-Wert von 9 und bei 50°C behandelt, wodurch die Protein-Lysinreste in der Probe selektiv geschützt werden und ein mittels Trypsin spaltbares Proteingemisch erzeugt wird (das Reaktionsgemisch kann durch Zugabe von Ammoniumhydroxid auf einen pH-Wert von 9 eingestellt werden). Der Schutz der N-terminalen freien Aminogruppen des Proteins wird dadurch bewerkstelligt, dass zwei Stunden lang bei 50°C eine Reaktion mit einem überschüssigen Essigsäureanhydrid (z. B. molarer Überschuss von 10–100) in H₂O bei einem pH-Wert von 9 durchgeführt wird. Die Probe wird anschließend einem Trypsinaufschluss unterzogen, indem das N-terminal geschützte Proteingemisch 15 Stunden lang bei 37°C mit einer auf einen pH-Wert von 7,5 gepufferten Trypsinlösung zur Reaktion gebracht wird. Beispielsweise kann ein Enzym/Substrat-Verhältnis von 1:20 w/w verwendet werden (z. B. 1 μg Trypsin und 20 μg Proteine). Das resultierende Peptidgemisch wird anschließend mit einem DITC-modifizierten festen Träger in Berührung gebracht, wodurch eine Immobilisierung von Peptiden, die einen freien und reaktiven N-Terminus aufweisen, auf der festen Oberfläche bewirkt wird. Nach ausreichenden Waschen der Oberfläche mit einem geeigneten Lösungsmittel (z. B. H₂O/AcCN/AcOH v/v 50/50/0,2) werden die gewünschten N-terminal geschützten Peptide in dem Waschlösungsmittel aufgefangen. Die Lösungsmittelfraktionen, die die gewünschten N-terminalen Peptide enthalten, können lyophilisiert werden (z. B. auf SpeedVac). Alternativ dazu können die Fraktionen an einer Umkehrphasenchromatographie-Säule konzentriert werden. Der Peptidrest wird mittels LC/MS analysiert. Die Peptide werden fragmentiert, und ihre MS-Fragmentierungsmuster werden dazu verwendet, verfügbare Datenbanken zu durchsuchen, um die Aminosäuresequenz der terminalen Peptide zu bestimmen. Die Aminosäuresequenzinformationen können anschließend dazu verwendet werden, Proteindatenbanken zu durchsuchen, um die Mutterproteine, von denen die terminalen Peptide stammen können, zu identifizieren.
3. Vergleichende differentielle Proteinexpression in zwei proteomischen Proben unter Verwendung des erfindungsgemäßen Ansatzes zur Auswahl von N-terminalen Peptiden – differentielles isotopisches Markieren vor einer enzymatischen Proteinspaltung
Bei einem exemplarischen Ausführungsbeispiel werden Proteinproben aus zwei Zellzuständen gewonnen (z. B. erkrankte gegenüber normaler Zelle oder beanspruchte gegenüber normaler Zelle). Jede Probe wird mit einem molaren Überschuss von 100–1000 an O-Methylisoharnstoff in H₂O zwei Stunden lang bei einem pH-Wert von 9 und bei 50°C behandelt, wodurch die Protein-Lysinreste selektiv geschützt und zwei mittels Trypsin spaltbare Proteingemische erzeugt werden (durch Beigabe von Ammoniumhydroxid kann das Reaktionsgemisch auf einen pH-Wert von 9 eingestellt werden). Bei einer Probe werden Protein-N-Termini unter geeigneten Bedingungen mit Essigsäureanhydrid-d(0) (alternativ dazu kann auch BOC-ON-(d0) verwendet werden) geschützt. Bei der zweiten Probe werden Protein-N-Termini unter geeigneten Bedingungen mit BOC-ON-(d9) geschützt. Beispielsweise umfassen geeignete Reaktionsbedingungen zum Schutz der N-terminalen freien Aminogruppen des Proteins in jeder Probe eine zweistündige Reaktion mit einem überschüssigen Essigsäureanhydrid-d(0) oder -d(6) (z. B. molarer Überschuss von 10–100) in H₂O bei