JP2004219418A - プロテオミクスにおいてn末端ペプチドとc末端ペプチドを選択する方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】
サンプルの複雑性を低減させると共に、プロテオームサンプル内のタンパク質を効率的に信頼性高く同定及び定量化できる改善された方法を提供する。
【解決手段】
一態様において本発明は、タンパク質1つにつき1つのN末端(又はC末端)ペプチドをキャラクタリゼーションすることにより、プロテオームサンプル内のタンパク質を同定する非常に効率の良い方法を提供する。別の態様において本発明は、種々のサンプルについて、タンパク質発現及び/又は修飾の差異に関する定量的測定法を提供する。さらに別の態様において本発明は、本発明の方法を便利に実施するのに有用なキットを提供する。
【選択図】図1
サンプルの複雑性を低減させると共に、プロテオームサンプル内のタンパク質を効率的に信頼性高く同定及び定量化できる改善された方法を提供する。
【解決手段】
一態様において本発明は、タンパク質1つにつき1つのN末端(又はC末端)ペプチドをキャラクタリゼーションすることにより、プロテオームサンプル内のタンパク質を同定する非常に効率の良い方法を提供する。別の態様において本発明は、種々のサンプルについて、タンパク質発現及び/又は修飾の差異に関する定量的測定法を提供する。さらに別の態様において本発明は、本発明の方法を便利に実施するのに有用なキットを提供する。
【選択図】図1
Description
プロテオミクスはゲノミクスを補完するものとして急速に脚光を浴びることになった。プロテオミクスでは、RNAではなく、タンパク質のレベル、及び/又は作用を評価することによって、遺伝子の作用を定量的且つ定性的に解析することが包含される。プロテオミクスには、タンパク質の翻訳後修飾、タンパク質間の相互作用、タンパク質の機能、細胞内でのタンパク質の位置などの事象を研究することが含まれる。本質的に、プロテオミクスには、細胞内に含まれている、又は細胞が分泌する全タンパク質補体の一部あるいは全部に関する状態を研究することが包含され、それ故、細胞の生物学的な機能を直接見る有望な方法をもたらすものである。その最も簡単な形態において、プロテオミクスは、生体サンプルを「採鉱(マイニング)」して、個別のサンプルに存在するタンパク質を同定する作業である。しかしながら、薬剤開発における応用プロテオミクスの能力は、例えば、正常な細胞と病気状態の細胞のプロテオーム間の主な違いを明らかにする機能にある。原理的には、応用プロテオミクスによって、正常な細胞と比べた場合の、病気状態の細胞の独特のタンパク質あるいはタンパク質の発現/作用パターンを明らかにすることができ、それによって、特定の病気あるいは疾患に関する分子診断を実施し得る。しかしながら、多くの類似のタンパク質を同定しキャラクタリゼーションする技術がなければ、この目的を達成し得ないであろう。
プロテオーム分析に関する現在の技術は、種々のタンパク質分離技術と、その後に行われる分離タンパク質の同定とを基礎とする。最も一般的な方法は、2次元ゲル電気泳動(2DE)を基礎とする。例えば、特許文献1及び2を参照されたい。この技術により、アクリルアミドゲル上のタンパク質を、それらの等電点(pI)と分子量に応じて分離し得る。典型的には、数百ものタンパク質を放射性標識、蛍光性標識、あるいは銀染色法によって視覚化し得る。しかしながら、サンプル内のタンパク質の数は優に1万を超えることがあり、また、公開されている2DEデータベースに記載されている分解ポリペプチドは典型的にはゲル当たり1000〜3000の範囲であり(例えば、Julio Celis Database、http://biobase.dk/cgi−bin/celis を参照されたい)、ゲル電気泳動では未精製のタンパク質混合物に含まれている最も量の多いタンパク質しか視覚化されないことは明らかであろう。従って、プロテオームサンプルの複雑性を低減し、プロテオームの検出方法を改善する必要性が高まってきている。
種々の生物ソースから得られたプロテオーム物質に関して分析を実施するための、より好感度で、より正確で、より高スループットの技術への要望によって、分離されたタンパク質を同定するための技術は次第に洗練されてきている。重要なブレイクスルーは、ゲル分離されたタンパク質の質量分析(MS)同定である。個々のタンパク質(スポット)をゲルから抽出して、MS解析を行う。同定法にはペプチドマッピングが含まれ、該ペプチドマッピングにおいては、部位特異的なタンパク質分解によって生成されたペプチド集合体をMSによって解析し、タンパク質データベース内の特定の質量パターンと相関させる。例えば、トリプシン(アルギニン残基とリシン残基においてポリペプチドを開裂する)などのタンパク質分解酵素を用いて、抽出したタンパク質を2つ以上のペプチドに断片化することができる。次いで、マトリックス支援レーザ脱離イオン化(MALDI)質量分析、あるいはエレクトロスプレーイオン化質量分析によって、これらのペプチドを分析し、質量を測定する。ついで測定された質量を用いてデータベースをスクリーニングし、ペプチドのアミノ酸配列を決定する。
代替技術においては、分離していないタンパク質混合物を分解することで生成させた非常に複雑なペプチド混合物を、液体クロマトグラフィ(LC)−MS/MSによって直接分析することが2DEの代替であり、それによって2DEの制約の一部(例えば、量の少ないタンパク質に対する検出能が低いこと、及びゲル分離において分解能が制限されること)が回避される。例えば、ペプチドアミノ酸配列データは、タンデム質量分析(MS/MS)によって得られ、これを使用して特定のタンパク質配列に関するデータベースをスクリーニングする(例えば非特許文献1〜4を参照されたい)。この技術においては、分析の第1段階において選択されたペプチド集合体を分離し、次いで第2段階において衝突誘起化学解離を実施し、サブフラグメント集合体を分析してアミノ酸配列を推定する。しかしながら、この技術だけでは、2つの類似するプロテオーム(例えば正常な細胞と病気状態の細胞のプロテオーム)の間で、定量的な比較はできない。さらに、プロテオーム分析に固有の顕著な問題は、サンプルの複雑性である。前述のように、所与のサンプル内のタンパク質の数は優に1万を超えることがある。酵素による消化(分解)後においては、プロテオームサンプル内に存在するペプチドの数は、何十万もの範囲になる可能性がある。複雑性がこのレベルに達すると、分離プロセスに非常な負担がかかり、複雑な分析技術と洗練されたコンピュータ支援技術を組み合わせることが必要となり、これらを使用しないと分析は非常に時間がかかる。
プロテオーム分析のために、特定の残基を含むシグネチャペプチドを単離することによって複雑なペプチド混合物の分析を簡易化する方法が提案されてきた。これらの方法には、チオール特異性ビオチン試薬によってタンパク質混合物内のシステインを誘導体化することや、アビジンへ結合させることによってトリプシン消化からビオチン化ペプチドを単離することが含まれる(非特許文献5を参照されたい)。ヒスチジン基又はグリコシル基を含むペプチドも又、固定化された金属アフィニティ吸着剤、あるいはレクチンカラムを用いてそれぞれ単離されている(非特許文献6を参照されたい)。これらの方法を、同位体標識化及びMS分析と共に使用し、複雑な混合物中の特定のタンパク質を同定し定量化する。これらの場合におけるデータベース検索は、ターゲットとなるアミノ酸又は修飾を含むペプチドに限定される。さらに、これらの方法は、ターゲット部分のないタンパク質は単離されたペプチド混合物中に存在しないため、必ずしも包括的ではない。
プロテオームサンプル内にあるタンパク質を効率的及び信頼性高く同定及び定量化し、好ましくはサンプルの複雑性を低減する改善された方法が望まれている。
サンプルの複雑性の低減
本発明は、プロテオームサンプルの複雑性を低減しながら、サンプル内の個々のタンパク質の同定を可能にする、新しい改善されたシステムを開示する。本システムは、元のプロテオームサンプルを分析することから、元のサンプル中のタンパク質1つ当たり単一のペプチド(各ペプチドは、元のサンプル内に存在するタンパク質のN末端(あるいはC末端)から抽出)を分析することへと低減(簡易化)する方法を基礎とする。本発明の目的のために、タンパク質同定が個々のタンパク質のN末端から抽出されたペプチドのキャラクタリゼーションに基づく場合、当該方法を「N末端ペプチド選択法」と呼ぶ。同様に、タンパク質同定が個々のタンパク質のC末端から抽出されたペプチドのキャラクタリゼーションに基づく場合、当該方法を本明細書では「C末端ペプチド選択法」と呼ぶ。より一般的には、どちらの方法も、「末端ペプチド選択法」という用語で呼ぶ。本発明の方法を周知の質量分析法及びコンピュータ支援データベース検索システムと組み合わせると、各タンパク質に関して生成されたN末端あるいはC末端の保護された単一のペプチドをキャラクタリゼーションすることによって、サンプル内のタンパク質を同定することが可能となる。各タンパク質について化学的な手段あるいは酵素による手段によって生成されたN末端ペプチドあるいはC末端ペプチドのアミノ酸配列からサンプル内のタンパク質を同定するために、当分野で既知の方法を適用することができる。従って、本発明によって、分析ステップを各タンパク質に関して単一のペプチドのキャラクタリゼーションにまで低減させることによって、プロテオームサンプルの複雑性を低減し、複雑な混合物中のタンパク質を同定する効率的な方法がもたらされる。
本発明は、プロテオームサンプルの複雑性を低減しながら、サンプル内の個々のタンパク質の同定を可能にする、新しい改善されたシステムを開示する。本システムは、元のプロテオームサンプルを分析することから、元のサンプル中のタンパク質1つ当たり単一のペプチド(各ペプチドは、元のサンプル内に存在するタンパク質のN末端(あるいはC末端)から抽出)を分析することへと低減(簡易化)する方法を基礎とする。本発明の目的のために、タンパク質同定が個々のタンパク質のN末端から抽出されたペプチドのキャラクタリゼーションに基づく場合、当該方法を「N末端ペプチド選択法」と呼ぶ。同様に、タンパク質同定が個々のタンパク質のC末端から抽出されたペプチドのキャラクタリゼーションに基づく場合、当該方法を本明細書では「C末端ペプチド選択法」と呼ぶ。より一般的には、どちらの方法も、「末端ペプチド選択法」という用語で呼ぶ。本発明の方法を周知の質量分析法及びコンピュータ支援データベース検索システムと組み合わせると、各タンパク質に関して生成されたN末端あるいはC末端の保護された単一のペプチドをキャラクタリゼーションすることによって、サンプル内のタンパク質を同定することが可能となる。各タンパク質について化学的な手段あるいは酵素による手段によって生成されたN末端ペプチドあるいはC末端ペプチドのアミノ酸配列からサンプル内のタンパク質を同定するために、当分野で既知の方法を適用することができる。従って、本発明によって、分析ステップを各タンパク質に関して単一のペプチドのキャラクタリゼーションにまで低減させることによって、プロテオームサンプルの複雑性を低減し、複雑な混合物中のタンパク質を同定する効率的な方法がもたらされる。
一態様において、本発明は、プロテオームサンプルの複雑性を低減する方法を包含する。ある実施形態においては、本発明の方法は、(i)1つ以上のタンパク質を設けるステップ、(ii)適切な保護剤を用いてタンパク質のN末端あるいはC末端を保護するステップ、(iii)末端の保護されたタンパク質を適切な開裂剤で開裂し、末端の保護されたペプチドと、開裂部位に対応する遊離アミノ基及び遊離カルボキシ基からなる末端の保護されていないペプチドとの混合物を生成するステップ、(iv)末端の保護されたペプチドをペプチド混合物から分離して、サンプルの複雑性を、サンプルタンパク質1つごとに1つの末端ペプチドにまで低減させるステップ、を包含する。
ある実施形態においては、タンパク質開裂混合物からの末端の保護されたペプチドの分離は、(i)末端の保護されていないペプチドを固体支持材上に選択的に固定化すること、(ii)適切な溶媒で固体支持材を洗浄すること、(iii)末端の保護されたペプチドを含有するこれらの溶媒部分を収集すること、によって達成する。
一実施形態では、N末端の保護されていないペプチドを固定化し、固体支持材には反応性遊離アミノ基と共有結合を形成できる反応基が含まれている。別の実施形態では、C末端の保護されていないペプチドを固定化し、固体支持材には、遊離カルボキシ基と共有結合を形成できる反応基が含まれている。
別の実施形態においては、タンパク質末端を保護するために用いられる保護基は、固体支持材と共有結合を形成できる反応基あるいは潜在的反応基を含む。こうして、末端の保護されたペプチドを固体支持材上に固定化することによって、混合物から、末端の保護された所望のペプチドを分離する。目的としていないペプチドは固体支持材から洗い流し、末端の保護されたペプチドは適切な脱離剤に曝すことによって遊離することができる。このようにして、一部の他の実施形態では、タンパク質開裂混合物からの末端の保護されたペプチドの分離は、(i)末端の保護されたペプチドを固体支持材上に選択的に固定化すること、(ii)固体支持材を洗浄して、固体支持材に共有結合していないペプチドを除去すること、(iii)末端の保護されたペプチドを固体支持材から脱離させること、を包含する。
別の態様においては、本発明は、プロテオームサンプル内のタンパク質を同定する方法を包含する。一部の実施形態では、本発明の方法は、(i)1つ以上のタンパク質を設けるステップ、(ii)タンパク質末端のアミノ基を適切な保護剤を用いて保護するステップ、(iii)末端の保護されたタンパク質を適切な開裂剤を用いて開裂し、末端の保護されたペプチドと、開裂部位に対応する遊離アミノ基及び遊離カルボキシ基からなるペプチドとの混合物を生成するステップ、(iv)ペプチド混合物から末端の保護されたペプチドを分離し、サンプルの複雑性をサンプルタンパク質1つごとに1つの末端ペプチドにまで低減させるステップ、(v)末端の保護されたペプチドを検出するステップ、を包含する。
一部の実施形態においては、ステップ(ii)〜(iv)を、前述したプロテオームサンプルの複雑性を低減する方法に関して記載した方法と同様な方法に従って実施する。
一実施形態では、上記の方法を質量分析技術と組み合わせ、N末端あるいはC末端の保護されたペプチドをキャラクタリゼーションし、N末端あるいはC末端の保護されたペプチドが抽出された元のサンプル中のタンパク質を同定する。一部の実施形態では、検出ステップにおいて質量分析技術が用いられる。一実施形態では、質量分析技術はタンデム質量分析であり、末端の保護されたペプチドのMS断片化パターンを用いて使用可能なデータベースをスクリーニングし、末端ペプチドのアミノ酸配列を決定する。一部の他の実施形態では、アミノ酸配列情報を用いてタンパク質データベースをスクリーニングし、末端ペプチドが抽出された元の親タンパク質を同定する。別の実施形態では、質量分析技術を、高圧液体クロマトグラフィ(HPLC)、ゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動(CE)などの分離技術と組み合わせ、N末端あるいはC末端の保護されたペプチドの混合物に対して分離ステップを実施した後にMS分析を実施する。
定量プロテオミクス
別の態様において、本発明は、2つのサンプル中に差異をもって存在するタンパク質のレベル、又は全部ではなくても一部のサンプルに存在するタンパク質(単数又は複数)を定量的に比較する方法を包含する。区別して同位体標識化することと組み合わせると、本発明のN末端ペプチド選択法あるいはC末端ペプチド選択法を使用して、種々のサンプル中のペプチド及びペプチドに対応するタンパク質の相対的な量を定量できる。
別の態様において、本発明は、2つのサンプル中に差異をもって存在するタンパク質のレベル、又は全部ではなくても一部のサンプルに存在するタンパク質(単数又は複数)を定量的に比較する方法を包含する。区別して同位体標識化することと組み合わせると、本発明のN末端ペプチド選択法あるいはC末端ペプチド選択法を使用して、種々のサンプル中のペプチド及びペプチドに対応するタンパク質の相対的な量を定量できる。
一部の実施形態では、本発明の定量化方法は、(i)各々が1つ以上のタンパク質を含む2つ以上のサンプルを設けるステップ、(ii)各サンプルにおいて、適切な保護剤を用いてタンパク質のN末端あるいはC末端を保護するステップ、(iii)各サンプルにおいて、末端の保護されたタンパク質を適切な開裂剤を用いて開裂し、末端の保護されたペプチドと、開裂部位に対応した遊離アミノ基及び遊離カルボキシ基からなるペプチドとの混合物を生成するステップ、(iv)各サンプルについて、末端の保護されたペプチドをペプチド混合物から分離し、2つ以上のタンパク質サンプルの各々に関して、サンプルの複雑性を、サンプルタンパク質1つごとに1つの末端ペプチドにまで低減させるステップ、(v)各サンプルの末端の保護されたペプチドを検出可能な標識を含む適切な試薬を用いて区別して標識化し、該区別して標識化されている末端ペプチドの2つ以上の組を生成するステップ、(v)区別して標識化されている末端の保護されたペプチドの相対レベルを測定するステップを包含する。
別の実施形態では、2つ以上のサンプル中のタンパク質レベルを定量的に比較する方法は、(i)各々が1つ以上のタンパク質を含む2つ以上のサンプルを設けるステップ、(ii)検出可能な標識を含む適切な保護剤を用いて、各サンプルのタンパク質のN末端あるいはC末端を区別して標識化し、該区別して標識化されている末端の保護されたタンパク質の2つ以上の組を生成するステップ、(iii)区別して標識化されている末端の保護されたタンパク質を適切な開裂剤で開裂し、区別して標識化されている末端の保護されたペプチドと、開裂部位に対応する遊離アミノ基及び遊離カルボキシ基からなるペプチドとの2つ以上の混合物を生成するステップ、(iv)2つ以上のペプチド混合物の各々について、末端の保護されていないペプチドから、区別して標識化されている末端の保護されたペプチドを分離し、それによって、サンプルの複雑性を、区別して標識化されているサンプルタンパク質1つごとに、区別して標識化されている1つの末端ペプチドにまで効果的に低減させるステップ、(v)区別して標識化されている末端の保護されたペプチドの相対レベルを測定するステップ、とを包含する。
上記2つの実施形態のうちのどちらにおいても、プロテオームサンプルの組み合わせは、各サンプル中の末端ペプチドあるいはタンパク質を区別して標識化するステップの後で、且つ混合物中の標識化したペプチドの相対レベルを測定する前の、任意の時期に実施できる。これによって、(キャリブレーションカーブの作成が必要である絶対定量法とは対照的に)、区別して標識化されている各ペプチド対/組を同時に分析することができ、相対的な定量化が可能となる。
一部の例示的な実施形態においては、すぐ上に記載した方法は、開裂ステップの前に、区別して標識化されている末端の保護されたタンパク質の組を結み合わせるステップをさらに含み、この方法は、(i)各々が1つ以上のタンパク質を含む2つ以上のサンプルを設けるステップ、(ii)検出可能な標識を含む適切な保護剤を用いて、各サンプルのタンパク質のN末端あるいはC末端を区別して標識化し、これによって、区別して標識化されている末端の保護されたタンパク質の2つ以上の組を生成するステップ、(iii)区別して標識化されている末端の保護されたタンパク質の組を組み合わせるステップ、(iv)区別して標識化されている末端の保護されたタンパク質を適切な開裂剤を用いて開裂し、それによって、区別して標識化されている末端の保護されたペプチドと、開裂部位に対応する遊離アミノ基及び遊離カルボキシ基からなるペプチドとが組み合わされた混合物を生成するステップ、(v)区別して標識化されている末端の保護されたペプチドを、末端の保護されていないペプチドから分離して、それによってサンプルの複雑性を、区別して標識化されているサンプルタンパク質1つごとに1つの区別して標識化されている末端ペプチドにまで低減させるステップ、(vi)区別して標識化されている末端の保護されたペプチドの相対レベルを測定するステップ、とを包含する。
一部の実施形態では、各サンプルのタンパク質のN末端あるいはC末端を区別して標識化するために用いられる検出可能な標識は、区別して同位体標識化されている。一部の例示的な実施形態では、検出可能な標識は、重水素を用いて区別して同位体標識化されている。
一部の実施形態では、末端の保護されたペプチドあるいはタンパク質を区別して標識化するステップは、N末端の保護されたペプチドを区別して標識化することを包含し、検出可能な標識を包含する試薬は、N末端の保護されたペプチドのC末端の遊離カルボキシ基と反応する。
一部の実施形態では、末端の保護されたペプチドあるいはタンパク質を区別して標識化するステップは、C末端の保護されたペプチドを区別して標識化することを包含し、検出可能な標識を包含する試薬は、C末端の保護されたペプチドのN末端の遊離アミノ基と反応する。
一部の実施形態では、上記の定量的な方法と質量分析技術を組み合わせて、N末端あるいはC末端の保護されたペプチドをキャラクタリゼーションし、N末端あるいはC末端の保護されたペプチドが抽出された元のサンプル中のタンパク質を同定する。一部の実施形態では、検出ステップにおいて質量分析技術が用いられる。別の実施形態では、質量分析技術はタンデム質量分析法であり、ペプチドのMS断片化パターンを用いて使用可能なデータベースをスクリーニングし、N末端ペプチドあるいはC末端ペプチドのアミノ酸配列を決定する。一部の他の実施形態では、アミノ酸配列情報を使用してタンパク質データベースをスクリーニングし、末端ペプチドが抽出された元の親タンパク質を同定する。別の実施形態では、質量分析技術を高圧液体クロマトグラフィ(HPLC)、ゲル電気泳動、キャピラリ電気泳動(CE)などの分離技術と組み合わせて、N末端あるいはC末端の保護されたペプチドの混合物に対して分離ステップを実施した後にMS分析を実施する。
例示的な一実施形態では、種々のサンプル内の検出可能な標識は区別して同位体標識化されており、種々のサンプル内のN末端あるいはC末端の保護されたペプチドレベル(即ち対応するタンパク質レベル)の定量的な比較は、種々のサンプル内の区別して同位体標識化されている標識の相対的な量を比較することによって実施する。
本発明の定量方法によって、例えば、サンプルを採取した元の細胞、組織、生物の状態あるいは細胞状態の変化(例えば病気状態、悪性度)、もしくは刺激(例えば投薬、あるいは毒物の可能性のある物質との接触)、もしくは環境の変化(例えば栄養レベル、温度、時間の経過)によって特異的に影響を受けるサンプルに関して、又は種々のソースから抽出されたサンプル全部(例えば、異なる細胞タイプあるいは異なる生物から採取したサンプル、又は特定部位の突然変異あるいは遺伝子ノックアウト実験から得られた細胞などの変形及び/又は遺伝子操作した細胞から得られた細胞)に関して、タンパク質の発現あるいは修飾を比較し得る。
本発明のキット
本発明の別の態様は、本発明による方法を都合良く実施するために有用なキットに関する。本発明の有用性を高めるために、試薬及び/又は物質をパッケージ化された組み合わせとして提供することができる(試薬及び/又は物質の交差反応性及び安定性に応じて同じ容器で提供することも、別の容器で提供することもできる)。
本発明の別の態様は、本発明による方法を都合良く実施するために有用なキットに関する。本発明の有用性を高めるために、試薬及び/又は物質をパッケージ化された組み合わせとして提供することができる(試薬及び/又は物質の交差反応性及び安定性に応じて同じ容器で提供することも、別の容器で提供することもできる)。
一実施形態では、プロテオームサンプル内の個々のタンパク質を同定するために有用なキットは、(i)タンパク質のN末端あるいはC末端を保護し、N末端あるいはC末端の保護されたタンパク質を生成する1つ以上の保護剤、(ii)末端の保護されたタンパク質を、末端の保護されたペプチドと、遊離アミノ基及び遊離カルボキシ基からなるペプチドとの混合物に開裂する1つ以上の開裂剤、(iii)末端の保護されたペプチドを混合物から分離する手段、とを具備する。
一部の実施形態では、開裂剤は化学的開裂剤である。例示的な一実施形態では、開裂剤はタンパク質消化を引き起こす酵素である。
一部の実施形態では、本発明のキットはさらに、タンパク質内のリシン残基の側鎖を選択的に保護するための二次保護剤を包含する。
一実施形態では、少なくとも1つの保護剤は、サンプル内のタンパク質のN末端を保護するためのアミン保護剤である。別の実施形態では、少なくとも1つの保護剤は、サンプル内のタンパク質のC末端を保護するためのカルボキシ保護剤である。さらに別の実施形態では、保護剤は、固体支持材と共有結合を形成し得る反応基あるいは潜在的反応基からなる。
別の実施形態では、末端の保護されたペプチドを分離する手段には固体支持材が含まれる。1つ以上の固体支持材をキットと共に設けることができ、各固体支持材は同じとすることも、異なるものとすることもできる。一実施形態では、固体支持材は(例えば、N末端の保護されていないペプチドを固定化するために)アミンと共有結合できる反応基を含む。別の実施形態では、固体支持材は(例えばC末端の保護されていないペプチドを固定化するために)カルボキシ基と共有結合できる反応基を含む。さらに別の実施形態では、固体支持材は末端の保護されたペプチドを固定化し、固体支持材には、末端の保護されたペプチド上に存在する保護基に共有結合し得る反応基が含まれる。
一部の実施形態では、必要であれば、当該キットには固定化されたペプチドを固体支持材から脱離させるための試薬が含まれる。
別の実施形態では、当該キットには、末端の保護されたペプチドあるいは末端の保護されていないペプチドを固体支持材上に固定化するためのリンカーが含まれる。
さらに別の実施形態では、本発明のキットは、2つ以上のサンプルの間に差異をもって存在するタンパク質レベルを定量的に比較するために有用であり、さらに、種々のサンプル内に存在するタンパク質から抽出されたN末端ペプチドあるいはC末端ペプチドを区別して標識化する1つ以上の試薬を含んでいる。一実施形態では、試薬は区別して同位体標識化されており、N末端の保護されたペプチドの遊離カルボキシ基(又はC末端の保護されたペプチドの遊離アミノ基)を共有結合にて修飾するために用いられる。例示的な一実施形態では、種々のサンプルにおけるタンパク質のN末端あるいはC末端を保護するために使用される保護基には、区別して同位体標識化されている検出可能な標識が含まれている。従って、種々のサンプルにおけるN末端あるいはC末端の保護されたペプチドレベル(即ち、対応するタンパク質レベル)の定量的な比較は、種々のサンプル中の区別して同位体標識化されている標識の相対的な量を比較することによって実施される。
本発明によって、サンプルの複雑性を低減させると共に、プロテオームサンプル内のタンパク質を効率的に信頼性高く同定及び定量化できる改善された方法及び該方法を便利に実施できるキットを提供することが可能となる。
定義
「プロテオームサンプル」
