KR20200051699A - 프로테오믹스를 위한 멀티플렉스화된 비드 어레이 - Google Patents

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블라디슬라프 비. 베르고
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아뎁트릭스 코퍼레이션
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Abstract

질량 분광법에 의한 분석에 적합한 비드 어레이가 개시된다. 한 실시양태에서, 비드 어레이는 다수의 반응성 부위를 포함하며, 반응성 부위의 각각은 다수의 별개의 표적 분석물에 결합할 수 있다.

Description

프로테오믹스를 위한 멀티플렉스화된 비드 어레이
관련 출원에 대한 상호-참조
본 출원은 2017년 9월 7일에 출원된 발명자 블라디슬라브 비. 베르고(Vladislav B. Bergo)의 미국 특허 가출원 번호 62/555,235의 35 U.S.C. 119(e) 하의 이익을 주장하며, 그의 개시내용은 본원에 참조로 포함된다.
연방정부 지원된 연구 또는 개발
본 발명은 미국 국립 보건원 (NIH)에 의해 수여된 허가 번호 GM103348 및 미국 국립 과학 재단 (NSF)에 의해 수여된 허가 번호 1456224 하에 정부 지원으로 이루어졌다. 정부는 본 발명에서 특정 권리를 갖는다.
서열 목록
본 출원은 ASCII 형식으로 전자 제출되었고, 그 전문이 본원에 참조로 포함되는 서열 목록을 함유한다. 2018년 9월 7일에 생성된 상기 ASCII 카피는 84025PCT_SL.txt로 명명되며, 크기가 14,638 바이트이다.
분야
본원에 개시된 실시양태는 일반적으로 비드 어레이의 분야, 및 보다 구체적으로 비드 어레이에서 비드를 인코딩하는 분야에 관한 것이다. 본원에 개시된 실시양태는 또한 비드-기반 분석적 검정, 프로테오믹스, 단백질 정량화, 친화성 분리 및 질량 분광법의 분야에 관한 것이다.
생물학적 어레이는 생명 과학에서, 특히 게노믹스, 메타볼로믹스, 리피도믹스, 글리코믹스, 프로테오믹스, 조직학 및 세포학의 분야에서 다수의 적용을 발견한 멀티플렉스화된 분석적 플랫폼 기술이다. 생물학적 어레이는 통상적으로 고체 지지체, 예컨대 유리 현미경 슬라이드 또는 비드 상에 고정화된 다수의 별개의 포획제를 특색으로 한다. 포획제는 표적 분석물에 결합할 수 있다. 고체 지지체의 선택된 유형에 따라, 생물학적 어레이는 프린팅된 어레이 또는 비드 어레이 중 어느 하나로서 분류될 수 있다. 프린팅된 어레이 및 비드 어레이 사이의 주요한 차이는 비드 어레이는 대개 위치적 인코딩을 결여한다는 것이다. 결과적으로, 특이적 비드에 결합된 포획제의 정체성은 비드의 공간적 위치로부터 추론되지 않을 수 있으며, 비드 인코딩의 다른 수단이 이용되어야 한다.
비드 어레이를 인코딩하는 다양한 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 이러한 방법은 광학적 표지, 형광 표지, 광학적 바코드, 식별자 결합 리간드 및 질량 태그를 이용한다.
특정 유형의 비드 어레이는 비드 인코딩을 요구하지 않는다. 예를 들어, 질량 분광법에 의해 포획제를 직접적으로 분석하고, 이러한 포획제를 그의 측정된 분자량, 소화 프로파일 또는 MS-MS 단편화 프로파일에 기반하여 식별하는 것이 가능할 수 있다.
또한, 질량 분광법에 의해 표적 분석물을 직접적으로 분석하고, 이러한 표적 분석물을 그의 측정된 분자량, 소화 프로파일 또는 MS-MS 단편화 프로파일에 기반하여 식별하는 것이 가능할 수 있다.
발명의 명칭이 "펩티드 및 단백질의 정량화 및 식별 방법"인 미국 특허 7,846,748은 매트릭스-보조 레이저 탈착 이온화 질량 분광법 (MALDI MS: Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry)을 사용하여 단일 비드에 결합된 비표지된 및 동위원소적으로 표지된 펩티드의 혼합물을 분석하는 것을 개시하고 있다. 비드-결합된 펩티드의 아미노산 서열은 탠덤 MALDI 질량 분광법 (MALDI MS-MS)을 사용하여 펩티드 단편화 프로파일을 측정하고, 이어서 데이터베이스 검색하거나, 드 노보 식별을 수행함으로써 결정될 수 있음이 개시되어 있다. 펩티드 풍부도의 정량적 측정의 가능성은 또한 개시되어 있으며, 이는 동위원소 표지된 펩티드, 즉, 2H 및 18O 동위원소를 함유하는 펩티드의 사용을 요구한다.
발명의 명칭이 "마이크로구체를 갖는 어레이 센서의 디코딩"인 미국 특허 7,033,754는 이미 생활성제를 함유하는 마이크로구체에 결합된 식별자 결합 리간드 (IBL)를 식별하기 위한 질량 분광법의 용도를 개시하고 있다. 개시된 접근법에서, IBL은 비드 질량 태그와 유사하게 기능한다. 또한, 생활성제의 특징규명이 질량 분광법을 사용하여 직접적으로 수행될 수 있음이 개시되어 있다.
그의 전문이 본원에 참조로 포함되는 발명의 명칭이 "마이크로어레이 조성물 및 그의 사용 방법"인 미국 특허 9,618,520은 마이크로어레이가 활성제를 인코딩하는 통상적인 수단을 갖지 않을 수 있음을 개시하고 있다. 결과적으로, 활성제는 그 자신의 암호로서 기능할 수 있으며, 마이크로어레이 디코딩 절차는 그의 상응하는 비드로부터 활성제를 방출하고, 이어서 질량 분광법을 사용한 활성제의 식별을 포함할 수 있다.
그의 전문이 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 출원 일련 번호 13/369,939, 공개 번호 US 2012-0202709 A1은 비드 어레이 내에 존재하거나 존재할 수 있는 화합물의 분자량에 관한 정보를 제공하는 것을 개시하고 있다. 이러한 화합물은 포획제, 표적, 프로브, 2차 프로브, 링커 및 비드 질량 태그를 포함할 수 있다. 분자량 정보는 질량 분광법적 데이터의 획득을 가이드하고, 또한 개별적 비드 상에 존재하는 분석물을 식별하는데 사용될 수 있음이 개시되어 있다.
명칭이 "MALDI 면역스크리닝 (MiSCREEN): 이뮤노프로테오믹스에 사용하기 위한 항-펩티드 모노클로날 항체의 선택 방법"인 논문 (Razawi M et al., J. Immunol. Methods 2011, 364, 50-64)은 면역친화성 풍부화에 적합한 항-펩티드 항체를 개시하고 있다. 이는 또한 단백질 표적, 상응하는 트립신성 펩티드, 그들의 아미노산 서열 및 예측된 분자량의 목록을 함유하는 표를 개시하고 있다.
명칭이 "MALDI-TOF 질량 분광법에 의해 측정된 중쇄 펩티드 비의 정확성"인 논문 (Anderson NL et al., J. Proteome Res. 2012, 11, 1868-1878)은 단백질 G 디나비즈에 접합된 항-펩티드 항체와 함께 소화된 인간 혈장의 인큐베이션 후에 기록된 MALDI TOF 질량 스펙트럼을 개시하고 있다. 다수의 (20개 초과의) 별개의 피크가 질량 스펙트럼의 1,000 - 1,500 m/z 영역에서 검출되었다. 이들 피크 중 몇몇은 비드-접합된 항체에 의해 특이적으로 포획된 펩티드에 할당되었다. 또 다른 피크는 항체-접합된 비드에 비-특이적으로 결합된, 인간 혈청 알부민으로부터 유래된 단백질분해성 펩티드에 할당되었다. 대다수의 피크는 특정한 분석물에 할당되지 않았으며, 그들의 기원은 미공지된 채 남아 있었다.
선행 기술은 반응성 부위가 반응성 부위의 포획제에 특이적으로 결합하는 표적 분석물의 분자량에 의해서만 인코딩되는 표적-인코딩된 비드 어레이를 교시하거나 시사하지 않는다. 특히, 선행 기술은 반응성 부위의 포획제가 2, 3, 4개 또는 더 많은 수의 별개의 표적 분석물에 결합할 수 있고, 반응성 부위가 2, 3, 4개 또는 더 많은 수의 값의 조합에 의해 인코딩되며, 값의 각각은 반응성 부위의 포획제에 특이적으로 결합하는 표적 분석물의 분자량으로부터 유래되는 것인 표적-인코딩된 비드 어레이를 개시하고 있지 않다.
따라서, 비드 어레이의 분석을 가능하게 할 방법 및 조성물에 대한 필요가 여전히 있다.
한 측면에서, 본 명세서는 적어도 제1 반응성 부위 및 제2 반응성 부위를 포함하는 비드 어레이를 기재한다. 제1 반응성 부위는 제1 비드 및 제1 비드와 회합된 제1 포획제를 포함한다. 제1 포획제는 천연 발생 에피토프를 특이적으로 인식하고, 이러한 에피토프를 함유하는 적어도 2개의 별개의 표적에 특이적으로 결합한다. 별개의 표적은 별개의 분자량을 갖는 단백질성 화합물일 수 있다. 별개의 표적은 단일 전구체 단백질의 단백질분해성 단편 또는 별개의 전구체 단백질의 단백질분해성 단편일 수 있다. 제2 반응성 부위는 제1 포획제와는 화학적으로 별개이고, 제2 비드 및 제2 비드와 회합되고, 제1 반응성 부위의 포획제에 의해 인식되지 않는 에피토프를 특이적으로 인식하는 제2 포획제를 포함한다. 제1 및 제2 반응성 부위의 각각은 상응하는 반응성 부위에 특이적으로 결합하는 표적의 분자량으로부터 유래된 적어도 2개의 별개의 값을 포함하는 고유한 조합과 회합된다. 제1 반응성 부위와 회합되는 조합은 제2 반응성 부위와 회합되는 조합과 별개이다.
또 다른 측면에서, 본 명세서는 비드 어레이를 샘플과 접촉시키는 단계, 샘플로부터의 제1 표적 및 제2 표적을 비드 어레이의 제1 반응성 부위에 결합시키는 단계, 및 샘플로부터의 제3 표적을 비드 어레이의 제2 반응성 부위에 결합시키는 단계를 포함하는, 비드 어레이를 사용하여 친화성 결합을 수행하는 방법을 기재한다. 제1 및 제2 반응성 부위는 비드 및 포획제를 함유하며, 제1 반응성 부위의 포획제는 제2 반응성 부위의 포획제와 상이하다. 제1 표적 및 제2 표적은 5000 Da 미만의 분자량을 갖고, 제1 반응성 부위의 포획제에 의해 인식되는 천연 발생 에피토프를 함유하는 단백질성 화합물이다. 제3 표적은 제2 반응성 부위의 포획제에 의해 인식되고, 제1 반응성 부위의 포획제에 의해 인식되지 않는 에피토프를 함유한다.
추가의 또 다른 측면에서, 본 명세서는 마이크로어레이의 반응성 부위를 분석함으로써 생성된 질량 스펙트럼을 수용하는 단계, 질량 스펙트럼에서 제1 신호 및 제2 신호를 검출하는 단계, 및 제1 신호의 및 제2 신호의 m/z 값 또는 그의 등가물이 마이크로어레이의 반응성 부위 중 적어도 하나와 회합된 조합에 존재하는 값에 매칭하는지를 검증하는 단계를 포함하는, 비드 어레이를 디코딩하는 방법을 기재한다.
추가의 또 다른 측면에서, 본 명세서는 비드 어레이를 제조하는 방법을 기재한다. 방법은 비드 어레이의 개별적 반응성 부위를 평가하여 각각의 반응성 부위에 특이적으로 또는 비-특이적으로 결합할 수 있는 표적 분석물의 정체성 및 분자량을 결정하는 단계를 포함한다. 방법은 임의로 표적 분석물의 정체성 및 분자량에 관한 정보를 이후 비드 어레이와 함께 포함되는 디코딩 표 내로 입력하는 단계를 포함할 수 있다.
추가의 또 다른 측면에서, 본 명세서는 비드 어레이 내의 표적 분석물을 식별하는 몇몇 방법을 기재한다. 기재된 방법의 일부는 표적 분석물의 분자량으로부터 유래된 값을 측정하고, 이어서 마이크로어레이와 함께 제공된 디코딩 표를 사용하여 표적 분석물의 정체성을 결정하는 것을 포함한다. 기재된 방법은 무세포 단백질 전사-번역 반응물, 박테리아 세포 배양물, 포유동물 세포 배양물, 세포 배양 상청액, 동물 모델, 이종이식편, 조직 생검, 생체유체 및 기타를 비롯한 다양한 유형의 생물학적 샘플을 분석하는데 이용될 수 있다.
이 명세서에 기재된 분석적 방법 및 조성물은 기본적 연구, 제약 약물 발견 및 약물 개발, 질환 진단 및 예측, 바이오마커 발견 및 확인, 개인화 의학, 정확성 의학, 시스템 생물학 및 기타를 비롯한 폭넓은 범위의 적용에 이용될 수 있다.
본 개시된 실시양태는 첨부된 도면을 참조로 추가로 설명될 것이며, 여기서 유사한 구조는 몇몇 도면 전반에 걸쳐 유사한 숫자에 의해 지칭된다. 나타내어진 도면은 반드시 일정한 비율은 아니며, 대신에 일반적으로 본 개시된 실시양태의 원리를 예시하는 것에 중점이 주어진다.
도 1a는 몇몇 별개의 반응성 부위를 포함하는 비드 어레이를 개략적으로 도시한다. 반응성 부위의 각각은 비드 및 2개 이상의 별개의 표적 분석물에 특이적으로 결합할 수 있는 포획제의 다수의 카피를 포함한다.
도 1b는 비드 어레이의 개별적 반응성 부위에 특이적으로 결합하는 표적 분석물에 관한 정보를 함유하는 몇몇 엔트리를 포함하는 디코딩 표를 개략적으로 도시한다. 표적 분석물에 관한 정보는 그들의 정체성, 예컨대 명칭, 데이터베이스 ID 및/또는 서열 및 그들의 분자량, 질량-대-전하 비 및/또는 비행 시간 값을 포함한다.
도 2a는 전구체 단백질의 별개의 단백질분해성 단편이 비드 어레이의 별개의 반응성 부위 상에 포획되는 친화성 결합을 수행하는 방법을 개략적으로 도시한다.
도 2b는 별개의 전구체 단백질로부터 유래된 단백질분해성 단편이 비드 어레이의 동일한 반응성 부위 상에 포획되는 친화성 결합을 수행하는 방법을 개략적으로 도시한다.
도 3은 자성 비드 분리 랙 상에 정치된 미세원심분리 튜브 내부의 다수의 별개의 반응성 부위를 함유하는 현탁액 비드 어레이의 사진이다.
도 4는 8-웰 프로플레이트(PROPLATE)® 모듈에 부착되고, 스프링 모듈에 대한 프로플레이트® 트레이의 중간 섹션에 위치한 마이크로웰 슬라이드의 사진이다.
도 5는 400 μm 자성 아가로스 비드가 마이크로웰 슬라이드 상의 500 μm 웰 내부에 어레이된 비드 어레이의 사진이다.
도 6a는 CHCA MALDI 매트릭스의 결정을 함유하는 500 μm 직경 마이크로스팟의 어레이의 명시야 현미경 화상이며, 일부 마이크로스팟은 또한 건조로 인해 크기가 감소된 아가로스 비드를 함유한다.
도 6b는 아가로스 비드의 제거 후의 CHCA MALDI 매트릭스의 결정을 함유하는 500 μm 직경 마이크로스팟의 어레이의 명시야 현미경 화상이다.
도 7은 어레이를 효소적으로 소화된 MKN-45 세포 용해물에 노출시킨 후 4-플렉스 비드 어레이의 개별적 반응성 부위로부터 기록된 예시적인 질량 스펙트럼을 나타낸다.
용어 "마이크로어레이" 및 "비드 어레이"는 본 명세서 전반에 걸쳐 상호교환가능하게 사용되며, 적어도 2개의 반응성 부위를 포함하는 군을 지칭한다.
용어 "반응성 부위"는 비드 및 비드와 회합되는 포획제의 조합을 지칭한다.
용어 "포획제"는 화합물에 특이적으로 결합할 수 있는 분자 또는 분자 복합체를 지칭한다. 포획제의 비-제한적 예는 모노클로날 항체이다. 용어 "포획제"의 단수 형태는 복수의 분자 또는 복수의 분자 복합체를 지칭할 수 있다. 예를 들어 이는 복수의 항체 분자를 지칭할 수 있다.
용어 "표적 분석물" 및 "표적"은 본 명세서 전반에 걸쳐 상호교환가능하게 사용되며, 일반적으로 포획제의 결합 상대를 지칭한다. 표적 분석물의 비-제한적 예는 펩티드이다. 용어 "표적 분석물" 및 "표적"의 단수 형태는 복수의 분자, 예를 들어 복수의 펩티드 분자를 지칭할 수 있다.
용어 "펩티드" 및 "폴리펩티드"는 본 명세서 전반에 걸쳐 상호교환가능하게 사용되며, 펩티드 결합으로도 공지된 아미드 결합에 의해 연결된 적어도 2개의 아미노산을 함유하는 화합물을 지칭한다.
용어 "단백질"은 생화학, 생물물리학 및 분자 생물학의 분야에서 통상적으로 사용되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 이는 일반적으로 적어도 1개의 폴리펩티드를 함유하는 분자 또는 분자 복합체를 지칭한다.
용어 "단백질성 화합물"은 펩티드, 폴리펩티드 및 단백질을 포괄한다.
용어 "웰" 및 "마이크로웰"은 본 명세서 전반에 걸쳐 상호교환가능하게 사용되며, 액체 매질, 입자 또는 둘 다를 보유할 수 있는 위상학적 특색, 예컨대 피트 또는 함몰부를 지칭한다.
용어 "값"은 통상적으로 대수적 용어: 규모, 수량, 또는 수에 의해 나타내어지는 수치적 양으로서 정의된다.
한 실시양태에서, 도 1a에 개략적으로 도시된 바와 같이, 본 명세서는 마이크로어레이, 즉, 제1 반응성 부위(102) 및 제2 반응성 부위(103)를 포함하는 비드 어레이를 기재한다. 제1 반응성 부위는 제1 비드(111)에 결합된 제1 포획제(112)의 다수의 카피를 포함한다. 제1 포획제(112)는 제1 표적(121) 및 제2 표적(122)에 특이적으로 결합하도록 구성된다. 제1 표적 및 제2 표적 둘 다는 제1 포획제에 의해 특이적으로 인식되는 에피토프(128)를 함유하는 단백질성 화합물이다. 제1 표적의 분자량 및 제2 표적의 분자량은 5000 달톤 (Da) 미만이다. 제1 표적의 분자량은 제2 표적의 분자량과 상이하다. 제1 표적의 분자량은 제2 표적의 분자량과 1 Da 미만 또는 수천 Da만큼 많이 상이할 수 있다. 한 실시양태에서, 제1 표적의 분자량 및 제2 표적의 분자량 사이의 차이는 5 Da 초과이다. 예를 들어, 제1 표적 및 제2 표적 사이이 분자량 차이는 10 Da 초과, 20 Da 초과, 50 Da 초과, 100 Da 초과, 200 Da 초과, 500 Da 초과 또는 1,000 Da 초과일 수 있다. 제2 반응성 부위는 제2 비드(113)에 결합된 제2 포획제(114)의 다수의 카피를 포함한다. 제2 포획제는 제1 포획제와 상이하며, 제1 표적(123), 제2 표적(124) 및 제3 표적(125)에 특이적으로 결합하도록 구성된다. 제2 반응성 부위의 포획제는 제1 반응성 부위의 포획제에 의해 인식되지 않는 에피토프(129)를 특이적으로 인식한다. 3개의 표적(123, 124 및 125)의 각각은 별개의 분자량을 갖는다. 3개의 표적(123, 124 및 125)의 각각은 에피토프(129)를 함유한다. 제1 및 제2 비드는 생체적합성 물질, 예컨대 유리, 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 다른 유형의 중합체, 아가로스, 셀룰로스, 다른 유형의 히드로겔 또는 복합 물질로부터 제작될 수 있다. 제1 및 제2 포획제의 각각은 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 항체 단편, 단일 도메인 항체, 압타머, 소마머(SOMAmer)® 시약, 아피머, 단백질, 폴리펩티드, 수용체, 리간드, 효소, 효소 기질, 효소 억제제 또는 친화성 결합이 가능한 임의의 다른 화합물일 수 있다. 예를 들어, 모노클로날 또는 폴리클로날 항체는 제1 비드에 접합된 항체가 제2 비드에 접합된 항체와는 상이한 에피토프를 인식하도록 특정한 에피토프를 인식하도록 선택될 수 있다.
