DE602005001302T2

DE602005001302T2 - Bestimmung von analytcharakteristika auf der grundlage von bindungseigenschaften

Info

Publication number: DE602005001302T2
Application number: DE602005001302T
Authority: DE
Inventors: Darryl J. Boxborough PAPPIN; Philip L. Westborough ROSS; Steven R. Lunenburg GUERTIN
Original assignee: Applera Corp
Current assignee: Applied Biosystems LLC
Priority date: 2004-03-01
Filing date: 2005-03-01
Publication date: 2008-02-14
Anticipated expiration: 2025-03-02
Also published as: DE602005001302D1; ATE364178T1; US20050208550A1; CA2557997C; US7868547B2; JP4613320B2; WO2005085869A2; JP2007525671A; EP1623234A2; EP1623234B1; WO2005085869A3; JP2010156706A; CA2557997A1

Description

Gebiet der Erfindung:
Die Erfindung betrifft die Bestimmung von Analytencharakteristika basierend auf Bindungseigenschaften unter Verwendung von Massenanalyse und unterschiedlichen Markierungsreagenzien.
Stand der Technik:
Bonenfant, D. et al., PNAS, 100: 880-885 (2003), beschreiben die Quantifizierung von Veränderungen der Proteinphosphorylierung unter Verwendung eines Verfahrens, das auf einer Markierung mit stabilen Isotopen und Massenspektrometrie basiert.
Beschreibung der Erfindung:
1. Erfindungsgemäßer Gegenstand:
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Analysieren, umfassend:

i) Auswählen von mehr als einer zu analysierenden Probe, wobei die Proben jeweils einen oder mehrere Analyten umfassen, von denen einige eine Modifikation von Interesse umfassen können,
ii) gegebenenfalls Prozessieren einer oder mehrerer der Proben oder einer Fraktion davon,
iii) gegebenenfalls Behandeln einer oder mehrerer der Proben oder einer Fraktion davon mit einem Enzym oder einer Chemikalie unter Bedingungen, die die Modifikation von Interesse von so modifizierten Analyten entfernt, mit der Maßgabe, dass nicht alle Proben oder Fraktionen davon mit dem Enzym oder der Chemikalie behandelt werden,
iv) Auftragen jeder Probe oder einer Fraktion davon auf einen Affinitätsträger, wobei der Affinitätsträger fähig ist, modifizierte von nicht modifizierten Analyten abzutrennen, und alle Affinitätsträger die gleiche stationäre Phase umfassen, aber wobei jede Probe oder Fraktion davon auf einen unterschiedlichen Affinitätsträger aufgetragen wird,
v) gegebenenfalls getrenntes Sammeln als eine Fraktion der Analyten, die durch jeden Affinitätsträger fließen,
vi) getrenntes Sammeln als eine Fraktion von Analyten, die an jeden Affinitätsträger binden, durch Eluieren der gebundenen Analyten unter geeigneten Bedingungen,
vii) Kodieren jeder Fraktion von Interesse mit dem einen oder mehreren Analyten, die an den Affinitätsträger binden, durch Reaktion mit einem einzigartigen isobaren und/oder isomeren Markierungsreagenz eines Satzes von isobaren und/oder isomeren Markierungsreagenzien,
viii) gegebenenfalls Kodieren jeder Fraktion von Interesse mit dem einen oder mehreren Analyten, die durch den Affinitätsträger flossen, durch Reaktion mit einem einzigartigen isobaren und/oder isomeren Markierungsreagenz des Satzes von isobaren und/oder isomeren Markierungsreagenzien,
ix) Mischen zweier oder mehrerer Fraktionen, die mit isobaren und/oder isomeren Markierungsreagenzien kodiert sind,
x) gegebenenfalls Zusetzen einer bekannten Menge eines oder mehrerer Kalibrierungsstandards zu dem Gemisch,
xi) Behandeln des Gemisches mit einem Enzym oder einer Chemikalie unter Bedingungen, die die Modifikation von Interesse von so modifizierten Analyten entfernen,
xii) gegebenenfalls Auftrennen des Gemisches und
xiii) Analysieren des Gemisches oder einer oder mehrerer Fraktionen davon durch Massenspektrometrie, um dadurch Tochter-Ionen-Fragmente für einen oder mehrere Analyten des Gemisches und Signatur-Ionen, die mit jedem einzigartigen Markierungsreagenz assoziiert sind, zu erhalten.

Bevorzugte Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens sind in den Ansprüchen 2 bis 26 dargelegt.
Das erfindungsgemäße Verfahren verwendet isobare und/oder isomere Markierungsreagenzien als unterschiedliche Markierungsreagenzien, um dadurch markierte Analyten oder markierte Fragmente der Analyten zu erzeugen. Der Affinitätsträger wird zum Zweck eines Auftrennens bestimmter Probenkomponenten basierend auf einem oder mehreren Charakteristika von Interesse verwendet. Die aus den Auftrennungen erhaltenen Fraktionen werden in einer vernünftig ausgewählten Weise mit unterschiedlichen Reagenzien eines Satzes von isobaren und/oder isomeren Markierungsreagenzien markiert, um dadurch einige oder alle der Fraktionen für eine nachfolgende Analyse zu kodieren. Fraktionen, die markierte Analyten oder markierte Fragmente der Analyten umfassen, werden gemischt und in einem Multiplexmodus analysiert. Fraktionen oder Gemische, die die markierten Analyten umfassen, können gegebenenfalls weiter aufgetrennt und sodann durch Massenspektrometrie analysiert werden. Tochterfragment-Ionen der Analyten können verwendet werden, um jeden Analyten der Probe zu identifizieren. Eine Analyse der Markierungen oder Fragment-Ionen davon der markierten Analyten kann dazu verwendet werden, den Analyten in jeder der Proben oder Probenfraktionen, die zum Erzeugen eines Probengemisches verwendet werden (relativ oder absolut), zu quantifizieren. In dieser Weise kann eine Information über die Komponenten der Proben von Interesse (einschließlich komplexer Proben) für Komponenten mit dem Charakteristikum oder den Charakteristika von Interesse abgefragt werden. Dieses Verfahren kann für die Analyse von post-translationalen Modifikationen von Proteinen und Peptiden in komplexen Proben, wie denjenigen, die analysiert werden, wenn eine Proteomanalyse durchgeführt wird, besonders verwendbar sein.
2. Kurze Beschreibung der Zeichnungen:
1a veranschaulicht den Ablaufplan für eine Ausführungsform der Analyse einer theoretischen Probe 1 und Probe 2 hinsichtlich des Vorhandenseins von Phosphopeptiden.
1b veranschaulicht die theoretischen Ergebnisse von Signatur-Ionen-Peaks in einem (MS/MS)-Massenspektrum für die Analyse, die durch den Ablaufplan von 1a dargestellt ist.
2a veranschaulicht den Ablaufplan für eine Ausführungsform der Analyse einer Probe hinsichtlich des Vorhandenseins von Phosphopeptiden, wobei ein spezifisches und nicht spezifisches Binden des Analyten an den Affinitätsträger bestimmt werden kann.
2b veranschaulicht die theoretischen Ergebnisse von Signatur-Ionen-Peaks in einem (MS/MS)-Massenspektrum für die Analyse, die durch den Ablaufplan von 2a dargestellt ist.
3a veranschaulicht den Ablaufplan für eine Ausführungsform der Analyse von Probe 1 und Probe 2 hinsichtlich des Vorhandenseins von Phosphopeptiden, wobei ein spezifisches und nicht spezifisches Binden des Analyten an den Affinitätsträger gleichzeitig bestimmt werden kann.
3b veranschaulicht die theoretischen Ergebnisse von Signatur-Ionen-Peaks in einem (MS/MS)-Massenspektrum für die Analyse, die durch den Ablaufplan von 3a dargestellt ist.
4 veranschaulicht einen möglichen Satz von vier isobaren Markierungsreagenzien, der für eine Verwendung mit den erfindungsgemäßen Ausführungsformen geeignet ist.
5a veranschaulicht ein Schema für die Synthese von verschiedenen Aktivestern.
5b veranschaulicht ein weiteres Schema für die Synthese von verschiedenen Aktivestern.
5c veranschaulicht ein noch weiteres Schema für die Synthese von verschiedenen Aktivestern.
5d veranschaulicht ein noch weiteres Schema für die Synthese von verschiedenen Aktivestern.
6a veranschaulicht ein Duplex-Phosphopeptid-Screening und einige assoziierte Daten.
6b ist eine Tabelle von experimentellen gegenüber veröffentlichten Daten, die mit der Analyse eines Modellphosphoproteins assoziiert sind.
3. Definitionen:
Für Interpretierungszwecke dieser Beschreibung werden die nachstehenden Definitionen verwendet werden und, wann immer geeignet, werden im Singular verwendete Begriffe auch den Plural einschließen und umgekehrt. In dem Fall, dass eine jegliche nachstehend dargelegte Definition mit einem jeglichen Referenzdokument in Konflikt steht, soll die nachstehend dargelegte Definition führen.

a. Wie hierin verwendet, betrifft „Analyt" ein Molekül von Interesse, das bestimmt werden kann. Nicht begrenzende Beispiele von Analyten können in nicht begrenzender Weise Proteine, Peptide, Antikörper, Nukleinsäuren (beide DNA oder RNA), Kohlenhydrate, Lipide, Steroide und/oder andere kleine Moleküle mit einem Molekulargewicht von weniger als 1500 Dalton beinhalten. Nicht begrenzende Beispiele von Quellen für den Analyten oder die Probe, die den Analyten umfasst, beinhalten in nicht begrenzender Weise Zellen oder Gewebe oder Kulturen (oder Subkulturen) davon. Nicht begrenzende Beispiele für zelluläre Analytenquellen beinhalten in nicht begrenzender Weise nicht aufgereinigte oder prozessierte Zelllysate (einschließlich Ganzzelllysaten), Körperflüssigkeiten, Gewebeextrakte oder Zellextrakte. Noch andere nicht begrenzende Beispiele für Quellen für den Analyten beinhalten in nicht begrenzender Weise Fraktionen aus einem Auftrennungsverfahren wie einer chromatographischen Auftrennung oder einer elektrophoretischen Auftrennung. Körperflüssigkeiten beinhalten in nicht begrenzender Weise Blut, Urin, Fäzes, Spinalflüssigkeit, Cerebralflüssigkeit, Fruchtwasser, Lymphflüssigkeit oder eine Flüssigkeit von einer Drüsensekretion. Unter einem prozessierten Zelllysat verste hen wir, dass das Zelllysat zusätzlich zu den Behandlungen, die zum Lysieren der Zellen benötigt werden, behandelt wird, um dadurch ein zusätzliches Prozessieren des gesammelten Materials durchzuführen. Zum Beispiel kann die Probe ein Zelllysat oder eine Fraktion davon sein, das/die einen oder mehrere Analyten umfasst, die Peptide sind, die durch Behandlung der Gesamtproteinkomponente eines unbehandelten Zelllysats mit einem proteolytischen Enzym gebildet werden, um dadurch Vorläuferprotein- oder Proteine zu verdauen. Um Zweifel auszuräumen, kann der Begriff Analyt den ursprünglichen Analyten und Verbindungen, die sich davon ableiten, einschließen, wenn nicht aus dem Kontext eine klar gegenteilige Bedeutung vorgesehen ist. Zum Beispiel kann in einigen Ausführungsformen der Begriff Analyt auf ein Protein als auch auf die Peptide, die sich davon durch Verdau des Proteins ableiten, zutreffen.
b. Wie hierin verwendet, ist „ein zellulärer Analyt" ein Analyt mit zellulärem Ursprung.
c. Wie hierin verwendet, betrifft „Fragmentierung" das Aufbrechen einer kovalenten Bindung.
d. Wie hierin verwendet, betrifft „Fragment/fragmentieren" ein Produkt einer Fragmentierung (Substantiv) oder die Handlung eines Bewirkens einer Fragmentierung (Verb).
e. Es ist anerkannt, dass die Masse eines Atoms oder Moleküls oft auf die nächste ganze Zahlatommasseneinheit oder das nächste Zehntel oder Hundertstel einer Atommasseneinheit angeglichen werden kann. Wie hierin verwendet, betrifft „Bruttomasse" die absolute Masse als auch die überschlägige Masse innerhalb eines Bereichs, bei dem verwendete Isotope von unterschiedlichen Atomtypen hinsichtlich der Masse so nah beieinander liegen, dass sie das funktionelle Äquivalent sind, ungeachtet, ob der sehr kleine Massenunterschied der verwendeten unterschiedlichen Isotoptypen nachgewiesen werden kann oder nicht. Zum Beispiel weisen die üblichen Sauerstoffisotope eine Bruttomasse von 16,0 (tatsächliche Masse von 15,9949) und 18,0 (tatsächliche Masse von 17,9992) auf, die üblichen Kohlenstoffisotope weisen eine Bruttomasse von 12,0 (tatsächliche Masse von 12,00000) und 13,0 (tatsächliche Masse von 13,00336) auf, und die üblichen Stickstoffisotope weisen eine Bruttomasse von 14,0 (tatsächliche Masse von 14,0031) und 15,0 (tatsächliche Masse von 15,0001) auf. Während diese Werte überschlägig sind, wird ein Fachmann anerkennen, dass, falls man das ¹⁸O-Isotop in einem Reporter eines Satzes verwendet, die zwei zusätzlichen Masseneinheiten (über dem Sauerstoffisotop mit einer Bruttomasse von 16,0) z.B. in einem unterschiedlichen Reporter des Satzes, der ein ¹⁶O-Atom umfasst, dadurch kompensiert werden kann, das an anderer Stelle in dem Reporter zwei Kohlenstoff-¹³C-Atome anstelle von zwei ¹²C-Atomen, zwei ¹⁵N-Atome anstelle von zwei ¹⁴N-Atomen oder sogar ein ¹³C-Atom und ein ¹⁵N-Atom anstelle eines ¹²C-Atoms und eines ¹⁴N-Atoms eingebaut werden, um das ¹⁸O-Atom zu kompensieren. In dieser Weise sind die zwei unterschiedlichen Reporter des Satzes das funktionelle Massenäquivalent (d.h. sie weisen die gleiche Bruttomasse auf), da die sehr kleinen tatsächlichen Massenunterschiede zwischen der Verwendung von zwei ¹³C-Atomen (anstelle von zwei ¹²C-Atomen), zwei ¹⁵N-Atomen (anstelle von zwei ¹⁴N-Atomen), eines ¹³C-Atoms und eines ¹⁵N-Atoms (anstelle eines ¹²C-Atoms und eines ¹⁴N-Atoms) oder eines ¹⁸O-Atoms (anstelle eines ¹⁶O-Atoms), um dadurch eine Massenzunahme von zwei Dalton zu erreichen, in allen der Markierungen des Satzes oder Kits kein Hindernis für die Analyseart sind.
f. Wie hierin verwendet, betrifft „Markierungsreagenz" eine Gruppe, die zum Markieren eines Analyten für eine Bestimmung geeignet ist. Der Begriff Markierung ist synonym mit den Begriffen Tag und Macker und anderen äquivalenten Begriffen und Ausdrücken. Zum Beispiel kann ein markierter Analyt auch als ein getaggter Analyt oder Markeranalyt bezeichnet werden. Dementsprechend sind die Begriffe „Markierung", „Tag", „Marker" und Abwandlungen dieser Begriffe austauschbar und betreffen eine Gruppe, die geeignet ist, einen Analyten für eine Bestimmung zu markieren, oder die diesen markiert hat.
g. Wie hierin verwendet, betrifft „Träger", „Festträger" oder „fester Carrier" ein jegliches Festphasenmaterial. Festträger umfasst Begriffe wie „Harz", „Syntheseträger", „Festphase", „Oberfläche", „Membran" und/oder „Träger". Ein Festträger kann aus organischen Polymeren wie Polystyrol, Polyethylen, Polypropylen, Polyfluorethylen, Polyethylenoxy und Polyacrylamid als auch aus Copolymeren und Pfropfungen davon zusammengesetzt sein. Ein Festträger kann auch anorganisch wie Glas, Silica, kontrolliertes Porenglas (CPG) oder Silica mit reverser Phase sein. Die Konfiguration eines Festträgers kann in der Form von Kügelchen, Kugeln, Partikeln, Granula, eines Gels, einer Membran oder einer Oberfläche sein. Oberflächen können planar, im Wesentlichen planar oder nicht planar sein. Festträger können porös oder nicht porös sein und können Quell- oder Nichtquelleigenschaften aufweisen. Ein Festträger kann in der Form eines Wells, einer Vertiefung oder eines anderen Behälters, Gefäßes, Merkmals oder einer Lage konfiguriert sein. Eine Vielzahl von Festträgern kann in einer Anordnung bei verschiedenen Lagen konfiguriert sein, die für ein Roboterzuführen von Reagenzien oder durch Nachweisverfahren und/oder -instrumente adressierbar sind.
h. Wie hierin verwendet, betrifft „stationäre Phase" einen Träger, der zum unterschiedlichen Binden eines oder mehrerer Komponentenanalyten einer Probe oder Fraktion davon verwendet wird. Ein nicht begrenzendes Beispiel einer stationären Phase ist ein chromatographisches Packungsmaterial. Quellen für chromatographische Packungsmaterialien sind bekannt. Die Funktion und Verfahren zum Verwenden von chromatographischen Packungsmaterialien, um Auftrennungen zu bewirken, sind bekannt.
i. Wie hierin verwendet, betrifft „natürliche Isotopenhäufigkeit" die Menge (oder Verteilung) eines oder mehrerer Isotope, die in einer Verbindung gefunden werden, basierend auf der natürlichen Verbreitung eines Isotops oder von Isotopen in der Natur. Zum Beispiel wird eine natürliche Verbindung, die aus Material einer lebenden Pflanze erhalten wurde, typischerweise etwa 1,08% ¹³C relativ zu ¹²C enthalten.
j. Wie hierin verwendet, betrifft „Probe oder eine Fraktion davon" oder „Probenfraktion" eine Fraktion einer Probe. Die Fraktion einer Probe kann entweder durch einfaches Entnehmen einer Fraktion einer Probe erzeugt werden oder sie kann anderweitig durch Durchführen eines Auftrennverfahrens erzeugt werden, das dazu führt, dass die Probe in zwei oder mehrere Fraktionen fraktioniert wird. Wenn der Inhalt der Beschreibung es nicht anders angibt, sind diese Bezugnahmen austauschbar und betreffen eine jegliche Art einer Erzeugung einer Fraktion (oder eines Teils) einer Probe.
k. Wie hierin verwendet, betrifft „Signatur-Ion" das einzigartige Ion, das durch ein Fragment (d.h. den Reporter) eines jeglichen einzigartigen Markierungsreagenzes eines Satzes von isomeren und/oder isobaren Markierungsreagenzien erzeugt wird. Das Signatur-Ion oder der Reporter (oder das Reporter-Ion) identifiziert das einzigartige Markierungsreagenz und dessen Peakidentität korreliert mit der Menge an markiertem Analyten, der in der Probe vorhanden ist, die analysiert wird. Das Signatur-Ion wird manchmal auch als ein Reporter oder Reporter-Ion und umgekehrt bezeichnet.