本明細書において用いられるプロテオームサンプルという用語は、複数のタンパク質を含むサンプルを意味する。好ましくは、当該サンプルは、細胞、組織、あるいは生体の全タンパク質の集合体である。一部の実施形態では、プロテオームサンプルは生体サンプルであり、任意の生体から得られるか、排出されるか、分泌される任意の固体あるいは液体サンプルを指し、生体には、単細胞微生物(バクテリアや酵母菌など)、多細胞生物(植物及び動物、例えば脊椎動物や哺乳類、特に健康なヒトあるいは見かけ上健康なヒトの被験者、又は診断、検査すべき状態あるいは病気の影響を受けたヒトの患者)が含まれる。生体サンプルは任意の形態のものでよく、例えば組織、細胞、細胞ペレット、細胞抽出物、細胞ホモジェネート、細胞片などの固体物質、又は生検によって得られた試料あるいは生体液が含まれる。生体液は任意の部位から得られ(例えば血液、唾液(又は口腔内細胞を含有するうがい液)、涙、血漿、血清、尿、胆液、脳脊髄液、羊水、腹水、胸膜液、あるいはこれらからの細胞、房水あるいは硝子体液、又は任意の検体からの分泌液)、濾出液、滲出液(例えば膿瘍あるいは任意の他の感染部位、炎症部位から得られた液体)、又は関節から得られた液体(例えば正常な関節、又は関節リウマチ、変形性関節症、通風、敗血症性関節炎などの病気の影響を受けた関節)などが含まれる。生体サンプルは任意の器官あるいは組織(生検によって得られた試料あるいは検死標本を含む)から得られ、即ち生体サンプルは任意の細胞、組織、器官から得られた細胞(一次細胞でも、培養した細胞でもよい)あるいは媒体を含有し得る。生体サンプルは又、組織学的な目的のために採取された凍結切片などの組織切片を含み得る。生体サンプルには又、細胞あるいは組織のホモジェネートの部分的あるいは完全な分画化によって生成されたタンパク質、脂質、炭水化物、核酸を含む生体分子の混合物が含まれる。サンプルは好ましくはヒトの被験者から採取するが、生体サンプルは任意の動物、植物、バクテリア、ウィルス、酵母菌などから採取することができる。本明細書にて使用される「動物」という用語は、任意の発達段階にあるヒト及びヒト以外の動物を指し、それには哺乳類、鳥類、爬虫類、両生類、魚類、寄生虫、単細胞生物が含まれる。細胞培養物及び生体組織サンプルは、複数の動物のものとし得る。一部の例示的な実施形態では、ヒト以外の動物は哺乳類である(例えば、げっ歯類、マウス、ラット、ウサギ、サル、イヌ、ネコ、ヒツジ、ウシ、霊長類、ブタ)。動物は遺伝子組み換え動物あるいはヒトクローンとし得る。必要であれば、生体サンプルに予備的な分離技術を含む前処理を施し得る。例えば、細胞あるいは組織を抽出し、分画化することで、異なる細胞成分内の生体分子(細胞の種々の部分におけるタンパク質など)を独立して分析し得る。Deutscher(ed),「Methods In Enzymology」,(1990)182,147−238を参照されたい(参照することによってその内容の全てを本明細書に取り入れることとする)。同様に、タンパク質などの抗原に関連した生体分子を同定するために免疫沈降を実施することができる。Firestone & Winguth In Deutscher,「Methods In Enzymology」,(1990)182,688−699を参照されたい(参照することによってその内容の全てを本明細書に取り入れることとする)。
「プロテオームサンプル」
本明細書において用いられるプロテオームサンプルという用語は、複数のタンパク質を含むサンプルを意味する。好ましくは、当該サンプルは、細胞、組織、あるいは生体の全タンパク質の集合体である。一部の実施形態では、プロテオームサンプルは生体サンプルであり、任意の生体から得られるか、排出されるか、分泌される任意の固体あるいは液体サンプルを指し、生体には、単細胞微生物(バクテリアや酵母菌など)、多細胞生物(植物及び動物、例えば脊椎動物や哺乳類、特に健康なヒトあるいは見かけ上健康なヒトの被験者、又は診断、検査すべき状態あるいは病気の影響を受けたヒトの患者)が含まれる。生体サンプルは任意の形態のものでよく、例えば組織、細胞、細胞ペレット、細胞抽出物、細胞ホモジェネート、細胞片などの固体物質、又は生検によって得られた試料あるいは生体液が含まれる。生体液は任意の部位から得られ(例えば血液、唾液(又は口腔内細胞を含有するうがい液)、涙、血漿、血清、尿、胆液、脳脊髄液、羊水、腹水、胸膜液、あるいはこれらからの細胞、房水あるいは硝子体液、又は任意の検体からの分泌液)、濾出液、滲出液(例えば膿瘍あるいは任意の他の感染部位、炎症部位から得られた液体)、又は関節から得られた液体(例えば正常な関節、又は関節リウマチ、変形性関節症、通風、敗血症性関節炎などの病気の影響を受けた関節)などが含まれる。生体サンプルは任意の器官あるいは組織(生検によって得られた試料あるいは検死標本を含む)から得られ、即ち生体サンプルは任意の細胞、組織、器官から得られた細胞(一次細胞でも、培養した細胞でもよい)あるいは媒体を含有し得る。生体サンプルは又、組織学的な目的のために採取された凍結切片などの組織切片を含み得る。生体サンプルには又、細胞あるいは組織のホモジェネートの部分的あるいは完全な分画化によって生成されたタンパク質、脂質、炭水化物、核酸を含む生体分子の混合物が含まれる。サンプルは好ましくはヒトの被験者から採取するが、生体サンプルは任意の動物、植物、バクテリア、ウィルス、酵母菌などから採取することができる。本明細書にて使用される「動物」という用語は、任意の発達段階にあるヒト及びヒト以外の動物を指し、それには哺乳類、鳥類、爬虫類、両生類、魚類、寄生虫、単細胞生物が含まれる。細胞培養物及び生体組織サンプルは、複数の動物のものとし得る。一部の例示的な実施形態では、ヒト以外の動物は哺乳類である(例えば、げっ歯類、マウス、ラット、ウサギ、サル、イヌ、ネコ、ヒツジ、ウシ、霊長類、ブタ)。動物は遺伝子組み換え動物あるいはヒトクローンとし得る。必要であれば、生体サンプルに予備的な分離技術を含む前処理を施し得る。例えば、細胞あるいは組織を抽出し、分画化することで、異なる細胞成分内の生体分子(細胞の種々の部分におけるタンパク質など)を独立して分析し得る。Deutscher(ed),「Methods In Enzymology」,(1990)182,147−238を参照されたい(参照することによってその内容の全てを本明細書に取り入れることとする)。同様に、タンパク質などの抗原に関連した生体分子を同定するために免疫沈降を実施することができる。Firestone & Winguth In Deutscher,「Methods In Enzymology」,(1990)182,688−699を参照されたい(参照することによってその内容の全てを本明細書に取り入れることとする)。
生体サンプルは健康な被験者から抽出することも、病気の被験者から抽出することもできる。生体サンプルは、種々の遺伝子背景、元となる組織、及び/又は発達段階の、細胞から抽出することができ、それには例えばバクテリア、酵母菌、植物、昆虫、哺乳類の細胞などが含まれる。プロテオームサンプルは正常な細胞、形質変換された細胞(例えば癌から抽出された細胞ではないが、正常な細胞を実験室で処理して生成された細胞)、病気の細胞、あるいは遺伝子操作された細胞(例えば特定部位の突然変異あるいは遺伝子ノックアウト実験から得られた細胞)、又はあらかじめ外部の刺激(例えば薬物の投与、毒物である可能性のある物質との接触、栄養レベルの変化、温度の変化、時間の経過)に曝した細胞から抽出することができる。
「タンパク質」
本明細書で用いられるとき、タンパク質という用語は、ペプチド結合したアミノ酸の鎖を意味し、例えばグリコシル化あるいはリン酸化などの翻訳後修飾の有無に関わらない。従って、タンパク質という用語は、単一のものを指すのではなく、同じ遺伝子産物が翻訳後修飾を受けた結果、又はN末端処理及び/又はC末端処理を受けた結果、生じたタンパク質を包含する。典型的には、タンパク質はアミノ酸残基が25より多い長さを有するアミノ酸の鎖である。
本明細書で用いられるとき、タンパク質という用語は、ペプチド結合したアミノ酸の鎖を意味し、例えばグリコシル化あるいはリン酸化などの翻訳後修飾の有無に関わらない。従って、タンパク質という用語は、単一のものを指すのではなく、同じ遺伝子産物が翻訳後修飾を受けた結果、又はN末端処理及び/又はC末端処理を受けた結果、生じたタンパク質を包含する。典型的には、タンパク質はアミノ酸残基が25より多い長さを有するアミノ酸の鎖である。
「ペプチド」
本明細書で用いられるとき、ペプチドという用語は、アミノ酸残基が約25未満の長さを有するアミノ酸の鎖を意味する。例えば、タンパク質のタンパク質分解断片化により複数のペプチドが生成する。
本明細書で用いられるとき、ペプチドという用語は、アミノ酸残基が約25未満の長さを有するアミノ酸の鎖を意味する。例えば、タンパク質のタンパク質分解断片化により複数のペプチドが生成する。
「差異をもって存在する」
種々のプロテオームサンプル内のタンパク質に関して本明細書で用いられる「差異をもって存在する」という用語は、種々のサンプル内に存在し、タンパク質固有の性質が変化して存在するタンパク質を意味する。本明細書で使用される「性質」という用語には、発現レベル、タンパク質修飾(例えば翻訳後修飾など)、タンパク質配列(即ち突然変異)、あるいはタンパク質の機能が含まれる。例えば、他のサンプルと比較した場合に、ある一群のサンプルにおいて1つ以上のタンパク質が相対的に多く存在するときに、「差異をもって存在する」という用語を使用することができる。またこの用語は、他のサンプルに存在しないタンパク質が、ある一群のサンプルに存在する場合にも使用することができる。当然、他のサンプルと比較した場合に、ある一群のサンプルにおいてあるタンパク質が相対的に多く存在しており、且つ他のタンパク質に関しては他のサンプルには存在しないのにある一群のサンプルには存在するという場合もある。
種々のプロテオームサンプル内のタンパク質に関して本明細書で用いられる「差異をもって存在する」という用語は、種々のサンプル内に存在し、タンパク質固有の性質が変化して存在するタンパク質を意味する。本明細書で使用される「性質」という用語には、発現レベル、タンパク質修飾(例えば翻訳後修飾など)、タンパク質配列(即ち突然変異)、あるいはタンパク質の機能が含まれる。例えば、他のサンプルと比較した場合に、ある一群のサンプルにおいて1つ以上のタンパク質が相対的に多く存在するときに、「差異をもって存在する」という用語を使用することができる。またこの用語は、他のサンプルに存在しないタンパク質が、ある一群のサンプルに存在する場合にも使用することができる。当然、他のサンプルと比較した場合に、ある一群のサンプルにおいてあるタンパク質が相対的に多く存在しており、且つ他のタンパク質に関しては他のサンプルには存在しないのにある一群のサンプルには存在するという場合もある。
「アフィニティラベル」
本明細書で用いられるとき、「アフィニティラベル」という用語は、対になる物質(例えば捕捉剤)と特異的に相互作用/結合する基、部位、物質を意味する。アフィニティラベル/捕捉剤の対は、しばしば「アフィニティペア」と呼ばれる。アフィニティペアは生化学的な対とすることができる。生化学的な対の例として、抗体−抗原、酵素−阻害物質、ホルモン−レセプタ、糖−レクチン、相補的な核酸成分が挙げられる。
本明細書で用いられるとき、「アフィニティラベル」という用語は、対になる物質(例えば捕捉剤)と特異的に相互作用/結合する基、部位、物質を意味する。アフィニティラベル/捕捉剤の対は、しばしば「アフィニティペア」と呼ばれる。アフィニティペアは生化学的な対とすることができる。生化学的な対の例として、抗体−抗原、酵素−阻害物質、ホルモン−レセプタ、糖−レクチン、相補的な核酸成分が挙げられる。
「アフィニティクロマトグラフィ」
本明細書で用いられるとき、アフィニティクロマトグラフィという用語は、固体支持材上にてアフィニティペアのうちの1成分を化学的に固定化し、これをカラム内に充填し、次いでこのカラムを従来のHPLCシステムにおいて使用することで、アフィニティペアの成分間の特異的な相互作用を利用して、成分対の相手側を含む物質を特異的に分析する分離方法を意味する。アフィニティペアは抗体−抗原対とすることができ、固定支持材には固定化された抗体を含ませ得る。抗体−抗原アフィニティペアの利点の1つに、特定の抗体を任意の化学構造に形成し得るため、本技術によって任意の化合物を検出し得ることが挙げられる。アフィニティペアは、例えばアビジン/ビオチンなどの酵素−阻害剤の対とすることもできる。この場合、分離すべき物質はアビジンに共有結合し、その結果生じる結合物は、アビジンとビオチンの間のアフィニティ結合によってビオチン化された固体支持材に固定化される。あるいは又、アビジンを固体支持材上に結合させ、分離すべき分析物を反応させてビオチン化末端を得ることで、アビジンが結合している固体支持材上に固定化することができる。
本明細書で用いられるとき、アフィニティクロマトグラフィという用語は、固体支持材上にてアフィニティペアのうちの1成分を化学的に固定化し、これをカラム内に充填し、次いでこのカラムを従来のHPLCシステムにおいて使用することで、アフィニティペアの成分間の特異的な相互作用を利用して、成分対の相手側を含む物質を特異的に分析する分離方法を意味する。アフィニティペアは抗体−抗原対とすることができ、固定支持材には固定化された抗体を含ませ得る。抗体−抗原アフィニティペアの利点の1つに、特定の抗体を任意の化学構造に形成し得るため、本技術によって任意の化合物を検出し得ることが挙げられる。アフィニティペアは、例えばアビジン/ビオチンなどの酵素−阻害剤の対とすることもできる。この場合、分離すべき物質はアビジンに共有結合し、その結果生じる結合物は、アビジンとビオチンの間のアフィニティ結合によってビオチン化された固体支持材に固定化される。あるいは又、アビジンを固体支持材上に結合させ、分離すべき分析物を反応させてビオチン化末端を得ることで、アビジンが結合している固体支持材上に固定化することができる。
「結合した」あるいは「結合する」
本明細書で用いられるとき、2つの物質が互いに結合している、又は結合するとは、これらの2つが、直接的な共有結合、間接的な共有結合、あるいは非共有結合による相互作用によって結合していることを意味する。好ましくは、結合は共有結合である。望ましい非共有結合による相互作用には、水素結合、ファンデルワールス力による相互作用、疎水性相互作用、磁気相互作用、静電相互作用、アフィニティ相互作用、これらの組み合わせが含まれる。
本明細書で用いられるとき、2つの物質が互いに結合している、又は結合するとは、これらの2つが、直接的な共有結合、間接的な共有結合、あるいは非共有結合による相互作用によって結合していることを意味する。好ましくは、結合は共有結合である。望ましい非共有結合による相互作用には、水素結合、ファンデルワールス力による相互作用、疎水性相互作用、磁気相互作用、静電相互作用、アフィニティ相互作用、これらの組み合わせが含まれる。
「開裂剤」
本明細書で用いられるとき、開裂剤という用語は、適切な条件下でタンパク質を2つ以上の断片に開裂する試薬を意味する。好ましくは開裂剤は酵素であり、最も好ましくはポリペプチドの主鎖を開裂する酵素である。好ましくは、酵素は、多くのリシンとアルギニンのC末端においてタンパク質を開裂するトリプシンである。例えば、キモトリプシン、ペプシン、パパイン、プロリンエンドペプチダーゼ、ブドウ球菌(staph)プロテアーゼ、エラスターゼ、プロテアーゼK、AspN、lys−C、arg−C、glu−Cなどの、他の酵素を使用して本発明を実施することもできる。開裂剤は酵素に限定されるものではなく、例えば、臭化シアン(CNBr)、2−ニトロ−5−チオシアノ安息香酸、N−ブロモスクシンアミド及び他の反応性ハロゲン化合物、ヒドロキシルアミン、1−2M ギ酸あるいは酢酸、過ヨウ素酸酸化、2−(2−ニトロフェニルスルフェニル)−3−メチル−3−ブロモインドレニン、あるいはo−ヨードソ安息香酸などの化学剤を用いることもできる(例えば、Hermodsonらによる、「Methods in Protein Sequence analysis」ed.Elzinga,Humons Press,Clifton,NJ,(1982)pp.313−323を参照されたい)。タンパク質開裂後の精製及びその結果得られるタンパク質消化産物の分析を容易に行うために、開裂剤を固体支持材に結合させることができる。例えば、親水性の高分子材料の多孔性ビーズの細孔中に、酵素(開裂剤)を物理的に捕捉させることができる。あるいは又、固体支持材上に存在する適切な捕捉剤に対するアフィニティ結合を介して、酵素を固体支持材上に固定化することもできる。即ち、酵素をアビジンに共有結合させ、その結果生じる結合物を、アビジンとビオチン間のアフィニティ結合によってビオチン化した膜上に付着させることができる。あるいは又、アビジンを膜に結合させ、酵素を反応させてビオチン化末端を得ることで、ビオチン化末端を有する酵素を、アビジンが付着している膜と反応させることもできる。
本明細書で用いられるとき、開裂剤という用語は、適切な条件下でタンパク質を2つ以上の断片に開裂する試薬を意味する。好ましくは開裂剤は酵素であり、最も好ましくはポリペプチドの主鎖を開裂する酵素である。好ましくは、酵素は、多くのリシンとアルギニンのC末端においてタンパク質を開裂するトリプシンである。例えば、キモトリプシン、ペプシン、パパイン、プロリンエンドペプチダーゼ、ブドウ球菌(staph)プロテアーゼ、エラスターゼ、プロテアーゼK、AspN、lys−C、arg−C、glu−Cなどの、他の酵素を使用して本発明を実施することもできる。開裂剤は酵素に限定されるものではなく、例えば、臭化シアン(CNBr)、2−ニトロ−5−チオシアノ安息香酸、N−ブロモスクシンアミド及び他の反応性ハロゲン化合物、ヒドロキシルアミン、1−2M ギ酸あるいは酢酸、過ヨウ素酸酸化、2−(2−ニトロフェニルスルフェニル)−3−メチル−3−ブロモインドレニン、あるいはo−ヨードソ安息香酸などの化学剤を用いることもできる(例えば、Hermodsonらによる、「Methods in Protein Sequence analysis」ed.Elzinga,Humons Press,Clifton,NJ,(1982)pp.313−323を参照されたい)。タンパク質開裂後の精製及びその結果得られるタンパク質消化産物の分析を容易に行うために、開裂剤を固体支持材に結合させることができる。例えば、親水性の高分子材料の多孔性ビーズの細孔中に、酵素(開裂剤)を物理的に捕捉させることができる。あるいは又、固体支持材上に存在する適切な捕捉剤に対するアフィニティ結合を介して、酵素を固体支持材上に固定化することもできる。即ち、酵素をアビジンに共有結合させ、その結果生じる結合物を、アビジンとビオチン間のアフィニティ結合によってビオチン化した膜上に付着させることができる。あるいは又、アビジンを膜に結合させ、酵素を反応させてビオチン化末端を得ることで、ビオチン化末端を有する酵素を、アビジンが付着している膜と反応させることもできる。
「N末端ペプチド」
本明細書で用いられるとき、N末端ペプチドという用語は、本発明のN末端ペプチド選択法によって、プロテオームサンプル内のタンパク質のN末端から抽出されたペプチドを意味する。あるいは又、このようなペプチドをN末端の保護されたペプチドと呼ぶ。
本明細書で用いられるとき、N末端ペプチドという用語は、本発明のN末端ペプチド選択法によって、プロテオームサンプル内のタンパク質のN末端から抽出されたペプチドを意味する。あるいは又、このようなペプチドをN末端の保護されたペプチドと呼ぶ。
「非N末端ペプチド」
本明細書で用いられるとき、非N末端ペプチドという用語は、本発明のN末端ペプチド選択法により、タンパク質サンプルを化学的及び/又は酵素によって断片化した結果得られた混合物中に存在する、本明細書で定義されたN末端ペプチド以外のペプチドを指す。あるいは又、このようなペプチドをN末端の保護されていないペプチドと呼ぶ。
本明細書で用いられるとき、非N末端ペプチドという用語は、本発明のN末端ペプチド選択法により、タンパク質サンプルを化学的及び/又は酵素によって断片化した結果得られた混合物中に存在する、本明細書で定義されたN末端ペプチド以外のペプチドを指す。あるいは又、このようなペプチドをN末端の保護されていないペプチドと呼ぶ。
「C末端ペプチド」
本明細書で用いられるとき、C末端ペプチドという用語は、本発明のC末端ペプチド選択法によってプロテオームサンプル内の同定すべきタンパク質のC末端から抽出されたペプチドを意味する。あるいは又、このようなペプチドをC末端の保護されたペプチドと呼ぶ。
本明細書で用いられるとき、C末端ペプチドという用語は、本発明のC末端ペプチド選択法によってプロテオームサンプル内の同定すべきタンパク質のC末端から抽出されたペプチドを意味する。あるいは又、このようなペプチドをC末端の保護されたペプチドと呼ぶ。
「非C末端ペプチド」
本明細書で用いられるとき、非C末端ペプチドという用語は、本発明のC末端ペプチド選択法によってタンパク質サンプルを化学的及び/又は酵素によって断片化した結果得られる混合物中に存在する、本明細書で定義されたC末端ペプチド以外のペプチドを指す。あるいは又、このようなペプチドをC末端の保護されていないペプチドと呼ぶ。
本明細書で用いられるとき、非C末端ペプチドという用語は、本発明のC末端ペプチド選択法によってタンパク質サンプルを化学的及び/又は酵素によって断片化した結果得られる混合物中に存在する、本明細書で定義されたC末端ペプチド以外のペプチドを指す。あるいは又、このようなペプチドをC末端の保護されていないペプチドと呼ぶ。
「潜在的反応基」
本明細書で用いられるとき、潜在的反応基という用語は、反応に際して活性化されることを必要とする基を意味する。例えば、保護基を有する基であって、保護基が除去されると反応性を示す基である。
本明細書で用いられるとき、潜在的反応基という用語は、反応に際して活性化されることを必要とする基を意味する。例えば、保護基を有する基であって、保護基が除去されると反応性を示す基である。
「反応性遊離アミノ基」
本明細書で用いられるとき、反応性遊離アミノ基という用語は、化学式−NR1R2で表される基を意味する。上式において、R1及びR2は、それぞれ独立して、水素、又は置換あるいは非置換の、環式あるいは非環式の、直鎖あるいは分岐の、飽和あるいは不飽和の、脂肪族部分、脂環式部分、ヘテロ脂肪族部分、ヘテロ脂環式部分である。好ましくは、R1及びR2のうちの少なくとも1つは水素である。より好ましくは、脂肪族アミンあるいは脂環式アミンには第一級アミンを用い、R1及びR2は両方とも水素である。最も好ましくは、窒素の非共有電子対は電子の非局在化(例えば、共鳴、芳香族性(aromatic)、互変異性による非局在化)に関与せず、他の電子効果(例えば電気誘導/電界効果)による影響を最小限にしか受けていない(さもなければ、求核反応性が実質的に低減する)。一部の実施形態では、反応性遊離アミノ基という用語は、タンパク質及び/ペプチドの遊離N末端アミノ基を意味する。
本明細書で用いられるとき、反応性遊離アミノ基という用語は、化学式−NR1R2で表される基を意味する。上式において、R1及びR2は、それぞれ独立して、水素、又は置換あるいは非置換の、環式あるいは非環式の、直鎖あるいは分岐の、飽和あるいは不飽和の、脂肪族部分、脂環式部分、ヘテロ脂肪族部分、ヘテロ脂環式部分である。好ましくは、R1及びR2のうちの少なくとも1つは水素である。より好ましくは、脂肪族アミンあるいは脂環式アミンには第一級アミンを用い、R1及びR2は両方とも水素である。最も好ましくは、窒素の非共有電子対は電子の非局在化(例えば、共鳴、芳香族性(aromatic)、互変異性による非局在化)に関与せず、他の電子効果(例えば電気誘導/電界効果)による影響を最小限にしか受けていない(さもなければ、求核反応性が実質的に低減する)。一部の実施形態では、反応性遊離アミノ基という用語は、タンパク質及び/ペプチドの遊離N末端アミノ基を意味する。
「置換」
一般的には、置換という用語は、所与の構造内の水素ラジカルを特定の置換基のラジカルと置き換えることを意味する。任意の所与の構造内の複数の位置を、特定の基から選択される複数の置換基を用いて置換することができ、置換基は各位置について同じとすることも、異なるものにすることもできる。本明細書に使用される「置換」という用語によって、有機化合物に関する全ての許容される置換基が包含されるものと意図している。広範な態様においては、許容可能な置換基には、有機化合物における、非環式及び環式の置換基、分岐及び非分岐の置換基、炭素環式及び複素環式の置換基、芳香族及び非芳香族の置換基が含まれる。窒素などのヘテロ原子も、水素置換基及び/又はヘテロ原子の原子価を満足させる本明細書に記載される有機化合物における任意の許容可能な置換基を有する。置換基の例として、限定はしないが、脂肪族化合物、脂環式化合物、ヘテロ脂肪族化合物、ヘテロ脂環式化合物、アリール、ヘテロアリール、アルキルアリール、アルキルへテロアリール、アルコキシ、アリールオキシ、ヘテロアルコキシ、ヘテロアリールオキシ、アルキルチオ、アリールチオ、ヘテロアルキルチオ、ヘテロアリールチオ、F、Cl、Br、I、−OH、−NO2、−CN、−CF3、−CH2CF3、−CHCl2、−CH2OH、−CH2CH2OH、−CH2NH2、−CH2SO2CH3、−C(O)Rx、−CO2(Rx)、−CON(Rx)2、−OC(O)Rx、−OCO2Rx、−OCON(Rx)2、−N(Rx)2、−S(O)2Rx、−NRx(CO)Rxが挙げられる。ここで各Rxには、限定はしないが、それぞれ独立して、脂肪族化合物、脂環式化合物、ヘテロ脂肪族化合物、ヘテロ脂環式化合物、アリール、ヘテロアリール、アルキルアリール、アルキルへテロアリールが含まれ、上記の脂肪族化合物、脂環式化合物、ヘテロ脂肪族化合物、ヘテロ脂環式化合物、アルキルアリール、アルキルへテロアリールの各置換基には、置換あるいは非置換、分岐あるいは非分岐、環式あるいは非環式のものを用いることができ、また上記任意のアリール置換基あるいはヘテロアリール置換基には、置換あるいは非置換のものを用いることができる。
一般的には、置換という用語は、所与の構造内の水素ラジカルを特定の置換基のラジカルと置き換えることを意味する。任意の所与の構造内の複数の位置を、特定の基から選択される複数の置換基を用いて置換することができ、置換基は各位置について同じとすることも、異なるものにすることもできる。本明細書に使用される「置換」という用語によって、有機化合物に関する全ての許容される置換基が包含されるものと意図している。広範な態様においては、許容可能な置換基には、有機化合物における、非環式及び環式の置換基、分岐及び非分岐の置換基、炭素環式及び複素環式の置換基、芳香族及び非芳香族の置換基が含まれる。窒素などのヘテロ原子も、水素置換基及び/又はヘテロ原子の原子価を満足させる本明細書に記載される有機化合物における任意の許容可能な置換基を有する。置換基の例として、限定はしないが、脂肪族化合物、脂環式化合物、ヘテロ脂肪族化合物、ヘテロ脂環式化合物、アリール、ヘテロアリール、アルキルアリール、アルキルへテロアリール、アルコキシ、アリールオキシ、ヘテロアルコキシ、ヘテロアリールオキシ、アルキルチオ、アリールチオ、ヘテロアルキルチオ、ヘテロアリールチオ、F、Cl、Br、I、−OH、−NO2、−CN、−CF3、−CH2CF3、−CHCl2、−CH2OH、−CH2CH2OH、−CH2NH2、−CH2SO2CH3、−C(O)Rx、−CO2(Rx)、−CON(Rx)2、−OC(O)Rx、−OCO2Rx、−OCON(Rx)2、−N(Rx)2、−S(O)2Rx、−NRx(CO)Rxが挙げられる。ここで各Rxには、限定はしないが、それぞれ独立して、脂肪族化合物、脂環式化合物、ヘテロ脂肪族化合物、ヘテロ脂環式化合物、アリール、ヘテロアリール、アルキルアリール、アルキルへテロアリールが含まれ、上記の脂肪族化合物、脂環式化合物、ヘテロ脂肪族化合物、ヘテロ脂環式化合物、アルキルアリール、アルキルへテロアリールの各置換基には、置換あるいは非置換、分岐あるいは非分岐、環式あるいは非環式のものを用いることができ、また上記任意のアリール置換基あるいはヘテロアリール置換基には、置換あるいは非置換のものを用いることができる。