한 실시양태에서, 제1 및 제2 비드 및 제1 및 제2 포획제는 비표지되며, 즉, 이들은 검출가능한 표지를 포함하지 않는다. 예를 들어, 비드 및 포획제 둘 다는 광학적 표지 및 질량 태그를 결여할 수 있다. 더욱이, 제1 및 제2 비드는 또한 위치적 인코딩을 결여할 수 있다. 반응성 부위가 위치적 인코딩을 결여한 마이크로어레이는 반응성 부위의 위치에 기반한 포획제의 식별을 허용하지 않는다.
바람직하게는, 제1 및 제2 비드 상에 존재하는 포획제의 양은 적어도 100 아토몰의 각각의 표적의 그들의 각각의 반응성 부위에의 결합을 가능하게 하는데 충분하다. 비드의 구체적 특성 및 포획 시약의 성질에 따라, 반응성 부위의 각각은 1 피코몰 초과 또는 심지어 10 피코몰 초과의 그들의 각각의 표적에 결합하는 능력을 가질 수 있다.
마이크로어레이는 적어도 1개의 반응성 부위의 적어도 1개의 복제물을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 도 1a에 개략적으로 도시된 제1 반응성 부위의 복제물은 비드 및 제1 반응성 부위의 포획제로부터 화학적으로 구별불가능한 비드-연결된 포획제를 포함할 수 있다. 마이크로어레이는 특정한 반응성 부위의 1 내지 100개의 복제물을 함유할 수 있다. 특정 분석적 적용을 위해, 마이크로어레이는 특정한 반응성 부위의 복제물의 상대적으로 적은 수를 함유하는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 마이크로어레이는 20개 미만, 15개 미만, 10개 미만 또는 5개 미만의 특정한 반응성 부위의 복제물을 함유할 수 있다. 사실, 특정한 반응성 부위의 1, 2, 3 또는 4개의 복제물을 제공하는 것이 대개 충분하다. 한 측면에서, 적은 수의 특정한 반응성 부위의 복제물을 갖는 것은 저-풍부도 분석물이 많은 동일한 반응성 부위 중에서 과도하게 희석되지 않는 것을 보장하는 것을 도울 수 있으며, 이는 개별적 반응성 부위로부터 획득되는 신호의 강도의 감소를 초래할 것이다. 또 다른 측면에서, 적은 수의 복제물 반응성 부위를 갖는 것은 이러한 마이크로어레이를 제조하는데 필요한 시약, 예를 들어 항체의 양을 감소시킴으로써 마이크로어레이 제작의 비용을 저하시키는 것을 도울 수 있다. 추가의 또 다른 측면에서, 적은 수의 복제물 반응성 부위를 갖는 것은, 보다 많은 수의 비-복제물 반응성 부위가 보다 작은 반응 부피로 조합되고, 이어서 고체 지지체 상에서 분석될 수 있기 때문에, 특정한 비드-기반 검정의 멀티플렉스화 능력을 증가시키는 것을 도울 수 있다. 본 명세서에 개시된 방법 및 조성물은 개별적 비드의 매우 효율적인 취급 및 분석을 가능하게 하며, 마이크로어레이 프로세싱 단계 전반에 걸쳐 비드를 소실할 가능성을 최소화함이 주목된다. 본 명세서에 개시된 방법 및 조성물은 마이크로어레이 프로세싱 단계 전반에 걸쳐 심지어 단일 비드를 소실하는 것을 방지하고 최종-사용자가 마이크로어레이 내의 모든 비드를 분석하는 것을 허용하는데 이용될 수 있다. 이 명세서에 기재된 마이크로어레이 취급 절차는 적어도 일부 반응성 부위가 고유한, 즉, 마이크로어레이 내에 복제물을 갖지 않는 마이크로어레이를 어셈블리하는 것을 가능하게 한다. 이는 많은 저 풍부도 분석물에 대한 증가된 검출 민감도를 초래할 수 있다.
한 실시양태에서, 도 1b에 개략적으로 도시된 바와 같이, 마이크로어레이는 디코딩 표(130)를 추가로 포함한다. 디코딩 표는 마이크로어레이의 개별적 반응성 부위에 특이적으로 결합하는 표적의 정체성 및 분자량에 관한 정보를 포함한다. 예를 들어, 제1 반응성 부위와 회합되고, "반응성 부위 1"로서 개략적으로 도시되는 엔트리(131)는 디코딩 표의 열(132 및 133)에 각각 "표적 1-1" 및 "값 1-1"로서 개략적으로 도시된 제1 반응성 부위에 특이적으로 결합하는 제1 표적의 정체성 및 분자량에 관한 정보를 함유한다. 엔트리(131)는 각각 "표적 1-2" 및 "값 1-2"로서 개략적으로 도시된 제1 반응성 부위에 특이적으로 결합하는 제2 표적의 정체성 및 분자량에 관한 정보를 추가로 함유한다. 마찬가지로, "반응성 부위 2"로서 개략적으로 도시된 제2 반응성 부위와 회합되는 엔트리는 제2 반응성 부위에 특이적으로 결합하는 3개의 별개의 표적의 각각의 정체성 및 분자량에 관한 정보를 함유한다.
표적이 단백질이거나, 예를 들어 단백질의 효소적 소화를 통해 단백질로부터 유래된 경우, 표적의 정체성에 관한 정보는 하기 중 하나 이상일 수 있다: 단백질의 명칭, 단백질의 식별자, 데이터베이스에서의 단백질의 수탁 번호, 단백질의 아미노산 조성, 단백질 내의 영역의 아미노산 조성 및 단백질 내의 부위의 아미노산 조성. 보다 일반적으로, 표적의 정체성에 관한 정보는 하기 중 하나 이상을 포함할 수 있다: 표적의 명칭, 그의 화학적 조성, 그의 구조식 등. 표적의 분자량에 관한 정보는 표적의 분자량으로부터 유래된 값일 수 있다. 구체적으로, 이는 하기 중 하나 이상일 수 있다: 표적의 분자량, 표적의 질량-대-전하 (m/z) 비, 표적의 비행 시간 (TOF) 값. 이는 또한 질량 분광법에 의해 측정될 수 있는 또 다른 정량적 값, 예컨대 (1) 표적의 단일- 또는 다중-하전된 형태, (2) 표적의 수소 부가물, 암모늄 부가물, 나트륨 부가물, 칼륨 부가물 또는 다른 부가물, (3) 그의 분자량의 감소를 초래하는 물, 암모니아 또는 다른 변형 등의 소실을 겪은 표적, (4) 그의 분자량의 증가를 초래하는 산화 또는 다른 변형 등을 겪은 표적의 m/z 비 또는 TOF 값일 수 있다. 디코딩 표는 임의로 또한 상응하는 포획제의 정체성에 관한 정보를 함유할 수 있다. 예를 들어 포획제가 항체인 경우, 디코딩 표는 항체에 의해 인식되는 에피토프의 서열, 항체의 제조자, 항체의 카탈로그 번호 등에 관한 정보를 함유할 수 있다. 디코딩 표에 포함되는 데이터는 프린팅된 매체에 저장될, 예를 들어 종이의 시트 상에 프린팅 수 있으며; 대안적으로 이는 전자적 매체에, 예를 들어 컴퓨터 메모리에, 제거가능한 메모리 장치, 예컨대 USB 메모리 카드 상에, 클라우드-기반 저장소 등에 저장될 수 있다. 디코딩 표에 포함되는 데이터는 또한 다른 수단을 통해 이용가능하며, 예를 들어 웹사이트 상에 포스팅되거나, 전자 통신, 예를 들어 전자 메일 또는 텍스트 메시징에 의해 전송되고 수신될 수 있다. 대안적으로, 디코딩 표에 포함되는 데이터는 소프트웨어 프로그램 또는 또 다른 형태의 컴퓨터 알고리듬에 의해 온-디맨드 생성될 수 있다.
디코딩 표를 제공하는 것은 분자량 (MW) 또는 질량 분광법에 의해 측정될 수 있는 표적 분석물의 다른 특성, 예컨대 표적 분석물의 질량 대 전하 (m/z) 비 또는 표적 분석물의 비행 시간 (TOF) 값에 기반한 표적 분석물의 식별을 가능하게 한다. 한 실시양태에서, 표적의 분자량으로부터 유래된 단일 값은 표적의 정체성과 분명하게 연관되며, 따라서 마이크로어레이 내의 표적을 분명하게 식별하는데 충분하다. 한 실시양태에서, 표적의 분자량으로부터 유래된 값은 표적의 비-단편화된 형태의 분자량으로부터 유래된 값이다. 다시 말해서, 탠덤 질량 분광법에 의한 표적의 단편화는 표적의 정체성을 결정하기 위해 요구되지 않는다. 더욱이, 본 개시내용의 마이크로어레이는 액체 크로마토그래피 (LC) 분리를 사용하지 않기 때문에, LC 측정과 연관되는 핵심적인 분석적 파라미터, 예컨대 분석물 체류 시간은 디코딩 표에 포함될 필요는 없다.
마이크로어레이 디코딩 표가 특정한 반응성 부위에 특이적으로 결합할 수 있는 모든 별개의 표적의 정체성 및 분자량에 관한 정보를 함유할 필요는 없다. 다시 말해서, 특정한 반응성 부위에 특이적으로 결합할 수 있는 별개의 표적의 수량은 정체성 및 분자량에 관한 정보가 디코딩 표에서 이용가능한 별개의 표적의 수량보다 더 많을 수 있다. 예를 들어, 도 1a 및 1b에 관하여, 제1 반응성 부위(102)는 2개 초과의 별개의 표적에 특이적으로 결합할 수 있는 반면, 제2 반응성 부위(103)는 3개 초과의 별개의 표적에 특이적으로 결합할 수 있다. 정체성 및 분자량에 관한 정보가 마이크로어레이 디코딩 표에서 이용가능한 별개의 표적의 수량은 특정한 표적, 표적의 특정한 군 또는 마이크로어레이 내의 특정한 반응성 부위의 분명한 식별을 허용하는데 충분해야 한다. 한 실시양태에서, 디코딩 표는 특정한 반응성 부위에 특이적으로 결합할 수 있는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12개의 별개의 표적에 대한 정체성 및 분자량 정보를 함유한다. 한 실시양태에서, 특정한 반응성 부위에 특이적으로 결합할 수 있는 별개의 표적의 분자량에 관한 정보는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12개의 별개의 값을 함유한다. 특정 경우에, 마이크로어레이 내의 표적의 분자량은 도 1b에서 "반응성 부위 N", "표적 N" 및 "값 N"으로 개략적으로 도시된 단일 측정된 MW, m/z 또는 TOF 값에 기반한 표적의 분명한 식별을 허용하기에 충분히 고유할 수 있다.
특정 경우에, 마이크로어레이 디코딩 표는 분자량 정보가 제공되는 표적의 수량이 정체성 정보가 제공되는 표적의 수량과 상이한 특정한 반응성 부위에 대한 엔트리를 함유할 수 있다. 예를 들어, 분자량 정보가 제공되는 표적의 수량은 정체성 정보가 제공되는 표적의 수량보다 더 많을 수 있다. 이러한 경우는 도 1b에 "반응성 부위 3"으로 표지된 엔트리로서 개략적으로 도시되며, 여기서, 정체성 정보는 "표적 3"으로서 도시된 단일 표적에 대해 제공되지만, 분자량 정보는 "값 3-1" 및 "값 3-2"로서 도시된 2개의 별개의 표적에 대해 제공된다. 이는 예를 들어, 특정한 반응성 부위가 표적에 특이적으로 결합할 수 있고, 그의 정체성이 공지되지 않은 경우 일어날 수 있다. 대안적으로, 마이크로어레이 제조자는 분자량 정보가 디코딩 표에 제공되는 모든 표적의 정체성을 개시하지 않는 것을 선택할 수 있다.
개시된 유형의 마이크로어레이는 표적의 분자량이 고유한 경우에 뿐만 아니라, 표적의 분자량이 고유하지 않은, 즉, 마이크로어레이 내의 2개 이상의 별개의 표적이 질량 분광법에 의해 해결되지 않을 수 있는 동일하거나 매우 유사한 분자량을 갖는 경우에도 표적의 분명한 식별을 가능하게 한다. 예를 들어, 도 1a에 관하여, 제1 반응성 부위(102)에 특이적으로 결합하는 표적(122)의 분자량은 제2 반응성 부위(103)에 특이적으로 결합하는 표적(125)의 분자량과 매우 가깝거나 동일할 수 있다. 2개의 별개의 분석물이 동일하거나 매우 유사한 분자량을 갖는 경우, 이들은 MALDI TOF 질량 분광법에 의해 구별되지 않을 수 있지만, 일부의 경우, 이들은 탠덤 질량 분광법, 예를 들어 MALDI TOF-TOF MS에 의해 또는 다른 유형의 질량 분광법에 의해 구별될 수 있다. 또한, 단일 표적이 마이크로어레이 내의 2개 이상의 별개의 반응성 부위에 특이적으로 결합할 수 있음이 가능하다. 예를 들어, 제1 반응성 부위(102)에 특이적으로 결합하는 도 1a에 개략적으로 도시된 표적(121)은 또한 제2 반응성 부위(103)에 특이적으로 결합할 수 있다. 이러한 경우, 마이크로어레이의 단일 반응성 부위에 의해 포획되고, 단일 질량 스펙트럼에서 함께 검출될 수 있는 2, 3, 4, 5개 또는 심지어 더 많은 수의 별개의 표적의 분자량, m/z 값 또는 TOF 값의 조합, 소위 스펙트럼 시그니처는 질량 분광법에 의해 상응하는 표적(들)의 분명한 식별을 가능하게 하는데 충분히 고유할 것이다. 2개 또는 더 많은 수의 값을 사용하여 특정한 표적 분석물 및/또는 특정한 반응성 부위의 정체성을 결정하는 것의 이점은 분석물 식별의 보다 큰 신뢰성 및 마이크로어레이-기반 분석적 방법에 대한 보다 높은 정도의 멀티플렉스화를 포함할 수 있다.
개시된 유형의 마이크로어레이는 또한 동일한 반응성 부위에 의해 포획되는 별개의 표적의 수가 상이한 샘플, 예를 들어 상이한 화학적 화합물로 처리된 상이한 세포주들 또는 세포주 사이에 다양한 분석적 적용에 적합하다.
개시된 마이크로어레이 인코딩 시스템은 마이크로어레이 내의 표적 분석물을 식별하기 위해 질량 분광법에 의한 표적 분석물의 단편화 또는 시퀀싱을 요구하지 않을 수 있음이 이전에 주목되었다. 그럼에도 불구하고, 질량 분광법에 의한, 예를 들어 탠덤 질량 분광법에 의한 분석물 시퀀싱은 임의로 분석물 식별에서의 신뢰성을 증가시키기 위해 또는 분석물 식별 이외의 목적을 위해, 마이크로어레이에 존재하는 표적 분석물의 일부 또는 전부에 대해 수행될 수 있다. 예를 들어, 펩티드는 펩티드 서열 내의 번역후 변형의 위치를 결정하기 위해 탠덤 질량 분광법에 의해 분석될 수 있다.
질량 분광법에 의한 시퀀싱은 또한 구체적으로 마이크로어레이의 반응성 부위에 의해 포획되는 개별적 표적 분석물을 식별하는 목적을 위해 사용될 수 있다. 이러한 경우, 디코딩 표에 함유되는 표적 분석물의 분자량 및 정체성에 관한 정보는 중복될 수 있으며, 따라서, 디코딩 표는 마이크로어레이와 함께 공급될 필요가 없을 수 있다. 마이크로어레이는 마이크로어레이에 의해 포획되는 개별적 표적 분석물의 MS-MS 시퀀싱을 사용하여 디코딩된다. 이러한 접근법의 한 가지 잠재적인 유익은 마이크로어레이의 반응성 부위에 결합하는 신규한 분석물을 발견하고 식별하는 가능성이다. 그러나, 이는 MS-MS (MS2) 분석을 수행할 수 있는 보다 진보된 MS 기기에 대한 접근을 요구할 것이다.
질량 분광법에 의한 시퀀싱은 또한 화학적 표지화 방법, 예컨대 탠덤 질량 태그 (TMT) 및 상대 및 절대 정량화를 위한 동중원소 태그 (iTRAQ)를 사용한 다수의 샘플에서의 단백질 풍부도 변화의 정량적 프로파일링에 사용될 수 있다. 이 명세서에 포함된 실시예는 TMT 및 iTRAQ 기반 단백질 정량화 연구를 수행하는데 적합한 큰 직경, 높은 결합 능력 자성 아가로스 비드를 기재한다.
한 실시양태에서, 본 개시내용의 마이크로어레이는 다수의 별개의 반응성 부위 및 마이크로어레이 디코딩 수단, 예를 들어 마이크로어레이 디코딩 표를 포함한다. 이러한 마이크로어레이의 반응성 부위의 각각은 1 내지 30개의 별개의 표적에 특이적으로 결합하도록 구성되며, 각각의 표적은 별개의 분자량을 갖는다. 반응성 부위의 각각은 비드 및 비드에 회합된 포획제를 포함한다. 반응성 부위의 각각은 1 내지 30개의 별개의 값을 함유하는 조합과 회합되며, 값의 각각은 상응하는 반응성 부위에 특이적으로 결합하는 표적의 분자량으로부터 유래된다. 특정한 반응성 부위와 회합된 조합은 표적 분석물의 측정된 분자량 또는 등가의 파라미터, 예를 들어 m/z 또는 TOF 값을 사용한 표적 분석물의 식별을 가능하게 하는 암호로서 기능한다. 이러한 조합은 표적의 각각의 (1) 정체성 및 (2) 분자량에 관한 정보를 포함하는 마이크로어레이 디코딩 표의 일부일 수 있다. 디코딩 표는 특정한 반응성 부위에 특이적으로 결합할 수 있는 별개의 표적의 수량에 관한 정보를 추가로 포함할 수 있다. 이는 또한 생물학적 샘플, 예컨대 생체유체 또는 세포 용해물에서의 개별적 별개의 표적의 풍부도에 관한 정보를 포함할 수 있다. 풍부도 정보는 정량적 또는 정성적 형태로 제공될 수 있다. 예를 들어, 디코딩 표는 특정 펩티드 분석물이 특정한 세포주로부터 제조되는 샘플에서 존재하지 않거나 검출가능하지 않다는 진술을 함유할 수 있다.
본 개시내용의 마이크로어레이는 2 내지 100개의 별개의 반응성 부위를 포함할 수 있다. 대안적으로, 본 개시내용의 마이크로어레이는 100개 초과의 별개의 반응성 부위를 포함할 수 있다. 다수의 반응성 부위를 특색으로 하는 마이크로어레이의 실험예는 이 명세서에 제공된다.