4. Allgemeines:
Markierungsreagenzien:
In erfindungsgemäßen Ausführungsformen verwendete Markierungsreagenzien sind isobar und/oder isomer. Typischerweise kann ein Satz von isomeren oder isobaren Markierungsreagenzien verwendet werden. Markierungsreagenzien eines Satzes können ausgewählt werden, um einen Reporter zu umfassen, der einzigartig ist und z.B. in einer MS/MS-Analyse unabhängig bestimmt werden kann. Die isobaren und/oder isomeren Markierungsreagenzien können diejenigen sein, die in der WO 2004/070352 beschrieben sind. Die isobaren und/oder isomeren Markierungsreagenzien können diejenigen sein, die in den ebenfalls anhängigen und gemeinschaftlich gehaltenen US-Patentanmeldungen 10/765,458 , 10/765,264 , 10/765,267 und 10/765,458 beschrieben sind. Die isobaren und/oder isomeren Markierungsreagenzien können Markierungsreagenzien auf Polymerbasis sein, wie diejenigen, die in der WO 02/14867 oder in der veröffentlichten US-Patentanmeldung US 2003-0045694 A1 beschrieben sind. Die Markierungsreagenzien können diejenigen isobaren oder isomeren Markierungsreagenzien sein, die in der WO 01/68664 beschrieben sind. Ein Beispiel eines Satzes von vier geeigneten isobaren Reagenzien ist in 4 veranschaulicht. Sätze von isobaren Markierungsreagenzien sind von Applied Biosystems käuflich erhältlich und werden als iTRAQ^TM-Markierungsreagenzien verkauft (vgl. Beispiel 4).
Isobare Markierungsreagenzien können nützlich sein, da sie mit Ausnahme ihrer nachweisbaren Differenz bei einer MS/MS-Analyse strukturell und chemisch ununterscheidbar sind (ausgenommen wenn eine nachweisbare Differenz bei der absoluten Masse im Vergleich mit der Bruttomasse auftritt). Dementsprechend wird der gleiche Analyt, der mit zwei unterschiedlichen isobaren Markierungsreagenzien eines Satzes markiert ist, strukturell und chemisch ununterscheidbar sein. Dementsprechend sollte jeder der zwei identischen Analyten, die jeweils eine einzigartige isobare Markierung tragen, hinsichtlich ihrer Reaktivität als auch hinsichtlich ihrer Auftrennungseigenschaften ununterscheidbar sein.
Die einzigartigen Reporter der Markierungsreagenzien können verwendet werden, um Analyten der Proben oder Probenfraktionen, den Umständen entsprechend, zu kodieren. Ein Kodieren kann durch Behandlung der Probe oder Probenfraktion mit dem Markierungsreagenz erfolgen, um dadurch einen markierten Analyten oder markierte Analyten zu erzeugen, und schließlich kann ein Probengemisch aus den Proben oder Probenfraktionen erzeugt werden. Wenn das Probengemisch analysiert wird, können die Reporter verwendet werden, um die relative und/oder absolute Menge (oft als Konzentration oder Quantität angegeben) eines jeglichen Analyten in den unterschiedlichen Proben oder Probenfraktionen, die zum Formulieren des Probengemisches verwendet wurden, zu dekodieren. Die Analyten selbst können auch aus einer Tochter-Ionen-Analyse bestimmt werden. In dieser Weise werden Komponenten des komplexen Probengemisches in einer Multiplexweise bestimmt und die Analyse stellt eine Information (d.h. Analytenidentität und -quantität) bereit, die sich auf die Originalproben und/oder Fraktionen davon zurückbezieht.
Markierung der Analyten einer Probe:
Die Markierungsreagenzien werden eine reaktive Gruppe umfassen. Die reaktive Gruppe des Markierungsreagenzes oder -reagenzien, das/die in den erfindungsgemäßen Ausführungsformen verwendet wird/werden, kann entweder ein Elektrophil oder ein Nukleophil sein, das zum Umsetzen mit einem oder mehreren reaktiven Analyten einer Probe fähig ist. Die reaktive Gruppe kann vorher vorhanden sein oder sie kann in situ hergestellt werden. In einigen Ausführungsformen kann die Herstellung der reaktiven Gruppe in situ in Abwesenheit des reaktiven Analyten stattfinden. Zum Beispiel kann eine Carbonsäuregruppe in situ mit wasserlöslichem Carbodiimid (z.B. 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimidhydrochlorid, EDC) modifiziert werden, um dadurch eine elektrophile Gruppe herzustellen, die mit einem Nukleophil wie einer Amingruppe (einschließlich einer Arylamingruppe) umgesetzt werden kann. In einigen Ausführungsformen kann eine Aktivierung der Carbonsäuregruppe eines Markierungsreagenzes mit EDC in Gegenwart eines aminhaltigen (nukleophilhaltigen) Analyten erfolgen. Alternativ dazu kann der aminhaltige (nukleophilhaltige) Analyt auch zugesetzt werden, nachdem die anfängliche Umsetzung mit EDC erfolgt. In anderen Ausführungsformen kann die reaktive Gruppe in situ durch die Entfernung einer Schutzgruppe in situ entfernt werden. Folglich ist ein jegliches bestehendes oder neu erzeugtes Reagenz oder sind jegliche bestehende oder neu erzeugte Reagenzien, das/die die Derivatisierung von Analyten durch die Umsetzung von Nukleophilen und/oder Elektrophilen bewirken kann/können, in erfindungsgemäßen Ausführungsformen vorgesehen.
In dem Fall, dass die reaktive Gruppe des Markierungsreagenzes ein Elektrophil ist, kann sie mit einer geeigneten nukleophilen Gruppe des Analyten oder der Analyten umgesetzt werden. In dem Fall, dass die reaktive Gruppe des Markierungsreagenzes ein Nukleophil ist, kann sie mit einer geeigneten elektrophilen Gruppe des Analyten oder der Analyten umgesetzt werden. Viele Paare von geeigneten nukleophilen Gruppen und elektrophilen Gruppen sind bekannt und werden oft in den chemischen und biochemischen Wissenschaften verwendet. Nicht begrenzende Beispiele von Reagenzien, die geeignete nukleophile oder elektrophile Gruppen umfassen, die an Analyten (z.B. Proteine, Peptide, Nukleinsäuren, Kohlenhydrate, Lipide, Steroide oder andere kleine Moleküle von weniger als 1500 Dalton) gekoppelt werden können, um deren Derivatisierung zu bewirken, sind in den Pierce Life Science & Analytical Research Products Catalog & Handbook (eine Perstorp Biotec Company), Rockford, IL 61105, USA, beschrieben. Andere geeignete Reagenzien sind bekannt und sind von vielen anderen Anbietern wie Sigma-Aldrich käuflich erhältlich.
Die reaktive Gruppe eines Markierungsreagenzes kann eine aminreaktive Gruppe sein. Zum Beispiel kann die aminreaktive Gruppe ein Aktivester sein. Aktivester sind in der Peptidsynthese bekannt und betreffen bestimmte Ester, die leicht mit der N-α-Amingruppe einer Aminosäure unter Bedingungen, die üblicherweise in der Peptidsynthese verwendet werden, umgesetzt werden. Der aminreaktive Aktivester kann ein N-Hydroxysuccinimidylester, ein N-Hydroxysulfosuccinimidylester, ein Pentafluorphenylester, ein 2-Nitrophenylester, ein 4-Nitrophenylester, ein 2,4-Dinitrophenylester oder ein 2,4-Dihalogenphenylester sein. Zum Beispiel kann die Alkohol- oder Thiolgruppe eines Aktivesters die Formel:
aufweisen, worin X ein O- oder S-, aber vorzugsweise ein O-Atom ist. Alle der Vorstehenden sind Alkohol- oder Thiolgruppen, von denen bekannt ist, dass sie Aktivester auf dem Peptidchemiegebiet ausbilden, wobei die Alkohol- oder Thiolgruppe durch die Umsetzung der N-α-Amingruppe der Aminosäure mit dem Carbonylkohlenstoff des Esters ersetzt wird. Es sollte ersichtlich sein, dass der Aktivester (z.B. N-Hydroxysuccinimidylester) eines jeglichen geeigneten hierin beschriebenen Markierungs-/Tagging-Reagenzes unter Verwendung bekannter Verfahren hergestellt werden könnte (vgl.: Greg T. Hermanson (1996). „The Chemistry of Reactive Groups" in „Bioconjugate Techniques", Kapitel 2, Seiten 137-165, Academic Press (New York); vgl. auch: Innovation And Perspectives In Solid Phase Synthesis, Herausgeber: Roger Epton, SPCC (UK) Ltd., Birmingham, 1990). Verfahren zur Ausbildung von Aktivestern von N-substituierten Piperazinessigsäure-Verbindungen, die repräsentative Beispiele von Markierungsreagenzien der allgemeinen Formel: RP-X-LK-Y-RG sind, sind in der ebenfalls anhängigen und gemeinschaftlich gehaltenen US-Patentanmeldung 10/751,354 beschrieben. Die 5a, 5b, 5c und 5d sind Darstellungen von verschiedenen Verfahren zum Herstellen von Aktivestern von N-Methylpiperazin. Unter Verwendung von nicht mehr als Routineexperimentieren können solche allgemeinen Verfahren auf das Herstellen anderer Arten von Aktivestern als auch die Herstellung von Aktivestern anderer Markierungsreagenzien angewendet werden. Verfahren zum Markieren von Peptid- und Proteinanalyten wurden für die von Applied Biosystems erhältlichen iTRAQ^TM-Reagenzien beschrieben.
In einer weiteren Ausführungsform kann die reaktive Gruppe des Markierungsreagenzes ein gemischtes Anhydrid sein, da gemischte Anhydride dafür bekannt sind, sich effizient mit Amingruppen umzusetzen, um dabei Amidbindungen zu erzeugen.
Die reaktive Gruppe eines Markierungsreagenzes kann eine thiolreaktive Gruppe sein. Zum Beispiel kann die thiolreaktive Gruppe eine Maleimid-, eine Alkylhalogenid-, eine Arylhalogenid- oder eine α-Halogenacylgruppe sein. Unter Halogenid oder Halogen verstehen wir Atome von Fluor, Chlor, Brom oder Iod.
Die reaktive Gruppe eines Markierungsreagenzes kann eine hydroxylreaktive Gruppe sein. Zum Beispiel kann die hydroxylreaktive Gruppe eine tritylhalogenid- oder silylhalogenidreaktive Gruppe sein. Die tritylhalogenidreaktiven Gruppen können substituiert (z.B. Y-Methoxytrityl-, Y-Dimethoxytrityl-, Y-Trimethoxytritylgruppe, etc.) oder nicht substituiert sein, wobei Y nachstehend definiert ist. Die silylreaktiven Gruppen können alkylsubstituierte Silylhalogenide (wie Y-Dimethylsilyl-, Y-Ditriethylsilyl-, Y-Dipropylsilyl-, Y-Diisopropylsilylgruppe, etc.) sein, wobei Y nachstehend definiert ist.
Die reaktive Gruppe des Markierungsreagenzes kann ein Nukleophil wie eine Amingruppe, eine Hydroxylgruppe oder eine Thiolgruppe sein.
Massenspektrometer/Massenspektrometrie:
Erfindungsgemäße Ausführungsformen können unter Verwendung von Tandem-Massenspektrometern oder anderen Massenspektrometern durchgeführt werden, die die Fähigkeit aufweisen, Molekül-Ionen auszuwählen und zu fragmentieren. Tandem-Massenspektrometer (und zu einem geringeren Grad einzelstufige Massenspektrometer wie diejenigen, die einen Zerfall nach der Quelle zeigen) weisen die Fähigkeit auf, Molekül-Ionen gemäß ihrem Masse-zu-Ladung (m/z)-Verhältnis auszuwählen und zu fragmentieren, und zeichnen sodann die sich ergebenden Fragment (Tochter)-Ionen-Spektren auf. Insbesondere können Tochterfragment-Ionen-Spektren dadurch erzeugt werden, dass ausgewählte Ionen dissoziativen Energieniveaus (z.B. durch kollisionsinduzierte Dissoziation (CID)) unterzogen werden. Zum Beispiel können Ionen, die markierten Peptiden eines spezifischen m/z-Verhältnisses entsprechen, aus einer ersten Massenanalyse ausgewählt, fragmentiert und in einer zweiten (MS/MS)-Massenanalyse erneut analysiert werden. Beispielhafte Instrumente, die eine solche Tandem-Massenanalyse durchführen können, beinhalten in nicht begrenzender Weise Vier-Magnetsektoren-, Tandem-Flugzeit-, Triple-Quadrupol-, Ionenfalle- und Hybrid-Quadrupol-Flugzeit (Q-TOF)-Massenspektrometer.
Diese Arten von Massenspektrometern können zusammen mit einer Vielzahl von Ionisationsquellen verwendet werden, einschließlich in nicht begrenzender Weise Elektrosprayionisation (ESI) und Matrix-unterstützte Laserdesorptionsionisation (MALDI). Ionisationsquellen können verwendet werden, um geladene Spezies für die erste Massenanalyse zu erzeugen, bei der die Analyten nicht bereits eine festgesetzte Ladung aufweisen. Zusätzliche Massenspektrometrie-Instrumente und Fragmentierungsverfahren beinhalten einen Zerfall nach der Quelle bei MALDI-MS-Instrumenten und CID mit hoher Energie unter Verwendung von MALDI-TOF (Flugzeit)-TOF-MS. Für einen jüngeren Überblick über Tandem-Massenspektrometer vgl.: R. Aebersold und D. Goodlett, Mass Spectrometry in Proteomics. Chem. Rev. 101: 269-295 (2001). Vgl. auch die US-PS 6,319,476 für eine Diskussion von TOF-TOF-Massenanalyse-Techniken. Im Allgemeinen gibt es keine Begrenzung hinsichtlich der Art an Massenspektrometer, die verwendet werden kann, sofern es möglich ist, eine erste Massenanalyse zu erhalten, Ionen aus der ersten Massenanalyse auszuwählen und zu fragmentieren und sodann das Ergebnis der Fragmentierung zu analysieren.
Fragmentierung durch dissoziative Energieniveaus:
Es ist anerkannt, dass Bindungen als ein Ergebnis der Prozesse, die in einem Massenspektrometer auftreten, fragmentieren können. Außerdem kann eine Bindungsfragmentierung in einem Massenspektrometer dadurch induziert werden, dass Ionen dissoziativen Energieniveaus unterzogen werden. Zum Beispiel können die dissoziativen Energieniveaus in einem Massenspektrometer durch kollisionsinduzierte Dissoziation (CID) erzeugt werden. Der Fachmann auf dem Gebiet der Massenspektrometrie wird anerkennen, dass andere beispielhafte Techniken zum Einbringen von dissoziativen Energieniveaus, die eine Fragmentierung bewirken, in nicht begrenzender Weise Fotodissoziation, Elektroneneinfang und oberflächeninduzierte Dissoziation einschließen.
Der Prozess einer Fragmentierung von Bindungen durch kollisionsinduzierte Dissoziation involviert ein Erhöhen des kinetischen Energiezustands von ausgewählten Ionen bis zu einem Punkt, an dem eine Bindungsfragmentierung auftritt. Zum Beispiel kann kinetische Energie durch Kollision mit einem Inertgas (wie Stickstoff, He lium oder Argon) in einer Kollisionszelle übertragen werden. Die Menge an kinetischer Energie, die an die Ionen übertragen werden kann, ist proportional zu der Anzahl von Gasmolekülen, denen ermöglicht wird, in die Kollisionszelle einzutreten. Wenn mehr Gasmoleküle vorhanden sind, kann eine größere Menge an kinetischer Energie an die ausgewählten Ionen übertragen werden, und weniger kinetische Energie wird übertragen, wenn weniger Gasmoleküle vorhanden sind.
Es ist daher klar, dass das dissoziative Energieniveau in einem Massenspektrometer gesteuert werden kann. Es ist auch anerkannt, dass bestimmte Bindungen labiler sind als andere Bindungen. Die Labilität der Bindungen in einem Analyten oder dem Reporter des Markierungsreagenzes hängt von der Art des Analyten oder des Markierungsreagenzes ab. Dementsprechend können die dissoziativen Energieniveaus derart angepasst werden, dass die Analyten und/oder die Markierungen (d.h. die Reporter/Linker-Kombinationen) in einer einigermaßen gesteuerten Weise fragmentiert werden können. Ein Fachmann wird verstehen, wie solche Routineanpassungen an die Komponenten eines Massenspektrometers gemacht werden, um dadurch das geeignete Niveau an dissoziativer Energie zu erreichen, um dadurch mindestens einen Teil von Ionen von markierten Analyten in ionisierte Reportergruppen und Tochterfragment-Ionen zu fragmentieren.
Zum Beispiel kann dissoziative Energie auf Ionen angewandt werden, die aus der ersten Massenanalyse ausgewählt/isoliert werden. In einem Tandem-Massenspektrometer können die extrahierten Ionen dissoziativen Energieniveaus unterzogen und sodann an einen zweiten Massenanalysator übertragen werden. Die ausgewählten Ionen können ein ausgewähltes Masse-zu-Ladung-Verhältnis aufweisen. Das Masse-zu-Ladung-Verhältnis kann innerhalb eines Bereichs von Masse-zu-Ladung-Verhältnissen liegen, abhängig von den Charakteristika des Massenspektrometers. Wenn eine kollisionsinduzierte Dissoziation verwendet wird, können die Ionen aus dem ersten zu dem zweiten Massenanalysator dadurch übertragen werden, dass sie durch eine Kollisionszelle, in der die dissoziative Energie angewendet werden kann, um dadurch Fragment-Ionen zu erzeugen, geleitet werden. Zum Beispiel können die Ionen, die zu dem zweiten Massenanalysator für eine Analyse geschickt werden, alle oder einen Teil der verbleibenden (nicht fragmentierten) ausgewählten Ionen als auch Reporter-Ionen (Signatur-Ionen) und Tochterfragment-Ionen des markierten Analyten beinhalten.
Analytenbestimmung durch Computer-unterstützte Datenbankanalyse:
In einigen Ausführungsformen können Analyten basierend auf Tochter-Ionen-Fragmentmuster bestimmt werden, wie durch Computer-unterstützten Vergleich mit den Spektren von bekannten oder „theoretischen" Analyten analysiert werden. Zum Beispiel kann das Tochterfragment-Ionen-Spektrum eines Peptid-Ions, das unter Bedingungen einer Niedrigenergie-CID fragmentiert wurde, als die Summe von vielen einzelnen Fragmentierungsereignissen betrachtet werden. Die herkömmliche Nomenklatur unterscheidet Tochterfragment-Ionen gemäß der Amidbindung, die bricht, und dem Peptidfragment, das nach einer Bindungsspaltung eine Ladung beibehält. Eine Beibehaltung von Ladung auf der N-terminalen Seite der gespaltenen Amidbindung führt zu der Bildung eines Ions des b-Typs. Falls die Ladung auf der C-terminalen Seite der aufgebrochenen Amidbindung verbleibt, wird sodann das Fragment-Ion als ein Ion des y-Typs bezeichnet. Zusätzlich zu Ionen des b-Typs und y-Typs kann das CID-Massenspektrum andere diagnostische Fragment-Ionen (Tochterfragment-Ionen) enthalten. Diese beinhalten Ionen, die durch Neutralverlust von Ammoniak (-17 amu) aus Glutamin, Lysin und Arginin oder den Verlust von Wasser (-18 amu) aus hydroxylhaltigen Aminosäuren wie Serin und Threonin erzeugt werden. Es wurde festgestellt, dass bestimmte Aminosäuren leichter unter Bedingungen einer Niedrigenergie-CID fragmentieren als andere. Dies ist insbesondere für Peptide ersichtlich, die Prolin- oder Asparaginsäurereste enthalten, und sogar noch offensichtlicher bei Aspartyl-Prolin-Bindungen (Mak, M. et al., Rapid Commun. Mass Spectrom., 12: 837-842 (1998)). Dementsprechend wird die Peptidbindung eines Z-pro-Dimers oder Z-asp-Dimers (worin Z eine jegliche natürliche Aminosäure ist, pro Prolin ist und asp Asparaginsäure ist) dazu neigen, labiler zu sein im Vergleich zu der Peptidbindung zwischen allen anderen Aminosäure-Dimer-Kombinationen.
Für Peptid- und Proteinproben enthalten daher Niedrigenergie-CID-Spektren eine redundante sequenzspezifische Information in überlappenden b- und y-Serien-Ionen, internen Fragment-Ionen aus dem gleichen Peptid und Immonium- und anderen Neutralverlust-Ionen. Eine Interpretation solcher CID-Spektren, um die Aminosäuresequenz des Stammpeptids de novo zusammenzusetzen, ist anspruchsvoll und zeitintensiv. Die signifikantesten Fortschritte beim Identifizieren von Peptidsequenzen waren die Entwicklung von Computeralgorithmen, die Peptid-CID-Spektren mit Peptidsequenzen korrelieren, die bereits in Protein- und DNA-Sequenzdatenbanken existieren. Solche Ansätze werden durch Programme wie SEQUEST (Eng, J. et al. J. Am. Soc. Mass Spectrom, 5: 976-989 (1994)) und MASCOT (Perkins, D. et al. Electrophoresis, 20: 3551-3567 (1999)) beispielhaft veranschaulicht.
Kurz gesagt, werden experimentelle Peptid-CID-Spektren (MS/MS-Spektren) mit „theoretischen" Tochterfragment-Ionen-Spektren abgestimmt oder korreliert, die mittels eines Computers aus von Protein- oder Genomsequenzdatenbanken erhaltenen Peptidsequenzen erzeugt wurden. Die Übereinstimmung oder Korrelation basiert auf den Ähnlichkeiten der erwarteten Masse und der festgestellten Masse der Tochterfragment-Ionen im MS/MS-Modus. Die mögliche Übereinstimmung oder Korrelation wird danach eingestuft, wie gut sich die experimentellen und „theoretischen" Fragmentmuster decken. Die Einschränkungen hinsichtlich einer Recherche in Datenbanken für eine gegebene Peptidaminosäuresequenz sind so unterscheidend, dass ein einziges Peptid-CID-Spektrum zum Identifizieren eines jeglichen gegebenen Proteins in einer Datenbank des gesamten Genoms oder von exprimierten Sequenztags (EST) hinreichend sein kann. Für andere Übersichtsartikel vgl.: Yates, J. R. Trends Genet., 16: 5-8 (2000) und Yates, J. R., Electrophoresis 19: 893-900 (1998).
Dementsprechend kann eine Tochterfragment-Ionen-Analyse von MS/MS-Spektren nicht nur zum Bestimmen des Analyten eines markierten Analyten verwendet werden, sondern sie kann auch dazu verwendet werden, Analyten zu bestimmen, aus denen der bestimmte Analyt herrührt. Zum Beispiel kann eine Identifizierung eines Peptids in der MS/MS-Analyse zum Bestimmen des Proteins verwendet werden, von dem das Peptid als eine Folge eines enzymatischen Verdaus des Proteins abgespalten wurde. Es ist vorgesehen, dass eine ähnliche Analyse auf die Bestimmung anderer Analyten wie Nukleinsäuren, Kohlenhydrate, Lipide und Steroide angewendet werden kann.
Probenprozessierung:
In bestimmten erfindungsgemäßen Ausführungsformen kann eine Probe vor als auch nach einem Markieren der Analyten prozessiert werden. Ein Prozessieren kann auf die gesamte Probe oder eine Fraktion davon angewendet werden. Ein Prozessieren kann auf Probengemische oder eine Fraktion davon angewendet werden. Ein Prozessieren kann verwendet werden, um die Komplexität der Probe zu vermindern, oder kann verwendet werden, um die Probe in eine bessere Form für eine Analyse zu bringen. Das Prozessieren kann das Markieren der Analyten erleichtern.
Das Prozessieren kann die Analyse der Probenkomponenten erleichtern. Das Prozessieren kann die Handhabung der Proben vereinfachen. Das Prozessieren kann zwei oder mehrere der Vorstehenden erleichtern.
Zum Beispiel kann eine Probe oder ein Probengemisch mit einem Enzym behandelt werden. Das Enzym kann eine Protease (zum Verdauen von Proteinen und Peptiden), eine Nuklease (zum Verdauen von Nukleinsäuren) oder ein anderes abbauendes Enzym sein. Das Enzym kann ausgewählt werden, um ein sehr vorhersehbares Abbaumuster aufzuweisen. Zwei oder mehrere Proteasen und/oder zwei oder mehrere Nukleaseenzyme können auch zusammen oder mit anderen Enzymen verwendet werden, um dadurch Probenkomponenten abzubauen.
Zum Beispiel ist das proteolytische Enzym Trypsin eine Serinprotease, die Peptidbindungen zwischen Lysin oder Arginin und einer unspezifischen Aminosäure spaltet, um dadurch Peptide zu erzeugen, die einen Aminterminus (N-Terminus) und eine Lysin- oder Arginin-Carboxyl-terminale Aminosäure (C-Terminus) umfassen. In dieser Weise sind die Peptide aus der Spaltung des Proteins vorhersehbar und deren Vorhandensein und/oder Quantität in einer Probe aus einem Trypsinverdau kann für das Vorhandensein und/oder die Quantität des Proteins ihres Ursprungs indikativ sein. Außerdem können die freien Amintermini eines Peptids ein gutes Nukleophil sein, das dessen Markierung erleichtert. Andere beispielhafte proteolytische Enzyme beinhalten Papain, Pepsin, ArgC, LysC, V8-Protease, AspN, Pronase, Chymotrypsin und Carboxypeptidase C.
Zum Beispiel kann ein Protein (z.B. Protein Z) drei Peptide (z.B. Peptide B, C und D) erzeugen, wenn es mit einer Protease wie Trypsin verdaut wird. Dementsprechend kann gelten, dass eine Probe, die mit einem proteolytischen Enzym wie Trypsin verdaut wurde und bei der, wenn analysiert, bestätigt wurde, dass sie die Peptide B, C und D enthält, ursprünglich das Protein Z umfasst hat (vgl. die vorstehende Beschreibung unter der Überschrift: „Analytenbestimmung durch Computer-unterstützte Datenbankanalyse"). Die Quantität an Peptiden B, C und D wird auch mit der Quantität an Protein Z in der Probe, die verdaut wurde, korrelieren. In dieser Weise kann eine jegliche Bestimmung der Identität und/oder Quantität eines oder mehrerer der Peptide B, C und D in einer Probe (oder einer Fraktion davon) verwendet werden, um das Protein Z in der ursprünglichen Probe (oder einer Fraktion davon) zu identifizieren und/oder zu quantifizieren.
Da eine Aktivität der Enzyme voraussagbar ist, kann die Sequenz von Peptiden, die aus einem Abbau eines Proteins bekannter Sequenz erzeugt werden, vorausgesagt werden. Mit dieser Information kann eine „theoretische Peptidinformation" erzeugt werden. Eine Bestimmung der „theoretischen" Peptidfragmente in einer Computer-unterstützten Analyse von Tochterfragment-Ionen (wie vorstehend beschrieben) aus einer Massenspektrometrieanalyse einer tatsächlichen Probe kann daher verwendet werden, um ein oder mehrere Peptide oder Proteine in einer oder mehreren unbekannten Proben zu bestimmen. Es ist vorgesehen, dass eine ähnliche Analyse auf die Bestimmung anderer Analyten wie Nukleinsäuren, Kohlenhydrate, Lipide und Steroide angewendet werden kann.
In einigen anderen Ausführungsformen kann ein Prozessieren eine Behandlung mit einem Enzym, das von denjenigen verschieden ist, die Probenkomponenten abbauen, umfassen. Zum Beispiel kann das Enzym eine Phosphatase, Glykosidase oder ein anderes Enzym sein, das eine Modifikation von dem Analyten wie diejenigen, die durch post-translationale Modifikation bewirkt werden, entfernt.
In einigen anderen Ausführungsformen involviert ein Probenprozessieren eine chemische Behandlung. Die chemische Behandlung kann als eine Alternative zu oder zusammen mit einer Enzymbehandlung, wie vorstehend beschrieben, verwendet werden. Die chemische Behandlung kann ausgewählt werden, um eine Modifikation des Analyten zu entfernen. Zum Beispiel kann die chemische Behandlung ausgewählt werden, um eine Modifikation von dem Analyten wie diejenigen, die durch post-translationale Modifikation bewirkt werden, zu entfernen.
Obwohl nicht typisch, kann die enzymatische und/oder chemische Behandlung verwendet werden, um eine oder mehrere Gruppen an den Analyten anstelle eines Entfernens einer Modifikation anzubringen. Für eine Einfachheit der Beschreibung werden alle Bezugnahmen hierin auf eine Entfernung der Modifikation des Analyten gerichtet sein, aber es soll verstanden werden, dass diese Bezugnahmen die Möglichkeit einer Anfügung einer oder mehrerer Gruppen an den Analyten beinhalten sollen. Was wichtig ist, ist, dass eine Veränderung des Analyten auftritt, die mit einzigartigen Markierungsreagenzien kodiert werden kann, abhängig davon, wann in dem Prozess die Veränderung des Analyten auftritt.
Auftrennungen:
In einigen Ausführungsformen kann das Prozessieren einer Probe oder eines Probengemisches, die/das Analyten (ob markiert oder nicht) umfasst, eine Auftrennung einbeziehen. In einigen Ausführungsformen kann die Auftrennung die Fraktionierung einer Probe (oder einer Fraktion davon) zwischen denjenigen Komponenten der Probe, die an eine stationäre Phase binden, und denjenigen Komponenten, die dies nicht tun, einbeziehen. Ein solcher Prozess wird oft als Affinitätschromatographie bezeichnet. In einigen Ausführungsformen kann die Auftrennung die Fraktionierung der Probe oder des Probengemisches basierend auf relativen Affinitäten der Komponenten der Probe oder des Probengemisches (oder einer Fraktion oder Fraktionen davon) einbeziehen.
In einigen Ausführungsformen kann eine Auftrennung erfolgen, um diejenigen Komponenten einer Probe oder eines Probengemisches, die an eine bestimmte stationäre Phase binden, von denjenigen, die dies nicht tun, zu unterscheiden. Zum Beispiel sind Phosphopeptide dafür bekannt, dass sie an immobilisierte Metallaffinitätschromatographie (IMAC)-Säulen binden. In dieser Weise können phosphorylierte Peptide einer Probe von nicht phosphorylierten Peptiden abgetrennt werden. Andere Arten von Trägern können verwendet werden, um die Auftrennung von Analyten einer komplexen Probe basierend auf anderen Arten von Affinitätscharakteristika zu bewirken.
In einigen Ausführungsformen kann ein Probengemisch, das unterschiedlich markierte Analyten aus der gleichen oder unterschiedlichen Proben umfasst, hergestellt werden. Unter unterschiedlich markiert verstehen wir, dass jede der Markierungen eine einzigartige Eigenschaft umfasst, die identifiziert werden kann (z.B. umfasst sie eine einzigartige Reportergruppe, die ein einzigartiges „Signatur-Ion" in einer MS/MS-Analyse erzeugt). Um das Probengemisch zu analysieren, können Komponenten des Probengemisches aufgetrennt und eine Massenanalyse auf das Probengemisch oder eine Fraktion davon durchgeführt werden. In dieser Weise kann die Komplexität der Analyse wesentlich vermindert werden, da aufgetrennte Analyten individuell hinsichtlich der Masse analysiert werden können, um dadurch die Empfindlichkeit des Analyseprozesses zu erhöhen. Die Analyse kann ein oder mehrere Male auf eine oder mehrere zusätzliche Fraktionen des Probengemisches wiederholt werden, um die Analyse aller Fraktionen des Probengemisches zu ermöglichen.
Auftrennbedingungen, unter denen identische Analyten, die unterschiedlich markiert sind, zusammen bei einer Konzentration und in einer Quantität, die proportional zu deren Häufigkeit in der Probe ist, eluieren, können verwendet werden, um die Menge eines jeglichen markierten Analyten in einer jeglichen der Proben, die das Probengemisch umfassen, zu bestimmen, mit der Maßgabe, dass die Menge einer jeglichen Probe, die zu dem Probengemisch hinzugefügt wurde, bekannt ist. Dementsprechend kann in einigen Ausführungsformen eine Auftrennung des Probengemisches die Analyse vereinfachen, während die Korrelation zwischen Signalen, die in der Massenanalyse (z.B. MS/MS-Analyse) bestimmt wurden, mit der Menge der unterschiedlich markierten Analyten in dem Probengemisch beibehalten wird.
Auftrennungen können durch Chromatographie erfolgen. Zum Beispiel kann Flüssigchromatographie/Massenspektrometrie (LC/MS) verwendet werden, um eine solche Probenauftrennung und Massenanalyse zu bewirken. Außerdem kann ein jegliches chromatographisches Auftrennverfahren, das zum Auftrennen der Analyten von Interesse geeignet ist, verwendet werden. Zum Beispiel kann die chromatographische Auftrennung Chromatographie mit normaler Phase, Chromatographie mit reverser Phase, Ionenaustauschchromatographie, Größenausschlusschromatographie oder Affinitätschromatographie sein.
Auftrennungen können elektrophoretisch erfolgen. Nicht begrenzende Beispiele von elektrophoretischen Auftrenntechniken, die verwendet werden können, beinhalten in nicht begrenzender Weise 1D-elektrophoretische Auftrennung, 2D-elektrophoretische Auftrennung und/oder kapillarelektrophoretische Auftrennung.
Ein isobares Markierungsreagenz oder ein Satz von Reagenzien kann verwendet werden, um die Analyten einer Probe zu markieren. Isobare Markierungsreagenzien sind insbesondere nützlich, wenn ein Auftrennschritt erfolgt, da die isobaren Markierungen eines Satzes von Markierungsreagenzien strukturell und chemisch ununterscheidbar sind (und hinsichtlich Bruttomasse ununterscheidbar sein können, bis eine Fragmentierung den Reporter von dem Analyten entfernt). Daher können alle Analyten einer identischen Zusammensetzung, die mit unterschiedlichen isobaren Markierungen markiert sind, in exakt der gleichen Weise chromatographisch aufgetrennt werden (d.h. sie eluieren zusammen). Da sie strukturell und chemisch ununterscheidbar sind, kann der Eluent aus dem Auftrennverfahren eine Menge eines jeweils isobar markierten Analyten umfassen, die proportional zu der Menge des markierten Analyten in dem Probengemisch ist. Ferner ist es aus dem Wissen, wie das Probengemisch hergestellt wurde (Anteile von Proben und anderen optionalen Komponenten (z.B. Kalibrierungsstandards), die zugegeben wurden, um das Probengemisch herzustellen) möglich, die Menge an markierten Analyten in dem Probengemisch zurück auf die Menge dieses markierten Analyten in der Probe oder Probenfraktion, von der er herrührt, zu beziehen (z.B. zurückzurechnen).
Die Markierungsreagenzien können auch isomer sein. Obwohl Isomere manchmal chromatographisch aufgetrennt werden, gibt es Umstände, die zustandsabhängig sind, bei denen das Auftrennverfahren derart betrieben werden kann, dass alle identischen Analyten, die unterschiedlich markiert sind, zusammen eluieren, wobei die Menge aller markierten Analyten, die in dem Eluenten vorhanden sind, proportional zu deren Konzentration und/oder Quantität in dem Probengemisch ist.
Wie hierin verwendet, unterscheiden sich Isobare von Isomeren in der Weise, dass Isobare strukturell und chemisch ununterscheidbare Verbindungen (mit der Ausnahme des Isotopengehalts und/oder -verteilung) der gleichen nominellen Bruttomasse sind, während Isomere strukturell und/oder chemisch unterscheidbare Verbindungen der gleichen nominellen Bruttomasse sind.
Relative und absolute Quantifizierung von Analyten:
Die relative Quantifizierung von unterschiedlich markierten identischen Analyten eines Probengemisches ist unter Verwendung von Sätzen von isobaren und/oder isomeren Markierungsreagenzien möglich. Eine relative Quantifizierung von unterschiedlich markierten identischen Analyten ist durch Vergleich der relativen Mengen an Reporter (z.B. Fläche oder Höhe des aufgezeichneten Peaks) möglich, die in der zweiten (MS/MS)-Massenanalyse für einen ausgewählten markierten Analyten, der in einer ersten (MS)-Massenanalyse festgestellt wurde, bestimmt werden. In anderen Worten ist, wenn jeder Reporter mit einer Information für eine spezifische Probe (oder Probenfraktion), die zum Erzeugen eines Probengemisches verwendet wurde, korreliert werden kann, die relative Menge dieses Reporters hinsichtlich anderer Reporter, die in der zweiten Massenanalyse festgestellt werden, die relative Menge dieses Analyten in dem Probengemisch. Wenn die Menge einer jeden Probe oder Fraktion davon, die zum Zusammensetzen des Probengemisches verwendet wurde, bekannt ist, kann die relative Menge des Analyten in jeder Probe, die zum Herstellen des Probengemisches verwendet wurde, basierend auf der relativen Menge des Reporters, der für die Ionen des aus der ersten Massenanalyse ausgewählten markierten Analyten festgestellt wurde, zurückgerechnet werden. Dieser Prozess kann für alle verschiedenen markierten Analyten, die in der ersten Massenanalyse festgestellt wurden, wiederholt werden. In dieser Weise ist es möglich, dass die relative Menge (oft als Konzentration und/oder Quantität ausgedrückt) eines jeglichen reaktiven Analyten in jeder der verschiedenen Proben (oder Probenfraktionen), die zum Herstellen des Probengemisches verwendet wurden, bestimmt werden kann.
In einigen Ausführungsformen kann eine absolute Quantifizierung von Analyten bestimmt werden. Für diese Ausführungsformen kann eine bekannte Menge eines oder mehrerer unterschiedlich markierter Analyten (der Kalibrierungsstandard oder die Kalibrierungsstandards) zu dem Probengemisch gegeben werden. Ein Kalibrierungsstandard kann ein erwarteter Analyt sein, der mit einer isomeren oder isobaren Markierung des Satzes von Markierungen markiert ist, der zum Markieren der Analyten des Probengemisches verwendet wird, mit der Maßgabe, dass der Reporter für den Kalibrierungsstandard einzigartig ist im Vergleich mit einer jeglichen der Proben, die zum Ausbilden des Probengemisches verwendet wurden. Sobald die relative Menge an Reporter (d.h. Signatur-Ion) für den Kalibrierungsstandard oder die Kalibrierungsstandards in Bezug auf die relativen Mengen des Reporters für die unterschiedlich markierten Analyten des Probengemisches bestimmt ist, ist es möglich, die absolute Menge (oft in Konzentration und/oder Quantität ausgedrückt) aller unterschiedlich markierter Analyten in dem Probengemisch zu berechnen. In dieser Weise kann die absolute Menge eines jeglichen unterschiedlich markierten Analyten (für den es einen Kalibrierungsstandard in der Probe gibt, von der der Analyt herrührt) auch basierend auf dem Wissen, wie das Probengemisch hergestellt wurde, bestimmt werden.
Ungeachtet des Vorstehenden können Korrekturen hinsichtlich der Intensität der Reporter (Signatur-Ionen), wie geeignet, für eine jegliche natürlich auftretende oder künstlich erzeugte Isotopenhäufgkeit innerhalb der Reporter erfolgen. Ein Beispiel einer solchen Korrekturmethodik kann in der ebenfalls anhängigen und gemeinschaftlich gehaltenen US-Patentanmeldung 10/916,629 mit dem Titel „Method and Apparatus For De-Convoluting A Convoluted Spectrum", eingereicht am 12. August 2004, gefunden werden. Je mehr Sorgfalt auf eine korrekte Quantifizierung der Intensität eines jeglichen Reporters aufgewendet wird, desto genauer wird die relative und absolute Quantifizierung der Analyten in den ursprünglichen Proben oder Probenfraktionen, die zum Zusammensetzen des Probengemisches verwendet wurden, sein.
Kurz gesagt, kann unter Verwendung dieser Verfahren die Intensität von Isotopenpeaks höherer Masse und niedriger Masse, die mit einem spezifischen Signatur-Ion assoziiert sind, zu dem Hauptintensitätspeak, der mit dem Signatur-Ion (d.h. dem Reporter) assoziiert ist, hinzugerechnet werden, so dass der Beitrag aller Intensitäten ordnungsgemäß dem richtigen Reporter zugeordnet wird. Peak-Intensitäten, die nicht mit einem spezifischen Signatur-Ion assoziiert sind, werden wie geeignet abgeleitet. Durch vollständige Zuordnung aller Peak-Intensitäten zu den richtigen Signatur-Ionen kann die relative und absolute Quantifizierungsinformation, die mit einem Signatur-Ion assoziiert ist, sehr genau sein.
Proteomische Analyse:
Proben können multiplexiert sein (d.h. durch Erzeugung von Probengemischen), analysiert und erneut in einer schnellen und sich wiederholenden Weise unter Verwendung von Massenanalysetechniken analysiert werden. Zum Beispiel können Probengemische hinsichtlich der Menge von individuellen Analyten in einer oder mehreren Proben analysiert werden. Die Menge (oft in Konzentration und/oder Quantität ausgedrückt) dieser Analyten kann für die Proben (oder Probenfraktionen), aus denen das Probengemisch zusammengesetzt war, bestimmt werden. Da das Probenprozessieren und die Massenanalysen schnell erfolgen können, können diese Verfahren viele Male wiederholt werden, so dass die Menge vieler unterschiedlich markierter Analyten des Probengemisches hinsichtlich ihrer relativen und/oder absoluten Mengen in der Probe, von der der Analyt herrührt, bestimmt werden kann.
Eine Anwendung, bei der eine solche schnelle Multiplexanalyse verwendbar ist, liegt in dem Gebiet einer proteomischen Analyse. Proteomics kann als ein experimenteller Ansatz angesehen werden, um die Information zu beschreiben, die in genomischen Sequenzen hinsichtlich Struktur, Funktion und Regulation von biologischen Prozessen kodiert ist. Dies kann durch systematische Analyse der Gesamtproteinkomponente, die von einer Zelle oder einem Gewebe exprimiert wird, erreicht werden. Massenspektrometrie, die zusammen mit erfindungsgemäßen Ausführungsformen verwendet wird, ist ein mögliches Werkzeug für eine solche globale Proteinanalyse, einschließlich der Analyse post-translationaler Modifikationen, Pulldown-Tests oder anderer solcher komplexer Analysen. Die Verfahren können auch für eine Biomarkeranalyse oder für eine Zeitverlaufsanalyse verwendet werden.
5. Verschiedene Arten zum Durchführen der Erfindung:
Erfindungsgemäße Ausführungsformen erlauben die Analyse der Proben von Interesse hinsichtlich des Vorhandenseins und/oder Fehlens von modifizierten und nicht modifizierten Analyten, wobei die Modifikation von Interesse sein kann. Affinitätschromatographie kann zum Auftrennen von modifizierten Analyten von den nicht modifizierten Analyten verwendet werden. In einigen Ausführungsformen kann das Vorhandensein der Modifikation unabhängig durch Unterscheiden zwischen spezifischen und nicht spezifischen Wechselwirkungen mit einem Affinitätsträger bestätigt werden. Isobare und/oder isomere Markierungsreagenzien eines Satzes können verwendet werden, um die Analyten der verschiedenen Proben oder Probenfraktionen zu kodieren. Die relativen Mengen der modifizierten und nicht modifizierten Analyten in den verschiedenen Proben können aus den Verhältnissen der Reporter (Signatur-Ionen), die mit den verschiedenen Markierungsreagenzien assoziiert sind, bestimmt werden, und gegebenenfalls ist eine absolute Quantifizierung möglich, falls markierte (Kalibrierungs)standards verwendet werden. Im Allgemeinen können die modifizierten und nicht modifizierten Analyten einer oder mehrerer Proben gemäß dem nachstehenden allgemeinen Verfahren bestimmt werden.
Zu bestimmende Proben werden ausgewählt und können gegebenenfalls, wenn erwünscht, prozessiert werden. Beispielhafte Ausführungsformen eines Probenprozessierens wurden vorstehend unter der Überschrift „Probenprozessierung" beschrieben. Zum Beispiel kann, falls die zu bestimmenden Analyten Proteine sind, es wünschenswert sein, die Proteine zu Peptiden unter Verwendung eines oder mehrerer Proteaseenzyme zu verdauen. Alternativ oder zusätzlich können Proben durch Abtrennen bestimmter Komponenten, bevor sie einer weiteren Handhabung unterzogen werden, prozessiert werden. Beispielhafte Ausführungsformen von Auftrennungen wurden vorstehend unter der Überschrift „Auftrennungen" beschrieben. Ein Prozessieren kann nicht notwendig sein, falls der Analyt in einer für eine Analyse geeigneten Form vorliegt.
Falls eine Bestimmung erfolgen soll, ob eine Modikation von Interesse eine spezifische Wechselwirkung der Analyten einer Probe oder Probenfraktion mit einer ausgewählten stationären Phase (d.h. Affinitätsträger) bewirkt oder nicht, kann eine Fraktion einer jeglichen Probe oder Probenfraktion (die „Spezifizitätskontrolle") mit einem Enzym (oder Enzymen) und/oder einer Chemikalie (oder Chemikalien) behandelt werden, das/die diese Modifikation von Analyten der Probe, die die Modifi kation umfassen, entfernt. Wenn zwei oder mehrere Proben gleichzeitig analysiert werden, können die behandelten Fraktionen alle gemischt werden, um ein Gemisch auszubilden (das „Spezifizitätskontrollgemisch" oder „SCM"). Ungeachtet des Vorstehenden wird mindestens eine Probe oder Fraktion davon mit dem Enzym und/oder der Chemikalie, das/die die Modifikation entfernt, unbehandelt bleiben, da es sonst nicht möglich sein wird, nicht modifizierte und modifizierte Analyten durch dieses Verfahren zu vergleichen.
Um die Analyse zu vereinfachen, kann das SCM dadurch hergestellt werden, dass eine Menge einer jeglichen Probe oder Probenfraktion, die untersucht werden soll, derart vereinigt wird, dass eine Proportionalität von Signaturpeaks in der Analyse von komplexen Gemischen eine einfach zu analysierende Verhältnisinformation bereitstellt. Zum Beispiel kann, falls vier Proben analysiert werden sollen, 1/5 jeder der vier Proben gemischt werden, um die Probe auszubilden, die mit dem Enzym oder der Chemikalie umgesetzt werden soll. Dementsprechend entspricht jede der verbleibenden Proben 4/5 der ursprünglichen Probe und das SCM wird ungefähr äquivalent sein (1/5 + 1/5 + 1/5 + 1/5 = 4/5). Als eine Daumenregel kann daher die Menge, die von jeder Probe vereinigt werden soll, um das SCM auszubilden, gemäß der Formel: 1/Anzahl von Proben (oder Probenfraktionen) + 1 = die Fraktion, die von jeder Probe (oder Probenfraktion entnommen wird, um das SCM herzustellen) ausgewählt werden. Es sollte beachtet werden, dass dies keine Begrenzung darstellt, da eine jegliche Menge von den Proben für diese Analyse entnommen werden kann. Jedoch vereinfacht das Befolgen dieses Verfahrens die Analyse basierend auf den relativen Intensitäten der Peaks, die für die Signatur-Ionen festgestellt werden.