einem pH-Wert von 9 und bei 50°C. Die resultierenden Proben werden kombiniert, und die kombinierte Probe wird anschließend einem Trypsinaufschluss unterzogen (z. B. 15-stündige Reaktion bei 37°C mit einer auf einen pH-Wert von 7,5 gepufferten Trypsinlösung). Das resultierende Peptidgemisch wird anschließend mit einem DITC-modifizierten festen Träger in Berührung gebracht, wodurch eine Immobilisierung von Peptiden, die einen freien und reaktiven N-Terminus aufweisen, auf der festen Oberfläche bewirkt wird. Nach einem ausreichenden Waschen der DITC-modifizierten Oberfläche mit einem geeigneten Lösungsmittel (z. B. H₂O/AcCN/AcOH v/v 50/50/0,2) werden die gewünschten differentiell isotopisch markierten N-terminalen Peptide in den Waschungen aufgefangen. Falls gewünscht, können die Lösungsmittelfraktionen, die die gewünschten N-terminalen Peptide enthalten, separat lyophilisiert werden; z. B. auf SpeedVac (alternativ dazu können die Fraktionen separat an einer Umkehrphasenchromatographie-Säule konzentriert werden). Ein aliqouter Teil wird mittels LC/MS analysiert, und die differentiellen Mengen an Proteinen in den ursprünglichen Proben können ermittelt werden, indem die relativen Mengen jedes differentiell isotopisch markierten Peptids in dem Gemisch gemessen werden. Falls Tandem-MS verwendet wird, kann die Aminosäuresequenz jedes Peptids in dem Gemisch ermittelt werden, und die Identität des entsprechenden Proteins in den ursprünglichen Proben kann anhand einer Datenbanksuche festgestellt werden.
4. Vergleichende differentielle Proteinexpression in zwei proteomischen Proben unter Verwendung des erfindungsgemäßen Ansatzes zur Auswahl von N-terminalen Peptiden – Differentielles isotopisches Markieren nach einer enzymatischen Proteinspaltung
Bei einem exemplarischen Ausführungsbeispiel werden Proteinproben aus zwei Zellzuständen gewonnen (z. B. erkrankte gegenüber normaler Zelle oder beanspruchte gegenüber normaler Zelle). Jede Probe wird mit einem molaren Überschuss von 100–1000 an O-Methylisoharnstoff in H₂O zwei Stunden lang bei einem pH-Wert von 9 und bei 50°C behandelt, wodurch die Protein-Lysinreste selektiv geschützt und zwei mittels Trypsin spaltbare Proteingemische erzeugt werden (durch Beigabe von Ammoniumhydroxid kann das Reaktionsgemisch auf einen pH-Wert von 9 eingestellt werden). Für jede Probe wird ein Schutz der N-terminalen freien Aminogruppen des Proteins dadurch bewerkstelligt, dass zwei Stunden lang eine Reaktion mit einem überschüssigen Essigsäureanhydrid (z. B. molarer Überschuss von 10–100) in H₂O bei einem pH-Wert von 9 und bei 50°C durchgeführt wird. Jede Probe wird anschließend einem Trypsinaufschluss unterzogen, indem man jedes N-terminal geschützte Proteingemisch 15 Stunden lang bei 37°C mit einer auf einen pH-Wert von 7,5 gepufferten Trypsinlösung reagieren lässt, wodurch zwei Peptidgemische erzeugt werden. Jedes resultierende Peptidgemisch wird anschließend separat mit einem DITC-modifizierten festen Träger in Berührung gebracht, wodurch eine Immobilisierung von Peptiden, die einen freien und reaktiven N-Terminus aufweisen, auf der festen Oberfläche bewirkt wird. Nach einem ausreichenden Waschen jeder DITC-modifizierten Oberfläche mit einem geeigneten Lösungsmittel (z. B. H₂O/AcCN/AcOH v/v 50/50/0,2) werden die gewünschten N-terminal geschützten Peptide für jede Probe separat in den