「脂肪族化合物」
本明細書で用いられるとき、脂肪族という用語は、概して飽和及び不飽和の、直鎖(即ち分岐していない)あるいは分岐の脂肪族炭水化物(任意に、先に定義した官能基のうちの1つ以上を用いて置換されている)を包含する。当業者であれば理解されるように、本明細書においては、「脂肪族化合物」には、アルキル、アルケニル、アルキニル部分が包含されるものと意図しているが、これらに限定されるものではない。従って本明細書では「アルキル」という用語は、直鎖アルキル基及び分岐アルキル基を包含する。「アルケニル」、「アルキニル」などの他の一般的な用語にも同様の定義を適用する。さらに、本明細書では「アルキル」、「アルケニル」、「アルキニル」などの用語は、置換あるいは非置換の基の両方を包含する。一部の実施形態では、本明細書では「低アルキル」は、1〜6の炭素原子を有するアルキル基(置換、非置換、分岐、非分岐のものを包含する)を表すために用いられる。一部の実施形態では、本発明で使用するアルキル基、アルケニル基、及びアルキニル基は、1〜20の脂肪族炭素原子を含む。一部の他の実施形態では、本発明で使用するアルキル基、アルケニル基、及びアルキニル基は、1〜10の脂肪族炭素原子を含む。さらに別の実施形態では、本発明で使用するアルキル基、アルケニル基、及びアルキニル基は、1〜8の脂肪族炭素原子を含む。さらに別の実施形態では、本発明で使用するアルキル基、アルケニル基、及びアルキニル基は、1〜6の脂肪族炭素原子を含む。さらに別の実施形態では、本発明で使用するアルキル基、アルケニル基、及びアルキニル基は、1〜4の脂肪族炭素原子を含む。
本明細書で用いられるとき、脂肪族という用語は、概して飽和及び不飽和の、直鎖(即ち分岐していない)あるいは分岐の脂肪族炭水化物(任意に、先に定義した官能基のうちの1つ以上を用いて置換されている)を包含する。当業者であれば理解されるように、本明細書においては、「脂肪族化合物」には、アルキル、アルケニル、アルキニル部分が包含されるものと意図しているが、これらに限定されるものではない。従って本明細書では「アルキル」という用語は、直鎖アルキル基及び分岐アルキル基を包含する。「アルケニル」、「アルキニル」などの他の一般的な用語にも同様の定義を適用する。さらに、本明細書では「アルキル」、「アルケニル」、「アルキニル」などの用語は、置換あるいは非置換の基の両方を包含する。一部の実施形態では、本明細書では「低アルキル」は、1〜6の炭素原子を有するアルキル基(置換、非置換、分岐、非分岐のものを包含する)を表すために用いられる。一部の実施形態では、本発明で使用するアルキル基、アルケニル基、及びアルキニル基は、1〜20の脂肪族炭素原子を含む。一部の他の実施形態では、本発明で使用するアルキル基、アルケニル基、及びアルキニル基は、1〜10の脂肪族炭素原子を含む。さらに別の実施形態では、本発明で使用するアルキル基、アルケニル基、及びアルキニル基は、1〜8の脂肪族炭素原子を含む。さらに別の実施形態では、本発明で使用するアルキル基、アルケニル基、及びアルキニル基は、1〜6の脂肪族炭素原子を含む。さらに別の実施形態では、本発明で使用するアルキル基、アルケニル基、及びアルキニル基は、1〜4の脂肪族炭素原子を含む。
従って例示的な脂肪族の基として、限定はしないが、例えばメチル、エチル、n−プロピル、イソプロピル、アリル、n−ブチル、sec−ブチル、イソブチル、tert−ブチル、n−ペンチル、sec−ペンチル、イソペンチル、tert−ペンチル、n−ヘキシル、sec−ヘキシルなどの基が挙げられ、重ねて、これらの基は以前に定義したように1つ以上の置換基を含み得る。アルケニル基として、限定はしないが、例えばエテニル、プロペニル、ブテニル、1−メチル−2−ブテン−l−イルが挙げられる。代表的なアルキニル基としては、限定はしないが、エチニル、2−プロピニル(プロパルギル)、1−プロピニルなどが挙げられる。
「脂環式化合物」
本明細書で用いられるとき、「脂環式化合物」という用語は、脂肪族化合物と環式化合物の性質兼ね備えた化合物を指し、限定はしないが、環式あるいは多環式脂肪族炭水化物と、架橋シクロアルキル化合物を包含する(これらは、任意に1つ以上の置換基で置換されている)。当業者であれば理解されるように、本明細書で用いられるとき、「脂環式化合物」は、限定はしないが、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキニルの各部分を含む(任意に、1つ以上の置換基で置換されている)。例示的な脂環式化合物として、限定はしないが、例えばシクロプロピル、−CH2−シクロプロピル、シクロブチル、−CH2−シクロブチル、シクロペンチル、−CH2−シクロペンチル−n、シクロヘキシル、−CH2−シクロヘキシル、シクロヘキセニルエチル、シクロヘキサニルエチル、ノルボルビル(norborbyl)の各部分を含む(重ねて、これらは任意に1つ以上の置換基で置換されている)。
本明細書で用いられるとき、「脂環式化合物」という用語は、脂肪族化合物と環式化合物の性質兼ね備えた化合物を指し、限定はしないが、環式あるいは多環式脂肪族炭水化物と、架橋シクロアルキル化合物を包含する(これらは、任意に1つ以上の置換基で置換されている)。当業者であれば理解されるように、本明細書で用いられるとき、「脂環式化合物」は、限定はしないが、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキニルの各部分を含む(任意に、1つ以上の置換基で置換されている)。例示的な脂環式化合物として、限定はしないが、例えばシクロプロピル、−CH2−シクロプロピル、シクロブチル、−CH2−シクロブチル、シクロペンチル、−CH2−シクロペンチル−n、シクロヘキシル、−CH2−シクロヘキシル、シクロヘキセニルエチル、シクロヘキサニルエチル、ノルボルビル(norborbyl)の各部分を含む(重ねて、これらは任意に1つ以上の置換基で置換されている)。
「ヘテロ脂肪族化合物」
本明細書で用いられるとき、ヘテロ脂肪族化合物という用語は、主鎖の1つ以上の炭素原子がヘテロ原子で置換されている脂肪族部分を意味する。従って、ヘテロ脂肪族化合物は、例えば炭素原子の場所に、1つ以上の酸素、硫黄、窒素、リン、シリコンの原子を含む脂肪鎖を意味する。ヘテロ脂肪族部分は、飽和あるいは不飽和、分岐あるいは直鎖(即ち非分岐)、置換あるいは非置換のいずれともし得る。置換基には、限定はしないが、先述した任意の置換基、即ち安定した化合物を形成する上記の置換基、が包含される。
本明細書で用いられるとき、ヘテロ脂肪族化合物という用語は、主鎖の1つ以上の炭素原子がヘテロ原子で置換されている脂肪族部分を意味する。従って、ヘテロ脂肪族化合物は、例えば炭素原子の場所に、1つ以上の酸素、硫黄、窒素、リン、シリコンの原子を含む脂肪鎖を意味する。ヘテロ脂肪族部分は、飽和あるいは不飽和、分岐あるいは直鎖(即ち非分岐)、置換あるいは非置換のいずれともし得る。置換基には、限定はしないが、先述した任意の置換基、即ち安定した化合物を形成する上記の置換基、が包含される。
「ヘテロ脂環式化合物」
本明細書で用いられるとき、ヘテロ脂環式化合物という用語は、ヘテロ脂肪族化合物と環式化合物の性質を兼ね備えた化合物を意味し、限定はしないが、例えばモルフォリノ、ピロリジニル、フラニル、チオフラニル、ピロリルなどの、飽和及び不飽和の、単環式あるいは多環式のヘテロ環が包含される(任意に、これらは1つ以上の官能基で置換されている)。置換基には、限定はしないが、上記の任意の置換基、即ち安定した化合物を形成する上記の置換基、が包含される。
本明細書で用いられるとき、ヘテロ脂環式化合物という用語は、ヘテロ脂肪族化合物と環式化合物の性質を兼ね備えた化合物を意味し、限定はしないが、例えばモルフォリノ、ピロリジニル、フラニル、チオフラニル、ピロリルなどの、飽和及び不飽和の、単環式あるいは多環式のヘテロ環が包含される(任意に、これらは1つ以上の官能基で置換されている)。置換基には、限定はしないが、上記の任意の置換基、即ち安定した化合物を形成する上記の置換基、が包含される。
「カルボジイミド」
本明細書で用いられるカルボジイミドという用語の意味は、当分野における当該用語の一般的な意味と本質的に異なるものではなく、R1−N=C=N−R2の構造を有する部分を意味し、ここでR1及びR2は、それぞれ独立して、置換あるいは非置換の、環式あるいは非環式の、直鎖あるいは分岐の、飽和あるいは不飽和の、脂肪族、脂環式、ヘテロ脂肪族、ヘテロ脂環式、アリール、あるいはヘテロアリールの部分である。
本明細書で用いられるカルボジイミドという用語の意味は、当分野における当該用語の一般的な意味と本質的に異なるものではなく、R1−N=C=N−R2の構造を有する部分を意味し、ここでR1及びR2は、それぞれ独立して、置換あるいは非置換の、環式あるいは非環式の、直鎖あるいは分岐の、飽和あるいは不飽和の、脂肪族、脂環式、ヘテロ脂肪族、ヘテロ脂環式、アリール、あるいはヘテロアリールの部分である。
「アリール」
本明細書で用いられるとき、アリールという用語は、概して、3〜14の炭素原子を有する安定な単環式あるいは多環式の不飽和部分を意味する(炭素原子の各々は、置換あるいは非置換のいずれともし得る)。置換基には、限定はしないが、上記任意の置換基、即ち安定な化合物を形成する上記の置換基、が包含される。アリールという用語は、1つあるいは2つの芳香環を有する単環又は二環の炭素環系を包含し、限定はしないが、フェニル、ナフチル、テトラヒドロナフチル、インダニル、インデニルなどが含まれる。
本明細書で用いられるとき、アリールという用語は、概して、3〜14の炭素原子を有する安定な単環式あるいは多環式の不飽和部分を意味する(炭素原子の各々は、置換あるいは非置換のいずれともし得る)。置換基には、限定はしないが、上記任意の置換基、即ち安定な化合物を形成する上記の置換基、が包含される。アリールという用語は、1つあるいは2つの芳香環を有する単環又は二環の炭素環系を包含し、限定はしないが、フェニル、ナフチル、テトラヒドロナフチル、インダニル、インデニルなどが含まれる。
「ヘテロアリール」
本明細書で用いられるとき、ヘテロアリールという用語は、環原子のうちの1つがS、O、Nから選択されている、5〜10の環原子を有する安定なヘテロ環又は多環式ヘテロ環の不飽和ラジカルを意味する。0、1つ、あるいは2つの環原子は、それぞれ独立して、S、O、Nから選択される追加のヘテロ原子であり、残りの環原子は炭素であり、ラジカルが任意の環原子を介して分子の残りの部分に結合している。該ラジカルには、例えば、ピリジル、ピラジニル、ピリミジニル、ピロリル、ピラゾリル、イミダゾリル、チアゾリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、チアジアゾリル、オキサジアゾリル、チオフェニル、フラニル、キノリニル、イソキノリニルなどがある。へテロアリール部分は、さらに、置換あるいは非置換のいずれともし得る。
本明細書で用いられるとき、ヘテロアリールという用語は、環原子のうちの1つがS、O、Nから選択されている、5〜10の環原子を有する安定なヘテロ環又は多環式ヘテロ環の不飽和ラジカルを意味する。0、1つ、あるいは2つの環原子は、それぞれ独立して、S、O、Nから選択される追加のヘテロ原子であり、残りの環原子は炭素であり、ラジカルが任意の環原子を介して分子の残りの部分に結合している。該ラジカルには、例えば、ピリジル、ピラジニル、ピリミジニル、ピロリル、ピラゾリル、イミダゾリル、チアゾリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、チアジアゾリル、オキサジアゾリル、チオフェニル、フラニル、キノリニル、イソキノリニルなどがある。へテロアリール部分は、さらに、置換あるいは非置換のいずれともし得る。
また、本明細書に定義されるように、アリールとヘテロアリール部分は、脂肪族化合物、脂環式化合物、ヘテロ脂肪族化合物、ヘテロ脂環式化合物のアルキル部分又はヘテロアルキル部分を介して結合していてもよく、従って、−(脂肪族)アリール、−(ヘテロ脂肪族)アリール、−(脂肪族)ヘテロアリール、−(ヘテロ脂肪族)ヘテロアリール、−(アルキル)アリール、−(ヘテロアルキル)アリール、−(ヘテロアルキル)アリール、−(ヘテロアルキル)ヘテロアリールの各部分を包含する。従って、本明細書では、「アリールあるいは(又は)ヘテロアリール」と「アリール、ヘテロアリール、−(脂肪族)アリール、−(ヘテロ脂肪族)アリール、−(脂肪族)ヘテロアリール、−(ヘテロ脂肪族)ヘテロアリール、−(アルキル)アリール、−(ヘテロアルキル)アリール、−(ヘテロアルキル)−アリール、−(ヘテロアルキル)へテロアリール」という用語は、相互に交換可能である。
「カルボキシ」
本明細書では、カルボキシルという用語は、化学式−CO2Hの基を意味する。
本明細書では、カルボキシルという用語は、化学式−CO2Hの基を意味する。
「アミド」
本明細書で用いられるアミドという用語は、当分野における当該用語の一般的な意味と実質的に異なるものではなく、C(O)NR1R2という構造の部分を意味する。ここで、R1及びR2は、それぞれ独立して、水素、又は置換あるいは非置換の、環式あるいは非環式の、直鎖あるいは分岐の、飽和あるいは不飽和の、脂肪族、脂環式、ヘテロ脂肪族、ヘテロ脂環式のアリールあるいはヘテロアリール部分、又はR1及びR2は一緒になって、置換あるいは非置換のヘテロ環部分あるいはヘテロアリール部分を形成する。
本明細書で用いられるアミドという用語は、当分野における当該用語の一般的な意味と実質的に異なるものではなく、C(O)NR1R2という構造の部分を意味する。ここで、R1及びR2は、それぞれ独立して、水素、又は置換あるいは非置換の、環式あるいは非環式の、直鎖あるいは分岐の、飽和あるいは不飽和の、脂肪族、脂環式、ヘテロ脂肪族、ヘテロ脂環式のアリールあるいはヘテロアリール部分、又はR1及びR2は一緒になって、置換あるいは非置換のヘテロ環部分あるいはヘテロアリール部分を形成する。
「カルボン酸エステル」
本明細書で用いられるカルボン酸エステルという用語は、当分野における当該用語の一般的な意味と実質的に異なるものではなく、−C(O)OR1の部分を意味する。ここで、R1は、置換あるいは非置換の、環式あるいは非環式の、直鎖あるいは分岐の、飽和あるいは不飽和の、脂肪族、脂環式、ヘテロ脂肪族、ヘテロ脂環式のアリールあるいはヘテロアリール部分である。
本明細書で用いられるカルボン酸エステルという用語は、当分野における当該用語の一般的な意味と実質的に異なるものではなく、−C(O)OR1の部分を意味する。ここで、R1は、置換あるいは非置換の、環式あるいは非環式の、直鎖あるいは分岐の、飽和あるいは不飽和の、脂肪族、脂環式、ヘテロ脂肪族、ヘテロ脂環式のアリールあるいはヘテロアリール部分である。
以下、本発明の一部の例示的な実施形態を詳細に記載し、説明する。本発明の特定の実施形態を例示のために示すが、それらによって本発明が限定されるものではないことを理解されたい。本発明の範囲から逸脱することなく、本発明の原理の特徴を種々の実施形態において実施し得る。
分子標的薬の開発及び合理的なドラッグ設計法においは、病気プロセスに因果関係を有する主要な細胞成分、例えばタンパク質など、を同定し、このような成分を治療処置を施す標的として用いる必要がある。しかしながら、タンパク質などの生体分子を分析する現在の方法では、時間がかかり費用も高く、検出、画像化、精製、分析が非効率的である。従って、本発明は、例えばプロテオミクス研究における、タンパク質の自動的な同定及び/又は一部に対するキャラクタリゼーションに対して、計り知れない可能性を有することは明らかである。
前述のように、複雑なサンプル内のタンパク質を同定しキャラクタリゼーションする現在の技術は、典型的に、2次元ゲル電気泳動(2DE)と質量分析(MS)との組み合わせに依存している。しかしながら、2DE固有の限界(複雑な混合物に関してはゲル分解能が限定されていることや、量の少ないタンパク質の検出(即ち定量化)が困難であること)によって、定量プロテオミクスの技術基盤の焦点はMSへと移行してきている。MSベースのプロテオミクスは、トリプシンなどの配列特異性プロテアーゼによってペプチドに消化されたタンパク質を分析することに依存している。所与のサンプル内のタンパク質の数が優に1万を超える可能性があることを考えると、酵素による消化によって、数十万という数のペプチドが生成するものと予想される。複雑性がこのレベルに達すると、分析プロセスに非常に負担がかかり、複雑な分析技術と、高度なコンピュータ支援技術を組み合わせて、時間のかかる分析を行うことが必要となる。
本発明はこの困難な問題に対処するために、タンパク質1つにつき、単一の(選択された)ペプチドをキャラクタリゼーションすることによって、プロテオームサンプル内のタンパク質の同定が可能な、簡単且つ非常に効率的な方法を提供する。これによって、サンプルの複雑性は劇的に低減する。さらに、本発明は種々のサンプルにおける、タンパク質の発現を定量化する方法も提供する。
サンプルの複雑性の低減
タンパク質サンプルの複雑性という問題に対処する方法が、最近、Footeらによって報告されている(例えば、米国特許出願第2002/0106700号を参照されたい)。簡単に言えば、Footeらは、所与のサンプル中のタンパク質をキャラクタリゼーションする方法を開示している。該方法は、タンパク質混合物を酵素で消化することで生じたペプチド混合物からC末端ペプチド及び/又はN末端ペプチドを分離し分析することを包含するものである。典型的に、該方法は、酵素を用いて複雑なタンパク質混合物をペプチド混合物へと消化するステップ、混合物内で末端ペプチドを非末端ペプチドから分離するステップ、例えば2Dカラム分離とMSを組み合わせるなどする従来の方法によって末端ペプチドをキャラクタリゼーションするステップを包含する。末端ペプチドのキャラクタリゼーションから得られた情報を、タンパク質キャラクタリゼーションデータを包含するデータベースと比較することで、所与の末端ペプチドを所与のタンパク質と相関させることができる。
タンパク質サンプルの複雑性という問題に対処する方法が、最近、Footeらによって報告されている(例えば、米国特許出願第2002/0106700号を参照されたい)。簡単に言えば、Footeらは、所与のサンプル中のタンパク質をキャラクタリゼーションする方法を開示している。該方法は、タンパク質混合物を酵素で消化することで生じたペプチド混合物からC末端ペプチド及び/又はN末端ペプチドを分離し分析することを包含するものである。典型的に、該方法は、酵素を用いて複雑なタンパク質混合物をペプチド混合物へと消化するステップ、混合物内で末端ペプチドを非末端ペプチドから分離するステップ、例えば2Dカラム分離とMSを組み合わせるなどする従来の方法によって末端ペプチドをキャラクタリゼーションするステップを包含する。末端ペプチドのキャラクタリゼーションから得られた情報を、タンパク質キャラクタリゼーションデータを包含するデータベースと比較することで、所与の末端ペプチドを所与のタンパク質と相関させることができる。
Footeらの方法の一形態では、トリプシン消化産物中の末端ペプチドを非末端ペプチドから分離するステップは、末端ペプチド及び非末端ペプチドの混合物を固定化されている無水トリプシン(即ち、触媒作用を示さない形態のトリプシンであり、C末端においてアルギニン残基あるいはレジン残基を有するペプチドに結合している)に接触させることを包含する。本法の制約の1つとして、全てのタンパク質を検出できるわけではないということが挙げられる。詳細には、C末端にリシンあるいはアルギニンを有するタンパク質の場合、対応するC末端ペプチドが非末端ペプチドと共に無水トリプシン支持材に固定化されたままなので現れない。C末端にアルギニンあるいはリシンを有するタンパク質のC末端ペプチドを分離しキャラクタリゼーションするためには、これらの残基部分で開裂しない酵素を用いる追加の実験が必要となる。他の制約として、無水トリプシンによる分離は、ペプチド混合物を生成するために、トリプシンを部位特異性プロテアーゼとして使用しなければならないことが挙げられる。無水トリプシンカラム分離は、アルギニン及び/又はリシン残基のカルボキシ基側を開裂しない他のプロテアーゼ(又は化学剤)を用いて実施する断片化から生じるペプチド混合物には適用できない。
Footeらの方法の別の形態では、非末端ペプチドをビオチン化し、続いて、アビジン、ステプタビジン(steptavidin)、あるいはストレプタビジン(streptavidin)アフィニティカラム上に固定化させることで、所望の末端ペプチドから非末端ペプチドを分離できる。あるいは又、サンプル内のタンパク質のN末端あるいはC末端をビオチン化し、断片化した後にN末端ペプチドあるいはC末端ペプチドをアビジン、ステプタビジン(steptavidin)、あるいはストレプタビジン(streptavidin)アフィニティカラム上で分離することができる。しかしながら、N末端あるいはC末端が元々保護されているタンパク質は、この代替方法では検出できない。それに加えて、ビオチン化反応は、N末端アミンあるいはC末端カルボキシに関して完全に選択的とはし得ず、側鎖のアミノ基あるいはカルボキシ基においてもビオチン化が起こり得る。さらに、ビオチン/アビジンあるいはストレプトアビジンの相互作用は100%の特異性を有しておらず、ビオチン/アビジンアフィニティクロマトグラフィを用いて末端ペプチドと非末端ペプチドとを完全に分離することはできない。即ち、末端ペプチドに非末端ペプチドが混ざる可能性がある。さらにビオチンは大きな官能基であり、分析段階(例えばMS)において判定に問題が起きる可能性がある。
本発明はこれらの制約に対処し、サンプル内の個々のタンパク質の同定を可能にすると共に、プロテオームサンプルの複雑性を低減させる新規で改善されたシステムを開示する。本発明の化学的方法は広い応用範囲を有し、自然に存在するタンパク質混合物あるいはペプチド混合物にも、組み換え法あるいは合成法から抽出されたタンパク質混合物あるいはペプチド混合物にも、適用可能である。
本システムによって、元のプロテオームサンプルの分析が、元のサンプル内のタンパク質1つにつき1つのペプチドの分析にまで簡易化される。ここで各ペプチドは、サンプル内に存在するタンパク質のN末端(又はC末端)から抽出されている。このペプチドと親タンパク質の1対1の化学量決定により、プロテオームサンプル内のタンパク質の簡単なキャラクタリゼーション及び/又は定量化(例えば細胞遺伝子の発現レベルの定量化)が可能になる。本発明の末端ペプチド選択法を周知の質量分析及びコンピュータ支援データベース検索システムと組み合わせれば、各タンパク質について生成された単一のN末端ペプチドあるいはC末端ペプチドをキャラクタリゼーションすることによって、サンプル内のタンパク質を同定することが可能になる。当分野で既知の方法を、各タンパク質に関して化学的手段又は酵素による手段で生成されたN末端ペプチドあるいはC末端ペプチドの配列から、サンプル内のタンパク質を同定することに応用できる。従って、本発明によって、分析ステップを1つのタンパク質につき単一のペプチドのキャラクタリゼーションにまで低減させことにより、複雑な混合物中の個々のタンパク質を同定する効率的なシステムがもたらされる。
N末端ペプチドあるいはC末端ペプチド選択法
一態様では、本発明は、プロテオームサンプルの複雑性を低減する方法を包含する。一部の実施形態では、本発明の方法は、(i)1つ以上のタンパク質を設けるステップ、(ii)タンパク質のN末端あるいはC末端を適切な保護剤で保護するステップ、(iii)末端の保護されたタンパク質を適切な開裂剤を用いて開裂し、末端の保護されたペプチドと、開裂部位に対応した遊離アミノ基及び遊離カルボキシ基を含む末端の保護されていないペプチドとの混合物を生成するステップ、(iv)末端の保護されたペプチドをペプチド混合物から分離し、サンプルの複雑性を、サンプルタンパク質1つにつき1つの末端ペプチドにまで低減させるステップ、を包含する。
一態様では、本発明は、プロテオームサンプルの複雑性を低減する方法を包含する。一部の実施形態では、本発明の方法は、(i)1つ以上のタンパク質を設けるステップ、(ii)タンパク質のN末端あるいはC末端を適切な保護剤で保護するステップ、(iii)末端の保護されたタンパク質を適切な開裂剤を用いて開裂し、末端の保護されたペプチドと、開裂部位に対応した遊離アミノ基及び遊離カルボキシ基を含む末端の保護されていないペプチドとの混合物を生成するステップ、(iv)末端の保護されたペプチドをペプチド混合物から分離し、サンプルの複雑性を、サンプルタンパク質1つにつき1つの末端ペプチドにまで低減させるステップ、を包含する。
一部の実施形態では、保護剤にはアフィニティラベルは包含されない。一部の他の実施形態では、末端の保護されたペプチドを混合物から分離するステップにおいて、アフィニティクロマトグラフィ(例えばビオチン/アビジンアフィニティクロマトグラフィ)は使用されない。
一部の実施形態では、タンパク質のN末端あるいはC末端を適切な保護剤を用いて保護するステップにおいて、保護剤には、放射性標識、蛍光性標識、比色分析標識、あるいは同位体標識が包含される。
一部の実施形態では、タンパク質のN末端あるいはC末端を適切な保護剤を用いて保護するステップにおいて、側鎖のアミノ基あるいはカルボキシ基も同時に保護される。一部の他の実施形態では、側鎖のアミノ基あるいはカルボキシ基は、適切な二次保護剤を用いて保護される。一部の例示的な実施形態では、本発明のN末端ペプチド選択法を使用する場合、リシン特異性プロテアーゼ(例えばトリプシンなど)によって(酵素による手段で)開裂されるというタンパク質の機能に影響を及ぼすことなく、タンパク質のN末端保護の前にタンパク質のリシン残基を好ましく且つ選択的に、適切な二次保護剤を用いて保護する。このような第2の保護剤の例として、限定はしないが、O−メチルイソ尿素あるいはO−メチルイミダゾール、及びこれらの化学的誘導体(例えば置換されたO−メチルイミダゾール)が挙げられる。当分野においては、これらの試薬をリシン残基と選択的に反応させてそれらを保護することで、遊離N末端アミノ基に影響を及ぼすことなく、トリプシンにより開裂可能であるリシンの保護されたタンパク質が生成することが知られている(例えば、Beardsleyらによる、「Enhancing the intensities of lysine−terminated tryptic peptide ions in matrix−assisted laser desorption/ionization spectrometry」,Rapid Commun.Mass Spectrom.,(2000)14,2147−2153、及びPetersらによる、「A novel multifunctional labeling agent for enhanced protein characterization with mass spectrometry」,Rapid Commun.Mass Spectrom.,(2001)15,2387−2392を参照されたい)。