Sobald die zu analysierenden Proben ausgewählt wurden, gegebenenfalls, wie gewünscht, prozessiert, gegebenenfalls fraktioniert (z.B. aufgetrennt) wurden, und gegebenenfalls ein Aliquot entnommen wurde und für eine spezifische Bindungsanalyse behandelt wurde, wird jede Probe oder Fraktion davon (einschließlich des SCM) auf einen Affinitätsträger aufgetragen und in eine Fraktion von Analyten, die durch den Träger fließen, und eine Fraktion von Analyten, die an den Affinitätsträger binden, aufgetrennt. Jede Probe oder Fraktion davon wird auf einen unterschiedlichen Affinitätsträger aufgetragen. Die Analyten, die an den Träger binden, werden unter Bedingungen eluiert, die sich von denjenigen der Durchflussanalyten unterscheiden. Die Analyten, die durch den Affinitätsträger fließen, können getrennt als eine Fraktion von denjenigen, die an den Affinitätsträger binden, gesammelt werden. Verfahren zum Durchführen solcher Auftrennungen von modifizierten und nicht modifizierten Analyten sind bekannt. Zum Beispiel wird verstanden, dass eine IMAC-Säule selektiv Phosphopeptide bindet, um dadurch die Abtrennung der Phosphopeptide von der assoziierten nicht modifizierten Version der Peptide zu ermöglichen.
An diesem Punkt können die Fraktionen von Interesse durch Reaktion der Analyten jeder Fraktion mit den isobaren und/oder isomeren Markierungsreagenzien eines Satzes kodiert werden. Abhängig von der Analyse kann es sein, dass bestimmte Fraktionen nicht kodiert werden müssen, und sie können verworfen werden. Fraktionen, die Analyten umfassen, die an den Affinitätsträger binden, werden typischerweise mit einem einzigartigen Markierungsreagenz eines Satzes von isobaren und/oder isomeren Markierungsreagenzien kodiert. In einigen Ausführungsformen werden die Fraktionen, die Analyten umfassen, die durch den Affinitätsträger fließen, kodiert und in einigen Ausführungsformen können diese verworfen werden.
Eine Beschreibung von Ausführungsformen solcher Markierungsreagenzien und Markierungsverfahren wurde vorstehend unter den Überschriften „Markierungsreagenzien" bzw. „Markierung der Analyten einer Probe" beschrieben. Mit der Ausnahme der Spezifizitätskontrolle oder des SCM kann eine jegliche der gebundenen und Durchflussprobenfraktionen mit einem unterschiedlichen Markierungsreagenz kodiert werden. Für die Spezifizitätskontrolle oder SCM wird lediglich die Fraktion mit Komponenten, die an den Affinitätsträger banden, typischerweise mit einem einzigartigen Markierungsreagenz aus dem Satz kodiert, obwohl der Durchfluss mit einem einzigartigen Markierungsreagenz kodiert werden kann, falls gewünscht. Sobald die Markierung abgeschlossen ist, wird eine jegliche der kodierten Fraktionen (oder einer Subfraktion davon) zusammengemischt. Durch Zusammenmischen aller Proben (oder Probenfraktionen) kann eine Multiplexanalyse in einer Zeit- und Ressourcen-effizienten Weise erfolgen, wodurch direkte Vergleiche zwischen den Zusammensetzungen der unterschiedlichen Proben (oder Probenfraktionen) gemacht werden können, ohne den Bedarf, Korrekturen basierend auf Variationen von Probe zu Probe oder Lauf zu Lauf einzusetzen. Falls eine absolute Quantifizierung erwünscht ist, kann eine bekannte Menge eines Kalibrierungsstandards für Analyten von Interesse zu dem Gemisch gegeben werden, wie vorstehend unter der Überschrift „Relative und absolute Quantifizierung von Analyten" beschrieben.
Sobald gemischt, wird das Gemisch chemisch oder enzymatisch behandelt, um die Modifikation von Interesse von den Analyten zu entfernen. Dementsprechend sind alle Analytenkomponenten des Gemisches nicht modifiziert, aber basierend auf Bindungseigenschaften, die damit assoziiert sind, ob sie die Modifikation von Interesse bei vorbestimmten Schritten in dem Verfahren enthielten oder nicht, kodiert. Dementsprechend ist eine relevante Information über die Analytenmodifikationen in dem Gemisch nach der chemischen oder enzymatischen Behandlung vorhanden, obwohl die Modifikationen an allen Analyten des Gemisches entfernt wurden. In anderen Worten sollten alle Analyten an diesem Punkt nicht modifiziert sein, aber sie sollten in einer Weise kodiert sein, die das Vorhandensein oder Fehlen der Modifikation der Analyten in den ursprünglichen Proben, die ausgewählt wurden, verfolgt.
Nach einer chemischen oder enzymatischen Behandlung kann das Probengemisch gegebenenfalls vor einer Massenspektralanalyse aufgetrennt werden. Eine Auftrennung kann verwendet werden, um die Komplexizität des Gemisches zu vermindern. Zum Beispiel kann eine Auftrennung verwendet werden, um unterschiedliche Analyten des Probengemisches aufzutrennen, um dadurch eine vereinfachte und vollständigere Massenspektralanalyse zu erleichtern. Je komplexer das Probengemisch ist, desto vorteilhafter wird die Durchführung einer oder mehrerer Schritte eines Auftrennens vor der Massenspektralanalyse sein. Wenn alle Markierungsreagenzien isobar sind, werden unterschiedlich markierte aber ansonsten identische Analyten durch die Auftrennungstechnik nicht unterscheidbar sein. Einige oder alle der so erhaltenen Fraktionen werden in einem Massenspektrometer analysiert, um so viel Information über die Komponentenanalyten einer jeden der ursprünglichen Proben wie möglich zu sammeln. Eine beispielhafte Analyse durch ein Massenspektrometer wurde vorstehend unter den Überschriften „Massenspektrometer/Massenspektrometrie", „Fragmentierung durch dissoziative Energieniveaus" und „Analytenbestimmung durch Computer-unterstützte Datenbankanalyse" beschrieben.
Zum Beispiel kann das Probengemisch (oder Fraktionen davon) durch Massenspektralanalyse, einschließlich MS/MS-Analyse, analysiert werden. Bei der MS/MS-Analyse können Signatur-Ionen für unterschiedliche markierte Analyten des Probengemisches bestimmt werden, wobei jedes Signatur-Ion mit dem einzigartigen Markierungsreagenz einer kodierten Probenfraktion korreliert und die Peak-Intensität des Signatur-Ions mit der relativen Quantität dieses Analyten in dem Probengemisch korreliert. Aus der relativen Intensitätsinformation von Signatur-Ionen für jeden Analyten ist es möglich, relative Mengen von modifizierten und nicht modifizierten Analyten in jeder der ursprünglichen Proben und gegebenenfalls (wenn eine Spezifizitätskontrolle oder SCM hergestellt wurde) zu bestimmen, ob der Analyt eine spezifische oder nicht spezifische Bindung an den Affinitätsträger aufwies. Eine Tochterfragment-Ionen-Analyse kann weiter verwendet werden, um die Analyten (z.B. Peptide) als auch Vorläufermoleküle (z.B. Proteine) zu bestimmen, wenn die in der Massenanalyse identifizierten Analyten aus Vorläufermolekülen erhalten wurden.
Spezifisch ist es, falls eine Spezifizitätskontrolle oder SCM getrennt auf einen Affinitätsträger aufgetragen wurde und mindestens die Fraktion von Analyten, die an den Affinitätsträger binden, getrennt mit einem einzigartigen Markierungsreagenz markiert wurde, es möglich, zu bestimmen, ob Analyten, die die Modifikation umfassen, spezifisch mit dem Affinitätsträger Wechselwirken oder nicht. Diese Information ist dadurch möglich, dass bestimmt wird, ob das Signatur-Ion für das einzigartige Markierungsreagenz, das mit einer Spezifizitätskontrolle oder SCM assoziiert ist, festgestellt wird oder nicht. Falls das Signatur-Ion festgestellt wird, ist die Wechselwirkung mit dem Affinitätsträger nicht spezifisch. Falls das Signatur-Ion für die Spezifizitätskontrolle oder SCM nicht festgestellt wird, ist die Wechselwirkung mit dem Affinitätsträger spezifisch.
Wie unter der Überschrift „Analytenbestimmung durch Computer-unterstützte Datenbankanalyse" beschrieben, ist es aus der Tochter-Ionen-Analyse möglich, einen oder mehrere Analyten in dem Gemisch zu identifizieren. Falls die Analyten aus Vorläufermolekülen erhalten werden, kann es möglich sein, die Identität eines oder mehrerer der Vorläufermoleküle zu erhalten. Zum Beispiel kann es, falls die Tochter-Ionen-Analyse einen oder mehrere Peptidanalyten in der Probe identifiziert, möglich sein, einen oder mehrere Proteinanalyten in der Probe zu identifizieren, wenn die Proteine verdaut wurden, um die Peptidanalyten herzustellen. Die nachstehende Beschreibung und nachstehenden Beispiele sind beispielhaft dafür, wie diese Analyse durchgeführt werden kann.
Ferner kann, da die Proben und Probenfraktionen kodiert wurden, die relative Intensität der Signatur-Ionen in dem Gemisch mit der relativen Menge an modifizierten und nicht modifizierten Versionen des identifizierten Analyten in dem Gemisch, das analysiert wird, korreliert werden. Diese Information bezieht sich auf die ursprünglichen Proben derart zurück, dass es möglich ist, die relative und/oder absolute Menge eines spezifischen modifizierten Analyten und dessen entsprechenden nicht modifizierten Analyten in jeder der ursprünglichen Proben zu bestimmen. Wenn die Analyten von Vorläufermolekülen erhalten werden, ist es möglich, die re lative und/oder absolute Menge eines spezifischen modifizierten Vorläufermoleküls (selbst ein Analyt) und seines entsprechenden nicht modifizierten Vorläufermoleküls (selbst ein Analyt) in jeder der ursprünglichen Proben zu bestimmen. Die nachstehende Beschreibung und nachstehenden Beispiele sind beispielhaft dafür, wie diese Analyse durchgeführt werden kann.
6. Beispielhafte Ausführungsformen:
Die nachstehend dargelegten Beschreibungen konzentrieren sich auf eine Bestimmung der relativen und/oder absoluten Quantifizierung von Phosphopeptiden in mehr als einer Probe oder Fraktion davon. Phosphopeptide können in einer Zelle als eine Folge einer post-translationalen Modifikation (PTM) erzeugt werden. Das Vorhandensein der Phosphatgruppe der Phosphopeptide ist daher ein Charakteristikum von Interesse, das durch erfindungsgemäße Ausführungsformen bestimmt werden kann. Jedoch können die spezifischen nachstehend beschriebenen Verfahren angepasst werden, um eine jegliche Modifikation oder ein anderes Charakteristikum von Interesse eines Analyten zu bestimmen, wenn die Modifikation (oder das mit einer Modifikation assoziierte Charakteristikum) durch ein enzymatisches oder chemisches Mittel entfernt werden kann, um dadurch den nativen (nicht modifizierten) Analyten zu erzeugen. Die nachstehend beschriebenen Verfahren können auch in nicht begrenzender Weise Affinitäts- (oder Antikörper-)Pulldown-Tests von spezifischen Proteinen oder Proteinkomplexen beinhalten, bei denen das Kodieren verwendet werden könnte, um spezifische von nicht spezifischen Wechselwirkungen zu unterscheiden. Breit betrachtet, könnte das Tagging verwendet werden, um Proben in einer jeglichen Situation zu kodieren, bei der man verlässlich zwischen experimentellen und Kontrollergebnissen unterscheiden möchte. Durch Multiplexen könnte dies ein Experiment und multiple Kontrollen umfassen. Die nachstehenden Beispiele sollen daher beispielhaft für die Erfindung und in keiner Weise begrenzend sein.
Die Identifizierung von post-translational modifizierten zellulären Analyten in komplexen Gemischen kann problematisch sein. Dies ist insbesondere für Phosphopeptide zutreffend. Nachweisgrenzen für Phosphopeptide in einem Massenspektrometer können signifikant vermindert werden, da sie oft in geringer molarer Häufigkeit (oft weniger als 10%) vorhanden sind, im Vergleich zu einem entsprechenden nativen (nicht phosphorylierten) Peptid. Zusätzlich kann die stark negative Phosphatgruppe eine Ionensuppression in sowohl einer Elektrospray (ES)- als auch Matrix-unter stützten Laserdesorptions-(MALDI)Massenspektralanalyse bewirken, was dadurch die festgestellte Ionenintensität vermindert. Es ist daher nicht überraschend, dass Phosphopeptide kaum erfolgreich in vielen Projekten in Proteommaßstab von hoher Probenkomplexizität identifiziert werden, bei denen die relativ schwachen Phosphopeptidsignale oft durch andere Ionen maskiert oder durch andere Probenkomponenten unterdrückt werden. Obwohl eine Probenkomplexizität durch Affinitätschromatographie oder die Anwendung von reinen MS-Techniken (z.B. als Vorläufer- oder Neutralverlustscanmodus) vermindert werden kann, schwächen die geringe molare Häufigkeit und schlechte Ionisierungseffizienz der phosphorylierten Peptide einen Nachweis in komplexen Peptidproben ab.
Dementsprechend betrifft in einigen Ausführungsformen die Erfindung Verfahren, die für die Analyse von post-translationalen Modifikationen (PTMs) von zellulären Analyten geeignet sind. Alle Arten von post-translationalen Modifikationen können bestimmt werden. Zum Beispiel kann die post-translationale Modifikation Phosphorylierung, Glykosylierung oder Metallmodifikation eines zellulären Analyten umfassen. Der zelluläre Analyt kann ein jeglicher zellulärer Bestandteil wie ein Peptid, Protein, Antikörper (einschließlich Antikörperfragmente), eine Nukleinsäure, ein Kohlenhydrat, Lipid oder Steroid sein.
Beispielhafte Verfahren werden nachstehend beschrieben. Ausführungsformen von Gemischen beinhalten das Probengemisch, wobei Analyten mit Markierungsreagenzien kodiert sind, die die Probenfraktion, von der sie herrühren, identifizieren. Ausführungsformen von Kits beinhalten Kits, die zum Durchführen der beschriebenen Verfahren geeignet sind, als auch diejenigen, die zum Erzeugen der beschriebenen Probengemische verwendet werden können. Ein Kit könnte z.B. einen Satz von isobaren Markierungsreagenzien und einen Affinitätsträger umfassen, der zur Auftrennung von modifizierten und nicht modifizierten Analyten von Interesse geeignet ist.
Bestimmung von Analytenmodifikationen basierend auf charakteristischen Affinitätseigenschaften:
Mit Bezug auf die 1a, 1b und Beispiel 1 wird eine Beschreibung einer Art zum Bestimmen von post-translationalen Modifikationen oder einer anderen charakteristischen Eigenschaft eines Analyten veranschaulicht. Gemäß der Darstellung von 1a können zwei Proben (d.h. Probe 1 und Probe 2), die einen Analyten wie ein Protein (z.B. von einem Zelllysat) umfassen, durch Behandlung mit einem pro teolytischen Enzym (z.B. Trypsin) prozessiert werden, um dadurch Komponentenproteine zu verdauen. Der Verdau kann sowohl nicht modifizierte als auch modifizierte Peptide (z.B. Phospho-, Glyko- oder Metallopeptide) umfassen. Für jedes modifizierte Peptid kann es ein korrelierendes natives (nicht modifiziertes) Peptid geben, das in größerer oder geringerer Häufigkeit im Vergleich mit dem modifizierten Peptid vorhanden ist.
Jede Probe von verdautem Material wird chromatographisch aufgetrennt, um dadurch die modifizierten Peptide von den nicht modifizierten Peptiden zu trennen. Zum Beispiel ist eine immobilisierte Metall-Affinitätschromatographie (IMAC)-Säule für die Immobilisierung von Phosphopeptiden geeignet und dafür bekannt, dass sie die Immobilisierung von Phosphopeptiden erleichtert. Die stationäre Phase und chromatographischen Bedingungen können für andere Arten von Modifikationen optimiert werden. Grundsätzlich kann die Auftrennung derart erfolgen, dass gebundene Komponenten, die wahrscheinlich die Eigenschaft von Interesse aufweisen (z.B. Phosphopeptide sind), von den anderen Komponenten der Probe abgetrennt werden können. Die gebundenen Komponenten werden getrennt von Komponenten, die durch die stationäre Phase fließen, eluiert, so dass sowohl die gebundenen als auch die nicht gebundenen (Durchfluss-)Komponenten jeder Probe getrennt gesammelt werden. Demzufolge kann es für ein Zweiprobensystem vier gesammelte Probenfraktionen geben. Die Anzahl von Fraktionen gemäß dieser Darstellung wird das Zweifache der Anzahl von zu vergleichenden Proben betragen.
Wie in 1a veranschaulicht, kann jede der vier Probenfraktionen mit einem unterschiedlichen isobaren oder isomeren Markierungsreagenz eines Satzes von Markierungsreagenzien umgesetzt werden. Zum Beispiel könnte jedes Markierungsreagenz als Reagenz A, Reagenz B, Reagenz C und Reagenz D bezeichnet werden, wobei z.B. die Reagenzien Fragment-Ionen von 114, 115, 116 bzw. 117 amu erzeugen, wenn sie einer MS/MS-Analyse unterzogen werden. An diesem Punkt können die Markierungsreagenzien mit den modifizierten und nicht modifizierten Peptiden (Analyten) einer jeden der vier Fraktionen umgesetzt werden.
Wie in 1a veranschaulicht, wird jede der vier Fraktionen (oder eine Fraktion davon), sobald sie mit einem der vier unterschiedlichen isobaren und/oder isomeren Markierungsreagenzien markiert worden ist, gemischt, um ein Probengemisch (d.h. „Gemisch" in der Figur) auszubilden. Gemäß 1a kann das Gemisch sowohl modifizierte als auch nicht modifizierte Peptide aus beiden Proben 1 und 2 enthalten, wobei diese Peptide aus Probe 1 mit Reagenz A (114) oder Reagenz C (116) markiert (kodiert) sein werden und diejenigen Peptide aus Probe 2 mit Reagenz B (115) oder Reagenz D (117) markiert (kodiert) sein werden. Ein beispielhafter Satz von isobaren Markierungsreagenzien, die Signatur-Ionen einer Masse/Ladung von 114, 115, 116 und 117 erzeugen, ist in 4 veranschaulicht.
Das Probengemisch wird sodann mit einem Enzym (oder Enzymen) oder einer Chemikalie (oder Chemikalien) behandelt, um die Modifikation von den Analyten des Probengemisches zu entfernen. Zum Beispiel kann die Phosphogruppe eines Phosphopeptids durch Behandlung mit einer oder mehreren Phosphataseenzymen (z.B. Serin (S)-, Threonin (T)- oder Tyrosin (Y)-Phosphatasen) entfernt werden. Nach der Behandlung ist, was vorher modifizierte und nicht modifizierte Versionen des gleichen Analyten war, jetzt alles nicht modifiziert. Jedoch umfassen alle zu bestimmenden Peptidanalyten eine Markierung, die die Probenfraktion als auch die Probe (d.h. Probe 1 oder Probe 2), von der sie herrühren, kodiert. Falls die Markierungen isobar sind, können abgesehen von den sich unterscheidenden Markierungen identische Analyten (z.B. Peptide) chemisch und strukturell ununterscheidbar sein (mit der Ausnahme der sich unterscheidenden Verteilung von Isotopen schwerer Atome), insbesondere bei einem jeglichen Auftrennungsverfahren. Folglich kann eine anschließende Auftrennung wie eine multidimensionale Flüssigchromatographie (LC) gegebenenfalls durchgeführt werden. Dies ist kein Problem, da Fraktionen des Probengemisches (die durch das Auftrennverfahren erzeugt wurden) einen jeglichen markierten Analyten proportional zu seiner Quantität oder Konzentration in dem Probengemisch umfassen werden.
Nach der Behandlung mit der Chemikalie oder dem Enzym, um die Modifikation (oder das Charakteristikum von Interesse, das mit einer entfernbaren Modifikation assoziiert ist) zu entfernen, und einer optionalen Auftrennung, wird das Probengemisch oder eine Fraktion davon in einem Massenspektrometer analysiert. Wie vorstehend beschrieben, kann in dem MS/MS-Modus die Tochter-Ionen jedes Analyten verwendet werden, um Peptide und/oder Proteine der Probe durch Auswahl von Ionen aus der MS-Analyse zu bestimmen. Ferner kann für jedes Analytenpeptid die relative Quantität dieses Peptids in jeder der vier Fraktionen, die zum Erzeugen des Probengemisches verwendet wurden, basierend auf jedem Signatur-Ionen-Peak des Reporters jedes Markierungsreagenzes bestimmt werden.
Mit Bezug auf 1b kann das für die Signatur-Ionen festgestellte Muster verwendet werden, um die Ergebnisse der Proben zu bestimmen, die auf den in 1a veranschaulichten Ablaufplan angewendet wurden. Wie aus einer Analyse von 1b ersichtlich ist, wird, falls ein Analyt eine Affinität hinsichtlich der IMAC-Säule aufweist (d.h. er ein Phosphopeptid ist), er auf der Säule immobilisiert und mit Reagenz A oder Reagenz B markiert werden. Folglich werden, falls der Analyt an den Affinitätsträger bindet, Signatur-Ionen für Reagenz A und Reagenz B in der MS/MS-Analyse festgestellt werden. Falls keine Bindung an die Affinitätssäule auftritt, werden Signatur-Ionen für lediglich Reagenzien C und D in der MS/MS-Analyse festgestellt werden. Es sollte beachtet werden, dass die Peak-Intensität für das Signatur-Ion für ein jegliches der Markierungsreagenzien proportional zu der Menge des Analyten in dem Probengemisch ist. Basierend auf dem Wissen über die Menge (z.B. Volumen) einer jeglichen Probenfraktion, die zugesetzt wurde, um das Probengemisch auszubilden, ist es möglich, die Menge (typischerweise in Konzentration oder Quantität angegeben) des Analyten in einer jeglichen der Probenfraktionen als auch in jeder von Probe 1 und Probe 2 zurückzurechnen.
Falls eine absolute Quantifizierung des Analyten gewünscht ist, ist es möglich, das Probengemisch mit einer bekannten Menge des Kalibrierungsstandardanalyten, der mit einer isobaren oder isomeren Markierung des Satzes von Markierungsreagenzien unterschiedlich markiert ist, zu versetzen. In dieser Weise können die relativen Mengen von Signatur-Ionen für den Analyten relativ zu der bekannten Menge des Kalibrierungsstandards verglichen werden. Durch Bezug auf die Quantität an Kalibrierungsstandard kann die absolute Menge des Analyten in jeder der Proben, die zum Ausbilden des Probengemisches verwendet wurden, basierend auf der relativen Intensität der Signatur-Ionen bestimmt werden.
Ein Vorbehalt zu dem vorstehenden Verfahren ist, ob die Bindung des Analyten an die stationäre Phase mit dem Vorhandensein der Modifikation, die bestimmt werden soll, korreliert werden kann oder nicht. Dies ist so, da die Bindung eines Analyten an einen Träger entweder spezifisch oder nicht spezifisch sein kann. Das nachstehende Beispiel veranschaulicht, wie unter Verwendung der isobaren und/oder isomeren Markierungsreagenzien bestimmt wird, ob eine festgestellte Affinität des Analyten hinsichtlich des Trägers spezifisch durch die Modifikation (oder das Charakteristikum von Interesse) verursacht wird oder nicht.
Bestimmung der Spezifität von Affinitätsbindungseigenschaften:
Mit Bezug auf die 2a, 2b und Beispiel 2 wird eine Beschreibung einer Art zum Bestimmen, ob eine charakteristische Eigenschaft eines Analyten zu einem spezifischen Binden an eine stationäre Phase führt oder nicht, veranschaulicht. Gemäß diesem Verfahren kann eine Probe, die einen Analyten oder Analyte (wie ein Protein aus einem Zelllysat) umfasst, durch Behandlung mit einem proteolytischen Enzym (z.B. Trypsin) prozessiert werden, um dadurch Komponenten der Probe zu verdauen. Für ein Protein kann der Verdau sowohl nicht modifizierte als auch modifizierte Peptide (z.B. Phospho-, Glyko- oder Metallopeptide) umfassen. Für ein jegliches modifiziertes Peptid kann es ein korrelierendes natives (nicht modifiziertes) Peptid geben, das in größerer oder geringerer Häufigkeit im Vergleich zu dem modifizierten Peptid vorhanden ist.
Mit Bezug auf 2a kann die verdaute Probe oder eine Fraktion davon in zwei Probenfraktionen aufgeteilt werden. Typischerweise werden die zwei Probenfraktionen ein gleiches Volumen aufweisen, aber dies ist kein Erfordernis, solange die relativen Mengen bekannt sind. Eine der zwei Probenfraktionen kann chemisch oder enzymatisch behandelt werden, um die Modifikation zu entfernen, die hinsichtlich einer spezifischen oder nicht spezifischen Wechselwirkung mit einer spezifischen stationären Phase untersucht werden soll. Die andere der zwei Probenfraktionen kann ohne eine weitere Probenprozessierung aufgenommen werden.
Jede der zwei Probenfraktionen wird sodann auf die stationäre Phase von Interesse aufgetragen. Zum Beispiel ist eine immobilisierte Metall-Affinitätschromatographie (IMAC)-Säule für die Immobilisierung von Phosphopeptiden geeignet und dafür bekannt, dass sie die Immobilisierung von Phosphopeptiden erleichtert. Die stationäre Phase und chromatographischen Bedingungen können für andere Arten von Modifikationen optimiert werden. Grundsätzlich kann die Auftrennung derart erfolgen, dass gebundene Komponenten, die wahrscheinlich die Eigenschaft von Interesse aufweisen (z.B. Phosphopeptide sind), von den anderen Komponenten der Probe abgetrennt werden können. Die gebundenen Komponenten werden getrennt von Komponenten, die durch die stationäre Phase fließen, eluiert, so dass sowohl die gebundenen als auch nicht gebundenen (Durchfluss-)Komponenten getrennt gesammelt werden.
Wie in 2a veranschaulicht, müssen lediglich die Fraktionen mit Komponenten, die an die stationäre Phase gebunden haben können, mit einem unterschiedlichen isobaren oder isomeren Markierungsreagenz eines Satzes von Markierungsreagenzien umgesetzt werden. Obwohl die „Durchfluss"-Fraktionen markiert und analysiert werden können, ist dies zum Bestimmen, ob die Wechselwirkungen der Komponenten mit der stationären Phase spezifisch oder nicht spezifisch sind, nicht essenziell.
Wie in 2a veranschaulicht, werden, sobald jede der zu markierenden Fraktionen tatsächlich mit einem der unterschiedlichen isobaren und/oder isomeren Markierungsreagenzien markiert ist, sie (oder eine Fraktion davon) gemischt, um ein Probengemisch auszubilden. Das Probengemisch kann sowohl modifizierte als auch nicht modifizierte Peptide enthalten. Gemäß 2a wird das Probengemisch sodann mit einem Enzym oder einer Chemikalie behandelt, um die Modifikation von dem Analyten zu entfernen. Zum Beispiel kann die Phosphogruppe eines Phosphopeptids durch Behandlung mit einem oder mehreren Phosphataseenzymen entfernt werden. Nach Behandlung ist alles, was vorher modifizierte oder nicht modifizierte Versionen des gleichen Analyten war, jetzt nicht modifiziert.
Jedoch umfassen alle zu bestimmenden Analyten eine Markierung, die die Probenfraktion und möglicherweise die Probe (d.h. Probe 1 oder Probe 2), von der sie herrühren, kodiert. Falls die Markierungen isobar sind, können, abgesehen von den sich unterscheidenden Markierungen, identische Analyten (z.B. Peptide) chemisch und strukturell ununterscheidbar sein (mit der Ausnahme der sich unterscheidenden Verteilung von Isotopen schwerer Atome), insbesondere bei einem jeglichen Auftrennungsverfahren. Folglich kann eine nachfolgende Auftrennung wie eine multidimensionale Flüssigchromatographie (LC) gegebenenfalls durchgeführt werden. Dies ist kein Problem, da Fraktionen des Probengemisches (die durch das Auftrennverfahren erzeugt wurden) jeden markierten Analyten proportional zu seiner Quantität oder Konzentration in dem Probengemisch umfassen werden.
Nach der Behandlung mit der Chemikalie oder dem Enzym, um die Modifikation (oder das Charakteristikum von Interesse, das mit einer entfernbaren Modifikation assoziiert ist) zu entfernen und einer optionalen Auftrennung wird das Probengemisch oder eine Fraktion davon in einem Massenspektrometer analysiert. Wie vorstehend beschrieben, können in dem MS/MS-Modus die Tochter-Ionen jedes Analyten verwendet werden, um Peptide und/oder Proteine der Probe durch Auswahl von Ionen aus der MS-Analyse zu bestimmen. Ferner kann für ein jegliches Analytenpeptid die relative Quantität dieses Peptids in jeder der Fraktionen, die zum Erzeugen des Probengemisches verwendet wurden, basierend auf einem jeglichen Signatur-Ionen-Peak des Reporters eines jeglichen Markierungsreagenzes bestimmt werden.
Mit Bezug auf 2b kann das für die Signatur-Ionen festgestellte Muster verwendet werden, um die Ergebnisse der Proben, die auf den in 2a veranschaulichten Ablaufplan angewendet wurden, zu bestimmen. Wie durch eine Analyse von 2b ersichtlich ist, kann, falls ein Analyt eine Affinität hinsichtlich der IMAC-Säule aufweist (d.h. er ein Phosphopeptid ist), er auf der Säule immobilisiert, von der Säule eluiert und mit Reagenz A oder Reagenz B markiert werden. Mit Bezug auf 2b sollte, falls der Analyt spezifisch an die stationäre Phase bindet, es einen geringen oder keinen Signaturpeak geben, der für Markierungsreagenz A festgestellt wird, da die Entfernung der Modifikation vor dem Kontakt mit der stationären Phase eine spezifische Bindung der Analyten an die stationäre Phase ausschließen sollte. Jedoch wird, falls die Wechselwirkung mit der stationären Phase nicht spezifisch ist, mindestens ein gewisser Signaturpeak für Markierungsreagenz A festgestellt werden, da eine Entfernung der Modifikation eine geringe oder keine Wirkung auf die Wechselwirkung der Modifikation mit der stationären Phase haben wird.
Es sollte beachtet werden, dass die Peak-Intensität für das Signatur-Ion für ein jegliches der Markierungsreagenzien proportional zu der Menge des Analyten in dem Probengemisch ist. Basierend auf dem Wissen der Menge (z.B. Volumen oder Konzentration) jeder Probenfraktion, die zugesetzt wurde, um das Probengemisch auszubilden, ist es möglich, die Menge (typischerweise in Konzentration oder Quantität angegeben) des Analyten in einer jeglichen der Probenfraktionen und, falls geeignet, in einer jeglichen der in einem Test verwendeten Proben zurückzurechnen.
Falls eine absolute Quantifizierung des Analyten erwünscht ist, ist es möglich, das Probengemisch mit einer bekannten Menge des Kalibrierungsstandardanalyten, der mit einer isobaren oder isomeren Markierung des Satzes von Markierungsreagenzien unterschiedlich markiert ist, zu versetzen. In dieser Weise können die relativen Mengen von Signatur-Ionen für den Analyten relativ zu der bekannten Menge des Kalibrierungsstandards verglichen werden. Durch Bezug auf die Quantität an Kalibrierungsstandard kann die absolute Menge des Analyten in einer jeglichen der Proben, die zum Ausbilden des Probengemisches verwendet wurden, basierend auf der relativen Intensität der Signatur-Ionen bestimmt werden.
Bestimmung von Analytenmodifikationen und der Spezifizität einer Bindungsaffinität der Modifikation an einen Träger:
Mit Bezug auf die 3a, 3b und Beispiel 3 wird eine Beschreibung einer Art zum Bestimmen von sowohl dem Vorhandensein einer Modifikation in Probenkomponenten als auch, ob die Modifikation zu einem spezifischen Binden an eine stationäre Phase führt oder nicht, veranschaulicht. Gemäß dem Verfahren können zwei Proben, die einen Analyten oder Analyten (wie ein Protein von einem Zelllysat) umfassen, durch Behandlung mit einem proteolytischen Enzym (z.B. Trypsin) prozessiert werden, um dadurch Komponenten der Probe zu verdauen. Für ein Protein kann der Verdau sowohl nicht modifizierte als auch modifizierte Peptide (z.B. Phospho-, Glyco- oder Metallopeptide) umfassen. Für ein jegliches modifiziertes Peptid kann es ein korrelierendes natives (nicht modifiziertes) Peptid geben, das in einer größeren oder geringeren Häufigkeit im Vergleich mit dem modifizierten Peptid vorhanden ist.
Mit Bezug auf 3a kann eine jegliche verdaute Probe oder eine Fraktion davon in zwei Probenfraktionen aufgeteilt werden. Gemäß der Abbildung kann jede Probe in Aliquots von 2/3 und 1/3 aufgeteilt werden, aber dies ist kein Erfordernis, sofern die relativen Mengen bekannt sind. Gemäß der Abbildung kann eine jegliche der 1/3-Probenfraktionen vereinigt (1/3 + 1/3 = 2/3) und chemisch oder enzymatisch behandelt werden, um die Modifikation zu entfernen, die hinsichtlich einer spezifischen oder nicht spezifischen Wechselwirkung mit einer spezifischen stationären Phase untersucht werden soll. Durch Vereinigen der zwei Fraktionen von 1/3 sind alle Mengen der auf die IMAC-Säulen aufgetragenen Proben identisch (d.h. 2/3). Dieser Ansatz kann die relative Quantifizierungsanalyse basierend auf einer Reportersignalanalyse vereinfachen. Die verbleibenden 2/3 jeder Probe können ohne eine weitere Probenprozessierung übernommen werden.
Eine jegliche der drei Probenfraktionen wird sodann auf die stationäre Phase von Interesse aufgetragen. Zum Beispiel ist eine immobilisierte Metall-Affinitätschromatographie (IMAC)-Säule für die Immobilisierung von Phosphopeptiden geeignet und bekannt dafür, dass sie die Immobilisierung von Phosphopeptiden vereinfacht. Die stationäre Phase und chromatographischen Bedingungen können für andere Arten von Modifikationen optimiert werden. Grundsätzlich kann die Auftrennung derart ausgeführt werden, dass gebundene Komponenten, die wahrscheinlich die Eigenschaft von Interesse aufweisen (z.B. Phosphopeptide sind), von den anderen Komponenten der Probe abgetrennt werden. Die gebundenen Komponenten werden getrennt von Komponenten, die durch die stationäre Phase fließen, eluiert, so dass sowohl die gebundenen als auch nicht gebundenen (Durchfluss-)Komponenten jeder Probe getrennt gesammelt werden.
Wie in 3a veranschaulicht, müssen lediglich die Fraktionen mit Komponenten, die an die stationäre Phase gebunden haben können, mit einem isobaren oder isomeren Markierungsreagenz eines Satzes von Markierungsreagenzien für die Probe umgesetzt werden, die enzymatisch oder chemisch behandelt wurde, um die Modifikation von Interesse zu entfernen (d.h. Reagenz C in der Abbildung). Für die Proben, die nicht behandelt wurden, um die Modifikation zu entfernen, sollten sowohl die gebundenen als auch Durchflussfraktionen jeweils mit einem unterschiedlichen isobaren und/oder isomeren Markierungsreagenz eines Satzes von Reagenzien markiert werden. Wie dargestellt, könnte ein jegliches Markierungsreagenz als Reagenz A, Reagenz B, Reagenz C, Reagenz D und Reagenz E bezeichnet werden, wobei z.B. die Reagenzien Fragment-Ionen von 113, 114, 115, 116 bzw. 117 amu erzeugen, wenn sie einer MS/MS-Analyse unterzogen werden. An diesem Punkt können die Markierungsreagenzien mit den modifizierten und nicht modifizierten Peptiden (Analyten) einer jeglichen der zwei oder vier Fraktionen, wie gewünscht, umgesetzt werden, um dadurch die Komponenten jeder Fraktion zu kodieren.
Wie in 3a veranschaulicht, werden, sobald eine jegliche der zu markierenden Fraktionen tatsächlich mit einem der unterschiedlichen isobaren und/oder isomeren Markierungsreagenzien markiert wird, sie (oder eine Fraktion davon) gemischt, um ein Probengemisch auszubilden. Das Gemisch kann sowohl modifizierte als auch nicht modifizierte Analyten (z.B. Peptide) enthalten. Gemäß 3a wird das Probengemisch sodann mit einem Enzym oder einer Chemikalie behandelt, um die Modifikation von dem Analyten zu entfernen. Zum Beispiel kann die Phosphogruppe eines Phosphopeptids durch Behandlung mit einem oder mehreren Phosphataseenzymen dephosphoryliert werden. Nach Behandlung wird alles, was vorher modifizierte und nicht modifizierte Versionen des gleichen Analyten war, nun nicht modifiziert sein.
Jedoch umfassen alle zu bestimmenden Analyten eine Markierung, die die Probenfraktion und möglicherweise die Probe, von der sie herrühren, kodiert. Falls die Markierungen isobar sind, können abgesehen von den sich unterscheidenden Markierungen identische Analyten (z.B. Peptide) chemisch und strukturell ununterscheidbar sein (mit der Ausnahme der sich unterscheidenden Verteilung von Isotopen schwerer Atome), insbesondere bei einem jeglichen Auftrennverfahren. Folglich kann eine anschließende Auftrennung wie eine multidimensionale Flüssigchromatographie (LC) gegebenenfalls durchgeführt werden. Dies ist kein Problem, da Fraktionen des Probengemisches (die durch das Auftrennverfahren erzeugt wurden) einen jeglichen markierten Analyten proportional zu seiner Quantität oder Konzentration in dem Probengemisch umfassen werden.
Nach der Behandlung mit der Chemikalie oder dem Enzym, um die Modifikation (oder das Charakteristikum von Interesse, das mit einer entfernbaren Modifikation assoziiert ist) zu entfernen, und einer optionalen Auftrennung wird das Probengemisch oder eine Fraktion davon in einem Massenspektrometer analysiert. Wie vorstehend beschrieben, können in dem MS/MS-Modus die Tochter-Ionen eines jeglichen Analyten verwendet werden, um Peptide und/oder Proteine der Probe durch Auswahl von Ionen aus der MS-Analyse zu bestimmen. Ferner kann für einen jeglichen Analyten (z.B. Peptid) die relative Quantität dieses Peptids in einer jeglichen der Fraktionen, die zum Herstellen des Probengemisches verwendet wurden, basierend auf einem jeglichen Signatur-Ionen-Peak des Reporters eines jeglichen Markierungsreagenzes bestimmt werden.
Mit Bezug auf 3b kann das für die Signatur-Ionen festgestellte Muster verwendet werden, um die Ergebnisse der Proben, die auf den in 3a dargestellten Ablaufplan angewendet wurden, zu bestimmen. Wie aus einer Analyse von 3b ersichtlich ist, können für Analyten, die eine Affinität hinsichtlich der IMAC-Säule aufweisen und daher daran binden (d.h. Phosphopeptide sind), diese mit Reagenzien A und B markiert werden. Dementsprechend zeigt die Intensität von Peaks für Reagenzien A und B die Menge an modifiziertem Analyt (z.B. Phosphopeptid) in den ursprünglichen Proben an. In ähnlicher Weise kann die Menge von nicht modifiziertem Analyt in den ursprünglichen Proben aus den Fraktionen, die mit Reagenzien D und E markiert wurden, bestimmt werden. Dementsprechend können Verhältnisse für die Menge von modifiziertem und nicht modifiziertem Analyten in einer jeglichen der ursprünglichen Proben basierend auf den Verhältnissen von Reportern für Reagenzien A, B, D und E in der MS/MS-Analyse bestimmt werden.
Mit Bezug auf 3b sollte, falls der Analyt spezifisch an die stationäre Phase bindet, es einen kleinen oder keinen Signaturpeak geben, der für das Markierungsreagenz C festgestellt wird, da die Entfernung der Modifikation vor dem Kontakt mit der stationären Phase ein spezifisches Binden der Analyten an die stationäre Phase verhindern sollte. Jedoch wird, wenn die Wechselwirkung mit der stationären Phase nicht spezifisch ist, mindestens ein gewisser Signaturpeak für das Markierungsreagenz C festgestellt werden, da eine Entfernung der Modifikation eine geringe oder keine Wirkung auf die Wechselwirkung der Modifikation mit der stationären Phase haben wird. Dementsprechend kann eine Bestimmung, ob die Modifikation zu einer spezifischen Wechselwirkung mit der stationären Phase führte oder nicht, auch durch diesen Ablaufplan bestimmt werden.
Es sollte beachtet werden, dass aufgrund der Weise, wie die Proben prozessiert wurden, die Peak-Intensität des Signatur-Ions für ein jegliches der Markierungsreagenzien proportional zu der Menge des Analyten in dem Probengemisch sein sollte. Basierend auf dem Wissen der Menge (z.B. Volumen oder Konzentration) einer jeglichen Probenfraktion, die zugesetzt wurde, um das Probengemisch auszubilden, ist es möglich, die Menge (typischerweise in Konzentration oder Quantität angegeben) des Analyten in einer jeglichen der Probenfraktionen und, falls geeignet, in einer jeglichen der in einem Test verwendeten Proben zurückzurechnen.
Falls eine absolute Quantifizierung des Analyten erwünscht ist, ist es möglich, das Probengemisch mit einer bekannten Menge des Kalibrierungsstandardanalyten, der mit einer isobaren oder isomeren Markierung des Satzes von Markierungsreagenzien unterschiedlich markiert ist, zu versetzen. In dieser Weise können die relativen Mengen von Signatur-Ionen für den Analyten relativ zu der bekannten Menge des Kalibrierungsstandards verglichen werden. Durch Bezug auf die Quantität an Kalibrierungsstandard kann die absolute Menge des Analyten in einer jeglichen der Proben, die zum Ausbilden des Probengemisches verwendet wurden, basierend auf der relativen Intensität der Signatur-Ionen bestimmt werden.
Allgemeine Bemerkungen zu verschiedenen beschriebenen Ausführungsformen:
In einer jeglichen der vorstehenden beschriebenen Ausführungsformen kann eine absolute Quantifizierung von Analyten basierend auf der relativen Quantifizierung bestimmt werden, falls ein Standard für den Analyten zu dem Probengemisch gegeben wird.
Arten zum Durchführen der Erfindung:
Beispiel 1: (prophetisch)
Einfache Multiplexanalyse von PTMs unter Verwendung von Affinitätschromatographie (1a & 1b):
Dieses Beispiel wird mit Bezug auf die 1a und 1b veranschaulicht. Mit Bezug auf die 1a sind Probe 1 und Probe 2 Gesamtproteinlysate aus Zellen oder Geweben, die für einen Vergleich ausgewählt wurden. Nicht begrenzende Beispiele davon würden normale gegenüber erkrankten Zellen oder Geweben, Zellen oder Gewebe, die mit Arzneimitteln oder anderen kleinen Molekülen behandelt wurden (oder nicht) und Proben einer biologischen Flüssigkeit (Serum, Urin, Spinalflüssigkeit), die aus dem gleichen oder unterschiedlichen Patienten während des Verlaufs einer Fortschreitung einer Erkrankung oder einer Erkrankungsbehandlung entnommen werden.
Die Proteinlysate werden getrennt mit einer Protease (z.B. Trypsin) verdaut und die sich ergebenden Peptide werden einer Affinitätschromatographie mit einer IMAC-Säule unterzogen, um dadurch selektiv diejenigen Peptide mit einer Phosphatgruppe zu binden. Die Durchflussfraktionen (z.B. nicht phosphorylierte Peptide) werden gesammelt und sodann werden die gebundenen (phosphorylierten) Peptide getrennt desorbiert und von jeder IMAC-Säule gesammelt.
Jede der vier Vereinigungen von Peptiden (gebundene und Durchflussfraktionen von den zwei IMAC-Säulen) wird einzeln mit einem Mitglied eines Vierfachsatzes der isobaren Markierungsreagenzien (d.h. Reagenzien A, B, C und D) umgesetzt. Die vier Vereinigungen werden sodann gemischt und mit einem Cocktail von Serin-, Threonin- und Tyrosin-(S, T und Y) Phosphatasen behandelt, um alle gebundenen Phosphatgruppen zu entfernen. Das Gemisch von Peptiden wird sodann durch 1D-, 2D- oder multidimensionale LC chromatographisch aufgetrennt und die Peptide durch MS analysiert, durch dissoziative Energie fragmentiert und ausgewählte Ionen werden durch MS/MS-Analyse analysiert. Die isobaren Markierungsreagenzien sind chemisch identisch, es gibt daher keine chromatographische Auftrennung von entsprechenden Peptiden und identische Peptide aus den vier Vereinigungen sind hinsichtlich der Masse isobar. Die Strategie an diesem Punkt besteht darin, so viele Daten über die vielen Peptide wie möglich innerhalb der zeit- oder probenbegrenzenden Einschränkungen zu sammeln. Ein Überprüfen der gesammelten MS/MS-Kollisionsspektren kann nun verwendet werden, um eine relative Häufigkeit von Peptid (und daher Protein) zwischen Proben 1 und 2 zu quantifizieren und zur gleichen Zeit die spezifische Identifizierung (basierend auf einer Tochterfragment-Ionen-Analyse) und Quantifizierung von Phosphopeptiden (basierend auf einer relativen Signatur-Ionen-Analyse der Reporter) innerhalb des Gemisches zu ermöglichen.
Die 1b veranschaulicht ein theoretisches Muster der „Signatur"-Ionen-Peaks der isobaren Markierungsreagenzien nach CID von einzelnen Peptiden. In diesem Beispiel sind die Signatur-Ionen-Peaks (d.h. Markierungsreagenzien A, B, C und D) ein Dalton voneinander getrennt, aber diese Beabstandung kann 2, 3, 4 oder mehr betragen. Für ein jegliches gegebenes Peptid kann die nachstehende Information durch Überprüfung des Signatur-Ionen-Bereichs des CID-Spektrums abgeleitet werden:

1) Lediglich Peptide, die in den Anfangsproben phosphoryliert waren, werden ein Signatur-Ion für das Reagenz A und/oder B aufweisen. Das Fehlen von Peaks A und B zeigt an, dass die Peptide in den ursprünglichen Proben nicht phosphoryliert waren.
2) Falls vorhanden (lediglich Phosphopeptide), kann das relative Intensitätsverhältnis von Peak A zu Peak B verwendet werden, um den relativen Phosphorylierungszustand des Peptids in Probe 1 im Vergleich zu Probe 2 zu bestimmen (gleiche Intensität bedeutet keine Veränderung; diese Aussage nimmt ähnliche Behandlungen für Proben 1 und 2 an, einschließlich, dass ähnliche Mengen von Proben oder Probenfraktionen auf die IMAC-Säulen aufgetragen wurden).
3) Die relativen Intensitäten von Peaks C und D können verwendet werden, um die relative Konzentration eines gegebenen Peptids in Probe 1 und Probe 2 zu bestimmen (alle Peptide; diese Aussage nimmt ähnliche Behandlungen für Proben 1 und 2 an, einschließlich, dass ähnliche Mengen von Proben oder Probenfraktionen auf die IMAC-Säulen aufgetragen wurden).
4) Die relativen Verhältnisse von Peak A zu Peak C und Peak B zu Peak D können verwendet werden, um die relative Stöchiometrie einer Phosphorylierung eines jeglichen gegebenen Peptids in Probe 1 und Probe 2 zu bestimmen (z.B. 5%, 10%, 25%; diese Aussage nimmt ähnliche Behandlungen für Proben 1 und 2 an, einschließlich, dass ähnliche Mengen von Proben oder Probenfraktionen auf die IMAC-Säulen aufgetragen wurden).