본 개시내용의 마이크로어레이는 2 내지 100개의 별개의 표적에 특이적으로 결합하도록 구성될 수 있으며, 별개의 표적의 각각은 별개의 분자량을 갖는다. 대안적으로, 본 개시내용의 마이크로어레이는 100 내지 500개의 별개의 표적에 특이적으로 결합하도록 구성될 수 있다. 대안적으로, 본 개시내용의 마이크로어레이는 500개 초과의 별개의 표적에 특이적으로 결합하도록 구성될 수 있다. 별개의 표적은 단일 단백질로부터 또는 다수의 별개의 단백질로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 마이크로어레이는 천연 발생 전구체 단백질의 별개의 단백질분해성 단편을 특이적으로 인식하고 그에 결합하는 별개의 포획제를 함유할 수 있다. 마이크로어레이에 포함되는 포획제에 의해 인식되는 이러한 전구체 단백질의 별개의 단백질분해성 단편의 수는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 10개 초과일 수 있다. 동일한 전구체 단백질의 다양한 영역으로부터 유래된 단백질분해성 단편을 결합시키는 것은 단백질의 완전한 서열 이하의 단백질 1차 서열의 실질적 부분의 분석을 가능하게 한다. 구체적으로, 마이크로어레이는 집합적으로 단백질의 1차 서열 길이의 5% 초과, 10% 초과, 20% 초과, 30% 초과, 40% 초과, 50% 초과, 60% 초과, 70% 초과, 80% 초과, 90% 초과, 95% 초과 또는 100%를 차지하는 전구체 단백질의 별개의 단백질분해성 단편에 결합하는 별개의 포획제를 함유할 수 있다. 이러한 별개의 포획제는 별개의 비드와 회합되며, 따라서, 별개의 단백질분해성 단편은 별개의 반응성 부위에 의해 포획된다. 동일한 단백질로부터 유래된 별개의 펩티드에 결합할 수 있는 마이크로어레이의 몇몇 예는 이 명세서에 제공된다.
본 개시내용의 마이크로어레이는 100개 미만의 별개의 표적, 100 내지 1,000개의 별개의 표적 또는 1,000개 초과의 별개의 표적의 분석을 수행하도록 구성될 수 있다. 본 개시내용의 마이크로어레이를 사용하여 분석될 수 있는 별개의 표적의 수는 개별적 표적의 화학적 조성, 질량 분광계의 스펙트럼 해상도 및 질량 분광계의 검출 질량 범위를 비롯한 몇몇 인자에 의해 결정된다. 예를 들어, MALDI TOF MS에 의해 선형 모드로 측정되는 단백질분해성 펩티드에 대해, 검출 질량 범위는 대략 800 Da 내지 8,000 Da로 설정될 수 있다. 개별적 단백질분해성 펩티드의 분자량이 현대 MALDI TOF MS 기기의 스펙트럼 해상도 용량 충분히 내인 약 5 Da만큼 떨어진 경우, 1,000개 초과의 별개의 표적 분석물이 측정되고, 이러한 마이크로어레이 내에서 분명하게 식별될 수 있다.
본 개시내용의 마이크로어레이는 다수의 별개의 표적에 결합하도록 구성될 수 있으며, 별개의 표적의 각각은 700 Da 초과 및 30,000 Da 미만인 분자량을 갖는다. 본 개시내용의 마이크로어레이는 또한 700 Da 미만 또는 30,000 Da 초과의 분자량을 갖는 표적에 결합하도록 구성될 수 있다. 1,000 Da 미만, 1,000 - 10,000 Da, 및 10,000 Da 초과의 분자량을 갖는 표적에 결합할 수 있는 마이크로어레이의 실험예는 이 명세서에 제공된다.
본 개시내용의 마이크로어레이는 그의 C-말단에 인접한 단백질의 영역으로부터 유래된 다수의 표적의 결합을 수행하도록 구성될 수 있다. 이를 달성하기 위해, 항체는 단백질 1차 서열에서 C-말단에 충분히 가깝게, 예를 들어 단백질 C-말단으로부터 3개 미만, 5개 미만, 7개 미만, 10개 미만, 15개 미만, 20개 미만 또는 25개 미만의 아미노산에 위치하는 에피토프를 인식하도록 선택될 수 있다. 이러한 마이크로어레이는 다른 효과 중에서도 단백질 이질성, 단백질분해성 분해 및/또는 C-말단 영역에서의 단백질 변형을 검출하는데 사용될 수 있다.
본 개시내용의 마이크로어레이는 단백질의 N-말단에 인접한 단백질의 영역으로부터 유래된 다수의 표적의 결합을 수행하도록 구성될 수 있다. 이를 달성하기 위해, 항체는 1차 서열에서의 단백질 N-말단에 충분히 가깝게, 예를 들어 단백질 N-말단으로부터 3개 미만, 5개 미만, 7개 미만, 10개 미만, 15개 미만, 20개 미만 또는 25개 미만의 아미노산에 위치하는 에피토프를 인식하도록 설계될 수 있다. 이러한 마이크로어레이는 다른 효과 중에서도 개시제 메티오닌의 제거 및/또는 단백질 N-말단의 아세틸화를 검출하는데 사용될 수 있다.
한 실시양태에서, 본 개시내용의 마이크로어레이는 다수의 별개의 표적에 결합하도록 구성되며, 별개의 표적 중 적어도 하나의 단편화 패턴에 관한 정보를 함유하는 디코딩 표를 포함한다. 특정한 표적의 단편화 패턴에 관한 정보는 표적의 정체성을 확인하는데 사용될 수 있다. 표적의 단편화 패턴에 관한 정보를 함유하는 디코딩 표를 포함하는 마이크로어레이의 실험예는 이 명세서에 제공된다.
본 개시내용의 마이크로어레이는 위치적, 광학적 및 질량 태그 인코딩을 결여한 하나 또는 몇몇 반응성 부위를 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 마이크로어레이의 모든 반응성 부위는 위치적, 광학적 및 질량 태그 인코딩을 결여한다. 더욱이, 멀티플렉스화된 샌드위치 면역검정과는 달리, 본 개시내용의 마이크로어레이는 표적 분석물 당 단지 단일 (포획) 항체를 포함하며, 표적 분석물 당 2개의 별개의 항체 (포획 및 검출)를 요구하지 않고, 포함하지 않는다.
한 실시양태에서, 본 명세서는 적어도 2개의 별개의 반응성 부위 및 디코딩 표를 포함하는 마이크로어레이를 개시한다. 별개의 반응성 부위의 각각은 적어도 1개의 표적에 특이적으로 결합할 수 있다. 디코딩 표는 별개의 반응성 부위의 각각에 특이적으로 결합하는 표적의 정체성 및 분자량에 관한 정보 및 또한 샘플에서의 표적 중 적어도 1개의 풍부도에 관한 정보를 함유한다. 디코딩 표는 또한 임의로 표적 풍부도 데이터가 제공되는 샘플의 설명을 포함할 수 있다.
샘플에서의 표적의 풍부도에 관한 정보를 제공하는 것은 마이크로어레이를 샘플과 반응시킨 후 질량 분광법에 의한 표적의 식별에서 신뢰성을 증가시키는 것을 도울 수 있다.
특정한 표적에 대한 풍부도 정보는 다양한 형태로 제공될 수 있다. 한 실시양태에서, 풍부도 정보는 샘플에서의 표적의 가능한 존재에 관한 정보로서 제공되며, 즉, 특정한 표적은 샘플에서 존재하거나 부재하는 것으로 예상될 수 있다. 예를 들어, 마우스 기원의 단백질은 인간 세포주로부터 유래된 샘플에 존재하는 것으로 예상되지 않는다. 또 다른 예에서, 특정한 단백질 또는 단백질 이소형은 특정한 세포주, 특정한 기관 또는 특정한 조직 유형에서 발현되지 않으며, 따라서, 이러한 샘플에서의 그의 풍부도는 0일 것임이 공지될 수 있다. 한 실시양태에서, 풍부도 정보는 샘플에서의 2개 이상이 표적의 상대 풍부도에 관한 정보로서 제공된다. 예를 들어, 특정한 전구체 단백질의 2개의 이소형은 특정 비로 존재할 것으로 예상될 수 있거나, 이소형 중 적어도 하나는 다른 것보다 더 풍부할 것으로 예상될 수 있다. 또 다른 예에서, 특정한 전구체 단백질의 2개의 PTM 부위는 특정 비로 존재할 것으로 예상될 수 있으며, 여기서 한 부위는 변형되고, 예를 들어 다른 것보다 더 큰 정도로 인산화된다. 한 실시양태에서, 풍부도 정보는 정량적 형태로 제공된다. 예를 들어, 혈청 또는 혈장에서의 특정한 단백질의 풍부도에 관한 정보는 적어도 대략 공지되고, 농도의 범위, 예를 들어 mg/ml, μg/ml, ng/ml 또는 pg/ml로서 표현될 수 있다. 또 다른 예에서, 특정한 분석물로부터 예상되는 질량 스펙 신호의 대략적 강도는 제공될 수 있다.
표적 풍부도 데이터가 제공되는 샘플의 설명은 하기 중 하나 이상을 포함할 수 있다: 샘플 기원, 예를 들어 특정한 세포주, 조직, 생체유체 등; 샘플 처리 조건, 예컨대 특정한 화학적 화합물에의 세포주의 노출; 샘플 프로세싱 내력, 예를 들어 특정한 소화 효소의 사용.
마이크로어레이의 별개의 반응성 부위에 특이적으로 결합하는 별개의 표적 분석물의 몇몇 비-제한적 예는 하기에 제공되며, 명세서의 실시예 섹션에 추가로 기재된다.
펩티드 이소형: 이들은 가깝게 관련되지만 동일하지는 않은 아미노산 서열을 갖는 펩티드이다. 서열 차이는 아미노산 부가, 아미노산 결실, 아미노산 치환 및 아미노산 변형을 포함할 수 있다. 아미노산 변형은 번역후 변형 (PTM), 예컨대 인산화, 아세틸화, 메틸화, 유비퀴틴화, 글리코실화 등일 수 있다. 단일 펩티드 서열은 1개 초과의 PTM 부위 및 1개 초과의 PTM 유형을 함유할 수 있다. 예를 들어, 단백질 인산화는 단일 펩티드 서열 내의 다수의 이웃하는 부위 상에서 일어날 수 있다.
상이한 화학적 변형을 갖는 펩티드: 펩티드의 화학적 변형은 통상적으로 아미노산의 측쇄에의 또는 펩티드 N- 또는 C-말단 기에의 펩티드에 대한 1개 이상의 화학기의 공유 부착을 포함한다. 펩티드를 변형시킬 수 있는 다수의 시약은 공지되어 있다. 예를 들어, 펩티드는 리신 측쇄 및 펩티드 N-말단의 1차 아민을 표적화하는 N-히드록시숙신이미드 (NHS) 에스테르 또는 이미도에스테르를 함유하는 화합물로 공유적으로 변형될 수 있다. 구체적으로, 펩티드는 형광 염료, 예컨대 시아닌 염료 CY®3 및 CY®5, 쿠마린 또는 쿠마린 유도체로 차등적으로 표지될 수 있다.
상이한 수의 화학적 변형을 그 외에는 동일한 아미노산 서열 내에 함유하는 펩티드: 예를 들어, 펩티드는 N-말단 아민에서 및 또한 리신 측쇄 아민(들)에서 화학적으로 변형될 수 있다. 따라서, 2개의 리신 잔기를 갖는 펩티드는 0, 1, 2 또는 3개의 화학적으로 변형된 아민을 함유할 수 있다.
내인성 펩티드 및 내부 표준물: 내부 표준물은 통상적으로 스파이크되며, 즉, 내인성 펩티드를 이미 함유하는 샘플 내로 첨가된다. 내부 표준물은 내인성 펩티드의 서열과는 별개인 서열을 갖는 합성 펩티드일 수 있다.
상실된 절단 부위를 함유하는 단백질분해성 펩티드: 소화 효소, 예컨대 트립신, 키모트립신, 엔도프로테이나제 GluC, LysC, LysN, Arg-C, 펩신, 엘라스타제 등에 의한 전구체 단백질의 소화는 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6개 또는 더 많은 수의 상실된 절단을 함유하는 다수의 펩티드를 생성할 수 있다. 이러한 펩티드는 동일한 에피토프를 갖지만, 상이한 길이 및 결과적으로 상이한 분자량을 가질 수 있다. 더욱이, 일부 소화 효소는 비-특이적 활성을 나타낼 수 있으며, 예를 들어 트립신의 특정 제제는 추가적으로 키모트립신 활성을 나타낼 수 있다. 이러한 시나리오에서, 단백질분해성 펩티드는 상응하는 소화 효소에 대해 전형적이거나 예상되지 않는 절단 부위를 함유할 수 있다.
펩티드 결합의 비-효소적 가수분해에 의해 생성된 펩티드: 특정 유형의 펩티드 결합은 본래 낮은 안정성을 가지며, 심지어 소화 효소의 부재 하에서 가수분해를 겪을 수 있다. 이들은 시아노겐 브로마이드의 존재 하에서 메티오닌-함유 펩티드 결합의 가수분해, 포름산의 존재 하에서 아스파르트산-프롤린 펩티드 결합의 가수분해, 및 히드록실아민의 존재 하에서 아스파라긴-글리신 펩티드 결합의 가수분해를 포함한다. 펩티드 결합의 부분적 가수분해는 상이한 길이의 2개 이상의 별개의 펩티드의 출현을 초래할 것이다.
상이한 종으로부터 기원한 펩티드: 특정 생물학적 기법, 예컨대 단백질분해성 소화와 결합된 종양 이종이식편의 생성은 상이한 종, 예를 들어 인간 및 마우스로부터 기원한 펩티드의 혼합물을 생성할 수 있다. 이러한 펩티드는 동일한 에피토프를 갖지만, 에피토프 외부의 아미노산 조성에 있어서 상이할 수 있다.
반응성 부위의 포획제에 의해 인식되는 에피토프 내의 동일하거나 유사한 서열을 공유하는 단백질로부터 유래된 펩티드. 이러한 단백질은 동일한 생물학적 경로 또는 별개의 생물학적 경로의 구성요소일 수 있다. 후자의 경우, 단일 마이크로어레이 반응성 부위는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 더 많은 수의 별개의 생물학적 경로의 구성요소인 단백질로부터 유래된 펩티드에 특이적으로 결합하도록 구성될 수 있다. 따라서, 단일 마이크로어레이 반응성 부위는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 더 많은 수의 별개의 생물학적 경로의 변화를 탐색하도록 구성될 수 있다.
도 2a 내지 2b는 마이크로어레이 및 마이크로어레이를 사용하여 친화성 결합을 수행하는 방법의 일부 예를 개략적으로 도시한다. 도 2a에 관하여, 마이크로어레이, 즉, 비드 어레이는 별개의 비드(207, 208 및 209)와 회합된 별개의 포획제를 함유할 수 있다. 별개의 포획제는 천연 발생 단백질(201)의 서열에 존재하는 별개의 에피토프를 특이적으로 인식한다. 에피토프가 단백질분해성 소화 후에 보존되는 경우, 별개의 반응성 부위는 또한 상응하는 에피토프를 함유하는 별개의 단백질분해성 단편(202, 203, 204 및 205)을 특이적으로 인식하고, 그에 특이적으로 결합할 것이다. 마이크로어레이는 집합적으로 단백질의 서열 길이의 10% 초과, 20% 초과, 30% 초과, 40% 초과, 50% 초과, 60% 초과, 70% 초과, 80% 초과, 90% 초과, 95% 초과, 또는 100%를 차지하는 다수의 별개의 단백질분해성 단편을 특이적으로 인식하는 다수의 별개의 포획제를 함유할 수 있다. 예를 들어, 단백질의 2개의 단백질분해성 단편은, 단백질분해성 단편이 비-중첩하고, 각각의 단백질분해성 단편이 10개 초과의 아미노산을 함유하고, 전체 단백질이 100개 미만의 아미노산을 함유하는 경우, 집합적으로 단백질의 서열 길이의 20% 초과를 차지한다.
중첩하는 단백질분해성 단편(202 및 203)이 예를 들어 불완전한 효소적 소화로 인해 발생할 수 있는 동일한 에피토프를 함유하는 경우, 이들은 도 2a에 개략적으로 도시된 바와 같이, 동일한 포획제에 의해 인식되고, 동일한 반응성 부위(207)에 의해 포획될 것이다.
도 2b에 관하여, 2개의 별개의 단백질(211 및 212)의 단백질분해성 소화는 비드 어레이의 동일한 반응성 부위(219)에 의해 포획될 것인 동일한 단편(215)을 생성할 것이다. 단편(215)의 풍부도를 측정하는 것은 둘 다의 전구체 단백질(211 및 212)의 풍부도에 관한 정보를 제공할 것이지만, 개별적 단백질의 풍부도에 관한 정보는 제공하지 않을 것이다. 각각 단백질(211 및 212)로부터 유래된 단백질분해성 단편(214 및 216)을 특이적으로 포획하는 추가의 반응성 부위(217 및 218)를 포함하는 것은 단백질-특이적 정량화를 가능하게 할 것이다. 대안적으로, 단백질(211 및 212)로부터 유래된 단편(215)은 공통적인 에피토프를 갖지만, 에피토프의 외부의 그들의 아미노산 조성의 차이로 인해 상이한 분자량을 가짐이 가능하다. 이러한 경우, 단편은 심지어 단일 반응성 부위 상에 포획되는 경우에도 질량 분광법에 의해 구별될 것이다.
마이크로어레이에서의 별개의 포획제는 5000 Da 미만의 분자량을 갖는 단백질성 화합물 내의 별개의 에피토프를 개별적으로 인식할 수 있다.
마이크로어레이의 포획제에 의해 인식되는 에피토프는 인간 단백질에 및 마우스 단백질에, 또는 보다 일반적으로, 상이한 종으로부터의 적어도 2종의 단백질에 존재하는 천연 발생 서열일 수 있다. 따라서, 마이크로어레이의 반응성 부위는 인간 및 마우스 단백질 둘 다로부터 유래된 단백질분해성 단편에 결합할 수 있다. 이러한 마이크로어레이의 예는 본 명세서에 제공된다.
마이크로어레이는 제1 반응성 부위의 포획제에 의해 인식되는 에피토프가 제1 단백질에서 및 제2 단백질에서 천연적으로 발생하는 반면, 제2 반응성 부위의 포획제에 의해 인식되는 에피토프는 제1 단백질에서 천연적으로 발생하지만, 제2 단백질에서는 그렇지 않도록 설계될 수 있다. 이러한 마이크로어레이의 예는 본 명세서에 제공된다.
마이크로어레이는 제1 및 제2 반응성 부위의 포획제에 의해 인식되는 에피토프가 트립신 및 키모트립신에 의해 인식되는 단백질분해성 절단 부위를 결여하도록 설계될 수 있다. 트립신은 이들이 프롤린에 의해 이어지거나, 인산화된 아미노산, 예컨대 포스포세린, 포스포트레오닌, 포스포티로신에 인접하는 경우를 제외하고는, 통상적으로 리신 또는 아르기닌을 함유하는 단백질분해성 절단 부위를 인식한다. 일부의 경우, 트립신은 Lys-Lys, Arg-Arg, Lys-Arg 또는 Arg-Lys 서열을 함유하는 부위를 인식하지 않을 수 있다. 키모트립신은 통상적으로 큰 소수성 아미노산, 예컨대 티로신, 트립토판, 및 페닐알라닌을 함유하는 부위를 인식하지만, 이는 또한 류신, 이소류신 및 메티오닌을 함유하는 부위를 인식할 수 있다. 이러한 마이크로어레이는 트립신 또는 키모트립신 중 어느 하나를 사용한 효소적 소화에 의해 생성된 샘플을 프로파일링하는데 유용할 수 있다. 이러한 마이크로어레이의 예는 본 명세서에 제공된다.