一実施形態では、本発明の方法は、サンプル内のタンパク質1つにつき1つのN末端の保護されたペプチドをキャラクタリゼーションすることに依存し、当該方法は、(i)1つ以上のタンパク質を設けるステップ、(ii)タンパク質のN末端アミノ基を適切な保護剤を用いて保護するステップ、(iii)N末端の保護されたタンパク質を適切な開裂剤を用いて開裂し、N末端の保護されたペプチドと、開裂部位に対応した遊離アミノ基及び遊離カルボキシ基からなるN末端の保護されていないペプチドとの混合物を生成するステップ、(iv)N末端の保護されたペプチドをペプチド混合物から分離し、これによってサンプルの複雑性をサンプルタンパク質1つにつき1つのN末端ペプチドにまで低減させるステップ、を包含する。
別の実施形態では、本発明の方法は、サンプル内の各タンパク質について単一のC末端の保護されたペプチドをキャラクタリゼーションすることに依存し、該方法は、(i)1つ以上のタンパク質を設けるステップ、(ii)タンパク質のC末端カルボキシ基を適切な保護剤を用いて保護するステップ、(iii)C末端の保護されたタンパク質を適切な開裂剤を用いて開裂し、C末端の保護されたペプチドと、開裂部位に対応した遊離アミノ基及び遊離カルボキシ基からなるペプチドとの混合物を生成するステップ、(iv)C末端の保護されたペプチドをペプチド混合物から分離し、これによってサンプルの複雑性をサンプルタンパク質1つについて1つのC末端ペプチドにまで低減させるステップ、を包含する。
例示的な実施形態では、保護剤は選択的に十分な量で反応し、所与の反応条件及び実験条件において安定なN末端あるいはC末端の保護されたタンパク質を生成する。必ずではないが、好ましくは、容易に入手可能で、好ましくは他の官能基を攻撃しない非毒性の試薬によって、選択的に十分な量で除去され得る保護剤を選択する。必ずではないが、好ましくは、保護剤は、別の部位が反応することを避けるために、追加の官能基は最小量のみ含有する。
一部の例示的な実施形態では、保護剤はアミン保護剤である。適切なアミン保護剤の例を少数挙げると、限定はしないが、例えばカルバメート(少数の例を挙げれば、メチル、エチル、tert−ブチル(例えばBoc)、9−フルオレニルメチルカルバメート(例えばFmoc)がある)、アミド、環状イミド誘導体、N−アルキルアミン及びN−アリールアミン、イミン誘導体、エナミン誘導体の形成に導く保護剤がある。一部の例示的な実施形態では、保護剤は、無水酢酸、ジ−tert−ブチルジカーボネート(即ち、Boc無水物)、又は反応性遊離アミンと反応すると9−フルオレニルメチルカルバメートを生成する9−フルオレニルメチルカルボニル試薬(即ちFmoc試薬)である。本発明を実施するのに適したFmoc試薬の例として、限定はしないが、Fmoc−Cl、Fmoc−N3、Fmoc−OBt(Bt=ベンゾトリアゾール−1−イル)、Fmoc−OSu(Su=スクシンイミジル)、及びFmoc−OC6F5が挙げられる。
一部の実施形態では、保護剤はカルボキシ保護剤である。適切な保護剤の例を少数挙げると、限定はしないが、カルボン酸エステル(例えばメタノール、又は他の低脂肪族アルコールあるいは脂環式アルコール、ジアゾメタン、MeI、Me3SiCHN2、Me2C(OMe)2、CH3OCH2Cl、CH3SCH2Cl、ジヒドロピラン、CH3OCH2CH2OCH2Cl、PhCH2OCH2Cl、Me3SiCl、Et3SiCl、Me2PhSiCl)、アミド(例えばメチルアミン、エチルアミン、Me2NH、ピロリジン、ピペリジン)、及びヒドラジド(例えばフェニルヒドラジン)誘導体、の形成に導く保護剤がある。カルボン酸エステル誘導体の生成は、(i)良好な離脱基でカルボキシ基を活性化し、次いで適切な求核試薬で置換すること、又は(ii)ハロゲン化アルキルあるいはスルホネートでカルボキシ基を求核試薬で置換すること、を包含する。一部の例示的な実施形態では、保護剤はヨウ化メチルである。別の実施形態では、タンパク質のC末端の保護は、適切な保護剤との反応の前に、カルボジイミド活性化を包含する。例えば、カルボジイミドにより活性化されたカルボキシ基との反応に適した保護剤は、脂肪族アミンである。一部の実施形態では、脂肪族アミンは、メチルアミンあるいはエチルアミンである。
本発明は、本明細書に記載する保護剤に限定することを意図せず、種々の他の等価の保護基が、上記基準によって容易に特定され、本発明で使用され得ることを理解されたい。さらに、種々の保護基は「Protecting groups in Organic Synthesis」Third Ed.Greene、T.W. and Wuts,P.G.,Eds.,John Wiley & Sons,New York,(1999)に記載されており、参照することでその内容の全てを本明細書に取り入れることとする。
本発明の目的のために、開裂剤には、適切な条件下でタンパク質を2つ以上の断片に変換する任意の試薬が用いられる。好ましくは、開裂剤は、ポリペプチドの主鎖を開裂する試薬である。タンパク質の開裂から生成されるペプチドの大きさは、典型的に約1〜50のアミノ酸残基の範囲の長さであり、より好ましくはタンデム質量分析を使用したペプチドの配列決定が容易に実施される大きさである。より好ましくは、ペプチドは、約5〜50のアミノ酸残基の大きさを有する。最も好ましくは、ペプチドは、約5〜20のアミノ酸残基の大きさを有する。タンパク質は、例えば化学的な方法あるいは酵素を使用した方法、又はこれらの2つの組み合わせを包含する多くの方法によって、好ましい長さに容易に開裂させることができる。タンパク質を開裂するために使用できる代表的な化合物には、臭化シアン(CNBr)、2−ニトロ−5−チオシアノ安息香酸、N−ブロモスクシンアミド及び他の反応性ハロゲン化合物、ヒドロキシルアミン、1−2M ギ酸あるいは酢酸、過ヨウ素酸酸化、2−(2−ニトロフェニルスルフェニル)−3−メチル−3−ブロモインドレニン、あるいはo−ヨードソ安息香酸が含まれる。代表的な酵素として、例えばトリプシン、キモトリプシン、ペプシン、パパイン、プロリンエンドペプチダーゼ、ブドウ球菌(staph)プロテアーゼ、エラスターゼ、プロテアーゼK、AspN、Lys−C、Arg−C、Glu−Cが挙げられる。一部の例示的な実施形態では、開裂剤は酵素である。最も好ましくは、酵素は、トリプシン(タンパク質を多くのリシン及びアルギニンのC末端で開裂する)である。タンパク質は当分野で既知の任意の適切な方法を用いて消化することができる。当業者であれば、対象とするタンパク質サンプルに使用するのに適したタンパク質消化法を選択できるであろう。
1.固体支持材上に非末端ペプチドを固定化することによる、所望のN末端ペプチドあるいはC末端ペプチドの分離
一部の実施形態では、本発明の方法における分離ステップは、(i)末端の保護されていないペプチドを固体支持材上に選択的に固定化するステップ、(ii)固体支持材を適切な溶媒で洗浄するステップ、(ii)末端の保護されたペプチドを含有する溶媒部分を収集するステップ、を包含する。
一部の実施形態では、本発明の方法における分離ステップは、(i)末端の保護されていないペプチドを固体支持材上に選択的に固定化するステップ、(ii)固体支持材を適切な溶媒で洗浄するステップ、(ii)末端の保護されたペプチドを含有する溶媒部分を収集するステップ、を包含する。
例示的な実施形態では、N末端ペプチド選択法を用いる場合、反応性遊離アミノ基(即ちN末端の保護されていないペプチド)を含むペプチドを固体支持材上に直接的に固定化させるか又はリンカーを介して間接的に固定化させ、次いで固体支持材を適切な溶媒で洗浄し、所望のN末端の保護されたペプチドを含む溶媒部分を収集することによって、混合物からN末端の保護されたペプチドを分離する。
一実施形態では、固体支持材は、遊離アミノ基と共有結合を形成し得る反応基を含んでおり、それによって混合物中に存在するN末端の保護されていないペプチドが固定化し得る。従って、所望のN末端の保護されたペプチドは、N末端の保護されていないペプチドを固体支持材上に固定化させることによって混合物から分離される。
一部の他の実施形態では、C末端ペプチド選択法を使用する場合、遊離カルボキシ基を含むペプチドを固体支持材上に直接的に固定化させるか又はリンカーを介して間接的に固定させ、次いで固体支持材を適切な溶媒で洗浄し、所望のC末端の保護されたペプチドを含む溶媒部分を収集することによって、混合物からC末端の保護されたペプチドを分離する。一実施形態では、固体支持材は、ペプチドの遊離カルボキシ基と共有結合を形成し得る反応基を含む。
一実施形態では、固体支持材は、遊離カルボキシ基と共有結合を形成し得る反応基を含んでおり、それによって混合物中に存在するC末端の保護されていないペプチドが固定化し得る。必ずしも必要とはされないが、好ましくは、非C末端ペプチドの遊離カルボキシ基は、固体支持材上へ固定化前にカルボジイミド試薬を用いて活性化される。こうして、固体支持材上にC末端の保護されていないペプチドを固定化させることによって、所望のC末端の保護されたペプチドが混合物から分離される。
(例えば望ましくない非N末端ペプチドあるいは非C末端ペプチドを固定化させるための)遊離アミノ基あるいは遊離カルボキシ基と反応し得る反応基を含む種々の官能基化された固相材料が、化学製品供給業者から容易に入手できる。例えば、ノババイオケム社は、これらの基準を満たす広く様々な官能基化された樹脂を提供している。例えば、Br−、Cl−、カーボネート−、CHO−、CO2H−樹脂が、非N末端ペプチドを固定化させるために使用することができる。例示的な固相材料は、ジイソチオシアネート(DITC)によって修飾された固相表面である。あるいは又、NH2−、OH−、SH−樹脂が、非C末端ペプチドを固定化させるために使用できる。他の適切な固相材料は当業者には明らかであろう。当業者であれば、本発明を実施するために使用できる固相材料が、本明細書に記載するものに限定されないことが理解されよう。本発明の教示に一致する範囲で、当分野で入手可能な任意の固相材料を使用できる。
一部の実施形態では、非N末端ペプチドをさらに分析することが望ましい場合、適切な条件下で固体支持材から脱離させることができる。例えば、DITCで修飾された固体支持材を使用する場合、固体支持材を例えばトリフルオロ酢酸(TFA)、塩酸(HCl)、ヘプタフルオロブタン酸(HFBA)などの強力な無水酸に曝すことによって、非N末端ペプチドを固体支持材から脱離させる。
2.固体支持材上に固定化することによる、所望のN末端ペプチドあるいはC末端ペプチドの分離
一部の実施形態では、本発明の方法における分離ステップは、(i)末端の保護されたペプチドを固体支持材上に選択的に固定化するステップ、(ii)固体支持材を適切な溶媒で洗浄して、固体支持材上に共有結合していないペプチドを除去するステップ、(iii)末端の保護されたペプチドを固体支持材から脱離させるステップ、を包含する。
一部の実施形態では、本発明の方法における分離ステップは、(i)末端の保護されたペプチドを固体支持材上に選択的に固定化するステップ、(ii)固体支持材を適切な溶媒で洗浄して、固体支持材上に共有結合していないペプチドを除去するステップ、(iii)末端の保護されたペプチドを固体支持材から脱離させるステップ、を包含する。
別の実施形態では、対象とするサンプル内のタンパク質のN末端あるいはC末端を保護するために使用する保護基は、固体支持材と直接的に共有結合を形成するか、又はリンカーを介して間接的に共有結合を形成し得る(又は形成するようにされ得る)、反応基あるいは潜在的反応基を含む。従って、所望の末端の保護されたペプチドは、固体支持材上に固定化されることで分離され得る。望ましくないペプチドは適切な溶媒を用いて固体支持材から洗い流すことができ、末端の保護されたペプチドは固体支持材を適切な脱離剤に暴露することによって脱離させることができる。
好ましくは、N末端保護基あるいはC末端保護基を介する、末端の保護されたペプチドの固定化に関与する化学反応は、アミンあるいはカルボキシの化学反応を伴わない。従って遊離アミノ基及び遊離カルボキシ基は、一般に、固定化条件の影響を受けることはなく、及び/又は固体支持材反応基と共有結合を形成することもない。
タンパク質の同定
別の態様では、本発明はプロテオームサンプル内のタンパク質を同定する方法を包含する。一部の実施形態では、本発明の方法は、(i)1つ以上のタンパク質を設けるステップ、(ii)適切な保護剤を用いてタンパク質の末端アミノ基を保護するステップ、(iii)末端の保護されたタンパク質を適切な開裂剤を用いて開裂し、末端の保護されたペプチドと、開裂部位に対応する遊離アミノ基及び遊離カルボキシ基からなるペプチドとの混合物を生成するステップ、(iv)末端の保護されたペプチドをペプチド混合物から分離し、サンプルの複雑性を、サンプルタンパク質1つについて1つの末端ペプチドにまで低減させるステップ、(v)末端の保護されたペプチドを検出するステップ、を包含する。
別の態様では、本発明はプロテオームサンプル内のタンパク質を同定する方法を包含する。一部の実施形態では、本発明の方法は、(i)1つ以上のタンパク質を設けるステップ、(ii)適切な保護剤を用いてタンパク質の末端アミノ基を保護するステップ、(iii)末端の保護されたタンパク質を適切な開裂剤を用いて開裂し、末端の保護されたペプチドと、開裂部位に対応する遊離アミノ基及び遊離カルボキシ基からなるペプチドとの混合物を生成するステップ、(iv)末端の保護されたペプチドをペプチド混合物から分離し、サンプルの複雑性を、サンプルタンパク質1つについて1つの末端ペプチドにまで低減させるステップ、(v)末端の保護されたペプチドを検出するステップ、を包含する。
一部の実施形態では、ステップ(ii)〜(iv)は、上記のN末端ペプチドあるいはC末端ペプチド選択法に従って実施される。
一実施形態では、上記方法を質量分析技術と組み合わせて、N末端あるいはC末端の保護されたペプチドをキャラクタリゼーションし、N末端あるいはC末端の保護されたペプチドが抽出された元のサンプル内のタンパク質を同定する。一部の実施形態では、検出ステップにおいて、質量分析技術が使用される。一実施形態では、質量分析技術にタンデム質量分析技術が用いられ、末端の保護されたペプチドのMS断片化パターンを用いて、使用可能なデータベースをスクリーニングし、末端ペプチドのアミノ酸配列を決定する。一部の他の実施形態では、アミノ酸配列情報を使用してタンパク質データベースをスクリーニングし、末端ペプチドが抽出された元の親タンパク質を同定する。別の実施形態では、質量分析技術を、高圧液体クロマトグラフィ(HPLC)、ゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動(CE)などの分離技術と組み合わせて、N末端あるいはC末端の保護されたペプチドの混合物に対して分離ステップを実施した後にMS分析を実施する。
ペプチド固定化方法に関する一般的な留意点
一部の実施形態では、ペプチド(用いたペプチド分離法に応じて、末端ペプチドあるいは非末端ペプチドのいずれか)は、直接的に固体支持材に共有結合させるか(上記)又はリンカーを介して間接的に共有結合させることによって、化学的及び/又は酵素によるタンパク質開裂混合物から分離することができる。例えば、固体支持材を化学的に修飾した後に、対象とするペプチドを2つの反応基を含むリンカーと反応させて固定化させることができる。反応基のうちの1つは、固体支持材上に存在する反応基と共有結合を形成し得る反応基である。リンカー上の第2の反応基は、固定化すべきペプチド上に存在するあらかじめ決定された官能基と共有結合を形成し得る反応基である。あるいは又、ペプチドをリンカーと反応させた後に固体支持材上に固定化することもでき、この場合、リンカー上の残りの反応基が固体支持材表面上に存在する反応基と反応することで、ペプチドリンカー結合産物が固体支持材上に固定化される。
一部の実施形態では、ペプチド(用いたペプチド分離法に応じて、末端ペプチドあるいは非末端ペプチドのいずれか)は、直接的に固体支持材に共有結合させるか(上記)又はリンカーを介して間接的に共有結合させることによって、化学的及び/又は酵素によるタンパク質開裂混合物から分離することができる。例えば、固体支持材を化学的に修飾した後に、対象とするペプチドを2つの反応基を含むリンカーと反応させて固定化させることができる。反応基のうちの1つは、固体支持材上に存在する反応基と共有結合を形成し得る反応基である。リンカー上の第2の反応基は、固定化すべきペプチド上に存在するあらかじめ決定された官能基と共有結合を形成し得る反応基である。あるいは又、ペプチドをリンカーと反応させた後に固体支持材上に固定化することもでき、この場合、リンカー上の残りの反応基が固体支持材表面上に存在する反応基と反応することで、ペプチドリンカー結合産物が固体支持材上に固定化される。
好ましくは、リンカー部分は実質的に化学的に不活性である(例えば、以後の化学反応に対し最小限にしか干渉しない)。さらに、リンカー部分が、分析すべき末端ペプチド内又は分析すべきペプチド溶液内に存在する場合には、リンカー部分は、タンデム質量分析法によるペプチドの質量スペクトル分析と配列決定にほとんど干渉しないのが好ましい。例えば、リンカー部分は、質量分析の間最小限にしかイオン化されないことが好ましく、ペプチドのような断片化が起こらないことが好ましい。リンカー部分が分析すべき末端ペプチド内に存在する場合には、ペプチドのイオン化をあまり抑制しないのが好ましい。さらに、リンカーは、リンカーを含むペプチドのイオン化を促進する官能基あるいは部分を含むことが好ましい。イオン化を促進するために適する官能基の例として、酸性基(例えばCOOH)、塩基性基(例えばアミノ基)、あるいは荷電基(例えばアンモニウム基あるいはホスホニウム基)が挙げられる。例示的な実施形態では、リンカー部分は、化学的、光化学的、酵素的に開裂可能である。感光リンカーは当分野において周知であり、例えば、o−ニトロベンジル部を含むリンカーなどが含まれる(例えば、www.innovachem.com/Reference.htmを参照のこと)。また、Garigipatiらによる米国特許第6、075、166号、「Photolytically cleavable encoding and linking agents for use in combinatorial chemistry」を参照されたい。開裂可能リンカーには又、ジスルフィド結合及び酸性あるいは塩基性の置換活性(labile)基(少数例を挙げると、シリルエーテル、カルバメート、チオエステルなど)を有する部分が含まれる。酵素で開裂可能なリンカーの例に関しては、Leblらによる米国特許第6、090、912号、「Topologically segregated, encoded solid phase libraries comprising linkers having an enzymatically susceptible bond」を参照されたい。
固体支持材上に(末端ペプチドあるいは非末端ペプチドを)固定化することによって所望のN末端ペプチドあるいはC末端ペプチドを分離する一部の実施形態では、結合していないペプチドを固体支持材表面から洗浄することが望ましい。ペプチドを固体支持材上に固定化している結合部と両立でき、結合したペプチドを固体支持材から脱離させないような洗浄溶媒を選択することが好ましい。また、結合したペプチドと固相表面との間の結合部は、種々の溶媒による広範囲で複数の洗浄に耐え、結合したペプチドを固体支持材からほとんど又は全く「流出しない」ことが好ましい(例えば、ペプチドと固体支持材との結合部は、多数の溶媒洗浄に対して実質的に安定している)。当業者であれば、非末端ペプチドと固体支持材との間の結合部の化学的な性質に応じて、適切な溶媒を選択する方法を理解し得るであろう。
一部の実施形態では、結合したペプチドを固体支持材から脱離させることが好ましく、ペプチドの脱離は適切な脱離剤を用いて実施する。脱離剤は、ペプチドと固体支持材との間の結合部の化学的な性質に依存して選択される。必ずしも必要とはされないが、ペプチドを固体支持材から効果的に脱離させるために用いる脱離剤及び/又は条件は、固体支持材から脱離されたときに保持されるペプチドへの修飾が、タンデム質量分析によるペプチドの質量スペクトル分析と配列決定にほとんど干渉しないように選択されることが好ましい。一部の実施形態では、ペプチドを固体支持材から脱離させるために用いる脱離剤及び/又は条件は、固体支持剤から脱離したときに保持されるペプチドへの修飾が、ペプチドのイオン化を促進するように選択されている。適切な修飾の例は、本明細書にて説明されており、当業者であれば容易に理解し得るであろう。
例えば、ペプチドが固体支持材に共有結合している末端ペプチドである場合、必ずしも必要とはされないが、N末端あるいはC末端保護基がペプチド上に保持されるように末端ペプチドを固体支持材から脱離するような脱離剤を選択するのが好ましい。あるいは又、脱離剤は、固体支持材から末端ペプチドを脱離させ、同時に、所望のペプチドの末端において保護基を除去する。同様に、末端ペプチドがリンカーを介して間接的に共有結合して固体支持材上に固定化されている場合は、末端の保護基とリンカーが両方ともペプチド上に保持されるように末端ペプチドを固体支持材から脱離する脱離剤を選択することができる。あるいは又、末端保護基だけがペプチド上に保持されるように固体支持材から末端ペプチドを脱離する脱離剤を選択することができる(リンカー部分はペプチドから開裂される)。あるいは又、末端ペプチドを固体支持材から脱離させ、同時に、所望のペプチドの末端における保護基を(従ってリンカーも)除去するような脱離剤を選択することもできる。当業者であれば、所望の開裂反応を実施する脱離剤を選択する方法を理解し得るであろう。
末端の保護されたペプチドを末端の保護されていないペプチドから分離するという特定の目的のために実施するペプチドの化学変化は、分離プロセスに関わる化学反応と両立していることが好ましい。例えば、N末端の保護されたペプチドを、対応するN末端の保護されていないペプチドを固定化することによって分離しようとする場合、直接的に又はリンカーを介して間接的に固体支持材上に固定化するために非N末端ペプチドの遊離アミノ基で起きる化学変化は、所望のN末端ペプチドのN末端保護基と両立し、これを変化させることはない。必ずしも必要とはされないが、直接的に又はリンカーを介して間接的に固体支持材上に固定化するために非N末端ペプチドの反応性遊離アミノ基で起きる化学変化は、所望のN末端ペプチドのC末端における遊離カルボキシ基と両立し、これを変化させないことが好ましい。あるいは又、混合物内のペプチドの遊離C末端カルボキシ部分は、望ましくないペプチドの遊離アミノ基を変化させる前に適切な保護剤を用いて保護することもできるし、又は望ましくないペプチドの反応性遊離アミノ基を変化させた後で且つ望ましくない非N末端ペプチドを固体支持材上に固定化する前に、適切な保護剤を用いて保護することもできる。本明細書で参照するように、種々のアミノ保護基及びカルボキシ保護基が当分野にて既知であり、本発明の実施を欲する者には明らかであろう。好ましくは、サンプル混合物からの分離の前、分離中、あるいは分離後に所望のN末端ペプチドあるいはC末端ペプチドが受ける化学変化は、タンデム質量分析によるペプチドの質量スペクトル分析と配列決定にほとんど影響を及ぼさない。
当業者であれば、対象とするプロテオームサンプルの化学的又は酵素による断片化から得られたペプチド混合物からN末端(又はC末端)ペプチドを分離するために使用する方法が、本明細書に記した方法に限定されないことを理解し得るであろう。断片化された混合物から所望の末端ペプチドを分離するのに適した、任意の適切な使用可能な技術を使用することができる。
質量分析法
一実施形態では、上記のN末端ペプチド選択法あるいはC末端ペプチド選択法と質量分析技術を組み合わせて、N末端あるいはC末端の保護されたペプチドをキャラクタリゼーションし、N末端あるいはC末端の保護されたペプチドが抽出された元のサンプル内のタンパク質を同定する。単離されたペプチドは元のサンプル内に存在するタンパク質の特徴を示す。詳細には、タンデムMS技術を用いることで、単離されたペプチドの配列を決定することができ、当業界で既知の配列データベース検索技術を適用することにより、配列が決定されたペプチドの元となったタンパク質を同定することができる。
一実施形態では、上記のN末端ペプチド選択法あるいはC末端ペプチド選択法と質量分析技術を組み合わせて、N末端あるいはC末端の保護されたペプチドをキャラクタリゼーションし、N末端あるいはC末端の保護されたペプチドが抽出された元のサンプル内のタンパク質を同定する。単離されたペプチドは元のサンプル内に存在するタンパク質の特徴を示す。詳細には、タンデムMS技術を用いることで、単離されたペプチドの配列を決定することができ、当業界で既知の配列データベース検索技術を適用することにより、配列が決定されたペプチドの元となったタンパク質を同定することができる。
本発明に関連する最新技術をより十分に説明するために、以下、タンパク質の同定及びプロテオーム解析への質量分析の応用に関して参照する。Akhilesh P.らによる、「Proteomics to study genes and genomes」,Nature,(2000)405,837−846;Dutt M.J.らによる、「Proteomics analysis」、Curr Opin Biotechnol.,(2000)11,176−179;Gygi SPらによる、「Mass spectrometry and proteomics」,Curr Opin Chem Biol.,(2000)4(5),489−494;Gygi SPら、Goodlett DRらによる、「Protein identification with a single accurate mass of a cysteine−containing peptide and constrained database searching」,Anal Chem.,(2000)72(6),1112−1118;Anderson N.L.らによる、「Proteomics applications in basic and applied biology」,Curr Opin Biotechnol.,(2000)11,408−412;Littleらによる米国特許第6、322、970号。これらの参考文献の各々は、参照することで、本出願の開示と矛盾しない範囲で、その内容を本明細書に取り入れることとする。