Das Nachstehende sind allgemein festgestellte Vorteile dieses Verfahrens:

1) Das Verfahren ermöglicht eine gleichzeitige Identifizierung und Quantifizierung von Phosphopeptiden in komplexen Probengemischen. Es ist sehr effizient hinsichtlich eines Zeit- und Probenverbrauchs, da diese Daten parallel ebenso mit Daten, die eine relative Peptidkonzentration aller (nicht phosphorylierter) Peptide betreffen, gesammelt werden.
2) Eine Behandlung mit den Phosphatasen weist mehrere vorteilhafte Folgen auf. Eine Entfernung der Phosphatgruppe vermindert die Gesamtprobenkomplexizität, da alle Peptide zu der gleichen nativen Form reduziert werden. Dies ist sowohl für eine chromatographische als auch eine MS-Auflösung gut. Eine Entfernung der Phosphatgruppe erhöht die Ionisierungseffizienz (und daher die Signalintensität) der Peptide, was die Nachweisempfindlichkeit erhöht. In der Tat haben wir das Signal von einer geringeren (5-10%) phosphorylierten Form eines jeglichen bestimmten Peptids zu dem Signal aus der Hauptkomponente des nativen Peptids zugesetzt. Die Identifizierungs- und Quantifizierungsinformation ist nun in dem gleichen einzigen Satz von CID-Spektren vorhanden.
3) Das Verfahren verbessert eine Fähigkeit zum Identifizieren von Phosphopeptiden durch CID und Recherche von Sequenzdatenbanken mit Programmen wie SEQUEST und MASCOT. Das beschriebene Verfahren weist die Wirkung eines Zusetzens schlecht ionisierbarer Phosphopeptidsignale mit niedriger Ausbeute zu der gleichen Hauptsignalkomponente des nicht modifizierten Stammpeptids auf.
4) Das Verfahren eignet sich für proteomische Ablaufpläne auf Peptidbasis. Für eine geringe zusätzliche Probenzubereitung (IMAC-Säulen) können die Daten, die aus einem einzigen multidimensionalen LC-Exeriment gesammelt wer den, analysiert werden, um ein jegliches gegebenes Peptid zwischen theoretischen Proben 1 und 2 zu identifizieren und zu quantifizieren und gleichzeitig jegliche Phosphopeptide, die vorhanden waren, zu identifizieren und zu quantifizieren.