마이크로어레이는 제1 반응성 부위의 포획제에 의해 인식되는 에피토프가 트립신에 의해 인식되는 단백질분해성 절단 부위를 결여하는 반면, 제2 반응성 부위의 포획제에 의해 인식되는 에피토프는 이러한 단백질분해성 절단 부위를 함유하도록 설계될 수 있다. 이러한 마이크로어레이는 트립신 또는 또 다른 프로테아제 중 어느 하나를 사용한 효소적 소화에 의해 생성된 샘플을 프로파일링하는데 유용할 수 있다. 이러한 마이크로어레이의 예는 본 명세서에 제공된다.
마이크로어레이는 제1 및 제2 반응성 부위의 포획제에 의해 인식되는 에피토프가 적어도 2종의 소화 효소에 의해, 예를 들어 트립신, 키모트립신, 펩신, 엘라스타제, 써모리신, 엔도프로테이나제 Arg-C, 엔도프로테이나제 Glu-C 및 엔도프로테이나제 Asp-N 중 적어도 2종에 의해 인식되는 단백질분해성 절단 부위를 결여하도록 설계될 수 있다. 이러한 마이크로어레이의 예는 본 명세서에 제공된다.
마이크로어레이는 제1 반응성 부위의 포획제가 PTM을 결여한 에피토프를 특이적으로 인식하고, 둘 다 에피토프를 함유하지만, 2개의 표적 중 단지 하나만이 에피토프의 외부에 위치한 PTM을 함유하는 제1 표적 및 제2 표적에 특이적으로 결합하도록 설계될 수 있다. 이러한 마이크로어레이의 예는 본 명세서에 제공된다.
마이크로어레이는 제1 반응성 부위의 포획제가 제1 PTM, 예를 들어 인산화를 함유하는 에피토프를 특이적으로 인식하고, 둘 다가 에피토프를 함유하는 반면, 표적 중 적어도 하나는 또한 에피토프의 외부에 위치한 제2 PTM, 예를 들어 아세틸화, 메틸화, 글리코실화, 유비퀴틴화 또는 SUMO화를 함유하는 제1 표적 및 제2 표적에 특이적으로 결합하도록 설계될 수 있다. 제1 PTM의 부위는 제2 PTM의 부위로부터 10개 미만의 아미노산만큼 분리될 수 있다. 이러한 마이크로어레이의 예는 본 명세서에 제공된다.
마이크로어레이는 제1 반응성 부위의 포획제가 적어도 2개의 PTM을 함유하는 에피토프를 특이적으로 인식하고, 그 중 적어도 하나는 에피토프의 외부에 위치한 추가의 PTM을 추가로 함유하는 제1 표적 및 제2 표적에 특이적으로 결합하도록 설계될 수 있다. 이러한 마이크로어레이의 예는 본 명세서에 제공된다.
마이크로어레이는 마이크로어레이의 별개의 반응성 부위가 천연 발생 단백질의 적어도 3개의 별개의 단백질분해성 단편에 특이적으로 결합하도록 설계될 수 있다. 한 실시양태에서, 각각의 별개의 단편은 적어도 1개의 PTM을 함유한다. 이러한 마이크로어레이의 예는 본 명세서에 제공된다.
마이크로어레이는 웨스턴 블롯, ELISA, 유동 세포측정, 면역조직화학, 면역침전 또는 면역형광 검정에서 그들의 상응하는 에피토프를 특이적으로 인식하는 포획제를 포함할 수 있다. 이러한 마이크로어레이의 예는 본 명세서에 제공된다.
마이크로어레이는 2개의 별개의 표적에 특이적으로 결합하는 포획제를 포함할 수 있다: 선형 모드 MALDI TOF MS에 의해 검출가능하지만, 리플렉터 모드 MALDI TOF MS에 의해서는 그렇지 않은 제1 표적, 및 리플렉터 모드 MALDI TOF MS에 의해 검출가능한 제2 표적. 선형 모드 MALDI TOF MS에 의해 검출가능한 표적은 불안정한 화합물, 예를 들어 포스포펩티드를 포함하거나, 높은 분자량, 예를 들어 10 kDa 초과를 갖는다. 실시예 14에 상세히 기재된 염소 항-아코니타제 2 항체는 무손상 ACO2 단백질 (MW 85,425 Da, 매트릭스로서 시나핀산을 사용한 선형 모드 MALDI TOF MS에 의해 검출가능함) 및 아미노산 541 내지 555를 포함하는 그의 단백질분해성 단편 (MW 4781.1 Da, 매트릭스로서 α-시아노-4-히드록시신남산을 사용한 리플렉터 모드 MALDI TOF MS에 의해 검출가능함) 둘 다를 인식한다.
마이크로어레이는 MALDI MS에 의한 검출을 위한 상이한 매트릭스를 요구하는 2개의 별개의 표적에 특이적으로 결합하는 포획제를 포함할 수 있다. 이러한 상이한 매트릭스의 예로는 α-시아노-4-히드록시신남산 (CHCA) 및 2,5-디히드록시벤조산 (DHB), CHCA 및 시나핀산 (SA), CHCA 및 2'6'-디히드록시아세토페논 (DHAP) 및 다른 조합을 들 수 있다. 이러한 포획제의 예는 이전의 단락에 기재된 염소 항-아코니타제 2 항체이다.
한 실시양태에서, 2개의 별개의 표적은 동위원소적 표지를 포함하지 않으며, 즉, 제1 표적 및 제2 표적은 유사한 동위원소 풍부도를 갖는다. 예를 들어, 제1 및 제2 표적 둘 다는 그들의 구조에 존재하는 모든 화학적 원소에 관하여 천연 동위원소 풍부도를 가질 수 있다. 탄소 및 질소에 대해, 천연 동위원소 풍부도는 각각 약 98.9%의 12C 및 약 99.6%의 14N인 것으로 공지되어 있다.
한 실시양태에서, 2개의 별개의 표적은 상이한 동위원소 풍부도를 가지며, 예를 들어 제1 표적, 제2 표적 또는 제1 표적 및 제2 표적 둘 다는 동위원소 표지된다. 펩티드의 동위원소 표지화는 하나 또는 몇몇 안정한 동위원소, 예컨대 2H, 13C, 15N 및 18O를 혼입함으로써 달성될 수 있다. 펩티드의 동위원소 표지화는 또한 방사성 동위원소를 사용하여 달성될 수 있다. 단일 아미노산에서의 동위원소 표지의 존재는 통상적으로 동일한 아미노산의 비표지된 버전에 비해 4 내지 10 Da의 질량 이동을 초래한다.
전형적인 상향식 프로테오믹 검정에서의 단백질분해성 펩티드의 비표지된 및 동위원소-표지된 형태 사이의 질량 차이는 통상적으로 10 Da을 초과하지 않음이 주목된다. 부분적으로, 이는 가장 통상적인 소화 효소, 트립신이 일반적으로 단일 리신 또는 아르기닌 잔기를 함유하는 펩티드를 생성하기 때문이다. 리신 및 아르기닌의 13C, 15N 동위원소-표지된 버전은 그들의 비표지된 대응물과 각각 8 및 10 Da만큼 상이하다. 다른 소화 효소, 예컨대 키모트립신을 사용하는 것은 몇몇 리신 및/또는 아르기닌 잔기를 함유하는 단백질분해성 펩티드를 생성할 수 있지만, 또한 이들 아미노산을 함유하지 않는 펩티드를 생성할 수 있다.
한 실시양태에서, 반응성 부위는 질량 분광법에 의한 제1 및 제2 표적의 분석과 혼화성인 형태로 비드로부터의 제1 및 제2 표적의 방출을 가능하게 하도록 구성되어 있다. 본 명세서 전반에 걸쳐, 질량 분광법의 사용은 주로 매트릭스 보조 레이저 탈착 이온화 비행 시간 질량 분광법 (MALDI TOF MS: Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry)의 예를 사용하여 예시된다. 그러나, 질량 분광법적 분석의 다수의 다른 방법이 분석물 이온화 및 분석물 검출 둘 다에 관하여 대안적으로 사용될 수 있음이 주목된다. 특히, 레이저 제거 전기분무 이온화 (LAESI: Laser Ablation ElectroSpray Ionization) 및 탈착 전기분무 이온화 (DESI: Desorption ElectroSpray Ionization) MS로 공지된 방법을 비롯한 전기분무 이온화 MS (ESI MS: ElectroSpray Ionization MS) 분석의 다양한 방법이 사용될 수 있다.
한 실시양태에서, 제1 및 제2 표적은 펩티드이며, 질량 분광법에 의한 분석은 선형 모드로 MALDI TOF MS에 의해 수행된다. 리플렉터 모드에 비해 선형 모드에서 펩티드를 측정하는 것의 이점은 보다 큰 검출 민감도 및 분석물 단편화로부터의 스펙트럼적 기여, 예컨대 인-소스 붕괴 (ISD: in-source decay) 및 포스트-소스 붕괴 (PSD: post-source decay)의 최소화를 포함할 수 있다. 예를 들어, 많은 포스포펩티드는 MALDI TOF MS에 의해 측정되는 경우 질량 분광계 내부에서 광범위한 단편화를 겪는 것으로 공지되어 있다. 그러나, 그들의 단편화의 스펙트럼적 효과는 리플렉터 모드에서 획득된 질량 스펙트럼에 비해 선형 모드에서 획득된 질량 스펙트럼에서 덜 현저하다. MALDI TOF MS에 의해 수행되는 펩티드 분석에 대해, 양성 검출 모드는 보다 빈번히 사용되지만, 음성 검출 모드는 또한 이용될 수 있다. 대략 10,000 Da 미만의 분자량을 갖는 분석물에 대해, MALDI TOF MS에 의한 측정은 리플렉터 모드에서 수행될 수 있다. 또한, MALDI TOF MS에 의한 특정 분석물의 측정은 탠덤 (MS-MS) 모드에서 수행될 수 있다.
질량 대 전하 (m/z) 비는 질량 분광법에 의해 통상적으로 측정되는 분석물 특성 중 하나이다. 측정된 m/z 비를 분석물 분자량 (MW)으로 전환시키는 것은 통상적으로 간단하다. 예를 들어, 양성 모드에서 MALDI TOF MS에 의해 측정된 펩티드 분석물은 대개 전하 (z)가 +1이고, 질량 (m)이 펩티드 분석물의 분자량 플러스 양성자의 질량과 동등한 단일-전하 양성자화 이온으로서 검출된다. 따라서, 질량 분광법을 사용하여 측정된 분석물의 분자량을 결정할 수 있다. 분자 질량으로도 용어화되는 분자량은 통상적으로 원자 질량 단위 (amu) 또는 달톤 (Da)으로 보고된다. 분석물 구조에서의 안정한 동위원소, 예컨대 13C 및 15N의 존재는 약 1 m/z 단위만큼 분리된 분석물 질량 스펙트럼에서의 다수의 피크의 출현을 초래한다. 이러한 다수의 피크는 동위원소적 엔벨로프로 공지되어 있다. 동위원소적 엔벨로프의 존재로 인해, 질량 분광법에 의해 측정된 분석물 분자 질량은 단일동위원소적 질량으로서 또는 평균 질량으로서 보고될 수 있다.
이 명세서에 개시된 마이크로어레이는 특정한 비드에 결합된 표적 분석물의 정체성이 그 표적 분석물의 직접 질량 분광법적 측정에 의해 결정될 수 있는 표적-인코딩된 비드 어레이로서 기재될 수 있다. 표적-인코딩된 비드 어레이는 개별적 비드의 위치적, 광학적 또는 질량 태그 인코딩을 요구하지 않을 수 있다. 더욱이, 표적-인코딩된 비드 어레이는 포획제의 질량 분광법적 분석을 요구하지 않을 수 있다. 결과적으로, 포획제는 심지어 상응하는 표적 분석물이 비드로부터 방출된 후에도 비드에 결합되어 잔류할 수 있다. 비드로부터의 표적 분석물의 방출 후에 비드 상에 포획제를 보유하는 것은 보다 양호한 품질의 질량 스펙트럼, 예를 들어 보다 낮은 배경 및 보다 강한 분석물 신호를 갖는 질량 스펙트럼을 얻는 것을 도울 수 있다. 대안적으로, 포획제는 질량 분광법에 의한 분석과 반드시 혼화성이지 않은 형태로 비드로부터 방출될 수 있으며, 예를 들어 포획제의 분자량은 질량 분광계의 질량 검출 범위 밖일 수 있다.
표적-인코딩된 비드 어레이는 그의 각각의 포획제에의 표적 분석물의 결합이 일어난 후에, 예를 들어 비드 어레이가 샘플에 노출된 후에 및 바람직하게는 샘플의 비반응된 부분이 제거된 후에 디코딩된다. 질량 분광법에 의한 분석은 다수의 m/z 위치 (다수의 질량 채널)에서의 신호 강도의 측정을 포함하며; 따라서, 단일 질량 분광법적 측정은 특정한 표적 분석물의 정체성 및 샘플에서의 그의 풍부도 둘 다를 결정하기에 충분한 데이터를 제공할 수 있음이 주목된다.
표적-인코딩된 비드 어레이에서의 표적 분석물의 성공적인 식별은 샘플에서의 충분한 양의 표적 분석물의 존재에 의존함이 주목된다. 샘플에서의 표적 분석물의 양이 검출 한계 미만인 경우, 표적 분석물은 검출되거나 식별되지 않을 것이다. 그럼에도 불구하고, 이러한 음성 결과는, 그것이 특정한 표적 분석물이 샘플에 부재하거나, 샘플에서의 그의 풍부도가 특정 역치 미만임을 밝혀내기 때문에, 가치있는 정보를 제공한다.
표적-인코딩된 비드 어레이를 제조하는 예시적인 방법이 하기 개시되며, 본 명세서의 실시예 섹션에 보다 상세히 기재된다. 한 실시양태에서, 방법은 (1) 비드에 결합할 수 있고, 비드에 결합되는 경우 상이한 분자량을 갖는 적어도 제1 표적 및 제2 표적에 결합할 수 있는 포획제를 선택하는 단계 및 (2) 제1 표적의 정체성, 제1 표적의 분자량으로부터 유래된 값 및 제2 표적의 분자량으로부터 유래된 값에 관한 정보를 함유하는 디코딩 표를 기록하는 단계를 포함한다.
단계 1: 포획제를 선택하는 단계. 이 단계는 비드 어레이에 이용되는 항체를 선택하고 획득하는 것을 포함한다. 항체는 특이적 바이오마커를 프로파일링하고, 특이적 유형의 단백질 변형을 프로파일링하고, 특이적 생물학적 또는 세포 경로를 프로파일링하고, 다수의 세포 경로를 프로파일링하고, 특이적 질환 또는 특이적 세포 상태와 연관된 분자적 변화를 프로파일링하는 등의 목적으로 선택될 수 있다. 항체는 총 단백질 풍부도를 프로파일링하도록 선택될 수 있으며, 대안적으로 항체는 부위-특이적 단백질 풍부도, 예컨대 특이적 단백질 부위에서의 단백질 번역후 변형 (PTM)의 정도를 프로파일링하도록 선택될 수 있다. 항체는 상업적 판매자로부터 구입되거나, 주문-생산될 수 있다. 항체는 모노클로날 또는 폴리클로날일 수 있다. 항체는 다양한 숙주 종, 예를 들어 토끼, 마우스, 염소, 말, 닭에서 발생될 수 있거나, 이는 합성적으로 제조될 수 있다. 상이한 숙주 종으로부터의 항체는 동일한 비드 어레이 내에서 이용될 수 있다. 한 실시양태에서, 면역원은 펩티드이다. 한 실시양태에서, 면역원은 전장 단백질 또는 생물학적 세포이다. 에피토프 서열 또는 특정한 항체에 대한 면역화 펩티드의 서열은 공지되어 있는 것이 바람직하다. 그러나, 또한, 에피토프 서열 또는 면역화 펩티드의 서열이 공지되지 않은 항체를 이용하는 것이 가능하다. 후자의 예는 본 명세서의 실시예 섹션에 나타내어진다.
상업적 판매자로부터 항체를 얻는 것은, 많은 시판되는 항체가 이들 항체가 입증된 적용, 예를 들어 웨스턴 블롯 (WB), 면역침전 (IP), 면역형광 (IF), 면역조직화학 (IHC), 유동 세포측정 (FC), 크로마틴 면역침전 (ChIP), 효소-연결 면역흡착 검정 (ELISA), 샌드위치 면역검정 등의 목록이 이미 제공되기 때문에 유리할 수 있다. 이러한 정보는 이것이 세포 배양물, 조직, 생체유체 및 동물 모델에서 상기-열거된 적용을 사용하여 수행된 동일한 단백질 표적의 후속 연구와 함께 질량 분광법에 의한 특이적 단백질 표적의 정량적 분석의 통합을 가능하게 하기 때문에 가치있을 수 있다.
공지된 에피토프를 갖는 항체를 선택하는 경우 한 가지 고려사항은 에피토프가 표적 분석물에서 보존되어야 한다는 것이다. 구체적으로, 분석되는 샘플이 소화 효소와의 단백질의 인큐베이션에 의해 생성되는 경우, 에피토프는 바람직하게는 소화 효소의 절단 부위를 함유하지 않아야 한다. 예를 들어, 트립신과의 인큐베이션에 의해 생성된 샘플에 대해, 에피토프는 바람직하게는 내부 아르기닌 또는 리신을 함유하지 않아야 한다. 마찬가지로, Lys-C 또는 Lys-N과의 인큐베이션에 의해 생성된 샘플에 대해, 에피토프는 바람직하게는 내부 리신을 함유하지 않아야 한다. 그러나, 상기 요건은 소화 효소에 의한 불완전한 소화가 심지어 잠재적 절단 부위가 에피토프 내에 존재하는 경우에도 에피토프를 보존할 수 있기 때문에 절대적이지는 않다. 또한, 특정 단백질 변형은 소화 효소에 의해 정상적으로 인식되는 절단 부위의 패턴을 변경시킬 수 있다. 예를 들어, 리신에 인접한 티로신의 인산화는 빈번히 트립신에 의해 상실된 절단을 초래한다. 공지된 에피토프를 갖는 항체를 선택하기 위한 또 다른 고려사항은 선형 또는 연속적 에피토프가 일반적으로 펩티드 면역친화성 풍부화를 수행하는데 바람직하다는 것이다.
전체적으로, 특정한 비드 어레이에 대해 선택되는 별개의 포획제, 예를 들어 별개의 항체의 총 수는 10개 미만, 10 내지 30개, 30 내지 100개, 100 내지 500개, 500 내지 1,000개, 1,000 내지 10,000개 또는 10,000개 초과일 수 있다. 다수의 복제물 비드, 예를 들어 2개의 비드, 3개의 비드, 5개의 비드, 10개의 비드 또는 더 많은 수는 각각의 포획제에 대해 제공될 수 있다. 직경이 대략 300 μm인 구형 비드에 대해, 약 25개의 비드가 1 μL 부피 내로 패킹될 수 있고, 약 2,500개의 비드가 100 μL 부피 내로 패킹될 수 있고, 약 25,000개의 비드가 1 ml 부피 내로 패킹될 수 있다. 표준 현미경 슬라이드의 치수, 25x75 mm를 갖는 마이크로웰 플레이트는 300 μm 직경 비드의 5,000개 초과의 어레이에 사용될 수 있다. 표준 미세역가판의 치수, 86x128 mm를 갖는 마이크로웰 플레이트는 300 μm 직경 비드의 25,000개 초과의 어레이에 사용될 수 있다.