適切な質量分析技術には、限定はしないが、マトリックス支援レーザ脱離イオン化飛行時間型質量分析(MALDI−TOF MS)あるいはエレクトロスプレーイオン化質量分析(ESI MS)が含まれる。例えば、Patterson & Aebersold,「Electrophoresis」,(1995)16,1791−1814、及びFigeysらによる、Anal.chem.,(1996)68,1822−1828を参照されたい。マトリックス支援レーザ脱離イオン化(MALDI)飛行時間型質量分析計(TOF)は、比較的広い質量範囲、高い分解能(質量5000において10000)及びサンプリングレート(最高で1サンプル/秒)を示すため、ペプチド同定に大きな可能性が見込まれる。一態様において、MALDIは、大きな質量の生体分子を容易にイオン化し分析できるという点で、ESIやFABと比べて利点をもたらし得る。さらに、ESIとは対照的に、MALDIは主に一価の化学種を生成する。一実施形態では、タンパク質サンプルから生成されたN末端ペプチドあるいはC末端ペプチドは、当分野において既知の方法によって、MALDI−TOF MSを用いて分析する。これには、典型的に、使用される特定の波長で入力光を強力に吸収する物質を用いて膜上にマトリックスを形成することが包含される。MALDI質量分析計では、サンプルはUVあるいはIRレーザ光で励起されて気相になる。気化によりイオンが生成されイオン流を形成する。イオンは電界中で加速され、所与の距離に沿ってそれらが移動した時間に応じて分離され、非常に感度の高い質量/電荷(m/z)測定値が得られる。
本発明の教示に従って使用される保護剤は、タンデム質量分析によるペプチドの質量スペクトル分析及び配列決定にほとんど影響を及ぼさないように選択することが好ましい。必ずしも必要ではないが、好ましくは、分析に望ましい特徴を賦与するような保護剤を選択する。このような特徴の例として、ペプチドを揮発させるために必要なレーザエネルギーを下げること、イオン化を促進すること、主に一価のイオンを生成すること、ピーク幅を低減すること、所望の分析産物の感度及び/又は選択性を高めること、が含まれる。保護基を固体支持材に直接的に又はリンカーを介して間接的に共有結合させることによって固体支持材上に固定化して、本発明の所望のN末端あるいはC末端を分離する場合、当該方法で用いられる保護剤に関しては、固体支持材から脱離されたときに保持されるペプチドへの修飾が、タンデム質量分析によるペプチドの質量スペクトル分析及び配列決定にほとんど干渉しない保護剤を選択することが好ましい。
ペプチドのMS分析の興味深い特徴は、対象とする特定のペプチドに関して種々のタイプの構造情報をもたらす機能である。例えば、質量分析計は、特定のペプチドの質量に関する情報を容易に提供でき、また、ポストソース分解あるいは衝突誘起解離のいずれかによって得られるタンデム質量スペクトルからアミノ酸配列情報をデノボ生成するためにも使用できる。例えば、Endらによる、「An Approach to Correlate Tandem Mass Spectral Data of Peptides with Amino Acid Sequences in a Protein Database」,J.Am.Soc.Mass Spectrom.,(1994)5,976−989;Swiderek K.らによる、「The identification of peptide modifications derived from gel−separated proteins using electrospray triple quadrupole and ion trap analyses」,Electrophoresis,(1998)19,989−997;Keough T.らによる、「A method for high−sensitivity peptide sequencing using postsource decay matrix−assisted laser desorption ionization mass spectrometry」,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,(1999)96,7131−7136を参照されたい。例えば、ペプチド配列決定は、ペプチドの分子量をMSによって正確に決定するコンピュータ支援配列決定技術を用いて実施することもできる。コンピュータを使用して、ペプチドの測定された質量の合計と分子量の一致するアミノ酸の全ての可能な組み合わせを決定する(ペプチド結合を形成する際に失われる水に関するパラメータ、プロトン付加に関するパラメータ、アミノ酸質量の測定値を変えるその他の要因、又は他の方法でアミノ酸の可能な組み合わせを制約する要因も考慮することができる)。アミノ酸の全ての許容される線形の、長さに関する順列についてのライブラリが生成される。次いでアルゴリズムにより、許容される順列のライブラリの各メンバーに関して理論的な断片化スペクトルを計算し、これらを質量分析法で得られた未知のペプチドの実験により得られた断片化スペクトルと比較することができる。実験による断片化パターンと最も一致する理論的な断片化スペクトルから、未知のペプチドのアミノ酸配列が明らかされる。
一実施形態では、質量分析技術にタンデム質量分析を用い、N末端あるいはC末端の保護されたペプチドのアミノ酸配列を決定する。典型的には、タンデム質量分析計に導入する任意の所与のペプチドを選択し、衝突誘起解離(CID)を実施する。この結果生じた断片イオンのスペクトルは、いわゆるCIDスペクトルとして第二段階の質量分析において記録される。このプロセスをサンプル内に存在する他のペプチド(理想的には全てのペプチド)に対して繰り返し実施する。CIDプロセスは、通常、ペプチド結合部において断片化を起こし、種々のアミノ酸はたいてい異なる質量のピークをもたらすので、CDIスペクトルだけでもペプチド配列を決定するのに十分な情報が提供される。あるいは又、ペプチドを分離し精製し、自動シーケンサ(配列を分析する機械)で配列を決定することもできる。ペプチドのアミノ酸配列を決定する前に、当業者に既知の多くの方法を用いて、ペプチドを精製することができる。代表的な例として、高圧液体クロマトグラフィ(HPLC)、逆相高圧液体クロマトグラフィ(RP−HPLC)、ゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動(CE)、又は他の適切なクロマトグラフィ技術が挙げられる。さらに、当分野では、自動シークェネータが知られている(例えばアプライドバイオシステムズ社のABI 470)。典型的には自動シーケンサは、アミノ酸を誘導体化し、ペプチドあるいはタンパク質のN末端側から連続して除去するエドマン分解法を実施する。アミノ酸誘導体は、次いでHPLC分離の後に同定され、タンパク質/ペプチドのアミノ酸配列が推定できる。この場合、ペプチドのN末端残基が保護されているとエドマン分解は進行しないので、自動配列決定の前に本発明のN末端の保護されたペプチドの保護を解除する。例示的な実施形態では、タンデム質量分析法を使用して、ペプチドのアミノ酸配列を決定する。
別の実施形態では、質量分析技術を、HPLC、RP−HPLC CE、ゲル電気泳動などの液体クロマトグラフィ技術と直接的に又は間接的に組み合わせて、MS分析の前にN末端あるいはC末端の保護されたペプチドをさらに分解することができる。これは特に分子量が同じ又は近接しているペプチドを分析するのに有効である。HPLC及びCEは、本発明を実施するための例示的なクロマトグラフィ方法である。CEは非常に大きな分解力を有するので(数百万の理論段での分解が証明されている)、CE分離における溶媒の流れは非常に遅く、電気浸透効果で誘起される。従って流れは溶媒のpHに依存する。さらに、分離に悪影響を与える任意の「壁」、即ち拡散効果を受けない。Aebersold R.H.の米国特許第5、240、859号;Clauserらによる、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,(1995)92,5072−5076;Ducretらによる、「Electrophoresis」,(1996)17,866−876;Gevaertらによる、「Electrophoresis」,(1996)17,918−924を参照されたい。
分離したN末端ペプチドあるいはC末端ペプチドのアミノ酸配列が実験によって決定されると、コンピュータプログラムを使用して使用可能なデータベースを検索し、アミノ酸配列を照合し、ペプチドを抽出した元のタンパク質を同定することができる。このタスクを行うことのできる種々の情報科学ツールが当分野にて既知である。例えば、インターネットでアクセス可能なプロテオームデータベースに関する貴重なリソースとして、http://www.expasy.ch/でオンラインで入手できるExpert Protein Analysis System(ExPASy)が挙げられる。タンパク質配列情報を包含するFASTA(ASCIIテキスト)フォーマットのいくつかのデータベースが、標準のウェブブラウザソフトウェアでワールドワイドウェブ(WWW)上でアクセス可能である。この中には、例えばSWISS−PROTデータベース(http://www.expasy.ch/sprot/)及びOWLデータベース(http://www.biochem.ucl.ac.uk/bsm/dbbrowser/OWL/OWL.html)が含まれる。他のタンパク質データベースには、インサイト ジェノミクス社のYeast Protein Database(YPD)、WormPD,HumanPSD,G−Protein Coupled Receptor Protein Database(GPCR−PD)などがある(http://www.incyte.com/sequence/proteome/index.shtmlを参照されたい)。
配列データベースには、タンパク質データベースを用いることも、核酸配列データベース用いることもできる。当業者であれば理解されるように、核酸配列データベースは標準の遺伝子コードを使用して検索し、シグネチャペプチドをエンコードする可能な限りの核酸配列を決定することができる。ヌクレオチドデータベースの例には、例えば、発現配列タグ(EST)データベース及び生のゲノム配列データベースが含まれる。例えば、アミノ酸配列を逆翻訳してcDNAプローブを生成することができる。次いで、このプローブを用いて、cDNAライブラリをスクリーニングし、その結果得られたcDNAクローンを用いてゲノムライブラリをスクリーニングし得る。次いで、配列分析によって、そのタンパク質をエンコードする遺伝子を同定することができる。遺伝子の素性は、遺伝子のイントロン−エクソン構造を決定し、エクソンをベクター内にクローニングして、インビトロで転写/翻訳し、タンパク質を発現させることによって確認することもできるし、又はインビボでタンパク質を発現させることによっても確認できる。次いで、発現したタンパク質を本発明の方法によって分析し、この結果を未知のタンパク質について得られた結果と比較する。発現したタンパク質と元のタンパク質との間の分析結果が実質的に同じであれば、この遺伝子が元のタンパク質をエンコードしていたことが確認される。これらの全ての操作に関する手順はよく確立されており、当業者に周知であり、及び/又は本明細書に記載されている。当業者であれば、タンパク質が得られた種を考慮することで、cDNAプローブを、適切な種において好まれるコドン(例えばタンパク質がヒトタンパク質の場合、ヒトにおいて好まれるコドン)だけを含むように設計し得ることが理解されるであろう。ヌクレオチド配列データベースは発現配列タグ(EST、発現した遺伝子及び遺伝子断片に対応する)に関する配列を包含する。全米バイオテクノロジー情報センターにおけるESTdb(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/dbEST/index.html)などのEST配列データベースは、タンパク質配列データベースと同じ方法でアクセス可能である。データベース検索は、SEQUEST(ワシントン州シアトルにあるワシントン大学の商標登録)などのコンピュータ支援データベース検索プログラムで実施し得る。例えば、McCormack A.L.らによる、「Direct Analysis and Identification of Proteins in Mixtures by IC/MS/MS and Database Searching at the Low−Femtomole Level」,Anal.Chem.,(1996)69,767−776;Eng,J.K.らによる、「An Approach to Correlate Tandem Mass Spectral Data of Peptides with Amino Acid Sequences in a Protein Database」,J.Amer.Soc.Mass.Spectrom.,(1994)5,976−989;Yates IIIらによる米国特許第5、538、897号;AebersoldらによるWO 01/96869号を参照されたい。例えば、このようなプログラムを操作して、全ての既知のゲノム配列情報を取得し、理論上可能な全てのCIDスペクトルを計算し、これらを実験で得られたCIDスペクトルを比較して、照合及び配列同定を実施することができる。さらに、一部の既知の情報(例えばC末端、グルタミン酸、アスパラギン酸、任意の他の酸性基に対する質量修飾、及びリン酸化あるいは他の翻訳後修飾による質量変化)をコンピュータ分析の際に考慮することもできる。
当業者であれば理解し得るように、本方法の利点は多く、その中には、簡便であること、時間及びコスト効率が良いこと、が含まれる。本発明の重要な特徴は、現在当分野で使用されている方法と比較して、サンプルの複雑性を劇的に低減し得ることである。分析ステップは、元のサンプル内のタンパク質1つにつき1つのペプチドのキャラクタリゼーションにまで低減される。さらに、元のタンパク質におけるターゲットペプチドの位置が本質的に既知である。即ち、N末端ペプチド選択法あるいはC末端ペプチド選択法のどちらが使用されているかに依存して、N末端あるいはC末端のどちらかである。タンパク質が既知であり、該タンパク質の構造に関する情報がコンピュータで検索可能なデータベースにて入手可能でありさえすれば、ペプチドのアミノ酸配列及び当該ペプチドが抽出された元のタンパク質内での当該ペプチドの位置が分かっているため、非常に確実にタンパク質を同定することができる。さらに本法は、高価ではない試薬及び周知の化学反応を使用し得る。また本法は、ジスルフィド結合の低減及びシステインのアルキル化を両立する。さらに、翻訳後修飾による混合物の複雑性(末端ペプチド以外)も低減され、分析及びキャラクタリゼーションプロセスを簡易化し得る。さらに、もともとN末端あるいはC末端が保護されているタンパク質も検出し得る。
一部の実施形態では、例えば、元のプロテオームサンプル内で、どのタンパク質のN末端(又はC末端)が保護されているかなどの、追加の情報ももたらし得る。最初のN末端(又はC末端)保護ステップにおいて、十分に選択された保護剤を使用することで、当該決定が可能となる。本発明の特定の保護基を有していないN末端(又はC末端)ペプチドは、元から保護されているはずである。これは、例えば放射性標識、比色分析標識、同位体標識化された標識、あるいは蛍光標識などの、検出可能な(及び独特の)標識を有するN末端(又はC末端)保護剤を選択することによって実施し得る。
別の実施形態では、タンパク質N末端における最初の10〜20の残基の配列は、一般に、(i)タンパク質分解熟成部位の特定、(ii)特異性cDNAを分離するためのオリゴヌクレオチドプローブの合成、(iii)データベース内のタンパク質の同定(上記)、(iv)DNA配列に対してタンパク質を並べること、を可能とするための十分な情報を提供する。質量分析の出現により、タンパク質末端におけるグリコシル化パターン、リン酸化、他の翻訳後修飾などの情報を入手することが可能になった。
さらに別の実施形態では、本発明はタンパク質のC末端の配列情報を提供できるので、タンパク質のC末端の完全性を確認するのに有用である。これは、特にバイオテクノロジーで重要な組み換えタンパク質(例えば食品業界、農業、医薬品業界の製品)に関してタンパク質発現の正確性を確立する際に、重要な品質管理の示唆を与える。C末端プロセシングは、タンパク質の構造及び作用に重大な影響を与え得る重要な翻訳後修飾として認識されている。従って本発明は、タンパク質プロセシングの障害に伴う病気及び/又は病気状態のみならず、C末端タンパク質の構造及びプロセシングメカニズムを見抜くのに役立つ。
さらに別の実施形態では、本発明の方法により、定量化も行うことができ、タンパク質発現の包括的な研究がもたらされる。
定量プロテオミクス
プロテオミクス分野における研究の重要な部分には、生体サンプルプロテオームのキャラクタリゼーションが包含される。例えば、時間に伴うプロテオームの変化を追跡すること(ダイナミック分析)、又はサンプル間におけるあるいはサンプル処理間におけるタンパク質の発現あるいは修飾の差異を同定することである。あるサンプル内に特定のタンパク質が存在するかあるいは相対的に多量に存在し、別のサンプル内には存在しないかあるいは相対的に少量しか存在しないということは、診断検査の基礎となりうるし、薬剤開発におけるターゲット同定にもつながる。種々の遺伝子背景、病気状態などのサンプルにおける、タンパク質発現を包括的に研究することにより、病気の発現に寄与する疑いのある多くの要因を評価し得る。例えば、特定の病気によって影響を受けたタンパク質(及びその経路)の同定を行うことで、より十分に薬物ターゲットを識別し得る。さらに、プロテオームを利用する薬物開発により、特定の表現型に対する薬物療法の適切さを評価する可能性をもたらす。このことは、薬物開発におけるプロテオミクスの重要性を強調し、プロテオームサンプル内のタンパク質を、安価に、高い信頼性で、効率的に定量化し得る分析方法の価値を明確に示すものである。
プロテオミクス分野における研究の重要な部分には、生体サンプルプロテオームのキャラクタリゼーションが包含される。例えば、時間に伴うプロテオームの変化を追跡すること(ダイナミック分析)、又はサンプル間におけるあるいはサンプル処理間におけるタンパク質の発現あるいは修飾の差異を同定することである。あるサンプル内に特定のタンパク質が存在するかあるいは相対的に多量に存在し、別のサンプル内には存在しないかあるいは相対的に少量しか存在しないということは、診断検査の基礎となりうるし、薬剤開発におけるターゲット同定にもつながる。種々の遺伝子背景、病気状態などのサンプルにおける、タンパク質発現を包括的に研究することにより、病気の発現に寄与する疑いのある多くの要因を評価し得る。例えば、特定の病気によって影響を受けたタンパク質(及びその経路)の同定を行うことで、より十分に薬物ターゲットを識別し得る。さらに、プロテオームを利用する薬物開発により、特定の表現型に対する薬物療法の適切さを評価する可能性をもたらす。このことは、薬物開発におけるプロテオミクスの重要性を強調し、プロテオームサンプル内のタンパク質を、安価に、高い信頼性で、効率的に定量化し得る分析方法の価値を明確に示すものである。
本明細書において論じたように、従来、定量プロテオミクスは、病気固有の機構でアップレギュレートあるいはダウンレギュレートされたタンパク質を、2次元ゲル電気泳動に依存して同定していた。最終目的は、差異をもって存在するタンパク質を診断マーカあるいは治療のターゲットとして利用することであった。しかしながら、この方法が抱える技術的問題により、この方法の応用範囲は著しく制約を受けている。このような制約を引き起こす原因として、(i)疎水性で大きなタンパク質が、通常2次元のゲルに入らないこと、(ii)ダイナミックレンジにより、特に、タンパク質補体の99%以上が血清アルブミン及び血清グロブリンからなる血清又は脳脊髄液などの体液内では、最も量の多いタンパク質以外は視覚化が困難であること、が挙げられる。
定量プロテオミクスを行う他の方法は、いわゆるタンパク質チップを用いる方法である。この場合、抗体などの種々の「おとり」タンパク質を、特別に処理された表面にアレイフォーマット固定化する(Wagnerらの米国特許第6、329、209号、及びLueking A.らによる、「Protein microarrays for gene expression and antibody screening」,Anal.Biochem.,(1999)270,103−111を参照のこと)。典型的には、対象とするサンプルに表面を曝し、関連する抗体と特異的に結合するタンパク質をチップ面に固定化する。例えば、タンパク質チップを、2つの異なる細胞状態から得た蛍光標識化されたタンパク質に曝す。細胞溶解物は、異なる蛍光標識を用いて標識化され混合されるため、それによって、色が、チップ上の抗体に結合しているタンパク質量の変化の読み取り値としての役割を果たす。しかしながら、この技術は、タンパク質の同定と定量化に際して、特異的且つ十分にキャラクタリゼーションされている抗体を入手できるか否かに依存しており、所与のサンプル内の全てのタンパク質に対して適応可能というわけではない。
最近、MSベースの定量プロテオーム解析が、同位体により記号化されたアフィニティタグ(ICAT)に基づいた技術などによって可能となった。Aebersoldらによる国際特許出願WO 01/96869号及びWO 00/11208号;Gygi S.P.らによる、「Quantitative analysis of protein mixtures using isotope coded affinity tags」,Nat.Biotechnol.,(1999)17,994−999を参照されたい。ICATは、同位体的に通常の又は重いICAT試薬を用いて、タンパク質に部位特異的に共有結合にて標識化することを包含し、以下に示すように典型的には、(1)システインに選択性を示すチオール反応基、(2)重水素化された状態及び同位体的に通常の形態において存在し、定量化の基礎を提供するエチレングリコールリンカー、(3)タグを付したペプチドを選択的に分離するためのアフィニティタグを与えるビオチン、を包含する。
従って、重い(d8)又は通常の(d0)同位体の試薬を用いて、システインを選択的にアルキル化することにより、安定な同位体が分離後に組み込まれる。種々のプロテオームサンプルからの2つのタンパク質混合物を混合し、トリプシン消化し、単量体アビジンアガロースカラムを通過させる(アビジンアフィニティクロマトグラフィ)。ICAT標識は、ビオチンタグを含むので、ICATを用いて標識化された(システインを含む)ペプチドを選択的に分離し分析することができる。質量分析とクロマトグラフィ技術(典型的には、マイクロキャピラリーLCエレクトロスプレーイオン化(ESI)−MS/MS)とを組み合わせてキャラクタリゼーションし定量を行う。共に溶離されるICAT標識化された対から得られるイオン強度比により定量化が可能となり、続くMS/MSスキャンによってタンパク質の同定が可能になる。
この方法により、タンパク質の定量化を実質的に容易に実施できるが、ICATには重大な制約がある。例えば、ICATは、システイン残基の特異的な標識化に依存しており、このシステインはほとんど(約93%)のタンパク質に存在するが、システイン残基を含まないタンパク質はこの方法では検出できない。従って、全てのタンパク質を検出できない。さらに、任意の所与のタンパク質はたいてい比較的少ないシステイン残基を含んでいるが、ICATは一部のタンパク質に関しては多数のペプチドを生成する可能性があり、実際に生成するので、分析プロセスを複雑にする可能性がある。従って、一部のタンパク質は何回も検出される。即ち、本発明とは対照的に、ICAT法では、親タンパクに対するペプチドが1:1で検出されるとは限らず、本発明で用いる1:1の化学量に基づく定量化という利点がない。さらに、ビオチン−アビジン結合は、サンプルマトリックスからの干渉を受け、アビジンアフィニティクロマトグラフィによる分離に悪影響を及ぼす可能性がある。また、アビジン/ビオチン結合は、100%の特異性を有しておらず、消化物をアフィニティクロマトグラフィによって分離した後に得られるサンプルは汚染物質を含む可能性があり、分析プロセスが複雑になる。
本発明は、当分野において既知の方法に関するいくつかの制約に対処し、種々のサンプル内のタンパク質の相対的な量を定量的に決定することを可能としながら、サンプルの複雑性を劇的に低減させる、非常に効率のよい方法を提供する(即ち、分析は、元のプロテオームサンプルタンパク質1つにつき1つのペプチドの分析にまで低減される)。
一態様では、本発明は第1の生体サンプルと第2の生体サンプルとの間で、タンパク質が差異をもって存在するか否か(例えば発現又は修飾が異なるかどうか)を決定するシステムを提供する。本発明のN末端ペプチドあるいはC末端ペプチド選択法を、ペプチドを区別して標識化する方法と組み合わせると、本発明を用いて種々のサンプル内のペプチドと対応するタンパク質の相対的な量を定量化することができる。一部の例示的な実施形態では、2つ以上のプロテオームサンプルのN末端(又はC末端)ペプチドに検出可能な標識を用いて区別して標識化し、この区別して標識化されているペプチドの相対的な量を、定量分析法を用いて測定する。
本明細書で言及する検出可能な標識は、当分野で使用可能な定量分析によって検出可能である任意の基、物質、部分を意味する。このような定量分析には、限定はしないが、質量分析、核磁気共鳴分析(NMR)、蛍光分光、UV−vis吸収分光、フーリエ変換赤外分光(FTIR)が含まれる。これら任意の方法に適する検出可能な標識の選択法は、当業者には理解されよう。好ましくは、各プロテオームサンプルは、種々の検出可能な標識を用いて、それぞれ独立して標識化される。任意選択的に、組み合わされたサンプル混合液の分析を行う前に分離ステップ実施し、混合液内に存在する区別して標識化されているペプチドを部分的に又は完全に分離する。本発明を実施するために適する分離技術の例として、HPLC、ゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動、及び他の適切なクロマトグラフィ技術が挙げられる。一実施形態では、区別して標識化されているサンプルを組み合わせ、区別して標識化されているN末端(又はC末端)ペプチドを分析して定量化することで、直接定量化できる。あるいは又、区別して標識化されているサンプルを個別に分析する。区別して標識化されている各ペプチド混合物内のN末端(又はC末端)ペプチドを、分析の前に各ペプチドサンプルに導入された基準物に対して定量化する。