Ein Vorbehalt zu diesem Ablaufplanansatz ist, dass keine Bestimmung erfolgen kann, ob die Bindung des Analyten an die stationäre Phase spezifisch oder nicht spezifisch war. Das heißt, nur weil der Analyt an die IMAC-Säule band, ist er nicht notwendigerweise ein Phosphopeptid, da bekannt ist, dass einige nicht phosphorylierte Peptide an IMAC-Säulen binden. Das nachstehende Beispiel beschreibt, wie bestimmt wird, ob ein Analyt spezifische oder nicht spezifische Wechselwirkungen mit der stationären Phase zeigt oder nicht.
Beispiel 2: (prophetisch)
Unterscheidung zwischen spezifischem und nicht spezifischem Affinitätsbinden (2a, 2b):
Eine Probe eines Phosphoproteins/von Phosphoproteinen wird mit einer Protease (z.B. Trypsin) verdaut und die verdaute Vereinigung von Peptiden wird in zwei Fraktionen aufgeteilt (vgl. 2a). Es ist nicht wichtig, dass die Fraktionen gleiches Volumen aufweisen, sofern eine jegliche Volumendifferenz bekannt ist und mit der Peak-Intensität des Reporters in der MS/MS-Analyse korreliert werden kann. Eine Fraktion wird enzymatisch mit einer Phosphatase (oder chemisch) behandelt, um alles kovalent gebundenes Phosphat der Komponenten der Probenfraktion zu entfernen. Diese Fraktion soll folglich als die Kontrollprobe fungieren. Die zwei Proben werden sodann jeweils einer chromatographischen Auftrennung unter Verwendung einer IMAC-Säule unterzogen, um selektiv diejenigen Peptide mit einer Phosphatgruppe zu binden. Die Durchfluss- (nicht phosphorylierten) Peptide werden gesammelt und sodann werden die gebundenen (potentiell phosphorylierten oder nicht spezifisch bindenden) Peptide selektiv desorbiert und von jeder IMAC-Säule gesammelt. Dies erzeugt möglicherweise vier einzelne Probenfraktionen (vgl. 2a).
Eine jede dieser selektiv desorbierten (gebundenen) Fraktionen wird einzeln mit einem Mitglied eines isobaren Reagenziensatzes (A oder B) umgesetzt, mit der Maßgabe, dass Probenfraktionen, die sich von einer spezifischen IMAC-Säule ableiten, beide mit der gleichen isobaren Markierung umgesetzt werden. Die markierten Peptid vereinigungen werden sodann gemischt und enzymatisch (z.B. mit Phosphatasen) oder chemisch behandelt, um gebundenes Phosphat zu entfernen. Alle Peptide wurden nun in ihre nativen nicht phosphorylierten Formen umgewandelt.
Das Gemisch von Peptiden wird sodann einer chromatographischen Auftrennung (z.B. 1D-, 2D- oder multidimensionaler LC) unterzogen und die Peptide werden durch MS und Tandem-MS/MS analysiert. Die isobaren Reagenzientags sind chemisch identisch, es gibt daher keine chromatographische Auftrennung von markierten Peptiden, und identische Peptide von den zwei Vereinigungen werden hinsichtlich der Masse isobar sein (MS). Nach MS/MS wird eine Überprüfung der Signatur-Ionen-Peaks, die von einer CID der isobar getaggten Peptide herrühren, eine Unterscheidung einer spezifischen oder nicht spezifischen Bindung von Peptiden an den IMAC-Affinitätsträger und folglich eine Unterscheidung einer tatsächlichen Phosphopeptid-Bindung im Vergleich zu einer nicht spezifischen Bindung ermöglichen.
Mit Bezug auf 2b wird ein theoretisches Muster von Signatur-Ionen-Peaks von den isobaren Reagenzientags nach CID von einzelnen Peptiden veranschaulicht. In diesem Experiment wurde Reagenz A zum Markieren der Kontrollprobe verwendet, die vor einer Immobilisierung an die IMAC-Säule dephosphoryliert wurde. Folglich sollten tatsächlich bindende Phosphopeptide im Wesentlichen lediglich Tag B zeigen, da es keinen modifizierten Analyten geben sollte, der in dem Material verblieb, das auf die IMAC-Säule aufgetragen worden war. Jedoch sollten Peptide, die nicht spezifisch an den IMAC-Träger binden, Signale von beiden Reagenzien A und B zeigen, da ein Binden nicht von dem Vorhandensein oder Fehlen der Phosphatmodifikation abhängt. Das Markierungsreagenz „A" wird folglich als ein „Kennzeichen"-Signal verwendet, das anzeigt, dass dieses Peptid wahrscheinlich kein spezifisches Bindungsmolekül ist und nicht als ein Phosphopeptid betrachtet werden sollte. Es sollte beachtet werden, dass das Verhältnis von Peaks für Markierungsreagenzien A und B etwa proportional zu dem Verhältnis der Menge der zwei Fraktionen, die auf die IMAC-Säulen aufgetragen wurden, sein sollte, falls die Phosphatmodifikation keine Affinität hinsichtlich der stationären Phase aufweist.
Beispiel 3: (prophetisch)
Analyse der Bindungsaffinität von vielen Analyten (3a & 3b):
Dieses Konzept eines Verwendens eines der Mitglieder des isobaren Reagenziensatzes, um als ein „Kennzeichen" zu fungieren, damit eine tatsächliche von einer nicht spezifischen Phosphorylierung unterschieden wird, kann von einer Analyse eines einzigen Phosphoproteins, wie vorstehend beschrieben, zu einer vollständigen Proteomanalyse (3a, 3b) ausgedehnt werden.
Zelllysate 1 und 2 (3a) können Gesamtproteinlysate von Zellen oder Geweben, die für einen Vergleich ausgewählt wurden, sein. Nicht begrenzende Beispiele dieser Art könnten normale gegenüber erkrankten Geweben, Zellen, die mit Arzneimitteln oder anderen kleinen Molekülen behandelt wurden (oder nicht), und/oder Proben einer biologischen Flüssigkeit (Serum, Urin, Spinalflüssigkeit), die von dem gleichen oder unterschiedlichen Patienten während des Verlaufs einer Erkrankungsfortschreitung oder einer Erkrankungsbehandlung entnommen wird, sein.
Die Proteinlysate werden mit einer Protease (z.B. Trypsin) getrennt verdaut. Die verdauten Lysate werden sodann gemäß den in der 3a gezeigten Verhältnissen (2/3- und 1/3-Aliquots von jedem Lysat) aufgeteilt. Die 2/3-Aliquots werden IMAC unterzogen, um selektiv diejenigen Peptide mit einer Phosphatgruppe zu binden. Die Durchfluss- (mögliche nicht phosphorylierte) Peptide werden gesammelt und sodann werden die gebundenen (möglichen phosphorylierten oder nicht spezifisch bindenden) Peptide selektiv desorbiert und gesammelt. Die 1/3-Fraktionen eines jeglichen der Zelllysate 1 und 2 werden gemischt, chemisch oder enzymatisch behandelt, um Phosphat zu entfernen, und auch IMAC unterzogen. Dies stellt die Kontrollprobe für ein nicht spezifisches Binden dar. Gebundene Peptide werden nach einer selektiven Desorption gesammelt, und in diesem Fall können die Durchflussfraktionen verworfen werden. Die hier gezeigte proportionale Aufteilung (2/3 und 1/3) wird ausgewählt, so dass im Wesentlichen gleiche Mengen an Gesamtprotein durch jede IMAC-Säule geleitet werden.
Gebundene und Durchflussfraktionen werden individuell mit Mitgliedern eines Multiplexsatzes von isobaren Reagenzien (A, B, C, D und E: diese können in einer jeglichen Reihenfolge zum Markieren verwendet werden, und die nachfolgende Beschreibung wird lediglich für Veranschaulichungszwecke verwendet und soll in keiner Weise begrenzend sein) umgesetzt, wie in 3a gezeigt. Alle markierten Pep tidvereinigungen werden sodann vereinigt und enzymatisch oder chemisch behandelt, um gebundenes Phosphat zu entfernen. Das vereinigte Gemisch wird sodann durch 1D-, 2D- oder multidimensionale LC analysiert und die Peptide werden durch MS analysiert und dissoziativer Energie unterzogen, gefolgt von MS/MS-Analyse von ausgewählten Ionen. Eine Untersuchung der gesammelten MS/MS-Kollisionsspektren kann nun verwendet werden, um eine relative Peptidhäufigkeit zu quantifizieren und gleichzeitig die spezifische Identifizierung und Quantifizierung von Phosphopeptiden in dem Gemisch zu ermöglichen. Als eine zusätzliche Messung kann das Vorhandensein oder Fehlen des „Kennzeichen"-Peaks C verwendet werden, um zwischen tatsächlicher und nicht spezifischer Bindung an IMAC-Medien zu unterscheiden (und folglich tatsächliche Phosphopeptide zu unterscheiden). Falls signifikante Mengen an Peak C in dem MS/MS-Spektrum vorhanden sind, ist das Peptid kein Bindungsmolekül und folglich kein echtes Phosphopeptid.
Unter Anwendung dieser Logik kann die nachfolgende Art von Information aus einem solchen Experiment (3b) abgeleitet werden:

1) Echte Phosphopeptide werden Peaks A und/oder B zeigen. Das Fehlen von Peaks A und B zeigt an, dass die Peptide nicht phosphoryliert waren. Die relativen Intensitäten von Peaks A und B zeigen die relative Konzentration der phosphorylierten Form des Peaks in den Zelllysaten 1 bzw. 2 an (diese Aussage nimmt ähnliche Behandlungen für die Zelllysate 1 und 2 an, einschließlich, dass ähnliche Mengen an Proben oder Probenfraktionen auf die IMAC-Säulen aufgetragen wurden).
2) Die relativen Intensitäten von Peaks D und E können verwendet werden, um die relative Konzentration eines jeglichen gegebenen Peptids (und daher Proteins) in den Zelllysaten 1 und 2 (alle Peptide) zu bestimmen.
3) Die relativen Verhältnisse von Peak A zu Peak D und Peak B zu Peak E können verwendet werden, um die relative Stöchiometrie einer Phosphorylierung eines jeglichen gegebenen Peptids in den Zelllysaten 1 und 2 zu bestimmen (z.B. 5%, 10%, 25%; diese Aussage nimmt ähnliche Behandlungen für die Zelllysate 1 und 2 an, einschließlich, dass ähnliche Mengen an Proben oder Probenfraktionen auf die IMAC-Säulen aufgetragen wurden).
4) Das Fehlen oder im Wesentlichen Vorhandensein eines jeglichen Signals von Peak C kann verwendet werden, um zu bestimmen, ob das Peptid ein echtes oder nicht spezifisches Bindungsmolekül war. Ein Fehlen von Peak C zeigt an, dass das Peptid ein echtes Phosphopeptid ist. Ein wesentliches Vorhandenseins eines Signals bei Peak C würde anzeigen, dass das Peptid nicht spezifisch an die IMAC-Säule binden könnte und es kein Phosphopeptid war.