Waschungen aufgefangen. Die Lösungsmittelfraktionen, die die gewünschten N-terminalen Peptide enthalten, können separat lyophilisiert werden (z. B. auf SpeedVac). Alternativ dazu können die Fraktionen separat an einer Umkehrphasenchromatographie-Säule konzentriert werden. Bei einer Probe werden die freien Peptid-C-Termini mit einem geeigneten Carbodiimid-Reagens aktiviert und anschließend mit Methylamin-(d0) zur Reaktion gebracht. In der zweiten Probe werden die freien Peptid-C-Termini mit einem geeigneten Carbodiimid-Reagens aktiviert und anschließend mit Methylamin-(d3) zur Reaktion gebracht. Die Proben werden anschließend kombiniert, und das resultierende Gemisch aus differentiell isotopisch markierten Peptiden wird mittels LC/MS analysiert. Die differentiellen Mengen an Proteinen in den ursprünglichen Proben können ermittelt werden, indem die relativen Mengen jedes differentiell isotopisch markierten Peptids in dem Gemisch gemessen werden. Falls Tandem-MS verwendet wird, kann die Aminosäuresequenz jedes Peptids in dem Gemisch ermittelt werden, und die Identität des entsprechenden Proteins in den ursprünglichen Proben kann anhand einer Datenbanksuche festgestellt werden.

Claims

Ein Verfahren zum Verringern der Komplexität einer proteomischen Probe, das folgende Schritte aufweist: (A) Bereitstellen eines oder mehrerer Proteine; (B) Schützen der N- oder C-Termini des Proteins mit einem geeigneten Schutzmittel; (C) Spalten der terminal geschützten Proteine mit einem geeigneten Spaltungsmittel, wodurch ein Gemisch von terminal geschützten Peptiden und nicht-terminal geschützten Peptiden erzeugt wird, die freie Amino- und Carboxylgruppen aufweisen, die den Spaltungsstellen entsprechen; und (D) Trennen der terminal geschützten Peptide von dem Peptidgemisch durch selektives Immobilisieren der terminal geschützten Peptide oder der nicht-terminal geschützten Peptide auf einem festen Träger, wodurch die Probenkomplexität auf ein terminales Peptid pro Probenprotein verringert wird.
Das Verfahren gemäß Anspruch 1, das den folgenden zusätzlichen Schritt aufweist: (E) Erfassen der terminal geschützten Peptide.
Das Verfahren gemäß Anspruch 1 oder Anspruch 2, bei dem bei dem Schritt des Schützens Seitenkettenamino- oder -carboxylgruppen gleichzeitig geschützt werden.
Das Verfahren gemäß Anspruch 1 oder Anspruch 2, bei dem: (a) bei dem Schritt des Schützens das Schutzmittel keine Affinitätsmarkierung aufweist; oder (b) das Verfahren ferner einen Schritt eines selektiven Schützens der Amino- oder Carboxylseitenkettengruppen mit einem geeigneten sekundären Schutzmittel aufweist; oder (c) bei dem Schritt des Spaltens das Spaltungsmittel ein Enzym ist, beispielsweise Trypsin, Chymotrypsin, Pepsin, Papain, Prolinendopeptidase, Staph-Protease, Elastase, Protease K, AspN, Lys-C, Arg-C oder Glu-C; oder (d) bei dem Schritt des Spaltens das Spaltungsmittel ein chemisches Spaltungsmittel ist, beispielsweise Cyanogenbromid (CNBr), 2-Nitro-5-thiocyanobenzoesäure, N-Bromsuccinamid und andere reaktive Halogenverbindungen, Hydroxylamin, 1–2 M Ameisen- oder Essigsäure, Periodatoxidation, 2-(2-Nitrophenylsulfenyl)-3-methyl-3-bromindolenin oder o-Jodosobenzoesäure; oder (e) bei dem Schritt des Schützens das Schutzmittel eine Radiomarkierung, eine fluoreszente Markierung, eine kolorimetrische Markierung oder eine isotope Markierung aufweist.