一部の例示的な実施形態では、本発明のN末端(又はC末端)ペプチドは、区別して同位体標識化され、化学的に実質的に同一であるが質量によって区別可能なペプチドの対又は組を生成する。例えば、1つは同位体的に重く、もう1つは同位体的に軽い保護基の試薬対を、2つのサンプルを比較するために使用することができる。このとき、2つのサンプルのうち1つは、1つ以上の既知のタンパク質を既知量だけ含む基準サンプルとすることができる。例えば、末端ペプチド選択法で用いられる保護基上に存在し得る水素、窒素、酸素、硫黄原子のうちの任意の1つ以上の原子を、同位体的に安定な同位体(例えば、2H、13C、15N、17O、18O、34S)で置き換えることもできる。必ずしも必要とはされないが、区別した同位体標識は、N末端ペプチドの遊離カルボキシ基を介して本発明のペプチドに導入されることが好ましい。他の実施形態では、区別した同位体標識は、C末端ペプチドの遊離アミノ基を介して本発明のペプチドに導入される。
一実施形態では、上記の定量方法と質量分析技術とを組み合わせて、N末端あるいはC末端の保護されたペプチドをキャラクタリゼーションし、このN末端あるいはC末端の保護されたペプチドを抽出した元のサンプル内のタンパク質を同定する。適切な質量分析技術の例を上述したが、本発明の実施を欲する当業者であれば容易に理解されるであろう。一実施形態では、質量分析技術にタンデム質量分析技術を用い、N末端あるいはC末端の保護されたペプチドのアミノ酸配列を決定する。別の実施形態では、質量分析技術を、例えばHPLC、ゲル電気泳動、CEなどの分離技術と組み合わせ、N末端あるいはC末端の保護されたペプチドの混合物に対して、MS分析する前に分離ステップ実施する。例示的な一実施形態では、種々のサンプル内の検出可能な標識は区別して同位体標識化され、種々のサンプル内の区別して同位体標識化されている標識の相対的な量を比較することによって、種々のサンプル内のN末端あるいはC末端の保護されたペプチド(従ってタンパク質レベル)を定量的に比較する。
本発明に関連する最新技術をさらに詳細に説明するために、以下に、定量プロテオミクスへの質量分析技術の応用に関する参考文献を示す。Gygi S.P.らによる、「Measuring gene expression by quantitative proteome analysis」,Curr Opin Biotechnol.,(2000)11(4),396−401;Mann M.による,「Quantitative proteomics?」,Nature Biotechnology,(1999)17,954−955;Hutchensらによる米国特許第6、225、047号;Waldmanらによる米国特許出願第2001/0039016号。
当業者であれば、区別して同位体標識化されているペプチド間の質量の差が、選択された検出可能な標識における同位体の質量差と、ペプチドの電荷状態とに依存することが理解されよう(自然の同位体分布に基づいて、質量分析計自体で決定できる)。質量分析計をクロマトグラフィによる分離技術と組み合わせる場合、区別して標識化されているペプチド混合物に対して質量分析を行う前に分離ステップを実施する。同位体により関連づけられているペプチドは、MS電離箱に導入される際、クロマトグラフィユニット(例えばHPLC)から本質的に共に溶離する。各々のペプチドは区別して標識化されているので、所与のペプチドは多数のピーク(例えば、メチルアミン−(d0)及びメチルアミン−(d3)で区別して標識化されている2つのサンプルに関する二重ピーク)として表れる。MSスペクトルでは、ペプチド上に存在する通常の(d0)と重い(d3)標識との間の質量差に等しいm/zだけピークが分離する。例えば、メチルアミン−(d0)とメチルアミン−(d3)を用いて、各サンプル内のN末端の保護されたペプチドの遊離カルボキシ基を標識化すると、区別して同位体標識化されているサンプル内の同じペプチドに関して検出されるピークは3m/zユニットだけ分離する。区別して同位体標識化されているサンプル内の同じペプチドからの多数のピーク(例えば二重ピーク)の組におけるピークの相対強度は、種々のサンプル内の当該ペプチドの相対濃度を直接的に反映している。この定量化法の基礎となる原理は、同位体的に関連づけられているペプチドは化学的には同一であり、従って、完全に相互に内部標準を示しているということである。種々のサンプルから得られる区別して同位体標識化されているペプチドから質量分析計にて生成された信号強度は、これらのサンプル内に存在する各々のペプチド分子の相対量を正確に反映している。
遊離C末端(又は遊離N末端)における、N末端ペプチド(又はC末端ペプチド)の区別標識化
一部の実施形態では、本発明の定量法は、(i)各々が1つ以上のタンパク質を含む2つ以上のサンプルを設けるステップ、(ii)各サンプルにおいて、タンパク質のN末端あるいはC末端を適切な保護剤を用いて保護するステップ、(iii)各サンプルにおいて、末端の保護されたタンパク質を適切な開裂剤を用いて開裂し、各サンプルに関して、末端の保護されたペプチドと、開裂部位に対応する遊離アミノ基及び遊離カルボキシ基からなるペプチド混合物を生成するステップ、(iv)各サンプルに関して、末端の保護されたペプチドをペプチド混合物から分離し、それによって2つ以上のタンパク質サンプルの各々についてサンプルの複雑性を、サンプルタンパク質1つにつき1つの末端ペプチドにまで低減させるステップ、(v)各サンプルの末端の保護されたペプチドに、検出可能な標識を含む適切な試薬を用いて区別して標識化し、それによって区別して標識化されている末端ペプチドの2つ以上の組を生成するステップ、(v)区別して標識化されている末端の保護されたペプチドの相対レベルを測定するステップ、を包含する。
一部の実施形態では、本発明の定量法は、(i)各々が1つ以上のタンパク質を含む2つ以上のサンプルを設けるステップ、(ii)各サンプルにおいて、タンパク質のN末端あるいはC末端を適切な保護剤を用いて保護するステップ、(iii)各サンプルにおいて、末端の保護されたタンパク質を適切な開裂剤を用いて開裂し、各サンプルに関して、末端の保護されたペプチドと、開裂部位に対応する遊離アミノ基及び遊離カルボキシ基からなるペプチド混合物を生成するステップ、(iv)各サンプルに関して、末端の保護されたペプチドをペプチド混合物から分離し、それによって2つ以上のタンパク質サンプルの各々についてサンプルの複雑性を、サンプルタンパク質1つにつき1つの末端ペプチドにまで低減させるステップ、(v)各サンプルの末端の保護されたペプチドに、検出可能な標識を含む適切な試薬を用いて区別して標識化し、それによって区別して標識化されている末端ペプチドの2つ以上の組を生成するステップ、(v)区別して標識化されている末端の保護されたペプチドの相対レベルを測定するステップ、を包含する。
一実施形態では、本発明の定量方法は本明細書にて説明したN末端ペプチド選択法を用いており、該方法は、(i)各々が1つ以上のタンパク質を含む2つ以上のサンプルを設けるステップ、(ii)各サンプルにおいて、タンパク質のN末端アミノ基を適切な保護剤を用いて保護するステップ、(iii)各サンプルにおいて、N末端の保護されたタンパク質を適切な開裂剤を用いて開裂し、各サンプルについて、N末端の保護されたペプチドと、開裂部位に対応する遊離アミノ基及び遊離カルボキシ基からなるペプチドとの混合物を生成するステップ、(iv)各サンプルについて、N末端の保護されたペプチドをペプチド混合物から分離し、2つ以上のタンパク質サンプルの各々についてサンプルの複雑性を、サンプルタンパク質1つにつき1つのN末端ペプチドにまで低減させるステップ、(v)各サンプルのN末端の保護されたペプチドに、検出可能な標識を含む適切な試薬を用いて区別して標識化し、それによって区別して標識化されているN末端ペプチドの2つ以上の組を生成するステップ、(vi)区別して標識化されているN末端の保護されたペプチドの相対レベルを測定するステップ、を包含する。
さらに別の実施形態では、2つ以上のサンプル内のタンパク質レベルを定量的に比較する方法は、サンプルタンパク質のC末端ペプチドに依存して定量化しており、該方法は、(i)各々が1つ以上のタンパク質を含む2つ以上のサンプルを設けるステップ、(ii)各サンプルにおいて、タンパク質のC末端カルボキシ基を適切な保護剤を用いて保護するステップ、(iii)各サンプルにおいて、C末端の保護されたタンパク質を適切な開裂剤を用いて開裂し、各サンプルについて、C末端の保護されたペプチドと、開裂部位に対応する遊離アミノ基及び遊離カルボキシ基からなるペプチドとの混合物を生成するステップ、(iv)各サンプルについて、C末端の保護されたペプチドをペプチド混合物から分離し、それによって2つ以上のタンパク質サンプルの各々のサンプルの複雑性をサンプルタンパク質1つにつき1つのC末端ペプチドにまで低減させるステップ、(v)各サンプルのC末端の保護されたペプチドを区別して標識化し、区別して標識化されている2つ以上のC末端ペプチドの組を生成するステップ、(vi)区別して標識化されているC末端の保護されたペプチドの相対レベルを測定するステップ、を包含する。
上記三実施形態の代替形態においては、ステップ(iv)で形成される区別して標識化されている末端ペプチドの組を組み合わせた後に、区別して標識化されている末端の保護されたペプチドの相対レベルを測定する。
上記実施形態の各々におけるステップ(ii)〜(iv)は、本明細書にて説明したN末端ペプチドあるいはC末端ペプチド選択法に従って実施し得ることが理解されよう。従って、当業者であれば、サンプルタンパク質のN末端(又はC末端)を保護し開裂し、その結果生じるN末端(又はC末端)が保護されたペプチドを混合物から分離するための特定の出発物質、実験条件、一般的な方法を、本明細書に記載されたN末端(又はC末端)ペプチド選択法の教示から容易に理解し得る。
例示的な実施形態では、検出可能な標識を含む試薬にカルボキシ反応基が用いられ、十分な量で選択的に反応することで、予定される反応条件あるいは実験条件に対して安定なC末端の標識化されているペプチドが生成される。別の実施形態では、検出可能な標識を含む試薬にアミノ反応基が用いられ、十分な量で選択的に反応させることで、予想される反応条件あるいは実験条件に対して安定なN末端の標識化されているペプチドが生成される。
必ずしも必要とはされないが、標識化されている試薬は、別の部位の反応を避けるために他の官能基を最小限しか有していないことが好ましい。一部の実施形態では、標識化されている試薬はカルボキシ保護剤である。適切なカルボキシ保護剤の例は本明細書に説明されており、当業者には理解されよう。適切な保護剤の例を少数挙げると、カルボン酸エステル(例えばメタノール、又は他の低脂肪族アルコール、ジアゾメタン、MeI、Me3SiCHN2、Me2C(OMe)2、CH3OCH2Cl、CH3SCH2Cl、ジヒドロピラン、CH3OCH2CH2OCH2Cl、PhCH2OCH2Cl、Me3SiCl、Et3SiCl、Me2PhSiCl)、アミド(例えば、メチルアミン、エチルアミン、Me2NH、ピロリジン、ピペリジン)、ヒドラジド(例えば、フェニルヒドラジン)誘導体がある。好ましくは、カルボキシ保護剤は、脂肪族アミンである。例示的な実施形態では、遊離カルボキシ基の官能化には、適切な保護試薬(例えば、メチルアミンあるいはエチルアミンなどの脂肪族アミン)と反応させる前のカルボジイミド活性化が包含される。一部の実施形態では、標識化されている試薬は、アミン保護剤である。上記のように適切な保護基の例を少数挙げると、限定はしないが、カルバメート(少数例を挙げると、メチル、エチル、tert−ブチル(例えばBoc)、9−フルオレニルメチルカルバメート(例えばFmocなど))、アミド、環状イミド誘導体、N−アルキルアミン及びN−アリールアミン、イミン誘導体、エナミン誘導体がある。一部の例示的な実施形態では、保護剤は、無水酢酸、ジ−tert−ブチルジカーボネート(即ち、Boc無水物)、2−tert−ブチルオキシ−カルボニルアミノ−2−フェニルアセトニトリル(即ち、BOC−ON)、又は反応性遊離アミンと反応すると9−フルオレニルメトキシカルバメートを生成する9−フルオレニルメチルカルボニル試薬(即ちFmoc試薬)がある。
本発明は、本明細書に記載する保護剤に限定することを意図せず、種々の他の等価の保護基が、上記基準によって容易に特定され、本発明で使用され得ることを理解されたい。
一部の例示的な実施形態では、標識化されている試薬は、種々の同位体形態で入手可能であるか又は調製可能である。例えば、N末端ペプチド選択法を使用し、ペプチドのN末端遊離カルボキシ基において標識化しようとする場合、メチルアミン及びメチルアミン−(d3)(又はエチルアミン及びエチルアミン−(d5))を用いて、ペプチドを区別して標識化することができる。あるサンプルでは、適切な条件下でN末端ペプチド遊離カルボキシ基をメチルアミン−(d0)と反応させ、対応するアミドを生成することができる。他のサンプルでは、適切な条件下でN末端ペプチド遊離カルボキシ基をメチルアミン−(d3)と反応させ、対応する重水素アミドを生成することができる。好ましくは、アミドの形成は、カルボキシ基のカルボジイミド活性化を介して実施される。
C末端ペプチド選択法を使用し、ペプチドのC末端遊離アミノ基において標識化使用とする他の実施形態の場合、Boc無水物−(d0)及びBOC−ON−(d9)、又は無水酢酸−(d0)及び無水酢酸−(d6)を用いて、ペプチドを区別して標識化することができる。例えば、あるサンプルでは、適切な条件下でC末端ペプチドの遊離アミノ基をBOC−ON−(d0)と反応させ、対応するカルバメートを生成することができる。他のサンプルでは、適切な条件下でC末端ペプチドの遊離アミノ基をBOC−ON−(d9)と反応させ、対応する重水素カルバメートを生成することができる。さらに別の実施形態では、あるサンプルでは、適切な条件下でC末端ペプチドの遊離アミノ基を無水酢酸−(d0)と反応させ、対応するアミドを生成することができる。第2のサンプルでは、適切な条件下でC末端ペプチドの遊離アミノ基を無水酢酸−(d6)と反応させ、対応する重水素アミドを生成することができる。
本発明は、上記の区別して標識化されている保護剤に限定することを意図せず、種々の他の等価の保護基が、上記基準によって容易に特定され、本発明で使用され得ることを理解されたい。
タンパク質のN末端あるいはC末端の区別標識化
別の実施形態では、2つ以上のサンプル内のタンパク質レベルを定量的に比較する方法は、(i)各々が1つ以上のタンパク質を含む2つ以上のサンプルを設けるステップ、(ii)各サンプルのタンパク質のN末端あるいはC末端を、検出可能な標識を含む適切な保護剤で区別して標識化し、区別して標識化されている末端の保護されたタンパク質の2つ以上の組を生成するステップ、(iii)区別して標識化されている末端の保護されたタンパク質を適切な開裂剤を用いて開裂し、区別して標識化されている末端の保護されたペプチドと、開裂部位に対応する遊離アミノ基及び遊離カルボキシ基からなるペプチドの2つ以上の混合物を生成するステップ、(iv)2つ以上のペプチド混合物の各々について、区別して標識化されている末端の保護されたペプチドを、末端の保護されていないペプチドから分離し、サンプルの複雑性を、区別して標識化されているサンプルタンパク質1つにつき1つの区別して標識化されている末端ペプチドにまで効果的に低減させるステップ、(v)区別して標識化されている末端の保護されたペプチドの相対レベルを測定するステップ、を包含する。
別の実施形態では、2つ以上のサンプル内のタンパク質レベルを定量的に比較する方法は、(i)各々が1つ以上のタンパク質を含む2つ以上のサンプルを設けるステップ、(ii)各サンプルのタンパク質のN末端あるいはC末端を、検出可能な標識を含む適切な保護剤で区別して標識化し、区別して標識化されている末端の保護されたタンパク質の2つ以上の組を生成するステップ、(iii)区別して標識化されている末端の保護されたタンパク質を適切な開裂剤を用いて開裂し、区別して標識化されている末端の保護されたペプチドと、開裂部位に対応する遊離アミノ基及び遊離カルボキシ基からなるペプチドの2つ以上の混合物を生成するステップ、(iv)2つ以上のペプチド混合物の各々について、区別して標識化されている末端の保護されたペプチドを、末端の保護されていないペプチドから分離し、サンプルの複雑性を、区別して標識化されているサンプルタンパク質1つにつき1つの区別して標識化されている末端ペプチドにまで効果的に低減させるステップ、(v)区別して標識化されている末端の保護されたペプチドの相対レベルを測定するステップ、を包含する。
上記の実施形態の代替形態では、ステップ(ii)で形成される区別して標識化されている末端ペプチドの組を、区別して標識化されている末端の保護されたペプチドの相対レベルを測定する前の任意の時期に組み合わせることができる。
同じ実施形態の一部の例示的な代替形態では、ステップ(ii)で形成される、区別して標識化されている末端ペプチドの組を、開裂ステップの前に組み合わせており、該方法は、(i)各々が1つ以上のタンパク質を含む2つ以上のサンプルを設けるステップ、(ii)各サンプルのタンパク質のN末端あるいはC末端を、検出可能な標識を含む適切な保護剤を用いて区別して標識化し、区別して標識化されている末端の保護されたタンパク質の2つ以上の組を生成するステップ、(iii)区別して標識化されている末端の保護されたタンパク質の組を組み合わせるステップ、(iv)区別して標識化されている末端の保護されたタンパク質を適切な開裂剤を用いて開裂し、区別して標識化されている末端の保護されたペプチドと、開裂部位に対応する遊離アミノ基及び遊離カルボキシ基からなるペプチドとが組み合わされた混合物を生成するステップ、(v)区別して標識化されている末端の保護されたペプチドを、末端の保護されていないペプチドから分離し、サンプルの複雑性を、区別して標識化されているサンプルタンパク質1つにつき1つの区別して標識化されている末端ペプチドにまで低減させるステップ、(vi)区別して標識化されている末端の保護されたペプチドの相対レベルを測定するステップ、を包含する。
上記の実施形態及びその代替形態の各々において、区別して標識化されている末端の保護されたペプチドの相対的な量を測定する前に実施される全てのステップは、本明細書に記載したN末端ペプチドあるいはC末端ペプチド選択法に従って実施し得ることが理解されよう。従って当業者であれば、タンパク質のN末端あるいはC末端を保護し開裂し、その結果生成する末端の保護されたペプチドを混合物から分離するための特定の出発物資、実験条件、一般的な方法を、本明細書に記載した末端ペプチド選択法の教示から理解し得るであろう。
末端ペプチドの遊離末端の区別標識化、又はタンパク質末端の区別標識化(即ち、酵素による断片化あるいは化学的断片化の前)のいずれを用いても、各サンプル内の末端ペプチドあるいはタンパク質を区別して標識化するステップの後で且つ混合物内の標識化されているペプチドの相対レベルを測定する前における任意の時期に、プロテオームサンプルの組合せを実施することができる。これによって、(キャリブレーションカーブの作成を必要とする絶対定量化とは対照的に)、区別して標識化されているペプチドの対/組を同時に分析することができ、相対的な定量化が可能となる。好ましくは、タンパク質標識化法を使用する場合(例えば、酵素による開裂あるいは化学的な開裂の前に区別して標識化する場合)、タンパク質サンプルを区別して標識化するステップのすぐ後に、区別して標識化されているサンプルを組み合わせることができる。従って、区別して標識化されている末端の保護されたタンパク質を開裂するステップ、その結果生じる区別して標識化されているペプチドをペプチド混合物から分離するステップは、組み合わされたサンプルを用いて同時に実施することができる。
N末端ペプチド選択法を使用する例示的な実施形態では、保護剤にアミン反応基が用いられ、十分な量で反応させることで、予想される反応条件あるいは実験条件に対して安定な標識化されているN末端の保護されたタンパク質を生成する。C末端ペプチド選択法を使用する別の実施形態では、保護剤にカルボキシ反応基が用いられ、十分な量で反応させることで、予想される反応条件あるいは実験条件に対して安定な標識化されているC末端の保護されたタンパク質を生成する。必ずしも必要とはされないが、保護剤は別の部位が反応するのを避けるために、他の官能基を最小限しか有していないことが好ましい。
一部の実施形態では、保護剤にアミン保護基が用いられる。適切なアミン保護基の例は上記の通りであり、当業者には理解されよう。一部の例示的な実施形態では、保護剤は、無水酢酸、ジ−tert−ブチルジカーボネート(即ち、Boc無水物)、又は反応性遊離アミンと反応すると9−フルオレニルメトキシカルバメートを生成する9−フルオレニルメチルカルボニル試薬(即ちFmoc試薬)である。本発明を実施するために適するFmoc試薬の例として、限定はしないが、Fmoc−Cl、Fmoc−N3、Fmoc−OBt(Btはベンゾトリアゾール−l−イル)、Fmoc−OSu(Suはスクシンイミジル)、Fmoc−OC6F5が含まれる。他の実施形態では、保護剤にカルボキシ保護基が用いられる。適切なカルボキシ保護基の例は上記の通りであり、当業者には理解されよう。例示的な実施形態では、遊離カルボキシ基の官能化には、適切な保護剤(例えば、メチルアミンあるいはエチルアミンなどの脂肪族アミン)と反応させる前のカルボジイミド活性化が包含される。
本発明は、上記の保護剤に限定することを意図せず、種々の他の等価の保護基が、上記基準によって容易に特定され、本発明で使用され得ることを理解されたい。
他の例示的な実施形態では、(タンパク質のN末端あるいはC末端を標識化するための)保護剤は、質量分析においてペプチドを定量的に分析するために有用な同位体で区別した標識を含むように選択することができる。N末端ペプチド選択法を使用する場合は、好ましくは、保護剤はアミン保護剤であり、種々の形態のものが入手可能か又は調製可能である。N末端ペプチドを区別して同位体標識化するのに適するアミン保護基の例として、2−tert−ブチルオキシ−カルボニルアミノ−2−フェニルアセトニトリル−(d0)あるいは(d9)(即ち、BOC−ON−(d0)あるいは(d9))、塩化アセチル−(d0)あるいは(d3)、塩化ベンゾイル−(d0)あるいは(d5)が挙げられ、これらは全てアイソテック社(米国オハイオ州マイアミズバーグ)から入手可能であり、また無水酢酸−(d0)あるいは(d6)もアミン保護基の例として挙げることができる。例えば、あるサンプルでは、適切な条件下でタンパク質のN末端遊離アミノ基をBOC−ON−(d0)と反応させ、対応するカルバメートを生成することができる。他のサンプルでは、タンパク質のN末端遊離アミノ基を適切な条件下でBOC−ON−(d9)と反応させて、対応する重水素カルバメートを生成することができる。あるいは又、各サンプル内のタンパク質を、あるサンプルでは無水酢酸−(d0)を用いてN末端アミノ基を保護し、他のサンプルでは無水酢酸−(d6)を用いて保護することによって区別して標識化することができる。先述したように、N末端を標識化する前にタンパク質のリシン残基を選択的に保護することができる。リシンをO−メチルイソ尿素あるいはO−メチルイミダゾールなどの試薬で保護し、トリプシンで開裂可能なタンパク質サンプルを生成することができる。
C末端ペプチド選択法を使用する別の実施形態では、保護剤はカルボキシル保護剤であり、種々の同位体の形態のものが入手可能か又は調製可能である。C末端ペプチドを区別して同位体標識化するのに適するカルボキシ保護基の例は、通常の又は重い同位体形態で入手可能な脂肪族アミンあるいは脂環式アミンである(例えばメチルアミン(d0とd3)及びエチルアミン(d0とd5))。例えば、あるサンプルでは、タンパク質の遊離カルボキシ基を適切な条件下でメチルアミン−(d0)と反応させ、対応するアミドを生成することができる。他のサンプルでは、タンパク質の遊離カルボキシ基を適切な条件下でメチルアミン−(d3)と反応させ、対応する重水素アミドを生成することができる。好ましくは、アミドの形成は、カルボキシ基のカルボジイミド活性化によって達成される。
本発明は、本明細書に記載する区別して同位体標識化されている保護剤に限定することを意図するものではないことを理解されたい。本発明の実施を欲する当業者であれば、他の化学業者から入手可能な他の安定な同位体標識試薬が理解されよう。
一実施形態では、タンパク質末端(N末端あるいはC末端)を区別して標識化することによって、元のプロテオームサンプルにおいてどのタンパク質の末端が保護されているかに関する情報が得られる。例えば、タンパク質N末端の区別標識化を使用する場合、選択された検出可能な標識を含まないN末端ペプチドはもともと保護されているはずである。あるいは又、タンパク質のC末端の区別標識化を使用する場合、プロテオームサンプルを酵素によって又は化学的に開裂した結果生成する一部のC末端ペプチド上で、選択された検出可能な標識が存在しないことは、これらのペプチド(即ち対応する元のタンパク質)がもともと保護されていたということを示す。
好ましくは、固体支持材に直接固定化するか又はリンカーを介して間接的に固定化することによって、所望の末端ペプチドを混合物から分離する場合、実験の脱離条件は、標識化した末端保護基が開裂せずに、末端ペプチドが固体支持材から選択的に脱離するような条件である。例えば、タンパク質のN末端の区別標識化を使用する場合、所望のN末端ペプチドを適切な固体支持材上に固定化し(従って、ペプチド混合液の残部から分離する)、次いで支持材から脱離させることができる。固体支持材から脱離した後は、適切な検出可能な標識を含むN末端保護基がペプチド上に保持される。このような条件下では、N末端保護剤を用いてMS定量化のために区別して同位体標識化することができる。当分野では、種々の固体支持材上に固定化するために適する種々のアミノ保護基あるいはカルボキシ保護基が入手可能である。当業者であれば、固体支持材から末端ペプチドが脱離したときに、ペプチド末端において保護基を保持するような保護試薬、任意選択のリンカー、固体支持材、脱離条件を選択し得るであろう。
一般に、種々のタンパク質発現及び/又は修飾に関して定量的に分析するプロテオームサンプルの数に制限はない。一部の実施形態では、プロテオームサンプルの数は2〜100であり、好ましくは2〜25であり、さらに好ましくは2〜10である。例示的な実施形態では、定量的なプロテオーム分析には2つのサンプルが用いられる。
本発明の定量システムにより、条件あるいは細胞状態の変化によって差異をもって影響を受ける、サンプル内のタンパク質発現あるいは修飾を比較することが可能になる。このようなタンパク質は、変化した状態のマーカとして機能し、「薬理プロテオミクス」(例えば、タンパク質疾病マーカ及びタンパク質薬品ターゲットの同定、及び/又は薬理学的治療への反応に関するキャラクタリゼーション)の基礎をもたらす。一実施形態では、当該システムは、種々の遺伝的背景、元の組織、及び/又は発達段階の2つの異なる細胞間で、あるタンパク質が差異をもって存在しているか又は修飾されているか否かを決定し、当該細胞には、例えばバクテリア、酵母、植物、昆虫、及び哺乳類の細胞が含まれる。別の実施形態では、ある生体サンプルは健康な被験者から抽出され、他の生体サンプルは病気の被験者から抽出される。一実施形態では、ある生体サンプルを正常な細胞から抽出し、他の生体サンプルを、変化した細胞(例えば、癌細胞から抽出したものではないが、正常な細胞を実験室処理して生成された細胞)、又は病気のあるいは遺伝子操作された細胞(例えば、特定部位突然変異あるいは遺伝子ノックアウト実験から生成された細胞)から抽出することができる。一実施形態では、生体サンプルを、あらかじめ種々の外的刺激(例えば投薬、毒物の可能性のある物質との接触、栄養状態の変化、温度、時間の経過)に曝された細胞から抽出することができる。サンプルは、例えば細胞ホモジェネート、細胞断片、尿や血液及び脳脊髄液を含む生体液、組織ホモジェネート、涙、排泄物、唾液、細胞ホモジェネートあるいは組織ホモジェネートの部分的な又は完全な断片化によって生成するタンパク質、脂質、炭水化物、及び核酸を含む生体分子混合物から選択することができる。