단계 2: 디코딩 표를 기록하는 단계. 이 단계는 단계 1에서 이전에 선택된 개별적 항체에 결합할 수 있는 펩티드의 정체성을 해명하는 것을 포함한다. 구체적으로, 특정한 항체에 결합할 것으로 예상되는 펩티드에 대해, 가능한 번역후 변형 (PTM) 및 펩티드 분자량을 포함하는 펩티드의 아미노산 서열은 바람직하게는 해명된다. 이러한 데이터는 특정한 항체에 대한 공지된 에피토프 서열(들)을 분석하고, 이어서 에피토프(들) 외부의 펩티드 아미노산 조성을 결정하여 특정한 분석적 작업흐름과 연관된 상이한 샘플 제조 조건에 대해 설명함으로써 생성될 수 있다. 예를 들어, 펩티드 길이 및 분자량은 샘플을 제조하는데 사용된 소화 효소의 선택에 의해 영향을 받을 수 있다. 통상적인 프로테오믹 기법, 예컨대 시스테인 환원 및 알킬화의 사용은 또한 생성된 펩티드의 아미노산 서열 및 분자량에 영향을 미칠 것이다. 더욱이, 분석되고 있는 샘플의 성질은 또한 상이한 표적 분석물의 존재에 기여할 수 있으며, 예를 들어 상승된 수준의 단백질 인산화를 유발하는 조건 하에서 배양된 포유동물 세포는 더 많은 수의 인산화된 부위를 갖는 펩티드를 생성할 것으로 예상된다.
또한 본 명세서에 개시된 대안적인 방법은 이어서 문서화될 수 있는 한정된 조건 하에서 수행되는 개별적 항체의 실험적 시험 및 입증을 포함한다. 이러한 조건은 특정 소화 효소의 사용, 특정 샘플 유형, 예를 들어 세포 배양물의 사용, 특정 세포주의 사용, 질량 분광법의 특정 방법의 사용 및 특정 분석적 기법, 예를 들어 단백질 인산화의 프로파일링의 사용을 포함할 수 있다. 개시된 방법에서, 바람직하게는 고체 지지체, 예를 들어 비드에 결합된 개별적 항체는 표적 분석물(들)을 함유하는 샘플에 노출되고, 면역친화성 포획 반응이 수행된다. 항체에 결합하는 표적 분석물(들)은 이어서 고체 지지체로부터 방출되고, 질량 분광법에 의해 분석된다. 질량 분광법에 의한 분석은 개별적 표적 분석물의 분자량의 결정, 뿐만 아니라 공지된 단편화 기법, 예컨대 충돌 유도된 해리 (CID), 전자 전달 해리 (ETD), 인 소스 붕괴 (ISD), 포스트-소스 붕괴 (PSD) 등을 사용하여 수행된 개별적 표적 분석물의 아미노산 서열의 결정을 포함할 수 있다. 상기 개시된 절차는 그 후 비드 어레이 내의 다른 항체에 대해 반복된다.
표적-인코딩된 비드 어레이를 사용하여 생물학적 샘플을 분석하는 예시적인 방법은 하기에 개시되며, 본 명세서의 실시예 섹션에 보다 상세히 기재된다. 한 실시양태에서, 표적-인코딩된 비드 어레이는 적어도 1개의 반응성 부위 및 디코딩 표를 포함한다. 반응성 부위의 예는 비드에 결합된 항체이다. 비드-결합된 항체는 상이한 MW를 갖는 적어도 2개의 별개의 표적 분석물에 결합할 수 있다: 제1 표적 분석물 및 제2 표적 분석물. 디코딩 표는 제1 표적 분석물의 정체성에 관한 정보, 제1 표적 분석물의 MW, m/z 비 및/또는 TOF 값에 관한 정보, 제2 표적 분석물의 정체성에 관한 임의적 정보 및 제2 표적 분석물의 MW, m/z 비 및/또는 TOF 값에 관한 정보를 포함한다. 따라서, 디코딩 표는 제1 표적 분석물의 MW 및 제2 표적 분석물의 MW로부터 유래된 값과 연관된, 질량 스펙트럼에서의 2개의 신호의 검출에 기반한 비드 어레이에서의 제1 표적 분석물의 식별을 가능하게 하는 충분한 정보를 함유한다. 일부의 경우, 질량 스펙트럼에서 심지어 단일 신호의 검출은 제1 표적 분석물을 분명하게 식별하는데 충분할 수 있다. 이는 제1 표적 분석물의 분자량이 충분히 고유한 경우, 즉, 비드 어레이에 의해 포획되는 다른 표적 분석물이 동일하거나 매우 유사한 분자량을 갖지 않는 경우 일어날 수 있다.
한 실시양태에서, 표적-인코딩된 비드 어레이를 사용하여 생물학적 샘플을 분석하는 방법은 하기 단계를 포함한다: (1) 비드 어레이의 반응성 부위를 반응성 부위에의 제1 표적 및 제2 표적의 결합을 허용하는 조건 하에서 제1 표적 및 제2 표적을 함유하거나 함유할 수 있는 샘플과 접촉시키는 단계; (2) 접촉 단계 후, 제1 표적으로부터의 신호 및 제2 표적으로부터의 신호가 질량 스펙트럼에서 검출가능하거나 사실상 검출되도록 반응성 부위로부터 질량 스펙트럼을 획득하는 단계, (3) 비드 어레이와 함께 제공된 디코딩 표를 사용하여 질량 스펙트럼에서 제1 표적으로부터의 신호 및 제2 표적으로부터의 신호를 식별하는 단계 및 (4) 제1 표적으로부터의 신호의 강도 및 제2 표적으로부터의 신호의 강도를 측정하는 단계.
단계 1: 반응성 부위를 샘플과 접촉시키는 단계. 이 단계는 면역친화성 정제 (IAP) 반응을 수행하고, 이어서 반응성 부위로부터 샘플의 비반응된 부분을 제거하는 것을 포함할 수 있다. 비드-기반 IAP 반응을 수행하는 다양한 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 비드의 현탁액을 샘플을 함유하는 수용액과 간단히 혼합하고, 특정 양의 시간 동안 인큐베이션할 수 있다.
단계 2: 질량 스펙트럼을 획득하는 단계. 이 단계는 결합된 표적 분석물(들)을 비드로부터 고체 지지체, 예컨대 MALDI 표적 플레이트 상의 스팟 상으로 용리하고, 질량 분광법을 사용하여 이러한 스팟 내에 국재화된 용리된 분석물(들)을 분석하는 것을 포함할 수 있다. 비드는 고체 지지체 상에 잔류할 수 있으며; 대안적으로, 비드는 질량 분광법에 의한 측정 전에 고체 지지체로부터 제거될 수 있다. 질량 분광법에 의한 분석이 MALDI MS의 사용을 포함하는 경우, 용리된 분석물은 MALDI 매트릭스와 혼합되어야 한다. MALDI 질량 분광계의 이온화 레이저 빔의 강도는 용리된 분석물(들)로부터의 충분히 강한 신호가 기록될 수 있도록 선택되어야 하며, 예를 들어 신호는 그의 신호-대-잡음 비가 적어도 3:1, 바람직하게는 적어도 10:1, 보다 바람직하게는 적어도 30:1, 가장 바람직하게는 적어도 100:1인 경우 충분히 강한 것으로 간주된다. 본 명세서에 개시된 방법은 1000:1 초과의 신호-대-잡음 비를 갖는 MALDI TOF MS에 의해 단일 비드로부터 용리된 분석물의 검출을 허용한다. 이온화 레이저 빔의 강도는 상이한 분석물을 함유하는 다수의 스팟이 측정되는 경우 조정을 요구할 수 있음이 주목된다.
단계 3: 제1 표적으로부터의 신호 및 제2 표적으로부터의 신호를 식별하는 단계. 한 실시양태에서, 이 단계는 신호에 대한 획득된 질량 스펙트럼, 예를 들어 배경 수준 초과의 강도를 갖는 피크를 검색하고, 일단 이러한 피크가 특이적 m/z 값에서 검출되었으면, 디코딩 표를 검색하여 질량 스펙트럼에서 검출된 m/z 값과 동일하거나 충분히 가까운 m/z 값과 연관된 표적 분석물을 발견하는 것을 포함한다. 이 프로세스는 그 후 다른 피크가 질량 스펙트럼에 존재하는 경우 반복된다. 일부의 경우, 표적 분석물의 식별은 질량 스펙트럼에서 단일 피크를 검출함으로써 달성될 수 있다. 대안적으로, 표적 분석물의 식별은 질량 스펙트럼에서 2개 이상의 피크를 검출함으로써 달성될 수 있다.
단계 4: 제1 표적으로부터의 신호의 강도 및 제2 표적으로부터의 신호의 강도를 측정하는 단계. 이 단계는 분석적 소프트웨어를 사용하여 질량 스펙트럼에서 검출된 피크(들)의 강도를 결정함으로써 달성될 수 있다. 신호 강도는 피크 높이, 피크하 면적으로서 또는 다른 공지된 형식을 사용하여 보고될 수 있다.
마이크로어레이의 개별적 반응성 부위와의 샘플의 인큐베이션은 반응성 부위에의 1종 이상의 화합물의 비-특이적 결합을 초래할 수 있다. 이러한 화합물은 비드에 결합될 수 있으며, 대안적으로 이들은 포획제에 결합되거나, 링커, 예를 들어 단백질 A 또는 단백질 G에 결합될 수 있다. 비-특이적 결합의 문제를 경감시키기 위해, 디코딩 표는 이러한 비-특이적으로 결합된 화합물과 연관된 m/z 값에 관한 정보를 함유할 수 있다.
한 실시양태에서, 제1 표적 분석물 및 제2 표적 분석물은 차등적으로 변형된 펩티드이다. 예를 들어, 2종의 펩티드는 그들의 N-말단, C-말단 또는 둘 다에서 차등적으로 변형될 수 있다. 2종의 펩티드는 또한 특이적 아미노산, 예를 들어 리신, 시스테인, 아스파르트산, 글루탐산, 아르기닌, 히스티딘 등에서 차등적으로 변형될 수 있다. 본 명세서에 개시된 방법에 대해, 적합한 펩티드 변형은 차등적 동위원소 풍부도를 갖는 화합물로의 변형 뿐만 아니라 동일한, 예를 달어 천연 동위원소 풍부도를 갖는 화합물로의 변형을 포함한다.
한 실시양태에서, 제1 표적 분석물 및 제2 표적 분석물은 차등적으로 변형되지 않은 펩티드이다. 예를 들어, 제1 표적 분석물은 생물학적 시편의 효소적 소화에 의해 생성된 내인성 펩티드일 수 있고, 제2 표적 분석물은 제1 표적 분석물을 함유하는 효소적으로 소화된 생물학적 시편에 첨가된 내부 표준물 펩티드일 수 있다. 이 예에서, 제1 및 제2 표적 분석물은 동일한, 예를 들어 천연 동위원소 풍부도를 갖지만, 그들의 아미노산 조성에 있어서 상이할 수 있으며, 아미노산 조성의 차이는 적어도 1개의 아미노산의 치환, 변형, 부가 또는 결실이다.
한 실시양태에서, 본 개시내용의 마이크로어레이에 의한 분석에 적합한 샘플은 소화된 생물시편, 예컨대 배양된 생물학적 세포, 생물학적 조직, 생물학적 유체 또는 이종이식편의 현탁액 또는 펠릿이다. 소화는 효소적 또는 비-효소적 화합물을 사용하여 수행될 수 있다. 더욱이, 생물시편은 소화 반응을 수행하기 전에 세포 용해로 처리될 수 있다.
그러나, 특정 적용에서, 생물학적 샘플은 친화성 풍부화 단계를 수행하기 전에 용해되고/거나 소화될 필요는 없다. 예를 들어, 비분획화된 혈청은 다수의 순환 펩티드를 함유하는 것으로 공지되어 있다. 또 다른 예는 배양된 세포로부터 세포 배양 배지 내로 방출되는 분비된 펩티드의 분석이다.
본 명세서에 개시된 마이크로어레이는 다양한 유형의 단백질 PTM, 예컨대 인산화, 아세틸화, 메틸화, 글리코실화, 유비퀴틴화, SUMO화 및 기타를 프로파일링하는데 적합하다. 한 실시양태에서, 마이크로어레이 반응성 부위는 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체 또는 압타머를 함유하며, 마이크로어레이 반응성 부위에 의해 특이적으로 포획되는 모든 표적은 에피토프를 함유한다. 한 실시양태에서, 에피토프는 6개 미만의 인접한 아미노산, 5개 미만의 인접한 아미노산 또는 4개 미만의 인접한 아미노산을 함유한다. 한 실시양태에서, 에피토프는 불연속적이며, 즉, 상응하는 항체에 의해 인식되는 아미노산의 적어도 일부는 서로에 인접하지 않는다. 한 실시양태에서, 에피토프는 제1 PTM을 함유하며, 표적 중 적어도 하나는 에피토프의 외부에 위치한 제2 PTM을 함유한다. 한 실시양태에서, 에피토프는 PTM을 함유하지 않으며, 표적 중 적어도 하나는 PTM을 함유한다. 한 실시양태에서, 마이크로어레이 반응성 부위에 결합하는 각각의 표적은 적어도 하나의 표적에서 번역후에 변형되는 단백질 부위를 함유하며, 적어도 하나의 표적에서 PTM을 결여한다. 한 실시양태에서, 마이크로어레이 반응성 부위에 의해 포획되는 개별적 표적은 별개의 생물학적 경로의 구성요소인 별개의 단백질로부터 유래된다.
본 개시내용은 하기 실시예에서 기재되며, 이는 본 개시내용의 이해를 돕기 위해 제시되고, 그 후에 이어지는 청구범위에서 정의된 바와 같은 본 개시내용의 범위를 어떤 식으로도 제한하는 것으로 해석되지 않아야 한다. 하기 실시예는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 본 개시내용을 생성하고 사용하는 방법의 완전한 개시 및 설명을 제공하기 위해 제시되고, 본 개시내용의 범위를 제한하는 것으로 의도되지 않으며, 이들은 하기 실험이 수행된 모든 또는 유일한 실험임을 나타내는 것으로 의도되지 않는다. 사용된 수 (예를 들어 양, 온도, 부피, 시간 등)에 관하여 정확성을 보장하기 위한 노력이 기울여 졌으나, 일부 실험적 오차 및 편차가 설명되어야 한다.
실시예
물질 및 장비
N-히드록시숙신이미드 (NHS)-활성화된 자성 6% 아가로스 비드를 큐브 바이오테크(Cube Biotech) (미국 펜실베니아주 플리마우스 미팅)에 의해 주문 제작하였다. 개별적 비드의 직경은 광학 현미경검사에 의해 결정 시 대략 250 μm 내지 500 μm였다. 이들 다분산 비드를 <280 μm, 280 내지 355 μm, 355 내지 375 μm, 355 내지 400 μm, 375 내지 400 μm, 375 내지 420 μm, 400 내지 420 μm, 400 내지 450 μm 및 >450 μm 직경 범위의 비드를 함유하는 분획을 포함하는 보다 좁은 크기 분포를 갖는 분획으로 추가로 분리하였다. 비드 분획화를 비드 현탁액을 바람직한 크기 분획이 생성될 때까지 일련의 폴리에스테르 메쉬 필터 (엘코 필터링 캄파니, 엘엘씨(ELKO Filtering Co, LLC))를 통해 수동으로 통과시킴으로써 달성하였다. 크기 분획화된 비드를 추가의 사용까지 순수한 이소프로판올 (피셔 케미칼(Fisher Chemical), 카탈로그 번호 A416-4)에 저장하였다.
특정 적용을 위해, 다양한 정도의 아가로스 가교를 갖는 자성 아가로스 비드를 사용하였다. 수성 매질로 충전된 96-웰 다중웰 플레이트의 웰 내로 정치되는 경우 보다 높은 정도의 아가로스 가교를 갖는 비드는 예를 들어 800 RPM 이상의 속도에서 12시간 초과 동안 개별적 비드 파손 없이 철저한 진탕을 견딜 수 있었음이 실험적으로 결정되었다.
특정 적용을 위해, 6% 초과의 아가로스 함량을 갖는 자성 비드가 사용되었으며, 예를 들어 비드는 7.5% 또는 9% 아가로스 중 어느 하나를 함유하였다. 6% 초과의 아가로스 함량을 갖는 비드는 다양한 펩티드 분석물의 결합 및 후속의 용리 후에 보다 강한 MS 신호를 생성하였음이 실험적으로 결정되었다.
특정 적용을 위해, 보다 큰 자성 아가로스 비드, 예를 들어 700 내지 790 μm, 790 내지 910 μm 및 >910 μm 직경 범위의 비드를 사용하였다.
특정 적용을 위해, 보다 작은 크기 자성 아가로스 비드, 예를 들어 160 내지 200 μm 직경 범위의 비드를 사용하였다.
산화인듐주석 (ITO: Indium Tin Oxide) 표면 코팅된 유리 현미경 슬라이드, 카탈로그 번호 237001은 브루커 달토닉스(Bruker Daltonics) (미국 매사추세츠주 빌레리카)로부터의 것이었다. 개별적 슬라이드는 25mm x 75mm x 0.9mm의 치수를 가지며, 브루커 달토닉스로부터 입수가능한 MALDI 화상화를 위한 MTP 슬라이드 어댑터 II(MTP Slide Adapter II) (카탈로그 번호 235380)와 함께 사용되도록 설계된다.
금 표면-코팅된 유리 현미경 슬라이드는 피셔 사이언티픽(Fisher Scientific) (카탈로그 번호 12-550-59)으로부터의 것이었다.
실리콘 아이솔레이터즈(SILICONE ISOLATORS)™로도 공지된 실리콘 마이크로웰 가스킷을 표준 등급의 폴리디메틸실록산 (PDMS)을 사용하여 그레이스 바이오-랩스(Grace Bio-Labs) (미국 오레곤주 벤드)에 의해 주문 제작하였다. 실리콘 가스킷의 전체 치수는 25mm x 75mm x 0.5mm였다. 각각의 가스킷은 26 x 88 마이크로웰의 정사각형 그리드 어레이를 함유하였다. 각각의 마이크로웰의 내경은 0.5 mm였으며, 인접한 마이크로웰은 0.3 mm의 거리 (중심-대-중심으로서 측정된 0.8 mm의 거리)만큼 분리되었다. 주변 웰 사이의 대략 2.5 mm의 영역 및 가스킷의 엣지는 웰을 함유하지 않았다.
특정 적용을 위해, 25 mm x 73 mm x 0.5 mm, 23 mm x 75 mm x 0.5 mm 및 23 mm x 73 mm x 0.5 mm를 비롯한 보다 작은 길이 및/또는 폭을 갖는 실리콘 가스킷을 사용하였다. 25 mm x 75 mm ITO 유리 슬라이드에 부착되는 경우 보다 작은 폭 및/또는 길이를 갖는 실리콘 가스킷은, 슬라이드가 엣지로부터 유지되고 있는 경우 손가락이 슬라이드로부터 가스킷을 우연히 당길 가능성이 적기 때문에, 수동 취급 동안 보다 적은 파손의 위험을 갖는 수밀 밀봉부를 형성한다.
1, 2, 3, 4, 8, 16, 24 및 64개의 챔버를 포함하는 몇몇 구성에서의 프로플레이트® 다중-웰 챔버는 그레이스 바이오-랩스로부터 구입하였다.
단백질 A+G는 압캠(Abcam) (카탈로그 번호 ab52213)으로부터 구입하였다. 제조자의 웹사이트 상에 포스팅된 제품 설명은 단백질 A+G를 "... 단백질 A 및 단백질 G 둘 다의 IgG 결합 프로파일을 조합하는 유전자 조작된 융합 단백질"로 지칭한다.