Das Verfahren gemäß Anspruch 1 oder Anspruch 2, bei dem: a) der Schritt des Schützens ein Schützen der N-terminalen freien Aminogruppen des Proteins beinhaltet und das Schutzmittel ein Aminschutzmittel ist, und beispielsweise: (i) bei dem das Schutzmittel auf ein Reagieren mit den N-terminalen freien Aminogruppen des Proteins hin einen Amidanteil bildet und das Schutzmittel Essigsäureanhydrid ist; oder (ii) das Schutzmittel auf ein Reagieren mit den N-terminalen freien Aminogruppen des Proteins hin einen Boc- oder Fmoc-Carbamatanteil bildet und das Schutzmittel Boc-Anhydrid oder ein Fmoc-Reagens ist; oder (iii) das Verfahren ferner einen Schritt eines selektiven Schützens der Protein-Lysin-Seitenkettenreste mit einem geeigneten zweiten Schutzmittel, z. B. O-Methyl-Isourea oder O-Methylimidazol, aufweist; oder (b) der Schritt des Schützens ein Schützen der C-terminalen freien Carboxylgruppen des Proteins beinhaltet und das Schutzmittel ein Carboxylschutzmittel ist, und bei dem beispielsweise: (i) bei dem Schritt des Schützens Seitenkettencarboxylgruppen gleichzeitig geschützt werden; oder (ii) der Schritt des Schützens ein Zurreaktionbringen des Carboxylschutzmittel mit den Carbodiimid-aktivierten Carboxylgruppen der Protein-C-Termini beinhaltet und das Carboxylschutzmittel z. B. aus einem alicyclischen Amin, einem aliphatischen Amin, Methylamin und Ethylamin ausgewählt ist.
Das Verfahren gemäß Anspruch 1 oder Anspruch 2, bei dem der Schritt des Trennens folgende Schritte umfasst: (a) selektives Immobilisieren der nicht-terminal geschützten Peptide auf einem festen Träger; (b) Waschen des festen Trägers mit einem geeigneten Lösungsmittel; und (c) Auffangen derjenigen Lösungsmittelfraktionen, die die terminal geschützten Peptide enthalten.
Das Verfahren gemäß Anspruch 6, bei dem: (a) der feste Träger kein mit einer Affinitätsmarkierung modifizierter Träger ist; oder (b) das Verfahren ferner einen Schritt eines Freisetzens der immobilisierten Peptide aus dem festen Träger mit einem geeigneten Freisetzungsmittel umfasst und beispielsweise der feste Träger ein DITC-modifizierter Träger ist und das Freisetzungsmittel eine starke wasserfreie Säure ist, z. B. TFA, HCl oder HFBA; oder (c) die nicht-terminal geschützten Peptide nicht-N-terminal geschützte Peptide sind und der feste Träger reaktive Gruppen aufweist, die mit Amingruppen eine kovalente Bindung eingehen können, und beispielsweise der feste Träger ein DITC-modifizierter Träger ist; oder (d) die nicht-terminal geschützten Peptide nicht-N-terminal geschützte Peptide sind und der feste Träger reaktive Gruppen aufweist, die mit Carboxylgruppen eine kovalente Bindung eingehen können, und wobei beispielsweise: (i) die reaktiven Gruppen des festen Trägers Aminogruppen sind; oder (ii) der Schritt des Immobilisierens eine durch Carbodiimid katalysierte Reaktion beinhaltet; oder (iii) bei dem Schritt des Immobilisierens die nicht-terminal geschützten Peptide indirekt durch einen Linker, z. B. einen photochemisch, chemisch oder enzymatisch spaltbaren Linker, kovalent an den festen Träger gebunden werden.