一部の実施形態では、プロテオームサンプルは、対象とする生体サンプルからタンパク質を抽出することによって得る。好ましくは、同じサンプル内のタンパク質を何回か抽出する間に、タンパク質の発現にほとんど変動が見られないか又は全く変動が見られないような方法によって抽出する(例えばタンパク質の抽出は再現可能性が高いことが好ましい)。実験法に起因する変動がある場合、タンパク質発現及び/又は修飾における真の差異を検出できなかったり、又は間違った差異を検出してしまう可能性があるため、2つ以上のサンプル間においてタンパク質発現及び/又は修飾の差異を比較評価する場合は、タンパク質抽出法における再現性が重要となる。例えば細胞からタンパク質を抽出する方法は、当分野では周知であり、これらの方法によるタンパク質の抽出は、サンプルごとに十分に再現可能であり、2つ以上のサンプルにおける差異のあるタンパク質発現/修飾の意義ある分析ができる。例えば、当業者であれば、抽出方法を工夫したり、既知の方法を対象とする特定のサンプルに適合させるように修正して、例えばゲル電気泳動あるいは2D SDS−PAGEのためのタンパク質サンプルを調製し得るであろう。例えば、Bollag D. M.らによる、「Protein Methods」,Wiley−Liss Publishing,(1996);Walshらによる、ABRFnews,(1998)9,11−21;Linkらによる、Electrophoresis,(1998)18,1314−1334;Ducretらによる、Protein Sci.,(1998)7,706−719を参照されたい。これらの各々を、本発明の教示と矛盾しない範囲において、参照することでその内容を本明細書に取り入れることとする。
他の態様では、本発明は、試験化合物が、特定の生体内において、タンパク質の発現又は修飾を調節するか否かを決定するスクリーニング方法を提供する。一実施形態では、この方法は、試験化合物が生体サンプルにおいて、タンパク質の発現又は修飾を調節するか否かを決定し、該方法は、試験化合物(例えば薬品又は毒物)を第1の生体サンプルには投与するが、第2の生体サンプル(対照用サンプル)には投与しないステップをさらに包含する。当業者であれば、本発明の定量方法は高スループットのアッセイフォーマットに容易に修正可能であり、本発明はコンビナトリアル薬物開発法に使用できることを理解し得るであろう。本発明に従って、多くの化合物を、タンパク質発現に影響を与える作用に関してスクリーニングすることができる。この方法は、対照用サンプル(テスト化合物に曝していない)の場合とは異なるテスト化合物に曝した生体から得られた種々のプロテオームサンプル内のタンパク質レベルを定量的に比較することを包含する。測定量と対照量との間の差異は、特定のテスト化合物が特定のタンパク質発現パターンを調節したことを示す。一部のテスト化合物に曝すことによって影響を受けることが見出されたタンパク質は、診断マーカ及び/又は薬品ターゲットの候補となる。任意の自然環境から得られたタンパク質及びペプチド、又は人為的に制御された環境から得られたタンパク質及びペプチドを、本明細書に記載されたシステムを用いて評価することができる。
本発明のキット
本発明の別の態様は、本発明による方法を都合良く実施するために有用なキットに関する。本発明の汎用性を高めるために、試薬及び/又は材料をパッケージ化した組み合わせで提供することができる(試薬及び/又は材料は、交差反応性及び安定性に応じて、同じ容器あるいは個別の容器に入れて提供される)。
本発明の別の態様は、本発明による方法を都合良く実施するために有用なキットに関する。本発明の汎用性を高めるために、試薬及び/又は材料をパッケージ化した組み合わせで提供することができる(試薬及び/又は材料は、交差反応性及び安定性に応じて、同じ容器あるいは個別の容器に入れて提供される)。
一実施形態では、プロテオームサンプル内のタンパク質を同定するために有用なキットは、(i)タンパク質のN末端あるいはC末端を保護し、N末端あるいはC末端の保護されたタンパク質を生成する1つ以上の保護剤、(ii)末端の保護されたタンパク質を、末端の保護されたペプチドと、遊離アミノ基及び遊離カルボキシ基からなるペプチドとの混合物に開裂する1つ以上の開裂剤、(iii)混合物から末端の保護されたペプチドを分離する手段、を包含する。
一部の実施形態では、開裂剤に化学的開裂剤を用いる。例示的な実施形態では、開裂剤はタンパク質消化を起こす酵素である。
一部の実施形態では、本発明のキットはさらに、タンパク質内のリシン残基の側鎖を選択的に保護する二次アミン保護剤を含む。例示的な実施形態では、本発明のキットは、O−メチルイソ尿素、O−メチルイミダゾール、又はこれらと同族の化学物質、又はこれらの組み合わせを含む。
別の実施形態では、本発明のキットは、サンプル内のタンパク質のN末端を保護するための少なくとも1つのアミン保護剤を含む。例示的な実施形態では、本発明のキットは、無水酢酸、Boc無水物、Fmoc試薬、又はこれらの組み合わせを含む。
さらに別の実施形態では、少なくとも1つの保護剤はカルボキシ保護剤であり、本発明のキットは、サンプル内のタンパク質のC末端を保護する1つ以上のカルボキシ保護剤を含む。別の実施形態では、本発明のキットは、保護の前にタンパク質のカルボキシ基を活性化する試薬を含む。一実施形態では、本発明のキットは、カルボジイミド試薬を含む。一実施形態では、本発明のキットは、タンパク質のカルボジイミド活性化カルボキシ基と反応する1つ以上の脂肪族アミンあるいは脂環式アミンを含む。例示的な実施形態では、本発明のキットはメチルアミンを含んでいる。
一実施形態では、少なくとも1つの保護剤はサンプル内のタンパク質のN末端を保護するアミン保護剤である。別の実施形態では、少なくとも1つの保護剤は、サンプル内のタンパク質のC末端を保護するカルボキシ保護剤である。さらに別の実施形態では、保護剤は固体支持材と共有結合を形成できる反応基あるいは潜在的反応基を含んでいる。
別の実施形態では、本発明のキットは、タンパク質開裂混合物内の末端の保護された所望のペプチドを非末端ペプチドから分離するための固体支持材を包含する。1つ以上の固体支持材がキットと共に提供され、その各々は同じものとすることも異なるものとすることもできる。一実施形態では、固体支持材は(例えばN末端の保護されていないペプチドを固定化するために)アミンに共有結合できる反応基を含んでいる。例えば、固体支持材はBr−、Cl−、カーボネート−、CHO−,CO2Hによって官能化されている樹脂である。例示的な一実施形態では、固体支持材はDITCで表面が修飾されている固体支持材である。別の実施形態では、固体支持材は(例えば、C末端の保護されていないペプチドを固定化するために)カルボキシ基と共有結合できる反応基を含んでいる。例えば、固体支持材には、NH2−、OH−、SH−によって官能化されている樹脂を用いることができる。例示的な一実施形態では、固体支持材の反応基は、カルボジイミド介在物を介してカルボキシ基と共有結合している。さらに別の実施形態では、固体支持材は末端の保護されたペプチドを固定化し、固体支持材はペプチド上に存在する保護基と共有結合し得る反応基を含んでいる。
一部の実施形態では、本発明のキットは、必要であれば、固定化されているペプチドを固体支持材から脱離させる試薬を含んでいる。例えば、アミド結合を介してペプチドを固体支持材に固定化している場合、本発明のキットは、トリフルオロ酢酸(TFA)、塩酸(HCI)、ヘプタフルオロ酪酸(HFBA)などの無水強酸を含み得る。
別の実施形態では、本発明のキットは、固体支持材上に末端の保護されたペプチドあるいは末端の保護されていないペプチドを固定化するリンカーを包含する。リンカーは、2つの反応基を含むことが好ましい。一方の反応基は、固定すべきペプチド上のあらかじめ決められた官能基と共有結合を形成することができ、もう一方の反応基は、固体支持材表面に存在する反応基と共有結合を形成することができる。
さらに別の実施形態では、本発明のキットは、(i)タンパク質のN末端を保護するための、アミン基と反応する1つ以上の保護剤、(ii)タンパク質のC末端を保護するための、カルボキシ基と反応する1つ以上の保護剤、(iii)N末端あるいはC末端の保護されたタンパク質を、N末端あるいはC末端の保護されたペプチドと、遊離アミノ基及び遊離カルボキシ基からなるペプチドとの混合物に開裂する1つ以上の開裂剤、(iv)N末端あるいはC末端の保護されたペプチドを混合物から分離する手段、を包含する。
一部の実施形態では、開裂剤はタンパク質消化を起こす酵素である。一部の実施形態では、酵素は、トリプシン、キモトリプシン、ペプシン、パパイン、プロリンエンドペプチダーゼ、ブドウ球菌(staph)プロテアーゼ、エラスターゼ、プロテアーゼK、AspN、Lys−C、Arg−C、Glu−Cである。例示的な一実施形態では、本発明のキットにはトリプシンが含まれる。
一部の実施形態では、開裂剤は、タンパク質を断片化するための化合物である。一部の実施形態では、化合物には、臭化シアン(CNBr)、2−ニトロ−5−チオシアノ安息香酸、N−ブロモスクシンアミド、及び他の反応性ハロゲン化合物、ヒドロキシルアミン、1−2M ギ酸あるいは酢酸、過ヨウ素酸酸化、2−(2−ニトロフェニルスルフェニル)−3−メチル−3−ブロモインドレニン、あるいはo−ヨードソ安息香酸が用いられる。
さらに別の実施形態では、本発明のキットは、2つ以上のサンプル間で差異をもって存在するタンパク質レベルを定量的に比較するために有用で、且つ種々のサンプル内に存在するタンパク質から抽出されたN末端ペプチド及び/又はC末端ペプチドを区別して標識化する1つ以上の試薬をさらに包含する。
例示的な一実施形態では、試薬は区別して同位体標識化されており、N末端の保護されたペプチドの遊離COOH基、及び/又はC末端の保護されたペプチドの遊離アミノ基を共有結合によって修飾するために用いられる。
一実施形態では、本発明のキットは、種々のサンプル内のN末端の保護されたペプチドの遊離カルボキシ基を選択的に区別して標識化するように、通常形態及び重水素形態の脂肪族アミンあるいは脂環式アミンを包含する。例示的な一実施形態では、脂肪族アミンはメチルアミンあるいはエチルアミンであり、本発明のキットは、メチルアミン−(d0)及びメチルアミン−(d3)、又はエチルアミン(d0)及びエチルアミン−(d5)を含んでいる。好ましくは、本キットは、脂肪族アミンあるいは脂環式アミンと結合する前に遊離カルボキシ基を活性化するカルボジイミド試薬をさらに含んでいることが好ましい。
別の実施形態では、本発明のキットは、種々のサンプル内のC末端の保護されたペプチドの遊離アミノ基を、対応するカルバメート部分として選択的に区別して標識化するための、通常形態及び重水素形態のカルバメート形成試薬を含んでいる。例示的な一実施形態では、カルバメート形成試薬は2−tert−ブチルオキシ−カルボニルアミノ−2−フェニルアセトニトリル(即ち、BOC−ON)であり、本発明のキットはBOC−ON−(d0)及びBOC−ON−(d9)を含んでいる。さらに別の実施形態では、本発明のキットは種々のサンプル内のC末端の保護されたペプチドの遊離アミノ基を、対応するアミド部分として選択的に区別して標識化するための、通常形態及び重水素形態のアミド形成剤を含んでいる。例示的な一実施形態では、アミド形成試薬は無水酢酸であり、本発明のキットは無水酢酸−(d0)及び無水酢酸−(d6)を含んでいる。
別の実施形態では、本発明のキットは、種々のサンプル内のタンパク質のN末端あるいはC末端を保護する1つ以上の保護剤を包含し、保護剤は区別して同位体標識化されている検出可能な標識を含んでいる。従って、種々のサンプル内のN末端あるいはC末端の保護されたペプチドレベル(従って対応するタンパク質レベル)の定量的な比較は、種々のサンプル内の区別して同位体標識化されている検出可能な標識の相対量を比較することによって実施される。
一実施形態では、本発明のキットは、種々のサンプル内のタンパク質のN末端遊離アミノ基を、対応するカルバメート部分として選択的に区別して標識化するための、通常形態及び重水素形態のカルバメート形成試薬を包含している。例示的な一実施形態では、カルバメート形成試薬は2−tert−ブチルオキシ−カルボニルアミノ−2−フェニルアセトニトリル(即ちBOC−ON)であり、本発明のキットはBOC−ON−(d0)及びBOC−ON−(d9)を含んでいる。さらに別の実施形態では、本発明のキットは、種々のサンプル内のタンパク質のN末端遊離アミノ基を対応するアミド部分として選択的に区別して標識化するための、通常形態及び重水素形態のアミド形成剤を包含する。例示的な一実施形態では、アミド形成試薬は無水酢酸であり、本発明のキットは無水酢酸−(d0)及び無水酢酸−(d6)を含んでいる。
一実施形態では、本発明のキットは、種々のサンプル内のタンパク質のC末端遊離カルボキシ基を選択的に区別して標識化するための、通常形態及び重水素形態の脂肪族アミンあるいは脂環式アミンを包含する。例示的な一実施形態では、脂肪族アミンはメチルアミンあるいはエチルアミンであり、本発明のキットはメチルアミン−(d0)及びメチルアミン−(d3)、又はエチルアミン(d0)及びエチルアミン−(d5)を含んでいる。好ましくは、本発明のキットは、脂肪族アミンあるいは脂環式アミンと結合する前に遊離カルボキシ基を活性化するカルボジイミド試薬をさらに含んでいる。
等価形態
以下に示す代表的な実施例は、本発明を説明する助けとなるものであり、本発明の範囲を限定することを意図するものではなく、また限定するものと解釈すべきではない。実際、当業者であれば、以下の例と、本明細書に引用される科学文献及び特許文献の参照を含む本明細書の全内容を読むことで、本明細書に示され説明される実施形態に加えて、本発明の種々の修正形態及び多くの他の実施形態が理解されよう。さらに、これらの引用された参考文献の内容は、最先端技術を説明する助けとするために参照することでその内容を本明細書に取り入れることとしていることを理解されたい。
以下に示す代表的な実施例は、本発明を説明する助けとなるものであり、本発明の範囲を限定することを意図するものではなく、また限定するものと解釈すべきではない。実際、当業者であれば、以下の例と、本明細書に引用される科学文献及び特許文献の参照を含む本明細書の全内容を読むことで、本明細書に示され説明される実施形態に加えて、本発明の種々の修正形態及び多くの他の実施形態が理解されよう。さらに、これらの引用された参考文献の内容は、最先端技術を説明する助けとするために参照することでその内容を本明細書に取り入れることとしていることを理解されたい。
以下に示す実施例は、本発明の種々の実施形態及びその等価形態において本発明を実施するために適応可能な、重要な追加の情報、事例、指針を包含するものである。
実施例
当業者であれば、本明細書に包含される情報と組み合わせて、本発明の末端ペプチドを設ける際に有用な合成法、保護基、他の材料及び方法に関する指針として利用できる、十分に確立されたペプチド化学の文献を有している。さらに、当業者に対して、このような末端ペプチドを得て、これらをタンパク質の同定及び定量化に使用するための、種々の例示的な方法に関する特定の指針及び事例が、本明細書中に提供されている。本発明の方法は、本発明の末端ペプチドを設ける又は使用するプロセスの一部を説明する実施例によって、さらに理解され得るであろう。しかしながら、これらの実施例は本発明を限定するものではないことを理解されたい。現在既知の又は今後開発される本発明の変形例も、本明細書及び添付の特許請求の範囲に記載される本発明の範囲内に包含されるものと考えられる。
当業者であれば、本明細書に包含される情報と組み合わせて、本発明の末端ペプチドを設ける際に有用な合成法、保護基、他の材料及び方法に関する指針として利用できる、十分に確立されたペプチド化学の文献を有している。さらに、当業者に対して、このような末端ペプチドを得て、これらをタンパク質の同定及び定量化に使用するための、種々の例示的な方法に関する特定の指針及び事例が、本明細書中に提供されている。本発明の方法は、本発明の末端ペプチドを設ける又は使用するプロセスの一部を説明する実施例によって、さらに理解され得るであろう。しかしながら、これらの実施例は本発明を限定するものではないことを理解されたい。現在既知の又は今後開発される本発明の変形例も、本明細書及び添付の特許請求の範囲に記載される本発明の範囲内に包含されるものと考えられる。
本発明によれば、任意の利用可能な技術を用いて、本発明の末端ペプチドを製造、即ち調製することができる。例えば、次に詳細に説明する種々の溶液相合成法を使用することができる。
本発明の末端ペプチドを調製するために使用される出発原料及び試薬は、アルドリッチケミカルカンパニー社(米国ウィスコンシン州ミルウォーキー)、バケム社(米国カリフォルニア州トランス)、シグマ社(米国ミズーリ州セントルイス)などの商業的な業者から入手可能であるか、又は以下に示す参考文献に記載されている当業者に周知の方法で調製することができる。Fieser and Fieser 1991,「Reagents for Organic Synthesis」,vols.1−17、John Wiley and Sons、New York,NY,1991;Rodd 1989,「Chemistry of Carbon Compounds」,vols.1−5 and supps.,Elsevier Science Publishers 1989;「Organic Reactions」,vols.1−40,John Wiley and Sons,New York,NY,1991;March 2001,「Advanced Organic Chemistry」,5th ed.John Wiley and Sons,New York,NY;Larock 1990,「Comprehensive Organic Transformations:A Guide to Functional Group Preparations」,2nd ed.VCH Publishers。
1.N末端ペプチド選択法−一般的な方法
ε−リシン及びアルギニンのアミノ基の保護は、適切な条件下において、タンパク質サンプルをO−メチルイソ尿素を用いて処理することによって実施する(例えば、Beardsleyらによる、「Enhancing the intensities of lysine−terminated tryptic peptide ions in matrix−assisted laser desorption/ionization spectrometry」,Rapid Commun.Mass Spectrom.(2000)14,2147−2153に記載されている反応をタンパク質サンプルに適合させ得る)。次いで、サンプルタンパク質を、適切な条件下において、適切な保護剤(例えば無水酢酸)と反応させてN末端を保護する。この段階でサンプルを清浄にできる。例えば、過剰なリシンを加えて、残余化学物質を抑えることができる。次いで、未精製の混合物をトリプシン消化し、N末端の保護されたペプチドと、開裂部位に対応する遊離アミノ基及び遊離カルボキシ基からなるペプチドとの混合物を生成する。次いで、このペプチド混合物をDITCによって修飾されている固体支持材に通過させると、固体支持材は反応性遊離アミンを有する部分を捕獲し(あるいは又、グルタルアルデヒドによって修飾されている面を使用することもできる)、これによって混合物内のN末端の保護されていないペプチド断片を効果的に固定化する。固体支持材を洗浄することで、所望のN末端の保護されたペプチドを収集しMSで分析することができる。MSは、好ましくはタンデムMSである。ペプチドを断片化し、このMS断片化パターンを用いて使用可能なデータベースをスクリーニングし、末端ペプチドのアミノ酸配列を決定する。次いで、アミノ酸配列情報を用いてタンパク質データベースをスクリーニングし、末端ペプチドが抽出された元の親タンパク質を同定することができる。
ε−リシン及びアルギニンのアミノ基の保護は、適切な条件下において、タンパク質サンプルをO−メチルイソ尿素を用いて処理することによって実施する(例えば、Beardsleyらによる、「Enhancing the intensities of lysine−terminated tryptic peptide ions in matrix−assisted laser desorption/ionization spectrometry」,Rapid Commun.Mass Spectrom.(2000)14,2147−2153に記載されている反応をタンパク質サンプルに適合させ得る)。次いで、サンプルタンパク質を、適切な条件下において、適切な保護剤(例えば無水酢酸)と反応させてN末端を保護する。この段階でサンプルを清浄にできる。例えば、過剰なリシンを加えて、残余化学物質を抑えることができる。次いで、未精製の混合物をトリプシン消化し、N末端の保護されたペプチドと、開裂部位に対応する遊離アミノ基及び遊離カルボキシ基からなるペプチドとの混合物を生成する。次いで、このペプチド混合物をDITCによって修飾されている固体支持材に通過させると、固体支持材は反応性遊離アミンを有する部分を捕獲し(あるいは又、グルタルアルデヒドによって修飾されている面を使用することもできる)、これによって混合物内のN末端の保護されていないペプチド断片を効果的に固定化する。固体支持材を洗浄することで、所望のN末端の保護されたペプチドを収集しMSで分析することができる。MSは、好ましくはタンデムMSである。ペプチドを断片化し、このMS断片化パターンを用いて使用可能なデータベースをスクリーニングし、末端ペプチドのアミノ酸配列を決定する。次いで、アミノ酸配列情報を用いてタンパク質データベースをスクリーニングし、末端ペプチドが抽出された元の親タンパク質を同定することができる。
2.N末端ペプチド選択法の一実施形態
例示的な一実施形態では、タンパク質サンプルは生体サンプルから得られる。このサンプルを、100−1000モル以上のO−メチルイソ尿素を含有するpH9、50℃の水の中で2時間に渡って処理し、サンプル中のタンパク質のリシン残基を選択的に保護し、トリプシンで開裂可能なタンパク質混合物を生成する(反応混合液は、水酸化アンモニウムを添加してpH9に調節することができる)。タンパク質のN末端遊離アミノ基は、過剰な無水酢酸(例えば10〜100モル以上)を含有するpH9、50℃の水中で2時間に渡って反応させることによって保護する。次いで、このサンプルを、N末端の保護されたタンパク質混合物をpH7.5に調節したトリプシン溶液と37℃で15時間反応させることで、トリプシン消化する。例えば、重量比1:20の酵素/基質比を用いることができる(例えば、1μgのトリプシンと20μgのタンパク質)。この結果生じるペプチド混合物を、次いで、DITC修飾されている固体支持材に曝し、これによって遊離反応性N末端を含むペプチドを固体表面上に効果的に固定化する。表面を適切な溶媒(例えば、体積比50/50/0.2のH2O/AcCN/AcOH)を用いて十分に洗浄した後、所望のN末端の保護されたペプチドを洗浄液溶媒中で収集する。所望のN末端ペプチドを含む溶媒部分を、(例えば、SpeedVacを用いて)凍結乾燥させることができる。あるいは又、所望のN末端ペプチドを含む溶媒部分を逆位相クロマトグラフィカラムを用いて濃縮させることができる。当該ペプチド残基を、LC/MSによって分析する。ペプチドを断片化しペプチドのMS断片化パターンを用いて使用可能なデータベースをスクリーニングし、末端ペプチドのアミノ酸配列を決定する。次いで、アミノ酸配列情報を用いてタンパク質データベースをスクリーニングし、末端ペプチドが抽出された元の親タンパク質を同定することができる。
例示的な一実施形態では、タンパク質サンプルは生体サンプルから得られる。このサンプルを、100−1000モル以上のO−メチルイソ尿素を含有するpH9、50℃の水の中で2時間に渡って処理し、サンプル中のタンパク質のリシン残基を選択的に保護し、トリプシンで開裂可能なタンパク質混合物を生成する(反応混合液は、水酸化アンモニウムを添加してpH9に調節することができる)。タンパク質のN末端遊離アミノ基は、過剰な無水酢酸(例えば10〜100モル以上)を含有するpH9、50℃の水中で2時間に渡って反応させることによって保護する。次いで、このサンプルを、N末端の保護されたタンパク質混合物をpH7.5に調節したトリプシン溶液と37℃で15時間反応させることで、トリプシン消化する。例えば、重量比1:20の酵素/基質比を用いることができる(例えば、1μgのトリプシンと20μgのタンパク質)。この結果生じるペプチド混合物を、次いで、DITC修飾されている固体支持材に曝し、これによって遊離反応性N末端を含むペプチドを固体表面上に効果的に固定化する。表面を適切な溶媒(例えば、体積比50/50/0.2のH2O/AcCN/AcOH)を用いて十分に洗浄した後、所望のN末端の保護されたペプチドを洗浄液溶媒中で収集する。所望のN末端ペプチドを含む溶媒部分を、(例えば、SpeedVacを用いて)凍結乾燥させることができる。あるいは又、所望のN末端ペプチドを含む溶媒部分を逆位相クロマトグラフィカラムを用いて濃縮させることができる。当該ペプチド残基を、LC/MSによって分析する。ペプチドを断片化しペプチドのMS断片化パターンを用いて使用可能なデータベースをスクリーニングし、末端ペプチドのアミノ酸配列を決定する。次いで、アミノ酸配列情報を用いてタンパク質データベースをスクリーニングし、末端ペプチドが抽出された元の親タンパク質を同定することができる。
3.本発明のN末端ペプチド選択法を用いる2つのプロテオームサンプル内のタンパク質発現の比較−タンパク質の酵素による開裂前に同位体を用いて区別標識化