달리 언급되지 않는다면, 소모품, 예컨대 미세원심분리 튜브, 피펫 팁, 웨이 보트 등은 표준 연구 등급이었다. 달리 언급되지 않는다면, 시약, 예컨대 유기 용매, 산, 염, 완충제, 세정제, MALDI 매트릭스 등은 99% 이상의 순도를 갖는 표준 연구 등급이었으며, 추가의 정제 없이 제조자로부터 수령한 대로 사용되었다. 표준 실험실 장비는 미세원심분리기, 마이크로플레이트 원심분리기, 자성 튜브 랙, 미세역가판 진탕기, 볼텍서 등을 포함하였다.
MALDI 매트릭스 용액을 침착시키기 위한 로봇식 액체 분무기 아이매트릭스스프레이(iMatrixSpray)는 타르도 게엠베하(Tardo GmbH) (스위스 수빙겐)로부터 구입하였다. 아이매트릭스스프레이의 설계 및 작동은 최근 간행물: [CHIMIA International Journal for Chemistry (2014), Volume 68(3), pp. 146-149]에 기재되어 있다.
실험 결과
이 출원에 개시된 조성물 및 방법을 사용하여 수행된 실험 및 생성된 실험 데이터의 일부는 하기에 기재된다.
실시예 1
단백질 A+G 접합된 자성 아가로스 비드를 제조하기
자성 퀵픽(QuicPick) 장치 (바이오-노바일(Bio-Nobile), 카탈로그 번호 24001)를 사용하여, 이소프로판올 중 100 내지 125개의 크기-분획화된 큐브 바이오테크 퓨어큐브 매그비즈(PureCube MagBeads) XXL NHS-활성화된 비드를 약 300 μL의 이소프로판올을 함유하는 0.65 mL 플라스틱 미세원심분리 튜브 (코스타(Costar), 카탈로그 번호 3208)에 옮겼다. 이어서, 이소프로판올을 제거하였다. 약 640 μL의 1x PBS (피셔 사이언티픽, 카탈로그 번호 BP24384)를 튜브에 첨가하고, 튜브를 실온에서 5분 동안 회전시켰다. 1X PBS 중 80 μg의 재조합 단백질 A+G를 튜브에 첨가하였다. 추가의 양의 1X PBS를 튜브가 가득 찰 때까지 첨가하였다. 튜브를 튜브 회전기 (크리스탈 인더스트리즈(Crystal Industries)로부터의 사일런트 쉐이크 리볼버(Silent Shake Revolver), 카탈로그 번호 HYQ-1130A) 상에서 저속에서, 4℃에서 최소 3시간 동안, 통상적으로 밤새 인큐베이션하였다. 튜브를 회전기로부터 제거하고, 2초 미만 동안 간단히 원심분리하였다. 상청액을 제거하였다. 20 μL의 10X 트리스-글리신 완충제를 첨가하여 잔류하는 반응성 NHS 기를 켄칭하였다. 튜브를 튜브 회전기 상에서 저속에서 실온에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 트리스-글리신 완충제를 제거하고, 300 μL의 1X PBS로 대체하였다. 비드를 그들을 자성 분리 스탠드 (프로메가(Promega), 카탈로그 번호 Z5332)를 사용하여 용액을 통해 이동시킴으로써 세척하였다. PBS를 제거하고, 세척 단계를 1회 더 반복하였다. 400 μL 1X PBS를 저장을 위해 첨가하고, 비드를 4℃에서 저장하였다. 기재된 절차 전반에 걸쳐, 비드를 피펫 팁과 직접적으로 닿아, 강력한 피펫 혼합 또는 과도한 볼텍싱을 적용하는 것을 회피하도록 주의를 기울였다.
실시예 2
항체 접합된 자성 아가로스 비드를 제조하기
이전의 실시예에 기재된 바와 같이 제조된 약 20개의 단백질 A+G 접합된 비드를 깨끗한 0.65 mL 미세원심분리 튜브에 옮겼다. 저장 용액을 제거하고, 300 μL의 1X PBS를 비드에 첨가하였다. 비드를 그들을 자성 분리 스탠드를 사용하여 PBS 용액을 통해 이동시킴으로써 세척하였다. PBS 용액을 제거하고, 5 μg의 포스포-S6 리보솜 단백질 (Ser235/236) (D57.2.2E) XP® 토끼 모노클로날 항체, 카탈로그 번호 4858 (셀 시그널링 테크놀로지(Cell Signaling Technology), 미국 매사추세츠주 댄버스)을 비드에 첨가하였다. 최적 결과는 항체가 소 혈청 알부민 (BSA) 또는 글리세롤을 함유하지 않은 배지에 제공된 경우 달성되었음이 실험적으로 결정되었다. 항체-비드 혼합물을 튜브 회전기 상에서 저속에서, 4℃에서 최소 3시간 동안, 통상적으로 밤새 인큐베이션하였다. 튜브를 회전기로부터 제거하고, 2초 미만 동안 간단히 원심분리하였다. 비결합된 항체를 비드로부터 제거하고, 300 μL의 1X PBS를 첨가하였다. 비드를 그들을 자성 분리 스탠드를 사용하여 용액을 통해 이동시킴으로써 세척하였다. PBS 용액을 제거하고, 세척 단계를 1회 더 반복하였다. 400 μL의 1X PBS를 저장을 위해 첨가하고, 비드를 4℃에서 저장하였다.
실시예 3
항체를 단백질 A+G 자성 아가로스 비드에 가교시키기
이전의 실시예에 기재된 바와 같이 제조된 항체-접합된 단백질 A+G 비드를 넓은 오리피스 피펫 팁을 사용하여 수동 피펫팅함으로써 깨끗한 미세원심분리 튜브에 옮겼다. 미세원심분리 튜브를 자성 스탠드 상에 정치하고, 비드와 함께 옮겨진 PBS 용액을 제거하였다. pH 8.2의 트리에탄올아민 (시그마-알드리치(Sigma-Aldrich), 카탈로그 번호 90279)의 300 μL의 새롭게 제조된 0.2M 용액을 비드에 첨가하고, 비드 현탁액을 간단히 볼텍싱한 후, 원심분리하고, 상청액을 제거하였다. 트리에탄올아민으로의 세척을 1회 더 반복하였다. pH 8.2의 0.2M 트리에탄올아민 중 디메틸 피멜리미데이트 디히드로클로라이드 (DMP, 시그마-알드리치, 카탈로그 번호 D8388)의 300 μL의 새롭게 제조된 25 mM 용액을 비드에 첨가하였다. 비드 현탁액을 간단히 볼텍싱한 후, 원심분리하였다. 비드 현탁액을 함유하는 미세원심분리 튜브를 실험실 회전기 상에 정치하고, 비드를 실온에서 45분 동안 회전시키면서 인큐베이션하였다. 이어서, 비드를 원심분리하고, 상청액을 제거하였다. pH 8.2의 에탄올아민 (시그마-알드리치, 카탈로그 번호 398136)의 300 μL의 새롭게 제조된 0.1M 용액을 첨가하였다. 비드 현탁액을 볼텍싱한 후, 원심분리하고, 상청액을 제거하였다. 에탄올아민 세척 단계를 1회 더 반복하였다. 비드 현탁액을 함유하는 미세원심분리 튜브를 실험실 회전기 상에 정치하고, 비드를 에탄올아민 용액에서 실온에서 1시간 동안 회전시키면서 인큐베이션하였다. 이어서, 상청액을 제거하고, 비드를 300 μL의 1X PBS 완충제 (피셔 사이언티픽, 카탈로그 번호 BP24384300)로 2회 세척하고, 1X PBS 완충제에서 4℃에서 저장하였다.
실시예 4
멀티플렉스화된 표적-인코딩된 비드 어레이를 어셈블리하기
라파마이신 (mTOR)의 기계적 표적 및 다른 경로에 관여하는 단백질 표적에 대해 특이적인 모노클로날 항체를 셀 시그널링 테크놀로지 (미국 매사추세츠주 댄버스), 알앤디 시스템즈(R&D Systems) (미국 미네소타주 미네아폴리스) 및 써모피셔(ThermoFisher) (미국 매사추세츠주 월텀)로부터 구입하였다. 셀 시그널링 테크놀로지로부터 구입한 항체는 포스포-p70 S6 키나제 (Thr389) (108D2) 토끼 mAb (카탈로그 번호 9234), 포스포-p70 S6 키나제 (Thr389) (1A5) 마우스 mAb (카탈로그 번호 9206), p70 S6 키나제 (49D7) 토끼 mAb (카탈로그 번호 2708), 포스포-S6 리보솜 단백질 (Ser235/236) (D57.2.2E) XP® 토끼 mAb (카탈로그 번호 4858), 포스포-S6 리보솜 단백질 (Ser240/244) (D68F8) XP® 토끼 mAb (카탈로그 번호 5364), S6 리보솜 단백질 (54D2) 마우스 mAb (카탈로그 번호 2317), 4E-BP1 (53H11) 토끼 mAb (카탈로그 번호 9644), 포스포-4E-BP1 (Thr37/46) (236B4) 토끼 mAb (카탈로그 번호 2855), 포스포-4E-BP1 (Ser65) (D9G1Q) 토끼 mAb (카탈로그 번호 13443), 포스포-4E-BP1 (Thr70) (D7F6I) 토끼 mAb (카탈로그 번호 13396), 포스포-Akt (Pan) (Ser473) (D9E) XP® 토끼 mAb (카탈로그 번호 4060), 포스포-Akt1 (Ser473) (D7F10) XP® 토끼 mAb (카탈로그 번호 9018), 포스포-Akt (Pan) (Thr308) (D25E6) XP® 토끼 mAb (카탈로그 번호 13038), Akt (pan) (C67E7) 토끼 mAb (카탈로그 번호 4691), Akt1 (C73H10) 토끼 mAb (카탈로그 번호 2938), 포스포-TSC2 (Thr1462) (5B12) 토끼 mAb (카탈로그 번호 3617), TSC2 (D93F12) XP® 토끼 mAb (카탈로그 번호 4308), 포스포-Gsk3b (Ser9) (D85E12) XP® 토끼 mAb (카탈로그 번호 5558) 및 GSK3b (D5C5Z) XP® 토끼 mAb (카탈로그 번호 12456)를 포함하였다. 알앤디 시스템즈로부터 구입한 항체는 인간 포스포-히스톤 H2AX (Ser139) (카탈로그 번호 AF2288), 인간/마우스/래트 포스포-ATM (Ser1981) (카탈로그 번호 AF1655), 인간 포스포-BRCA1 (Ser1423) (카탈로그 번호 AF1386), 인간 포스포-Chk2 (Thr68) (카탈로그 번호 AF1626), 인간 포스포-Chk1 (Ser345) (카탈로그 번호 AF2475)을 포함하였다. 고유한 포획 시약, 즉, 비드 어레이에 포함된 항체의 총 수는 50개 초과였다.
개별적 항체를 이전의 실시예에 기재된 절차를 사용하여 자성 아가로스 비드에 접합시켰다. mTOR 경로에서의 다수의 표적을 프로파일링하기 위한 일련의 멀티플렉스화된 비드 어레이를 상기 열거된 항체 중 1종에 접합된 1 내지 3개의 비드를 선택하고, 이어서 상이한 항체에 접합된 비드를 단일 1.7 mL 미세원심분리 튜브에서 조합함으로써 어셈블리하였다. 예를 들어, 도 3은 2종의 단백질: 4E-BP1 및 p70 S6 키나제의 총 단백질 풍부도 및 부위-특이적 인산화를 측정하기 위한 멀티플렉스화된 현탁액 비드 어레이를 나타낸다. 도 3에 나타내어진 비드 어레이는 700 내지 790 μm 직경 자성 아가로스 비드에 개별적으로 접합된 셀 시그널링 테크놀로지 항체 #2855, #9644, #2708 및 #9234를 함유하였다. 이 4-멀티플렉스 비드 어레이의 개별적 반응성 부위는 구별가능한 광학적 특성 또는 질량 태그를 갖지 않았으며, 이들은 위치적 인코딩을 갖지도 않았다. 그러나, 비드 어레이에 의해 포획된 표적 분석물은 표적 분석물의 정체성 및 분자량에 관한 정보가 마이크로어레이 디코딩 표에 제공되었기 때문에 질량 분광법에 의해 용이하게 식별가능하였다. 디코딩 표에서의 데이터를 비드 어레이에 포함된 항체의 각각을 독립적으로 확인함으로써 생성하였다. 항체 확인 프로세스는 (1) 특이적 항체에 접합된 단일 비드를 사용하여 소화된 세포 용해물로부터 펩티드 분석물(들)의 면역친화성 풍부화를 수행하는 단계, (2) 질량 분광법을 사용하여 비드-접합된 항체에 의해 포획된 분석물(들)을 측정하는 단계 및 (3) 검출된 분석물 신호(들), 즉, 질량 스펙트럼에서의 피크(들)를 특이적 펩티드 서열(들)에 할당하는 단계를 포함하였다. 피크 할당을 전구체 단백질 서열, 항체 특이성, 예를 들어 가능한 에피토프 및 소화 효소 특이성에 관한 이용가능한 정보를 사용하여 수행하였다. 구체적으로, 이 실시예에서, 모든 전구체 단백질은 인간 기원의 것이었으며, 소화 효소는 질량 분광법 시퀀싱 등급 트립신이었다. 이 비드 어레이의 개별적 반응성 부위에 의해 포획된 펩티드 표적은 표적의 분자량으로부터 유래된 단일 값에 기반한 특정한 표적의 분명한 식별을 가능하게 하기에 충분히 고유한 분자량을 가졌음이 실험적으로 결정되었다. 구체적으로, 4E-BP1의 총 단백질 풍부도를 측정하기 위한 항체 #9644를 함유하는 반응성 부위는, 하나의 상실된 절단 부위를 함유하고, 1469.58의 평균 계산된 [MH]+ m/z를 가진 4E-BP1의 C-말단으로부터 유래된 단백질분해성 단편 RAGGEESQFEMDI (서열식별번호(SEQ ID NO): 1)를 포획하였다. 동일한 반응성 부위는 또한 상실된 절단 부위를 함유하지 않고, 1313.39의 평균 계산된 [MH]+ m/z를 가진 단백질분해성 단편 AGGEESQFEMDI (서열식별번호: 2)를 포획하였다. Thr37 및 Thr46에서 4E-BP1의 인산화를 측정하기 위한 항체 #2855를 함유하는 반응성 부위는 2개의 포스포-기를 함유하고, 3209.32의 평균 계산된 [MH]+ m/z를 가진 단백질분해성 단편 VVLGDGVQLPPGDYSTTPGGTLFSTTPGGTR (서열식별번호: 3)을 포획하였다. 항체 #2855를 함유하는 반응성 부위는 3129.35의 평균 계산된 [MH]+ m/z를 가진 동일한 서열, 그러나 단일 포스포-기를 갖는 단백질분해성 단편을 포획하였다.
실시예 5
세포 용해, 단백질 소화 및 펩티드 추출
MKN45 인간 위암 세포를 20% FBS로 보충된 RPMI 1640 배지를 사용하여 배양하였다. 플레이트 상에서 약 80% 전면생장률로 성장된 세포를 차가운 PBS로 2회 세척하고, 1 mL의 우레아 용해 완충제를 플레이트에 첨가하고, 세포를 플레이트로부터 스크래핑하고, 50 mL 팔콘(FALCON)™ 원심분리 튜브에 수집하였다. 세포 현탁액을 각각의 시간에 20초 동안 15W 출력으로 3 내지 5개의 버스트에서 마이크로팁을 사용하여 초음파처리하였다. 세포 현탁액을 얼음 상에서 1분 동안 버스트 사이에서 냉각시켰다. 용해물을 5,000g에서 15분 동안 실온에서의 원심분리에 의해 청소하고, 상청액을 효소적 소화를 위해 깨끗한 튜브에 옮겼다.
청소된 세포 상청액을 환원, 알킬화 및 효소적 소화로 처리하였다. 1/278 부피의 1.25M DTT를 상청액과 혼합하고, 40℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 용액을 간단히 얼음 상에서 그것이 실온에 도달할 때까지 냉각시켰다. 이어서, 1/10 부피의 새롭게 제조된 100 mM 아이오도아세트아미드 용액을 첨가하고, 어둠에서 실온에서 15분 동안 인큐베이션하였다. 용액을 0.2M 중탄산암모늄 소화 완충제로 5배 희석하였다. 1/100 부피의 1 mg/mL 시퀀싱-등급 트립신 스톡을 첨가하고, 소화 반응을 혼합하면서 37℃에서 밤새 진행되게 하였다. 키모트립신으로의 소화를 위해, 1/60 부피의 1 mg/mL 키모트립신 스톡을 트립신 대신 첨가하고, 소화 반응을 혼합하면서 37℃에서 밤새 진행되게 하였다.
소화 반응 직후, 소화된 세포 용해물을 워터스 코포레이션(Waters Corporation), 카탈로그 번호 WAT051910으로부터의 0.7 mL SEP-PAK® C18 컬럼 상에서 정제하였다. 단백질 소화로부터의 펩티드를 컬럼 상에 로딩하기 전에, 소화된 용해물을 1/20 부피의 10% TFA를 0.5% TFA의 최종 농도로 첨가함으로써 산성화시켰다. 용액을 얼음 상에서 15분 동안 방치하여, 침전물의 형성을 초래하였다. 산성화된 펩티드 용액을 실온에서 1,780 g에서 15분 동안 원심분리하고, 펩티드-함유 상청액을 침전된 물질을 제거하지 않고 깨끗한 50 mL 원뿔형 튜브 내로 옮겼다.
플런저가 제거된 10 cc 시린지로부터 제조된 저장소를 SEP-PAK® 컬럼의 짧은 말단에 연결시켰다. 5 mL의 100% MeCN을 적용하여 컬럼을 미리-습윤시켰다. 컬럼을 1 mL, 3 mL, 및 6 mL의 0.1% TFA 용액으로 순차적으로 세척하였다. 산성화되고 청소된 소화물을 컬럼 상에 로딩하고, 1 mL, 3 mL, 및 6 mL의 0.1% TFA 용액으로 순차적으로 세척하고, 이어서 2 mL의 5% MeCN, 0.1% TFA 용액으로 세척하였다. 펩티드를 각각 2 mL의 0.1% TFA, 50% 아세토니트릴 용액으로의 3회의 순차적 세척에 의해 용리시켰다. 용리된 펩티드를 함유하는 용액을 -80℃ 동결기 내부에 적어도 2시간 내지 밤새 정치하였다. 동결된 펩티드 용액을 표준 동결건조기를 사용하여 최소 2일 동안 동결건조시켜 TFA가 샘플로부터 제거된 것을 보장하였다. 동결건조된 소화된 펩티드는 밀봉된 미세원심분리 튜브 내부에 -80℃에서 수개월 동안 보관될 수 있다.