Das Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, bei dem: (a) das Schutzmittel eine reaktive Gruppe trägt, die mit einem geeigneten festen Träger eine kovalente Bindung eingehen kann; oder (b) der Schritt des Trennens folgende Schritte umfasst: (i) selektives Immobilisieren der terminal geschützten Peptide auf einem festen Träger; (ii) Waschen des festen Trägers mit einem geeigneten Lösungsmittel, um Peptide zu beseitigen, die nicht kovalent an den festen Träger angelagert sind; und (iii) Freisetzen der terminal geschützten Peptide aus dem festen Träger, und bei dem beispielsweise bei dem Schritt des Immobilisierens die terminal geschützten Peptide durch einen Linker indirekt kovalent an den festen Träger gebunden werden.
Das Verfahren gemäß Anspruch 2, bei dem: (a) der Schritt des Erfassens massenspektrometrische Techniken verwendet; oder (b) der Schritt des Erfassens Tandem-Massenspektrometrie verwendet; oder (c) der Schritt des Erfassens Tandem-Massenspektrometrie verwendet, und bei dem die Terminal-Geschütztes-Peptid-MS-Fragmentierungsmuster dazu verwendet werden, verfügbare Datenbanken zu durchsuchen, um die Aminosäuresequenz der terminalen Peptide zu ermitteln, und beispielsweise die Aminosäuresequenzinformationen dazu verwendet werden, Proteindatenbanken zu durchsuchen, um die Mutterproteine zu identifizieren, von denen die terminalen Peptide abgeleitet sein können.
Das Verfahren gemäß Anspruch 9, bei dem die massenspektrometrische Technik mit einer Trennungstechnik, beispielsweise HPLC, Gelelektrophorese oder CE, gekoppelt ist.
Das Verfahren gemäß Anspruch 1, bei dem das eine oder die mehreren Proteine in zwei oder mehr Proben enthalten sind und bei dem die zwei oder mehr Proben vor dem Spaltungsschritt oder nach dem Trennungsschritt differentiell markiert werden und wobei das Verfahren ferner einen folgenden Schritt umfasst: (E) Messen relativer Mengen an differentiell markierten, terminal geschützten Peptiden.
Das Verfahren gemäß Anspruch 11, bei dem die zwei oder mehr differentiell markierten Proben nach einem Markieren von Peptiden kombiniert werden.
Das Verfahren gemäß Anspruch 11 oder Anspruch 12, bei dem: (a) bei dem Schritt des Schützens das Schutzmittel keine Affinitätsmarkierung aufweist; oder (b) das Verfahren ferner einen Schritt eines selektiven Schützens der Amino- oder Carboxylseitenkettengruppen mit einem geeigneten sekundären Schutzmittel aufweist; oder (c) die erfassbaren Markierungen, die zum differentiellen Markieren der N- oder C-Termini des Proteins jeder Probe verwendet werden, beispielsweise unter Verwendung von Deuterium differentiell isotopisch markiert werden; oder (d) der Schritt des Trennens gemäß dem Verfahren eines der Ansprüche 6, 7 und 8 ausgeführt wird.
Das Verfahren gemäß Anspruch 11, bei dem: (a) der Schritt des differentiellen Markierens der terminal geschützten Peptide ein differentielles Markieren der N-terminal geschützten Peptide beinhaltet und das Reagens, das eine erfassbare Markierung aufweist, mit den C-terminalen freien Carboxylgruppen der N-terminal geschützten Peptide zur Reaktion gebracht wird, und bei dem beispielsweise: (i) die C-terminalen Carboxylgruppen Carbodiimid-aktiviert sind; oder (ii) das Reagens, das eine erfassbare Markierung aufweist, ein aliphatisches oder alicyclisches Amin isotop oder ein aliphatisches Aminisotop ist, z. B. Methylamin-d(0) oder Methylamin-d(3); oder (b) der Schritt des differentiellen Markierens der terminal geschützten Peptide ein differentielles Markieren der C-terminal geschützten Peptide beinhaltet und das Reagens, das eine erfassbare Markierung aufweist, mit den N-terminalen freien Aminogruppen der C-terminal geschützten Peptide zur Reaktion gebracht wird, und bei dem beispielsweise: (i) das Schutzmittel auf ein Reagieren mit den N-terminalen freien Aminogruppen der C-terminal geschützten Peptide hin einen Amidanteil bildet und das Schutzmittel Essigsäureanhydrid-d(0) oder Essigsäureanhydrid-d(6) ist, oder (ii) das Schutzmittel auf ein Reagieren mit N-terminalen freien Aminogruppen der C-terminal geschützten Peptide hin einen Boc-Carbamatanteil bildet, und das Schutzmittel BOC-ON-d(0) oder BOC-ON-d(9) ist.