例示的な一実施形態では、タンパク質サンプルは、2つの細胞状態(例えば病気の細胞と正常な細胞、又はストレス負荷した細胞と正常な細胞)から得る。各サンプルは、100−1000モル以上のO−メチルイソ尿素を含有するpH9、50℃の水中で2時間に渡って処理し、タンパク質のリシン残基を選択的に保護し、トリプシンで開裂可能な2つのタンパク質混合物を得る(水酸化アンモニアを加えることによって、反応混合物をpH9に調節することができる)。一方のサンプルでは、適切な条件下において、タンパク質のN末端を無水酢酸−d(0)(あるいは又、BOC−ON−(d0)を使用することもできる)を用いて保護する。第2のサンプルでは、適切な条件下において、タンパク質のN末端をBOC−ON−(d9)を用いて保護する。例えば、各サンプル内のタンパク質のN末端遊離アミノ基を保護する適切な反応条件には、過剰な無水酢酸−d(0)あるいはd(6)(例えば10〜100モル以上)を含有するpH9、50℃の水中で2時間に渡って反応させることが包含される。この結果生じるサンプルを組み合わせ、組み合わせたサンプルを次いでトリプシン消化する(例えば、pH7.5に調節したトリプシン溶液と37℃、15時間に渡って反応させる)。この結果生じるペプチド混合物を次いでDITCで修飾されている固体支持材に曝し、固体支持材表面に遊離反応性N末端を保持するペプチドを効果的に固定化する。DITCで修飾されている表面を適切な溶媒(例えば、体積比50/50/0.2のH2O/AcCN/AcOH)を用いて十分に洗浄した後、区別して同位体標識化されている所望のN末端ペプチドを洗浄液内で収集する。必要であれば、所望のN末端ペプチドを含む溶媒部分を、例えばSpeedVacを用いて個別に凍結乾燥させることもできる(あるいは又、所望のN末端ペプチドを含む溶媒部分を逆位相クロマトグラフィカラムを用いて個別に濃縮させることもできる)。アリコート(全体から取り出した一部の試料)をLC/MSによって分析し、混合物内の区別して同位体標識化されているペプチドの個々のの相対量を測定して、元のサンプル内の種々のタンパク質量を決定することができる。タンデムMSを使用する場合は、混合物内の各ペプチドのアミノ酸配列を決定し、元のサンプル内の対応するタンパク質を、データベース検索を用いて特定し得る。
例示的な一実施形態では、タンパク質サンプルは、2つの細胞状態(例えば病気の細胞と正常な細胞、又はストレス負荷した細胞と正常な細胞)から得る。各サンプルは、100−1000モル以上のO−メチルイソ尿素を含有するpH9、50℃の水中で2時間に渡って処理し、タンパク質のリシン残基を選択的に保護し、トリプシンで開裂可能な2つのタンパク質混合物を得る(水酸化アンモニアを加えることによって、反応混合物をpH9に調節することができる)。一方のサンプルでは、適切な条件下において、タンパク質のN末端を無水酢酸−d(0)(あるいは又、BOC−ON−(d0)を使用することもできる)を用いて保護する。第2のサンプルでは、適切な条件下において、タンパク質のN末端をBOC−ON−(d9)を用いて保護する。例えば、各サンプル内のタンパク質のN末端遊離アミノ基を保護する適切な反応条件には、過剰な無水酢酸−d(0)あるいはd(6)(例えば10〜100モル以上)を含有するpH9、50℃の水中で2時間に渡って反応させることが包含される。この結果生じるサンプルを組み合わせ、組み合わせたサンプルを次いでトリプシン消化する(例えば、pH7.5に調節したトリプシン溶液と37℃、15時間に渡って反応させる)。この結果生じるペプチド混合物を次いでDITCで修飾されている固体支持材に曝し、固体支持材表面に遊離反応性N末端を保持するペプチドを効果的に固定化する。DITCで修飾されている表面を適切な溶媒(例えば、体積比50/50/0.2のH2O/AcCN/AcOH)を用いて十分に洗浄した後、区別して同位体標識化されている所望のN末端ペプチドを洗浄液内で収集する。必要であれば、所望のN末端ペプチドを含む溶媒部分を、例えばSpeedVacを用いて個別に凍結乾燥させることもできる(あるいは又、所望のN末端ペプチドを含む溶媒部分を逆位相クロマトグラフィカラムを用いて個別に濃縮させることもできる)。アリコート(全体から取り出した一部の試料)をLC/MSによって分析し、混合物内の区別して同位体標識化されているペプチドの個々のの相対量を測定して、元のサンプル内の種々のタンパク質量を決定することができる。タンデムMSを使用する場合は、混合物内の各ペプチドのアミノ酸配列を決定し、元のサンプル内の対応するタンパク質を、データベース検索を用いて特定し得る。
4.本発明のN末端ペプチド選択法を用いる2つのプロテオームサンプル内の種々のタンパク質発現の比較−タンパク質の酵素による開裂後に同位体を用いて区別標識化
例示的な一実施形態では、タンパク質サンプルは、2つの細胞状態(例えば病気の細胞と正常な細胞、又はストレス負荷を受けている細胞と正常な細胞)から得る。各サンプルは、100−1000モル以上のO−メチルイソ尿素を含有するpH9、50℃の水中で2時間処理し、これによって、タンパク質のリシン残基を選択的に保護し、トリプシンで開裂可能な2つのタンパク質混合物を生成する(水酸化アンモニアを加えて、反応混合物をpH9に調節することができる)。各サンプルについて、タンパク質のN末端遊離アミノ基を、過剰な無水酢酸(例えば10−100モル以上)を含有するpH9、50℃の水中で2時間に渡って反応させることによって保護する。次いで、各N末端の保護されたタンパク質混合物を、pH7.5に調節したトリプシン溶液中で、37℃、15時間に渡って反応させてトリプシン消化し、2つのペプチド混合物を生成する。この結果生じるペプチド混合物を、次いで、DITCで修飾されている固体支持材に個別に曝して、遊離反応性N末端を含むペプチドを固体表面上に効果的に固定化する。適切な溶媒(例えば、体積比50/50/0.2のH2O/AcCN/AcOH)を用いて、DITCで修飾されている各表面を十分に洗浄した後、洗浄液の中で所望のN末端の保護されたペプチドをサンプルごとに別々に収集する。所望のN末端ペプチドを含む溶媒部分を(例えば、SpeedVacで)別々に凍結乾燥することができる。あるいは又、所望のN末端ペプチドを含む溶媒部分を逆位相クロマトグラフィカラムによって別々に濃縮することもできる。一方のサンプルでは、ペプチドの遊離C末端を適切なカルボジイミド試薬で活性化し、次いでメチルアミン−(d0)と反応させる。第2のサンプルでは、ペプチドの遊離C末端を適切なカルボジイミド試薬で活性化し、次いで、メチルアミン−(d3)と反応させる。次いで、サンプルを組み合わせ、その結果生じる区別して同位体標識化されているペプチドの混合物をLC/MSによって分析する。元のサンプル内の種々のタンパク質量は、混合物内の区別して同位体標識化されているペプチドの相対量を測定することによって決定することができる。タンデムMSを使用する場合、混合物内の各ペプチドのアミノ酸配列を決定することができ、元のサンプルの対応するタンパク質を、データベース検索を用いて特定し得る。
例示的な一実施形態では、タンパク質サンプルは、2つの細胞状態(例えば病気の細胞と正常な細胞、又はストレス負荷を受けている細胞と正常な細胞)から得る。各サンプルは、100−1000モル以上のO−メチルイソ尿素を含有するpH9、50℃の水中で2時間処理し、これによって、タンパク質のリシン残基を選択的に保護し、トリプシンで開裂可能な2つのタンパク質混合物を生成する(水酸化アンモニアを加えて、反応混合物をpH9に調節することができる)。各サンプルについて、タンパク質のN末端遊離アミノ基を、過剰な無水酢酸(例えば10−100モル以上)を含有するpH9、50℃の水中で2時間に渡って反応させることによって保護する。次いで、各N末端の保護されたタンパク質混合物を、pH7.5に調節したトリプシン溶液中で、37℃、15時間に渡って反応させてトリプシン消化し、2つのペプチド混合物を生成する。この結果生じるペプチド混合物を、次いで、DITCで修飾されている固体支持材に個別に曝して、遊離反応性N末端を含むペプチドを固体表面上に効果的に固定化する。適切な溶媒(例えば、体積比50/50/0.2のH2O/AcCN/AcOH)を用いて、DITCで修飾されている各表面を十分に洗浄した後、洗浄液の中で所望のN末端の保護されたペプチドをサンプルごとに別々に収集する。所望のN末端ペプチドを含む溶媒部分を(例えば、SpeedVacで)別々に凍結乾燥することができる。あるいは又、所望のN末端ペプチドを含む溶媒部分を逆位相クロマトグラフィカラムによって別々に濃縮することもできる。一方のサンプルでは、ペプチドの遊離C末端を適切なカルボジイミド試薬で活性化し、次いでメチルアミン−(d0)と反応させる。第2のサンプルでは、ペプチドの遊離C末端を適切なカルボジイミド試薬で活性化し、次いで、メチルアミン−(d3)と反応させる。次いで、サンプルを組み合わせ、その結果生じる区別して同位体標識化されているペプチドの混合物をLC/MSによって分析する。元のサンプル内の種々のタンパク質量は、混合物内の区別して同位体標識化されているペプチドの相対量を測定することによって決定することができる。タンデムMSを使用する場合、混合物内の各ペプチドのアミノ酸配列を決定することができ、元のサンプルの対応するタンパク質を、データベース検索を用いて特定し得る。
Claims (24)
- プロテオームサンプルの複雑性を低減させる方法であって、
(A)1つ以上のタンパク質を設けるステップと、
(B)適切な保護剤を用いてタンパク質のN末端あるいはC末端を保護するステップと、
(C)適切な開裂剤を用いて前記末端の保護されたタンパク質を開裂し、末端の保護されたペプチドと、開裂部位に対応する遊離アミノ基及び遊離カルボキシ基からなる末端の保護されていないペプチドとの混合物を生成するステップと、
(D)前記ペプチド混合物から前記末端の保護されたペプチドを分離し、前記サンプルの複雑性を、サンプルタンパク質1つにつき1つの末端ペプチドにまで低減させるステップと、
を包含する方法。 - プロテオームサンプル内のタンパク質を同定する方法であって、
(A)1つ以上のタンパク質を設けるステップと、
(B)適切な保護剤を用いて前記タンパク質の末端アミノ基を保護するステップと、
(C)適切な開裂剤を用いて前記末端の保護されたタンパク質を開裂し、末端の保護されたペプチドと、開裂部位に対応する遊離アミノ基及び遊離カルボキシ基からなる末端の保護されていないペプチドとの混合物を生成するステップと、
(D)前記ペプチドの混合物から前記末端の保護されたペプチドを分離し、前記サンプルの複雑性を、サンプルタンパク質1つにつき1つの末端ペプチドにまで低減させるステップと、
(E)前記末端の保護されたペプチドを検出するステップと、
を包含する方法。 - 前記保護ステップにおいて、側鎖のアミノ基あるいはカルボキシ基を同時に保護する請求項1又は2に記載の方法。
- (a)前記保護ステップにおいて、前記保護剤がアフィニティラベルを含まない、又は、
(b)前記末端の保護されたペプチドを前記混合物から分離するステップにおいて、アフィニティクロマトグラフィを用いない、又は、
(c)前記方法が、適切な二次保護剤で側鎖のアミノ基あるいはカルボキシ基を選択的に保護するステップをさらに包含する、又は、
(d)前記開裂ステップにおいて、前記開裂剤が、例えばトリプシン、キモトリプシン、ペプシン、パパイン、プロリンエンドペプチダーゼ、ブドウ球菌(staph)プロテアーゼ、エラスターゼ、プロテアーゼK、AspN、Lys−C、Arg−C、Glu−Cなどの酵素である、又は、
(e)前記開裂ステップにおいて、前記開裂剤が、例えば、臭化シアン(CNBr)、2−ニトロ−5−チオシアノ安息香酸、N−ブロモスクシンアミド及び他の反応性ハロゲン化合物、ヒドロキシルアミン、1−2M ギ酸あるいは酢酸、過ヨウ素酸酸化、2−(2−ニトロフェニルスルフェニル)−3−メチル−3−ブロモインドレニン、あるいはo−ヨードソ安息香酸などの化学開裂剤である、又は、
(f)前記保護ステップにおいて、前記保護剤が、放射性標識、蛍光標識、比色分析標識、同位体標識を含む、
請求項1又は2に記載の方法。 - (a)前記保護ステップが、タンパク質のN末端遊離アミノ基を保護することを包含し、前記保護剤がアミン保護剤であり、この場合に例えば、
(i)前記保護剤がタンパク質のN末端遊離アミノ基と反応するとアミド部を形成し、前記保護剤が無水酢酸である、又は、
(ii)前記保護剤がタンパク質のN末端遊離アミノ基と反応するとBocあるいはFmocカルバメート部を形成し、前記保護剤がBoc無水物あるいはFmoc試薬である、又は、
(iii)前記方法が、例えばO−メチルイソ尿素又はO−メチルイミダゾールなどの適切な第2の保護剤でタンパク質のリシン残基の側鎖を選択的に保護するステップをさらに包含する、又は、
(b)前記保護ステップが、タンパク質のC末端遊離カルボキシ基を保護することを包含し、前記保護剤がカルボキシ保護剤であり、この場合に例えば、
(i)前記保護ステップにおいて、側鎖のカルボキシ基を同時に保護する、又は、
(ii)前記保護ステップが、前記カルボキシ保護剤を前記タンパク質のC末端のカルボジイミド活性化カルボキシ基と反応させることを包含し、前記カルボキシ保護剤が、例えば脂環式アミン、脂肪族アミン、メチルアミン、及びエチルアミンから選択されている請求項1又は2に記載の方法。 - 前記分離ステップが、
(a)末端の保護されていないペプチドを固体支持材に選択的に固定化するステップと、
(b)前記固体支持材を適切な溶媒で洗浄するステップと、
(c)前記末端の保護されたペプチドを含有する溶媒部分を収集するステップと、
を包含する請求項1又は2に記載の方法。 - (a)前記固体支持材が、アフィニティラベルで修飾されている支持材ではない、又は、
(b)前記方法が、前記固定化されているペプチドを適切な脱離剤を用いて前記固体支持材から脱離させるステップをさらに包含しており、例えば、前記固体支持材が、DITCによって修飾されている支持材であり、前記脱離剤が無水強酸、例えばTFA、HCl、あるいはHFBA、である、又は、
(c)前記末端の保護されていないペプチドがN末端の保護されていないペプチドであり、前記固体支持材がアミン基と共有結合を形成し得る反応基を含み、例えば前記固体支持剤がDITCによって修飾されている支持材である、又は、
(d)前記末端の保護されていないペプチドがC末端の保護されていないペプチドであり、前記固体支持材がカルボキシ基と共有結合を形成し得る反応基を含み、この場合に例えば、
(i)前記固体支持材の反応基がアミノ基である、又は、
(ii)前記固定化ステップがカルボジイミドが介在する反応を包含する、又は、
(iii)前記固定化ステップにおいて、末端の保護されていないペプチドが、例えば、光化学的に、化学的に、あるいは酵素によって開裂可能なリンカーを介して前記固体支持材に共有結合している請求項2から6に記載の方法。 - (a)前記保護剤が、適切な固体支持材と共有結合を形成し得る反応基を有している、又は、
(b)前記分離ステップが、
(i)前記末端の保護されたペプチドを固体支持材上に選択的に固定化するステップと、
(ii)前記固体支持材を適切な溶媒で洗浄し、前記固体支持材に共有結合していないペプチドを除去するステップと、
(iii)前記末端の保護されたペプチドを前記固体支持材から脱離させるステップと、
からなり、前記固定化ステップにおいて、前記末端の保護されたペプチドがリンカーを介して前記固体支持材に間接的に共有結合している請求項1又は2に記載の方法。 - (a)前記検出ステップにおいて質量分析技術が用いられる、又は、
(b)前記検出ステップにおいてタンデム質量分析技術が用いられる、又は、
(c)前記検出ステップがタンデム質量分析技術を使用し、前記末端の保護されたペプチドのMS断片化パターンを用いて入手可能なデータベースをスクリーニングし、前記末端ペプチドのアミノ酸配列を決定し、例えば、前記アミノ酸配列情報を用いてタンパク質データベースをスクリーニングし、前記末端ペプチドを抽出した元の親タンパク質を同定する請求項2に記載の方法。 - 前記質量分析技術を、例えばHPLC、ゲル電気泳動、あるいはCEなどの分離技術と組み合わせている請求項9に記載の方法。
- 2つ以上のプロテオームサンプル内のタンパク質レベルを定量的に比較する方法であって、
(A)各々が1つ以上のタンパク質を含有する2つ以上のサンプルを設けるステップと、
(B)各サンプルにおいて、タンパク質のN末端あるいはC末端を適切な保護剤を用いて保護するステップと、
(C)各サンプルにおいて、前記末端の保護されたタンパク質を適切な開裂剤を用いて開裂し、各サンプルについて、末端の保護されたペプチドと、開裂部位に対応する遊離アミノ基及び遊離カルボキシ基からなるペプチドとの混合物を生成するステップと、
(D)各サンプルについて、前記末端の保護されたペプチドを前記ペプチド混合物から分離し、それによって前記2つ以上のタンパク質サンプルの各々に関するサンプルの複雑性をサンプルタンパク質1つにつき1つの末端ペプチドにまで低減させるステップと、
(E)検出可能な標識を含む適切な試薬を用いて、前記各サンプルの前記末端の保護されたペプチドを区別して標識化し、それによって、区別して標識化されている末端ペプチドの2つ以上の組を生成するステップと、
(F)前記区別して標識化されている末端の保護されたペプチドの相対的なレベルを測定するステップと、さらに任意に、
(G)前記測定ステップの前に前記ステップ(E)において生成した前記区別して標識化されている末端ペプチドの組を組み合わせるステップと、
を包含する方法。 - 2つ以上のプロテオームサンプル内のタンパク質レベルを定量的に比較する方法であって、
(A)各々が1つ以上のタンパク質を含有する2つ以上のサンプルを設けるステップと、
(B)各サンプルのタンパク質N末端あるいはC末端を、検出可能な標識を含む適切な保護剤を用いて区別して標識化し、該区別して標識化されている末端の保護されたタンパク質の2つ以上の組を生成するステップと、
(C)前記区別して標識化されている末端の保護されたタンパク質を適切な開裂剤を用いて開裂し、区別して標識化されている末端の保護されたペプチドと、前記開裂部位に対応する遊離アミノ基及び遊離カルボキシ基からなるペプチドとの2つ以上の混合物を生成するステップと、
(D)前記2つ以上のペプチド混合物の各々について、前記区別して標識化されている末端の保護されたペプチドを末端の保護されていないペプチドから分離し、それによって前記サンプルの複雑性を、区別して標識化されているサンプルタンパク質1つにつき、区別して標識化されている1つの末端ペプチドにまで低減させるステップと、
(E)前記区別して標識化されている末端の保護されたペプチドの相対的なレベルを測定するステップと、さらに任意に、
(F)前記開裂ステップの前に、前記区別して標識化されている末端の保護されたタンパク質の組を組み合わせるステップを包含する請求項11の方法であって、該方法が、
(a)各々が1つ以上のタンパク質を含む2つ以上のサンプルを設けるステップと、
(b)各サンプルのタンパク質N末端あるいはC末端を、検出可能な標識を含む適切な保護剤を用いて区別して標識化し、それによって区別して標識化されている末端の保護されたタンパク質の2つ以上の組を生成するステップと、
(c)前記区別して標識化されている末端の保護されたタンパク質の組を組み合わせるステップと、
(d)前記区別して標識化されている末端の保護されたタンパク質を適切な開裂剤を用いて開裂し、それによって区別して標識化されている末端の保護されたペプチドと、開裂部位に対応する遊離アミノ基及び遊離カルボキシ基からなるペプチドとが組合わされた混合物を生成するステップと、
(e)前記区別して標識化されている末端の保護されたペプチドを末端の保護されていないペプチドから分離し、それによって、サンプルの複雑性を、区別して標識化されているサンプルタンパク質1つにつき、区別して標識化されている1つの末端ペプチドにまで低減させるステップと、
(f)前記区別して標識化されている末端の保護されたペプチドの相対的なレベルを測定するステップと、
を包含する方法。 - (a)前記保護ステップにおいて、前記保護剤がアフィニティラベルを含まない、又は、
(b)前記末端の保護されたペプチドを前記ペプチド混合物から分離するステップにおいて、アフィニティクロマトグラフィを用いない、又は、
(c)前記方法が、側鎖のアミノ基あるいはカルボキシ基を適切な二次保護剤で選択的に保護するステップをさらに包含する、又は、
(d)各サンプルのタンパク質N末端あるいはC末端に区別して標識化するために用いる検出可能な標識が、例えば重水素によって区別して同位体標識化されている、又は、
(e)前記分離ステップが、請求項6、7、8のいずれか1つに記載の方法によって実施される請求項11又は12に記載の方法。 - (a)前記末端の保護されたペプチドを区別して標識化するステップが、N末端の保護されたペプチドを区別して標識化することを包含し、前記検出可能な標識を含む試薬が、N末端の保護されたペプチドのC末端遊離カルボキシ基と反応し、この場合において例えば、
(i)C末端カルボキシ基がカルボジイミドによって活性化されている、又は、
(ii)前記検出可能な標識を含む試薬が、例えばメチルアミン−d(0)あるいはメチルアミン−d(3)などの脂肪族あるいは脂環式のアミン同位体である、又は、
(b)前記末端の保護されたペプチドを区別して標識化するステップが、C末端の保護されたペプチドを区別して標識化することを包含し、前記検出可能な標識を含む試薬が、前記C末端の保護されたペプチドのN末端遊離アミノ基と反応し、この場合において例えば、
(i)前記保護剤が前記C末端の保護されたペプチドのN末端遊離アミノ基と反応するとアミド部分を形成し、前記保護剤が無水酢酸−d(0)あるいは無水酢酸−d(6)である、又は、
(ii)前記保護剤が、前記C末端の保護されたペプチドのN末端遊離アミノ基と反応するとBocカルバメート部分を形成し、前記保護剤がBOC−ON−d(0)あるいはBOC−ON−d(9)である請求項11に記載の方法。 - (a)前記タンパク質を区別して標識化するステップが、タンパク質のN末端を区別して標識化することを包含し、前記検出可能な標識を含む保護剤がアミン保護剤であり、例えば前記保護剤が無水酢酸−d(0)あるいは無水酢酸−d(6)、又はBOC−ON−d(0)あるいはBOC−ON−d(9)である、又は、
(b)前記タンパク質を区別して標識化するステップが、タンパク質のC末端を区別して標識化することを包含し、前記検出可能な標識を含む保護剤がカルボキシ保護剤であり、この場合に例えば、
(i)前記区別して標識化するステップにおいて、前記C末端カルボキシ基がカルボジイミドによって活性化されている、又は、
(ii)前記保護剤が、例えばメチルアミン−d(0)あるいはメチルアミン−d(3)などの脂肪族アミン同位体あるいは脂環式アミン同位体である請求項12に記載の方法。 - (a)前記検出ステップにおいて質量分析技術が用いられる、又は、
(b)前記検出ステップにおいてタンデム質量分析が用いられる請求項11又は12に記載の方法。 - 前記質量分析技術を、例えばHPLC、ゲル電気泳動、あるいはCEなどの分離技術と組み合わせている請求項16に記載の方法。
- (a)前記検出ステップにおいて質量分析技術が用いられ、前記質量分析技術がタンデム質量分析であり、前記末端の保護されたペプチドのMS断片化パターンを用いて入手可能なデータベースをスクリーニングし、末端ペプチドのアミノ酸配列を決定し、例えば、前記アミノ酸配列情報を用いてタンパク質データベースをスクリーニングして前記末端ペプチドが抽出された元の親タンパク質を同定する、又は、
(b)前記検出ステップにおいて質量分析技術が用いられ、前記質量分析技術を分離技術と組み合わせており、前記質量分析技術がタンデム質量分析であり、前記末端の保護されたペプチドのMS断片化パターンを用いて入手可能なデータベースをスクリーニングし、末端ペプチドのアミノ酸配列を決定し、例えば、前記アミノ酸配列情報を用いてタンパク質データベースをスクリーニングして前記末端ペプチドが抽出された元の親タンパク質を同定する、又は、
(c)種々のサンプルが、種々の外的刺激に応答して、又は細胞状態、環境条件あるいは病理条件の変化に応答して発現するタンパク質の典型である請求項11又は12に記載の方法。 - プロテオームサンプル内のタンパク質を同定するキットであって、
(a)タンパク質のN末端あるいはC末端を保護し、N末端あるいはC末端の保護されたタンパク質を生成する1つ以上の保護剤と、
(b)前記N末端あるいはC末端の保護されたタンパク質を、N末端あるいはC末端の保護されたペプチドと、遊離アミノ基及び遊離カルボキシ基からなるペプチドとの混合物に開裂する1つ以上の開裂剤と、
(c)前記N末端あるいはC末端の保護されたペプチドを前記混合物から分離する手段と、 を包含するキット。 - (a)少なくとも1つの前記開裂剤が、例えばトリプシン、キモトリプシン、ペプシン、パパイン、プロリンエンドペプチダーゼ、ブドウ球菌(staph)プロテアーゼ、エラスターゼ、プロテアーゼK、AspN、Lys−C,Arg−C、Glu−Cなどの酵素である、又は、
(b)少なくとも1つの前記開裂剤が、例えば臭化シアン(CNBr)、2−ニトロ−5−チオシアノ安息香酸、N−ブロモスクシンアミド及び他の反応性ハロゲン化合物、ヒドロキシルアミン、1−2M ギ酸あるいは酢酸、過ヨウ素酸酸化、2−(2−ニトロフェニルスルフェニル)−3−メチル−3−ブロモインドレニン、あるいはo−ヨードソ安息香酸などの化合物である、又は、
(c)前記キットが、タンパク質内のリシン残基の側鎖を選択的に保護する、例えばO−メチルイソ尿素あるいはO−メチルイミダゾールなどの二次保護剤を包含する、又は、
(d)少なくとも1つの前記保護剤が、放射性標識、蛍光標識、比色分析標識、あるいは同位体標識を含む、又は、
(e)少なくとも1つの前記保護剤が、例えば無水酢酸、Boc無水物、あるいはFmoc試薬などのアミン保護基である、又は、
(f)少なくとも1つの保護剤が、例えばメチルアミンあるいはエチルアミンなどの脂環式アミンあるいは脂肪族アミンなどのカルボキシ保護剤である、又は、
(g)前記キットが、遊離カルボキシ基を活性化させるカルボジイミド試薬をさらに包含する、又は、
(h)前記キットが、種々のサンプル中のN末端あるいはC末端の保護されたペプチドあるいはタンパク質を区別して標識化するための、少なくとも2つの区別して標識化されている試薬を包含する請求項19に記載のキット。 - 前記区別して標識化されている試薬が同位体によって区別して標識化されており、例えば、前記区別して標識化されている試薬が、カルボキシ反応試薬、脂肪族あるいは脂環式アミン、メチルアミン−(d0)及びメチルアミン−(d3)を包含する脂肪族アミンあるいは脂環式アミン、アミン反応試薬、無水酢酸−(d0)及び無水酢酸−(d6)を包含するアミン反応試薬、BOC−ON−(d0)及びBOC−ON−(d9)を包含するアミン反応試薬、から選択されている請求項20に記載のキット。
- (a)前記分離手段が、末端ペプチドあるいは非末端ペプチドを固定化するための少なくとも1つの固体支持材を包含する、又は、
(b)前記分離手段が、アフィニティクロマトグラフィを包含しない請求項19に記載のキット。 - (a)前記固体支持材がアミン基と共有結合反応する官能基を含み、例えば、前記固体支持材がDITCによって修飾されている支持材を包含する、又は、
(b)前記固体支持材がカルボキシ基と共有結合反応する官能基を含み、例えば、前記固体支持材がNH2によって官能化されている面を包含する、又は、
(c)前記キットが、前記固体支持材とは結合していないペプチドを洗い流す溶媒をさらに包含する、又は、
(d)前記キットが、前記固定化されているペプチドを前記固体支持材から脱離させるための脱離剤を包含しており、例えば前記固体支持材がDITCによって修飾されている支持材であり、前記脱離剤が、例えばTFA、HCI、あるいはHFBAなどの無水強酸である請求項22に記載のキット。 - 請求項1、及び請求項3から8のいずれか1つに記載の方法によって得られる複雑性の低減したプロテオームサンプル。
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