실시예 6
항체-접합된 자성 비드를 사용하여 효소적으로 소화된 세포 용해물로부터 펩티드의 멀티플렉스화된 면역친화성 풍부화를 수행하기
이전의 실시예에 기재된 바와 같이 제조된 동결건조된 세포 용해물을 결합 완충제 (25 mM 트리스, 192 mM 글리신 중 2.5M NaCl, pH 약 8.3)에 약 2 mg/mL의 최종 농도로 현탁시켰다. 용해물 현탁액을 용액에서 버블의 형성을 회피하면서 반복된 수동 피펫팅에 의해 균질화시켰다. 세포 용해물 용액을 14,000 RPM에서 4℃에서 5분 동안 원심분리하였다. 투명한 상청액을 새로운 1.7 mL 미세원심분리 튜브에 옮겼다. 넓은 오리피스 피펫 팁을 사용하여, 실시예 4에 기재된 바와 같이 제조된 20개의 항체-접합된 자성 비드를 함유하는 현탁액 비드 어레이를 깨끗한 0.65 mL 미세원심분리 튜브에 옮겼다. 투명한 세포 용해물 상청액을 용해물에서 버블의 형성을 회피하면서 비드에 첨가하였다. 이에 이어서 간단한, 예를 들어 튜브의 1초 미만의 원심분리를 수행하여 튜브 벽으로부터 액적을 수집하였다. 세포 용해물 상청액과 혼합된 비드의 현탁액을 회전기 상에서 저속에서 4℃에서 적어도 3시간 동안, 일부의 경우 밤새 또는 24시간 초과 동안 원심분리하였다. 튜브를 간단히 원심분리하고, 비드를 자성 퀵픽 장치를 사용하여 제거하고, 탈이온수 중 300 μL의 2.5M NaCl 용액을 함유하는 깨끗한 0.65 mL 튜브에 옮겼다. 추가의 340 μL의 2.5M NaCl 용액을 튜브에 첨가하였다. 비드를 회전기 상에서 저속에서 실온에서 10분 동안 인큐베이션하였다. 튜브를 간단히 원심분리하고, 약 300 μL의 용액을 피펫팅에 의해 제거하였다. 자성 퀵픽 장치를 사용하여 비드를 300 μL의 탈이온수를 함유하는 깨끗한 0.65 mL 튜브에 옮겼다. 비드를 튜브를 자성 분리 스탠드 상에서 반복적으로 이동시킴으로써 세척하고, 실온에서 약 2분 동안 추가로 인큐베이션하였다. 넓은 오리피스 피펫 팁으로의 피펫팅을 사용하여, 비드를 약 200 μL의 탈이온수를 함유하는 깨끗한 0.65 mL 튜브 내로 옮기고, 4℃에서 저장하였다.
실시예 7
마이크로웰 슬라이드를 어셈블리하기
마이크로웰 슬라이드를 실리콘 가스킷을 ITO-코팅된 유리 현미경 슬라이드의 전도성 측면에 부착시킴으로써 제조하였다. 구체적으로, 실리콘 가스킷의 표면을 먼저 접착 테이프의 스트립을 사용하여 임의의 잔류의 먼지 입자로부터 청소하였다. 그 후, 가스킷을 저 보풀 티슈, 예컨대 실험실 벤치의 평평한 표면 상에 위치된 킴와이프스(KIMWIPES)®의 1개 또는 2개의 시트의 상부 상에 정치하였다. 유리 슬라이드의 건조 ITO-코팅된 표면을 실리콘 가스킷과 접촉하여 정치하고, 슬라이드를 가스킷 내로 수동으로 가압하여 수밀 밀봉부를 형성하였다. 밀봉부 품질을 육안으로 점검하고, 임의의 잔류의 공기 포켓을 슬라이드를 국소적으로 가압함으로써 제거하였다. 제작된 마이크로웰 슬라이드의 전체 치수는 25mm x 75mm x 1.4mm였다.
실시예 8
마이크로웰 슬라이드 상에 비드 어레이를 형성하기
마이크로웰 슬라이드를 이전의 실시예에 기재된 바와 같이 제조하고, 각각의 챔버가 7mm x 16mm의 내부 치수를 갖는 8개의 직사각형 챔버를 함유하는 프로플레이트® 8-웰 슬라이드 모듈에 부착시켰다. 특정 적용을 위해, 표준 프로플레이트® 슬라이드 모듈에 포함된 1.6 mm 두께의 투명한 실리콘 가스킷을 1.4 mm 두께 마이크로웰 슬라이드를 보다 잘 수용하기 위해 보다 얇은 1.3 mm 투명한 실리콘 가스킷으로 대체하였다. 마이크로웰 슬라이드를 프로플레이트® 스테인리스 스틸 스프링 클립에 의해 프로플레이트® 모듈에 고정시켰다.
이어서, 프로플레이트® 모듈에 부착된 마이크로웰 슬라이드를 함유하는 어셈블리를 도 4에 도시된 바와 같이, 스프링 클립 모듈을 위한 3-섹션 프로플레이트® 트레이의 중간 섹션에 정치하였다. 약 300 μL의 탈이온수를 8개의 챔버의 각각 내로 분배하고, 프로플레이트® 트레이를 2700 RPM에서 5분 동안 실온에서 인큐베이션하여 마이크로웰 슬라이드의 0.5 mm 직경 웰 내로 물의 진입을 용이하게 하였다.
0.375 내지 0.420 mm 직경 범위의 42개의 자성 아가로스 비드를 함유하는 수성 현탁액을 피펫팅함으로써 넓은 오리피스 피펫 팁 내로 뽑아낸 후, 프로플레이트® 모듈의 8개의 챔버 중 2개 내로 임의로 분배하였다. 프로플레이트® 트레이를 표준 실험실 미세역가판 진탕기 상에 정치하고, 1 내지 2분 동안 기계적 교반으로 처리하여 비드가 마이크로웰 내로 분포되는 것을 보조하였다. 이어서, 프로플레이트® 트레이를 2700 RPM에서 1분 동안 실온에서 원심분리하여 비드가 그들의 각각의 마이크로웰의 바닥으로 내려가는 것을 보조하였다. 따라서, 모든 비드는 마이크로웰 슬라이드의 표면 아래 약 80 내지 120 마이크로미터에 위치되었다.
프로플레이트® 모듈에 부착된 마이크로웰 슬라이드를 프로플레이트® 트레이로부터 제거하고, 두께 네오디뮴 자석 (케이앤제이 마그네틱스(K&J Magnetics), 카탈로그 번호 BZ0X02)을 통해 자화된 플레이팅된 3" x 1" x 1/8" 두께 니켈을 스테인리스 스틸 클립 사이의 모듈 밑에 정치하여 비드가 그들의 위치에 고정되는 것을 보조하였다. 비드 어레이를 건드리지 않도록 피펫 팁을 챔버의 측벽을 향해 가리키게 하면서, 많은 물을 피펫팅에 의해 각각의 챔버로부터 빼내고, 자석 및 스테인리스 스틸 클립을 제거하고, 마이크로웰 슬라이드를 프로플레이트® 모듈로부터 탈착시켰다. 마이크로웰 슬라이드를 자석의 상부에 정치하고, 표면 상에 남아 있는 잔류의 물의 방울을 저 보풀 흡착 티슈, 예컨대 킴와이프스® 또는 대안적으로 종이 타올의 시트를 슬라이드 표면에 대해 부드럽게 가압함으로써 제거하였다. 슬라이드 표면 아래 약 80 내지 120 마이크로미터에 위치되어 잔류하는 비드 중 어느 것도 도 5에 나타난 바와 같이 이 절차에 의해 사라지지 않았다. 많은 물은 마이크로웰 슬라이드의 표면으로부터 완전히 제거되었지만, 개별적 0.5 mm 직경 마이크로웰은 표준 조건, 예를 들어 10% 내지 90%의 상대 습도, 18 ℃ 내지 32 ℃의 온도 하에서 약 5 내지 10분 동안 마이크로웰 내부에 잔류한 충분한 양의 액체를 보유하였음이 관찰되었다. 일부 양의 액체가 마이크로웰에 잔류하는 한, 아가로스 비드는 그들의 충분히 수화된 크기를 보유하였다. 단지 잔류 액체가 마이크로웰로부터 증발된 후에, 비드는 건조의 결과로서 그들의 원래 크기의 분획으로 수축하였다.
실시예 9
비드 어레이로부터 분석물을 용리하기
13개의 비드를 함유하는 비드 어레이를 이전의 실시예에 기재된 절차를 사용하여 마이크로웰 슬라이드 상에서 제작하였다. 비드 어레이 내의 모든 개별적 비드를 이전에 기재된 포스포-S6 리보솜 단백질 (Ser235/236) 모노클로날 항체 #4858에 접합시켰으며, Ser235 및 Ser236에서 이중으로 인산화된 S6 리보솜 단백질의 포획된 단백질분해성 단편을 함유하였다.
프로플레이트® 모듈로부터의 분리 후에 마이크로웰 슬라이드의 표면 상에 존재하는 물의 액적을 슬라이드 표면을 흡착 티슈로 부드럽게 터치함으로써 제거하였다. 마이크로웰 슬라이드를 아이매트릭스스프레이의 매트릭스 침착 영역의 중앙에 즉시 정치하고, 10 사이클의 매트릭스 침착을 비드 어레이에 적용하였다. 제1 매트릭스 침착 사이클은 MALDI 매트릭스 용액과 마이크로웰 내부에 잔류하는 잔류의 액체와의 최적 혼합을 달성하기 위해 슬라이드 표면으로부터 물의 액적을 제거한 후에 5분 이하, 바람직하게는 3분 내로 개시되어야 함을 유념한다. 아이매트릭스스프레이의 매트릭스 침착 파라미터를 하기와 같이 설정하였다: 높이: 60 mm; 라인 거리: 0.5 mm; 속도: 60 mm/s; 밀도: 5 μL/cm2; 사이클의 수: 10; 지연: 0초; 분무 영역 폭: 80 mm; 분무 영역 깊이: 30 mm. 매트릭스 용액은 5 mg/mL의 α-시아노-4-히드록시신남산 (CHCA), 50% 아세토니트릴 (v/v), 0.4% 트리플루오로아세트산 및 4 mM 시트르산이암모늄을 함유하였다.
최종 매트릭스 침착 사이클이 완료되었으면, 비드 어레이를 약 25 내지 30분을 요구하는 공기-건조로 처리하였다. 마이크로웰 슬라이드를 육안으로 검사하여 마이크로웰이 잔류의 액체를 함유하지 않고, 모든 비드가 건조로 인해 크기가 감소되었음을 검증하였다. 실리콘 가스킷을 현미경 슬라이드로부터 분리하였다. 건조된 아가로스 비드의 일부를 실리콘에 고착시키고, 가스킷을 따라 슬라이드로부터 제거하였다. 잔류의 비드를 압축 공기의 스트림을 사용하여 슬라이드 표면에 지정된 에어 더스터로부터 제거하였다. 건조된 아가로스 비드는 압축 가스에 의해 그들의 위치로부터 용이하게 사라진 반면, MALDI 매트릭스의 결정은 슬라이드 표면에 단단히 부착되어 잔류하고, 그들의 각각의 마이크로스팟 내에 국재화되었음이 관찰되었다.
도 6a는 압축 공기에 의한 슬라이드로부터의 비드의 제거 전에 기록된 CHCA MALDI 매트릭스를 함유하는 스팟의 어레이의 명시야 현미경 화상이다. 건조로 인해 크기가 감소된 아가로스 비드는 9개의 스팟에서 볼 수 있다. 추가의 4개의 스팟에서, 비드는 존재하지 않았지만, 스팟 형상, 예를 들어 CHCA 매트릭스의 비-균일한 분포는 실리콘 가스킷을 따라 슬라이드로부터 제거되었을 가능성이 있는 비드의 사전 존재를 지시하였다. 나머지 스팟은 비드를 함유하지 않았으며, 스팟을 가로질러 매트릭스의 보다 균일한 분포를 나타내었다. 도 6b는 모든 비드가 압축 공기를 사용하여 슬라이드로부터 제거된 CHCA MALDI 매트릭스를 함유하는 스팟의 비관련된 어레이의 명시야 현미경 화상이다. 초기에 비드를 함유한 위치에 형성된 스팟은 CHCA 매트릭스를 거의 또는 전혀 함유하지 않는 영역을 갖는 특징적인 "초승달" 또는 "도넛" 형상을 나타내었다. 대조적으로, 초기에 비드가 없는 위치에 형성된 스팟은 일반적으로 보다 균일한 매트릭스 커버리지를 나타내었다. 도 6a 및 도 6b에 나타내어진 화상은 바이오텍(BioTek) (미국 버몬트주 위누스키)으로부터의 시테이션 (CYTATION)™ 3 다중-모드 판독기 상에서 획득되었다.
실시예 10
마이크로스팟의 어레이로부터 질량 분광법적 데이터를 획득하기
현미경 슬라이드의 ITO-코팅된 표면 상의 마이크로스팟의 어레이를 이전의 실시예에 기재된 절차를 사용하여 제조하였다. 슬라이드를 MALDI 화상화를 위한 MTP 슬라이드 어댑터 II 내로 정치하였다. 브루커 달토닉스 (미국 매사추세츠주 빌레리카)에 의해 제공된 주문제작 기하 파일은 각각의 스팟이 600 μm 이하의 가변적 직경을 갖는 2288개의 스팟의 정사각형 그리드 어레이로부터의 질량 분광법적 데이터의 연속적 획득을 가능하게 하였다. 일부의 경우, 데이터는 50 내지 500개의 스팟을 함유한 어레이 내의 보다 작은 섹션으로부터 획득되었다.
MALDI TOF MS 데이터를 기기와 함께 제공된 플렉스컨트롤(flexControl) 소프트웨어를 사용하여 브루커 달토닉스로부터의 브루커 오토플렉스 스피드(Bruker Autoflex Speed) MALDI TOF-TOF 질량 분광계 상에서 획득하였다. 데이터를 2 kHz의 레이저 반복 속도를 사용하여 1,000 내지 7,000 m/z 질량 범위의 선형 양성 모드에서 획득하였다. 총 20,000개의 단일-쇼트 스펙트럼이 전형적으로 단일 마이크로어레이 스팟으로부터 수집되고, 공동-첨가되었지만, 일부의 경우 고 품질 스펙트럼이 100개만큼 적은 스팟으로부터 얻어졌다. 일부의 경우, 100,000개 초과의 단일-스팟 스펙트럼이 스팟에 존재하지 않는 분석물을 완전히 고갈시키지 않고 단일 마이크로어레이 스팟으로부터 수집되었다. 스펙트럼을 둘 다의 방법이 플렉스컨트롤 소프트웨어에서 제공된 랜덤 워크 또는 역나선 방법 중 어느 하나를 사용하여 각각의 스팟 내의 다수의 위치로부터 획득하였다.
실시예 11
질량 분광법적 데이터를 분석하기
MS 데이터세트를 브루커 달토닉스로부터의 플렉스어낼리시스(flexAnalysis) 및 바이오툴즈(BIOTOOLS)™ 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. 일부의 경우, MS 데이터를 함유하는 파일을 .txt 형식으로 전환시키고, 공중 도메인 소프트웨어 mMass를 사용하여 분석하였다. 질량 스펙트럼을 분석하여 핵심적 파라미터, 예컨대 질량 정확도, 스펙트럼 해상도, 뿐만 아니라 신호-대-잡음 비, 특정한 질량 스펙트럼에 존재하는 개별적 피크의 상대 강도 및 피크 면적을 결정하였다.
실시예 12
다수의 표적 분석물을 포획하도록 구성된 마이크로어레이 반응성 부위
이 실시예에서, 포획제는 셀 시그널링 테크놀로지 (미국 매사추세츠주 댄버스)로부터 획득된 모노클로날 항체 포스포-Met (Tyr1234/1235) (D26) XP® 토끼 mAb, 카탈로그 번호 3077이다. 간세포 성장 인자 수용체 (HGFR)로도 공지된 Met는 145 kDa의 MW를 갖는 티로신 키나제이다. 유니프롯(UniProt) (유니버셜 프로테인 리소스(Universal Protein Resource)) 데이터베이스에서의 이 단백질에 대한 엔트리 번호 및 엔트리 명칭은 각각 P08581 및 MET_인간이다. 2017년 2월 20일에 액세스된 제조자의 웹사이트 상에 제공된 제품 설명에 따르면, #3077 항체는 "...단지 Tyr1234/1235에서 인산화되는 경우 Met의 내인성 수준을 검출한다". #3077 항체는 웨스턴 블롯팅, 면역침전, 면역조직화학 (파라핀), 면역조직화학 (동결된), 면역형광 (면역세포화학) 및 유동 세포측정을 포함하는 적용에 대해 입증되어 있다. 이전의 실시예에 기재된 절차를 사용하여, #3077 항체를 단백질 A+G 아가로스 비드에 접합시키고, 용해된 MKN-45 세포의 트립신 소화물 1 mg과 함께 인큐베이션하였다. 질량 스펙트럼을, 면역친화성 정제 (IAP) 반응을 수행하고, 결합된 분석물을 단일 비드로부터 용리한 후에 선형 양성 모드에서 기록하였다. MS 측정을 또한 리플렉터 양성 모드에서 수행하였다 (데이터는 나타내지 않음). 3개의 강한 피크가 질량 스펙트럼에서 1853.06, 2210.27 및 2647.54의 m/z 값에서 검출되었다. 특이적 펩티드 분석물에 대한 이들 피크의 할당을 하기 데이터에 기반하여 수행하였다: 전구체 단백질, 즉, Met 키나제의 공지된 아미노산 서열, 소화 효소, 즉, 트립신의 공지된 특이성 및 가능한 에피토프. 후자에 관하여, 정확한 에피토프 서열은 개시되어 있지 않지만, 제조자의 웹사이트는 "모노클로날 항체는 인간 Met의 Tyr1234/1235를 둘러싼 잔기에 상응하는 합성 포스포펩티드로 동물을 면역화함으로써 제조된다"라고 진술한다. 상기 정보에 기반하여, 피크 할당을 하기와 같이 수행하였다: 1853.06 피크를 1852.82의 계산된 MH+ 값을 갖는 펩티드 DMYDKE[pY][pY]SVHNK (서열식별번호: 4)에 할당하고, 2210.27 피크를 2210.23의 계산된 MH+ 값을 갖는 펩티드 DMYDKE[pY][pY]SVHNKTGAK (서열식별번호: 5)에 할당하고, 2647.54 피크를 2647.81의 계산된 MH+ 값을 갖는 펩티드 DMYDKE[pY][pY]SVHNKTGAKLPVK (서열식별번호: 6)에 할당하였다. 상기 열거된 아미노산 서열에서, [pY]는 인산화된 티로신을 나타낸다. 피크 할당은 질량 분광법에 의한 펩티드 단편화 또는 탠덤 질량 분광법 (MS-MS)의 사용을 요구하지 않았음이 주목된다. 이 실시예에서, 다수의 표적 분석물은 상이한 수의 상실된 절단 부위를 함유하는 전구체 단백질의 단백질분해성 단편이다.
실시예 13
가변적 수의 표적 분석물을 포획하도록 구성된 마이크로어레이 반응성 부위
이 실시예에서, 포획제는 셀 시그널링 테크놀로지로부터 구입한 포스포-S6 리보솜 단백질 (Ser235/236) (D57.2.2E) XP® 토끼 모노클로날 항체, 카탈로그 번호 4858이다. 2017년 2월 20일에 액세스된 제조자의 웹사이트 상에 제공된 설명에 따르면, #4858 항체는 "... 단지 Ser235 및 236에서 인산화되는 경우 리보솜 단백질 S6의 내인성 수준을 검출한다". 유니프롯 데이터베이스에서의 인간 S6 리보솜 단백질에 대한 엔트리 번호 및 엔트리 명칭은 각각 P62753 및 RS6_인간이다. 자성 아가로스 비드에의 항체의 접합 및 면역친화성 풍부화 반응을 이전의 실시예에 기재된 절차를 사용하여 수행하였다. 면역친화성 풍부화를 과산화수소의 부재 및 존재 하에서 배양된 MKN-45 세포의 트립신-소화된 용해물로부터 제조된 2개의 샘플로부터 독립적으로 수행하였다. 과산화수소에의 포유동물 세포의 노출은 상승된 수준의 단백질 인산화를 유발하는 것으로 공지되어 있다.