Das vorstehende Verfahren könnte auf die Analyse von zusätzlichen Proben mit einem größeren Satz von isobaren und/oder isomeren Markierungsreagenzien ausgedehnt werden. Dementsprechend könnte das Verfahren für die Analyse von drei, vier, fünf, sechs oder mehr unterschiedlichen Proben (z.B. Zelllysaten) verwendet werden.
Beispiel 4: Analyse unter Verwendung eines Modellphosphoproteins (6a & 6b)
Ein Modellphosphoprotein (Rinder-α-Casein) wurde reduziert (TCEP, 37°C) alkyliert (MMTS, 2 Stunden, Raumtemperatur) und Trypsin verdaut (1:20 w/w, 37°C, 16 Stunden).
IMAC-Bedingungen: Eine IMAC-Chromatographie erfolgte unter Verwendung einer Schutzsäule (5 cm × 1 mm) gepackt mit Poros MC-Harz, geladen mit Fe³⁺, angeschlossen an eine Spritzenpumpe. Proben wurden in 0,1 M Essigsäure aufgetragen und die Säule mit 2 ml 0,1 M Essigsäure gewaschen, bis jegliche nicht phosphorylierten Peptide eluierten. Die gebundenen Phosphopeptide wurden sodann spezifisch in 1,5 ml Triethylammoniumbicarbonat/75% v/v Ethanol (pH-Wert von 8,5) eluiert.
iTRAQ^TM-Markierung: Die gesammelten Peptidfraktionen, die aus den getrennten gebundenen und Durchflussfraktionen der IMAC-Säule wiedergewonnen wurden, wurden sodann getrocknet und in iTRAQ-Markierungspuffer wieder aufgenommen, der aus 75% Ethanol/0,25 M Triethylammoniumbicarbonat bestand. 1 mg jedes Reagenzes (114 oder 115) wurde zu dem entsprechenden Peptidgemisch gegeben und ihm wurde ermöglicht, sich 30 Minuten bei Raumtemperatur umzusetzen. Abhängig von dem verwendeten Ablaufplan wurden markierte Proben sodann mit alkalischer Phosphatase (1% w/w, 1 Stunde, RT) behandelt, um die Phosphatgrup pen zu entfernen, und die Peptidfraktionen wurden sodann für eine LC-MS/MS-Analyse vereinigt.
LC-MALDI-MS/MS: Sich ergebende Peptidgemische wurden durch Kapillar-RP-HPLC unter Verwendung eines LC-Packings UltiMate^TM-Systems aufgetrennt und mit α-Cyanhydroxyzimtsäure-Matrix auf MALDI-Platten punktförmig aufgetragen, die nachfolgend auf einem ABI 4700 Proteomics-Analysegerät analysiert wurden. Peptide wurden aus LC-MS/MS-Daten unter Verwendung von GPS-Explorer^TM-2-Software identifiziert. Peakflächen von iTRAQ^TM-Reagenz-Signatur-Ionen wurden direkt aus der Massenspektrometerdatenbank extrahiert.
6a und 6b: Duplex-Phosphopeptid-Screening. 6a veranschaulicht die einfachste Implementierung dieses Ansatzes. Dementsprechend kann ein Proteinverdaugemisch hinsichtlich sowohl Phospho- als auch Nicht-Phosphopeptiden analysiert werden. In diesem Experiment wurde das Vorhandensein von Phosphat durch Auftreten eines 115 m/z-Signatur-Ions (gebunden an die IMAC-Säule) gekennzeichnet, während ein Nicht-Phosphopeptid mit einer Reportergruppe mit einem m/z-Wert von 114 (Durchfluss) kodiert wurde. Obwohl dieses Verfahren keine Bestimmung der spezifischen Stelle einer Phosphorylierung erlaubt, haben unsere Ergebnisse nahe gelegt, dass ein größerer Anteil von phosphorylierten Peptiden identifiziert werden kann. Dies ist hauptsächlich darauf zurückzuführen, dass das Phosphat vor einer Analyse entfernt wird (was die MS-Empfindlichkeit verbessert) und ein isobares Tagging verwendet wird, um eine definitive MS/MS-Signatur bereitzustellen, um das Vorhandensein oder Fehlen einer Phosphatgruppe anzuzeigen. Wir verglichen die Phosphopeptide, die in unserem Experiment identifiziert wurden, mit anderen Berichten für α-Casein (6b). Am meisten bemerkenswert ist, dass mehrere der längeren Phosphopeptide beständiger unter Verwendung dieser Methodik nachgewiesen werden.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Analyseverfahren, umfassend: i) Auswählen von mehr als einer zu analysierenden Probe, wobei die Proben jeweils einen oder mehrere Analyten umfassen, von denen manche eine Modifikation von Interesse umfassen können, ii) gegebenenfalls Prozessieren einer oder mehrerer der Proben oder einer Fraktion davon, iii) gegebenenfalls Behandeln einer oder mehrerer der Proben oder einer Fraktion davon mit einem Enzym oder einer Chemikalie unter Bedingungen, die die Modifikation von Interesse von den so modifizierten Analyten entfernen, mit der Maßgabe, dass nicht alle der Proben oder Fraktionen davon mit dem Enzym oder der Chemikalie behandelt werden, iv) Auftragen jeder Probe oder einer Fraktion davon auf einen Affinitätsträger, wobei der Affinitätsträger fähig ist, modifizierte von nicht modifizierten Analyten zu trennen, und alle Affinitätsträger die gleiche stationäre Phase umfassen, aber wobei jede Probe oder Fraktion davon auf einen unterschiedlichen Affinitätsträger aufgetragen wird, v) gegebenenfalls getrenntes Sammeln der Analyten, die durch jeden Affinitätsträger fließen, als eine Fraktion, vi) getrenntes Sammeln von Analyten, die an jeden Affinitätsträger binden, als eine Fraktion durch Eluieren der gebundenen Analyten unter geeigneten Bedingungen, vii) Kodieren jeder Fraktion von Interesse, die den einen oder die mehreren Analyten enthält, die an den Affinitätsträger binden, durch Reaktion mit einem einzigartigen isobaren und/oder isomeren Markierungsreagenz eines Satzes von isobaren und/oder isomeren Markierungsreagenzien, viii) gegebenenfalls Kodieren jeder Fraktion von Interesse, die den einen oder die mehreren Analyten enthält, die durch den Affinitätsträger geflossen sind, durch Reaktion mit einem einzigartigen isobaren und/oder isomeren Markierungsreagenz des Satzes von isobaren und/oder isomeren Markierungsreagenzien, ix) Mischen von zwei oder mehreren mit isobaren und/oder isomeren Markierungsreagenzien kodierten Fraktionen, x) gegebenenfalls Zugeben einer bekannten Menge eines oder mehrerer Kalibrierungsstandards zu dem Gemisch, xi) Behandeln des Gemisches mit einem Enzym oder einer Chemikalie unter Bedingungen, die die Modifikation von Interesse von den so modifizierten Analyten entfernen, xii) gegebenenfalls Auftrennen des Gemisches, und xiii) Analysieren des Gemisches oder einer oder mehrerer Fraktionen davon durch Massenspektrometrie, um dadurch Tochterionen-Fragmente für einen oder mehrere Analyten des Gemisches und Signatur-Ionen, die mit einem jeglichen einzigartigen Markierungsreagenz assoziiert sind, zu erhalten.
Verfahren nach Anspruch 1, ferner umfassend: a) Bestimmen, ob die Analyten, die die Modifikation umfassen, spezifisch mit dem Affinitätsträger Wechselwirken.
Verfahren nach Anspruch 1, ferner umfassend: a) Identifizieren eines oder mehrerer der Analyten in dem Gemisch durch Analyse von Tochterionen-Fragmenten, und/oder b) Bestimmen der relativen und/oder absoluten Menge eines bestimmten modifizierten Analyten und seines entsprechenden nicht modifizierten Analyten in einer jeglichen der Proben.
Verfahren nach Anspruch 3, ferner umfassend: a) einmaliges oder mehrmaliges Wiederholen der Schritte a) und b), um dadurch für einen unterschiedlichen Analyten die relative und/oder absolute Menge eines bestimmten modifizierten Analyten und seines entsprechenden nicht modifizierten Analyten in einer jeglichen der Proben zu bestimmen.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei zwei oder mehrere Proben, die jeweils ein oder mehrere Proteine und/oder Phosphoproteine als Analyten umfassen, ausgewählt werden.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei jede Probe durch Behandlung mit Trypsin prozessiert wird, um dadurch die Proteine und/oder Phosphoproteine in Peptide und/oder Phosphopeptide zu verdauen.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei jede prozessierte Probe auf einen Affinitätsträger aufgetragen wird, der Phosphopeptide von nicht modifizierten Peptiden trennen kann.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei eine Fraktion, die Analyten umfasst, die an jeden Affinitätsträger binden, gesammelt wird und die von jeder unterschiedlichen Säule erhaltene Fraktion mit einem einzigartigen Markierungsreagenz aus dem Satz von isomeren und/oder isobaren Markierungsreagenzien kodiert wird.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei eine Fraktion, die Analyten umfasst, die durch jeden der Affinitätsträger geflossen sind, gesammelt wird und die von jeder unterschiedlichen Säule erhaltene Fraktion mit einem einzigartigen Markierungsreagenz aus dem Satz von isomeren und/oder isobaren Markierungsreagenzien kodiert wird.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei die kodierten Fraktionen zur Ausbildung eines Gemisches gemischt werden und das Gemisch mit einem oder mehreren Fhosphatase-Enzymen behandelt wird, um die Phosphopeptide zu dephosphorylieren.
Verfahren nach Anspruch 10, ferner umfassend: a) Identifizieren eines oder mehrerer der Peptide in dem Gemisch durch Analyse von Tochterionen-Fragmenten, und/oder b) Bestimmen der relativen und/oder absoluten Menge eines bestimmten Phosphopeptids und seines entsprechenden nicht modifizierten Peptids in einer jeglichen von zwei oder mehreren der Proben.
Verfahren nach Anspruch 11, ferner umfassend: a) einmaliges oder mehrmaliges Wiederholen der Schritte a) und b), um dadurch für ein unterschiedliches Peptid die Identität und/oder die relative und/oder absolute Menge eines bestimmten Phospho peptids und seines entsprechenden nicht modifizierten Peptids in einer jeglichen von zwei oder mehreren der Proben zu bestimmen.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei eine erste Probe und eine zweite Probe ausgewählt werden, wobei jede Probe ein oder mehrere Proteine und/oder Phosphoproteine als Analyten umfasst.
Verfahren nach Anspruch 13, wobei die erste Probe und die zweite Probe jeweils durch Behandlung mit Trypsin prozessiert werden, um dadurch die Proteine und/oder Phosphoproteine in Peptide und/oder Phosphopeptide zu verdauen.
Verfahren nach Anspruch 14, wobei eine Fraktion jeder prozessierten Probe zur Ausbildung eines Spezifitätskontrollgemisches gemischt wird.
Verfahren nach Anspruch 15, wobei das Spezifitätskontrollgemisch mit einem oder mehreren Phosphatase-Enzymen behandelt wird, um dadurch die Phosphopeptide zu dephosphorylieren.
Verfahren nach Anspruch 16, wobei jede Fraktion auf einen Affinitätsträger aufgetragen wird, der Phosphopeptide von nicht modifizierten Peptiden trennen kann, wobei die Fraktionen sind: a) das Gesamte oder ein Teil des Restes der ersten Probe, b) das Gesamte oder ein Teil des Restes der zweiten Probe, und c) das Gesamte oder ein Teil des Spezifitätskontrollgemisches.
Verfahren nach Anspruch 17, wobei Fraktionen, die Analyten umfassen, die an jeden Affinitätsträger binden, gesammelt werden und jede von jeder unterschiedlichen Säule erhaltene Fraktion mit einem einzigartigen Markierungsreagenz aus dem Satz von isomeren und/oder isobaren Markierungsreagenzien kodiert wird.
Verfahren nach Anspruch 18, wobei Fraktionen, die Analyten umfassen, die durch jeden Affinitätsträger geflossen sind, gesammelt werden und mindestens die von der ersten Probe und der zweiten Probe erhaltenen Durchfluss-Fraktionen mit einem einzigartigen Markierungsreagenz aus dem Satz von isomeren und/oder isobaren Markierungsreagenzien kodiert werden.
Verfahren nach Anspruch 19, wobei die kodierten Fraktionen zur Ausbildung eines Gemisches gemischt werden und das Gemisch mit einem oder mehreren Phosphatase-Enzymen behandelt wird, um dadurch die Phosphopeptide zu dephosphorylieren.
Verfahren nach Anspruch 20, das ferner ein Bestimmen, ob ein oder mehrere der Peptide, die die Phosphatmodifikation umfassen, spezifisch mit dem Affinitätsträger wechselwirken, umfasst.
Verfahren nach Anspruch 21, ferner umfassend: a) Identifizieren eines oder mehrerer der Peptide in dem Gemisch durch Analyse von Tochterionen-Fragmenten, und/oder b) Bestimmen der relativen und/oder absoluten Menge des identifizierten Peptids und seines entsprechenden Phosphopeptids in sowohl der ersten Probe als auch der zweiten Probe.
Verfahren nach Anspruch 22, ferner umfassend: a) einmaliges oder mehrmaliges Wiederholen der Schritte a) und b), um dadurch für ein unterschiedliches Peptid die relative und/oder absolute Menge eines bestimmten Phosphopeptids und seines entsprechenden nicht modifizierten Peptids in der ersten Probe und der zweiten Probe zu bestimmen.
Verfahren nach Anspruch 22, das ferner ein Bestimmen der relativen und/oder absoluten Menge des Proteins und Phosphoproteins, das mit dem identifizierten Peptid bzw. dem assoziierten Phosphopeptid assoziiert ist, in jeder der ersten Probe und der zweiten Probe umfasst.
Verfahren nach Anspruch 24, wobei die erste Probe und die zweite Probe jeweils ein Zelllysat sind.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Analyt oder die Analyten Nukleinsäuren, Kohlenhydrate, Lipide, Steroide oder andere kleine Moleküle mit einem Molekulargewicht von weniger als 1500 Dalton sind.