Das Verfahren gemäß Anspruch 12, bei dem: (a) der Schritt des differentiellen Markierens der Proteine ein differentielles Markieren der Protein-N-Termini beinhaltet, und das Schutzmittel, das eine erfassbare Markierung aufweist, ein Aminschutzmittel ist, und beispielsweise das Schutzmittel Essigsäureanhydrid-d(0) oder Essigsäureanhydrid-d(6), BOC-ON-d(0) oder BOC-ON-d(9) ist; oder (b) der Schritt des differentiellen Markierens der Proteine ein differentielles Markieren der Protein-C-Termini beinhaltet, und das Schutzmittel, das eine erfassbare Markierung aufweist, ein Carboxylschutzmittel ist, und bei dem beispielsweise: (i) bei dem Schritt des differentiellen Markierens die C-terminalen Carboxylgruppen Carbodiimid-aktiviert sind, oder (ii) das Schutzmittel ein aliphatisches oder alicyclisches Aminisotop oder ein aliphatisches Aminisotop ist, z. B. Methylamin-d(0) oder Methylamin-d(3).
Das Verfahren gemäß Anspruch 11 oder Anspruch 12, bei dem: (a) der Schritt des Erfassens eine massenspektrometrische Technik verwendet; oder (b) der Schritt des Erfassens Tandem-Massenspektrometrie verwendet.
Das Verfahren gemäß Anspruch 16, bei dem die massenspektrometrische Technik mit einer Trennungstechnik, beispielsweise HPLC, Gelelektrophorese oder CE, gekoppelt ist.
Das Verfahren gemäß Anspruch 1 oder Anspruch 12, bei dem: (a) der Schritt des Erfassens eine massenspektrometrische Technik verwendet, die massenspektrometrische Technik Tandem-Massenspektrometrie ist und die Terminal-Geschütztes-Peptid-MS-Fragmentierungsmuster dazu verwendet werden, verfügbare Datenbanken zu durchsuchen, um die Aminosäuresequenz der terminalen Peptide zu ermitteln, und beispielsweise die Aminosäuresequenzinformationen dazu verwendet werden, Proteindatenbanken zu durchsuchen, um die Mutterproteine zu identifizieren, von denen die terminalen Peptide abgeleitet sein können; oder (b) der Schritt des Erfassens eine massenspektrometrische Technik verwendet, die massenspektrometrische Technik mit einer Trennungstechnik gekoppelt ist, die massenspektrometrische Technik Tandem-Massenspektrometrie ist und die Terminal-Geschütztes-Peptid-MS-Fragmentierungsmuster dazu verwendet werden, verfügbare Datenbanken zu durchsuchen, um die Aminosäuresequenz der terminalen Peptide zu ermitteln, und beispielsweise die Aminosäuresequenzinformationen dazu verwendet werden, Proteindatenbanken zu durchsuchen, um die Mutterproteine zu identifizieren, von denen die terminalen Peptide abgeleitet sein können; oder (c) unterschiedliche Proben Proteine darstellen, die ansprechend auf unterschiedliche äußere Stimuli oder eine Veränderung eines Zellenzustands oder von Umwelt- oder pathologischen Bedingungen exprimiert werden.