과산화수소의 부재 하에서 성장된 MKN-45 세포의 소화된 용해물로부터 포획된 단백질분해성 펩티드의 질량 스펙트럼은 약 80 m/z 단위만큼 떨어진 총 4개의 별개의 피크를 나타내었다. 과산화수소의 존재 하에서 성장된 MKN-45 세포의 소화된 용해물로부터 포획된 단백질분해성 펩티드의 질량 스펙트럼은 총 6개의 별개의 피크를 나타내었다. 피크 중 4개는 2개의 스펙트럼에서 동일한 m/z 위치에 존재한 반면, 과산화수소-처리된 세포에 고유한 2개의 추가의 피크는 보다 높은 m/z에서 나타났으며, 또한 약 80 m/z만큼 떨어져 있었다. 단백질 서열, 항체 특이성 및 소화 효소 특이성에 관한 이용가능한 정보를 사용하여, 모든 검출된 피크를 인간 S6 리보솜 단백질의 아미노산 233 내지 249로 이루어지고, 3개의 상실된 절단 부위 및 가변적 수의 인산화된 부위를 함유하는 단백질분해성 펩티드 RLSSLRASTSKSESSQK (서열식별번호: 7)에 할당하였다. 차등적으로 인산화된 펩티드에 대한 예측된 평균 m/z 값은 2013.1 (2개의 포스포 부위), 2093.0 (3개의 포스포 부위), 2173.0 (4개의 포스포 부위), 2252.9 (5개의 포스포 부위), 2332.9 (6개의 포스포 부위) 및 2412.9 (7개의 포스포 부위)였다. 인산화된 부위를 함유하지 않거나 단일 인산화된 부위를 함유하는 펩티드는 단지 Ser235 및 Ser236 둘 다가 인산화되는 경우 펩티드 서열을 인식하는 항체의 특이성 때문에 검출되지 않았음을 주목한다. 더욱이, 검출된 펩티드에서의 다수의 상실된 절단 부위의 존재는, 트립신이 인산화된 잔기에 대해 근위인 Lys 또는 Arg 잔기 뒤에 절단하지 않을 수 있는 것으로 공지되어 있기 때문에, 이 소화 효소의 특이성과 일치하였다. 이 실시예에서, 마이크로어레이 반응성 부위는 변역후에 변형된 부위의 수량에 있어서 상이한 적어도 6개의 별개의 펩티드 분석물에 결합할 수 있다.
실시예 14
인간 및 마우스 기원의 단백질분해성 펩티드를 포획하도록 구성된 마이크로어레이 반응성 부위
이 실시예에서, 포획제는 에버레스트 바이오테크(Everest Biotech) (영국 옥스포드샤이어 어퍼 헤이포드)에 의해 공급된 염소 항-아코니타제 2 (aa541-555) 폴리클로날 항체, 카탈로그 번호 EB09858이다. 포획제는 미토콘드리아 아코니테이트 히드라타제로도 공지된 단백질 ACO2의 내부 서열을 인식한다. 유니프롯 데이터베이스에서의 인간 ACO2에 대한 엔트리 번호 및 엔트리 명칭은 각각 Q99798 및 ACON_인간이다. 유니프롯 데이터베이스에서의 마우스 ACO2에 대한 엔트리 번호 및 엔트리 명칭은 각각 Q99KI0 및 ACON_마우스이다. 항체 생산에 사용된 면역화 펩티드의 서열은 QDTYQHPPKDSSGQH (서열식별번호: 8)이다. 자성 아가로스 비드에의 항체의 접합 및 면역친화성 풍부화 반응을 이전의 실시예에 기재된 절차를 사용하여 수행하였다. 면역친화성 풍부화를 2개의 샘플, 즉, 배양된 MKN-45 세포의 트립신-소화된 용해물 및 마우스 뇌 조직의 트립신-소화된 용해물로부터 독립적으로 수행하였다. 샘플 제조에 사용된 소화 효소는 워싱턴 바이오케미칼 코포레이션 (미국 뉴저지주 레이크우드), 카탈로그 번호 LS02119로부터의 소 트립신이었다.
소화된 MKN-45 용해물로부터 포획된 단백질분해성 펩티드의 질량 스펙트럼은 4,400 내지 4,800 m/z의 현저한 피크의 쌍 및 2,200 내지 2,400 m/z의 또 다른 피크의 쌍을 나타내었다. 단백질 서열, 항체 특이성 및 소화 효소 특이성에 관한 이용가능한 정보를 사용하여, 보다 높은 m/z 범위에서 관찰된 피크의 쌍을 각각 4477.7 및 4781.1의 예측된 평균 m/z 값을 갖는 단백질분해성 펩티드 LEAPDADELPKGEFDPGQDTYQHPPKDSSGQHVDVSPTSQR (서열식별번호: 9) 및 FRLEAPDADELPKGEFDPGQDTYQHPPKDSSGQHVDVSPTSQR (서열식별번호: 10)에 할당하였다. 보다 낮은 m/z 범위에서 관찰된 피크의 쌍을 동일한 펩티드의 이중-하전된 형태에 할당하였다.
소화된 마우스 뇌 조직으로부터 포획된 단백질분해성 펩티드의 질량 스펙트럼은 3,800 내지 4,000 m/z의 현저한 피크의 쌍 및 2,500 m/z 미만의 일련의 보다 작은 피크를 나타내었다. 단백질 서열, 항체 특이성 및 소화 효소 특이성에 관한 이용가능한 정보를 사용하여, 3,800 내지 4,000 m/z에서 관찰된 피크의 쌍을 각각 3846.1 및 3974.3의 예측된 평균 m/z 값을 갖는 단백질분해성 펩티드 FKLEAPDADELPRSDFDPGQDTYQHPPKDSSGQR (서열식별번호: 11) 및 KFKLEAPDADELPRSDFDPGQDTYQHPPKDSSGQR (서열식별번호: 12)에 할당하였다. 보다 낮은 m/z 범위에서 관찰된 2개의 피크를 동일한 펩티드의 이중-하전된 형태에 할당하였다.
이 실시예에서, 항체는 에피토프 서열이 이들 단백질에서 보존되기 때문에 ACO2의 인간 및 마우스 형태 둘 다로부터 유래된 단백질분해성 펩티드를 인식하고, 그에 특이적으로 결합한다. 인간 및 마우스 기원의 단백질분해성 펩티드 사이의 검출된 m/z 값의 차이는 2가지 인자의 조합에 기인한다: (1) 단백질분해성 펩티드의 상이한 길이를 초래하는 상응하는 전구체 단백질에서의 소화 효소, 예를 들어 트립신에 대한 상이한 인식 부위 및 (2) 소화 효소에 대한 인식 부위를 변경시키지 않지만, 그럼에도 불구하고 질량 차이를 유발하는 상응하는 전구체 단백질에서의 아미노산 치환.
이 실시예는 2가지 상이한 종, 즉, 인간 (호모 사피엔스(Homo sapiens)) 및 마우스 (무스 무스쿨루스(Mus musculus))로부터 유래된 단백질의 검출 및 정량화의 방법을 입증한다. 이 기술의 한 가지 적용은 세포, 조직 및 기관 이식편, 예를 들어 종양 이종이식편에서의 단백질 발현 및/또는 단백질 변형의 단일-플렉스 또는 멀티플렉스 분석이다.
실시예 15
상이한 소화 효소에 의해 생산되는 단백질분해성 펩티드를 포획하도록 구성된 마이크로어레이 반응성 부위
이 실시예에서, 포획제는 셀 시그널링 테크놀로지로부터 구입한 포스포-4E-BP1 (Thr37/46) (236B4) 토끼 모노클로날 항체, 카탈로그 번호 2855이다. 2017년 2월 20일에 액세스된 제조자의 웹사이트 상에 제공된 설명에 따르면, #2855 항체는 "... 단지 Thr37 및/또는 Thr46에서 인산화되는 경우 4E-BP1의 내인성 수준을 검출한다. 이 항체는 등가의 부위에서 인산화되는 경우 4E-BP2 및 4E-BP3과 교차-반응할 수 있다". 유니프롯 데이터베이스에서의 인간 진핵생물 번역 개시 인자 4E-결합 단백질 1에 대한 엔트리 번호 및 엔트리 명칭은 각각 Q13541 및 4EBP1_인간이다. 자성 아가로스 비드에의 항체의 접합 및 면역친화성 풍부화 반응을 이전의 실시예에 기재된 절차를 사용하여 수행하였다. 항체 인식 부위를 함유하는 단백질분해성 펩티드의 면역친화성 풍부화를 하기 소화 효소를 사용한 MKN-45 세포 용해물의 효소적 소화에 의해 제조된 몇몇 샘플로부터 수행하였다: 시퀀싱 등급 변형된 트립신 (프로메가 카탈로그 번호 V5117), 시퀀싱 등급 키모트립신 (프로메가 카탈로그 번호 V1061), 펩신 (프로메가 카탈로그 번호 V1959), MS 등급 Lys-C 프로테아제 (써모피셔 카탈로그 번호 90051), MS 등급 Lys-N 프로테아제 (써모피셔 카탈로그 번호 90300), MS 등급 Glu-C 프로테아제 (써모피셔 카탈로그 번호 90054), 시퀀싱 등급 Arg-C 프로테아제 (프로메가 카탈로그 번호 V1881), 써모리신 (프로메가 카탈로그 번호 V4001), 엘라스타제 (프로메가 카탈로그 번호 V1891).
면역친화성 풍부화 후에 비드로부터 용리된 단백질분해성 펩티드의 질량 분광법적 분석을 이전의 실시예에 기재된 바와 같이 선형 양성 모드에서 수행하였다. 질량 스펙트럼에서 관찰된 피크의 위치는 특이적 효소로의 소화 후에 4E-BP1의 에피토프-함유 단편에 대해 예측된 m/z 값과 일치하였다. 예를 들어, 트립신-소화된 4E-BP1의 질량 스펙트럼에서의 2개의 강한 피크는 각각 인간 4E-BP1의 아미노산 21 내지 51을 함유하는 펩티드 VVLGDGVQLPPGDYSTTPGGTLFSTTPGGTR (서열식별번호: 3)의 단일- 및 이중-인산화된 형태의 계산된 평균 m/z 값에 상응하는 m/z 3129.4 및 3209.3 부근에서 관찰되었다. 마찬가지로, 펩신-소화된 4E-BP1의 질량 스펙트럼은 인간 4E-BP1의 아미노산 43 내지 54를 함유하는 펩티드 FSTTPGGTRIIY (서열식별번호: 13)의 단일-인산화된 형태에 상응하는 1393.5의 m/z 부근에서 강한 피크를 나타내었다. 키모트립신-소화된 4E-BP1의 질량 스펙트럼은 1246.3 및 2053.3의 m/z 부근에서 강한 피크의 쌍을 나타내었다. 전자의 피크를 인간 4E-BP1의 아미노산 44 내지 54 및 키모트립신에 의한 0개의 상실된 절단을 함유하는 펩티드 STTPGGTRIIY (서열식별번호: 14)의 단일-인산화된 형태에 할당한 반면, 후자의 피크를 인간 4E-BP1의 아미노산 43 내지 59 및 키모트립신에 의한 3개의 상실된 절단을 함유하는 펩티드 FSTTPGGTRIIYDRKFL (서열식별번호: 15)의 단일-인산화된 형태에 할당하였다.
펩신-소화된 샘플은 또한 #2855 항체에 의해 인식되는 펩티드 ST[pT]PGGTL (서열식별번호: 16) (0개의 상실된 절단, MW 813.78)을 함유한다. 이 펩티드는 2개의 단백질로부터 유래된다: 4E-BP1 및 4E-BP3 (유니프롯 엔트리 번호 O60516). 대조적으로, 이전에 기재된 #9644 항체에 의해 인식되는 펩신-소화된 펩티드 GGEESQFEMDI (서열식별번호: 17) (1개의 상실된 절단, MW 1242.31)는 4E-BP1로부터 유래되지만, 4E-BP3으로부터는 그렇지 않다. 따라서, #2855 및 #9644 항체 둘 다를 포함시키는 것은 하나의 포획제가 2개의 별개의 단백질에서 발견되는 에피토프를 인식하고, 다른 포획제가 이들 단백질 중 단지 하나에서 발견되는 에피토프를 인식하는 마이크로어레이를 생성한다.
별개의 실험에서, 이전에 기재된 항체 #4858을 함유하는 반응성 부위를 마이크로어레이에 첨가하였다. #2855 및 #4858 항체 둘 다는 하기 소화 효소 중 적어도 2종에 의해 인식되는 단백질분해성 절단 부위를 결여한 에피토프를 인식한다: 트립신, 키모트립신, 펩신, 엔도프로테이나제 Glu-C 및 엔도프로테이나제 Asp-N.
실시예 16
마이크로어레이의 별개의 반응성 부위에의 표적 분석물의 비-특이적 결합
별개의 반응성 부위를 특색으로 하는 몇몇 동일한 마이크로어레이를 이전의 실시예에 기재된 3가지 포스포-특이적 항체 #2855, #3077 및 #4858을 사용하여 제조하였다. 동일한 유형의 항체를 함유하는 10개 미만 (3 내지 5개)의 복제물 비드가 각각의 마이크로어레이에 포함되었다. 따라서, 각각의 마이크로어레이는 포스포-4E-BP1 (Thr37/46), 포스포-Met (Tyr1234/1235) 및 포스포-S6 리보솜 단백질 (Ser235/236)로부터 유래된 단백질분해성 펩티드에 결합할 수 있는 총 9개의 반응성 부위를 함유하였다. 제작된 마이크로어레이를 이전의 실시예에 열거된 효소, 즉, 트립신, 키모트립신, Glu-C 프로테아제, Lys-C 프로테아제 및 Lys-N 프로테아제를 사용하여 제조된 일련의 소화된 MKN-45 세포 용해물과 함께 인큐베이션하였다. 소화된 세포 용해물의 각각으로부터의 면역친화성 풍부화를, 2.5M NaCl이 결합 반응 동안 결합 완충제로부터 생략되고, 비드를 NaCl의 2.5M 용액 대신 1xPBS 완충제에서 세척한 것을 제외하고는, 실시예 6에 기재된 바와 같이 수행하였다. 각각의 마이크로어레이의 개별적 반응성 부위에 의해 포획된 분석물을 이전에 기재된 바와 같이 질량 분광법에 의해 분석하였다. 결합 및 세척 완충제에서의 2.5M NaCl의 부재는 트립신-소화된 세포 용해물로부터 포획된 분석물의 질량 스펙트럼에 대한 유의한 효과를 갖지 않았다. 대조적으로, 키모트립신-소화된 세포 용해물로부터 수행된 면역친화성 풍부화 동안 결합 및 세척 완충제에서 높은 염을 사용하지 않는 것은 접합된 항체와 무관하게 모든 반응성 부위로부터 기록된 스펙트럼에서 2222.5의 m/z 부근에서 관찰된 강한 피크를 갖는 질량 스펙트럼에 대한 유의한 효과를 가졌다. 비-특이적 2222.5 피크는 분석물-특이적 피크 외에도 질량 스펙트럼에 존재하였으며, 이는 키모트립신 소화 후의 상응하는 전구체 단백질의 단백질분해성 단편의 예상된 m/z 값에 매칭하였다. 예를 들어, 포스포-4E-BP1 반응성 부위로부터 기록된 질량 스펙트럼은 이전의 실시예에서 식별된 1246.3 및 2053.3 피크 외에도 2222.5 피크를 나타내었다. 2222.5 피크를 담당하는 비-특이적으로 결합하는 화합물을 식별하기 위해, 용리액을 키모트립신-소화된 MKN-45 세포 용해물에 노출된 소 혈청 알부민 (BSA)-접합된 아가로스 비드로부터 수집하였다. 용리액을 에드만 분해에 의해 분석하여, 2222.6의 예측된 평균 [M+H]+ 값 및 인간 히스톤 H2B 유형 1-C/E/F/G/I의 아미노산 21 내지 38에의 잠정적 할당을 갖는 펩티드 서열 KAQKKDGKKRKRSRKESY (서열식별번호: 18)를 수득하였다. 유니프롯 데이터베이스에서의 인간 히스톤 H2B 유형 1-C/E/F/G/I에 대한 엔트리 번호 및 엔트리 명칭은 각각 P62807 및 H2B1C_인간이다. 이어서, 데이터를 사용하여 마이크로어레이 디코딩 표에서 엔트리를 생성하였으며, 이는 이 비-특이적으로 결합하는 화합물의 분자량에 관한 정보, 및 이 화합물이 키모트립신으로의 소화로 처리된 인간 기원의 샘플, 예컨대 인간 세포 배양물의 질량 스펙트럼에서 나타날 수 있다는 사실을 함유하였다.
실시예 17
마이크로어레이의 별개의 반응성 부위에의 표적 분석물의 특이적 결합
포획제로서 사용된 폴리클로날 항체는 에버레스트 바이오테크로부터의 것이었다. 이들은 (1) 염소 항-아코니타제 2 항체 (카탈로그 번호 EB09857, 면역원성 펩티드 서열 C-QHVDVSPTSQRLQ (서열식별번호: 19)); (2) 염소 항-아코니타제 2 (aa541-555) 항체 (카탈로그 번호 EB09858, 면역원성 펩티드 서열 C-QDTYQHPPKDSSGQH (서열식별번호: 20)); (3) 염소 항-GPI/뉴로류킨 항체 (카탈로그 번호 EB09739, 면역원성 펩티드 서열 C-YREHRSELNLRR (서열식별번호: 21)) 및 (4) 염소 항-IDH3B (aa369-383) 항체 (카탈로그 번호 EB10997, 면역원성 펩티드 서열 C-TTDFIKSVIGHLQTK (서열식별번호: 22))를 포함하였다.
개별적 항체를 이전의 실시예에 기재된 절차를 사용하여 자성 아가로스 비드에 접합시켰다. 8개의 반응성 부위를 함유하는 4-플렉스 비드 어레이를, 상기 열거된 4종의 항체 중 하나에 접합된 2개의 비드를 선택하고, 상이한 항체에 접합된 비드를 단일 1.7 mL 미세원심분리 튜브에서 조합함으로써 어셈블리하였다. 이어서, 어셈블리된 마이크로어레이를 이전의 실시예에 기재된 바와 같이 제조된 2 mg의 키모트립신 소화된 MKN-45 세포 용해물과 반응시켰다. 반응된 비드 어레이를 마이크로웰 슬라이드 상에 옮기고, 분석물을 비드로부터 용리하고, 이전의 실시예에 기재된 바와 같이 MALDI TOF MS에 의해 분석하였다.
마이크로어레이에 존재하는 반응성 부위의 수에 매칭하는, 1,000-5,000 m/z 질량 범위에서 3:1 초과의 신호-대-잡음 비를 갖는 하나 또는 몇몇 피크를 가진 총 8개의 질량 스펙트럼을 식별하였다. 마이크로어레이의 4개의 별개의 반응성 부위에 상응하는 4개의 별개의 쌍의 질량 스펙트럼을 식별하였다. 복제물 반응성 부위로부터 기록된 질량 스펙트럼은 매우 유사하였으며, 예를 들어 상이한 스펙트럼 사이에 0.1 미만만큼 다양한 m/z 값을 갖는 동일한 수의 피크를 가졌다. 도 7은 개별적 반응성 부위로부터 획득된 예시적인 질량 스펙트럼을 나타낸다. 표 1은 이 마이크로어레이에 대한 디코딩 표를 나타낸다. 이 실시예에서, QHPPKDSSGQHVDVSPTSQRL (서열식별번호: 23)의 서열 및 2301.49의 m/z를 갖는 동일한 펩티드 표적이 마이크로어레이의 2개의 별개의 반응성 부위, 즉, 항체 EB09857 및 EB09858을 함유하는 반응성 부위에 의해 포획되었다. 이들 항체는 이들이 동일한 단백질분해성 펩티드에 특이적으로 결합하는 것을 허용하는 인간 아코니타제 2 내의 인접한 서열을 인식한다. 그러나, 항체 EB09857은 추가적으로 QHVDVSPTSQRLQLLEPFDKWDGKDLED (서열식별번호: 24)의 서열 및 3297.60의 m/z를 갖는 펩티드를 포획하였으며, 이는 항체 EB09858에 의해 포획되지 않았다. 따라서, 표 1에 나타난 바와 같이, 2개의 반응성 부위 (ACO2 및 ACO2 (541-555))는, 둘 다가 2301.49의 m/z를 갖는 표적에 결합하지만, 단지 전자만이 3297.60의 m/z를 갖는 표적에 결합하기 때문에, 마이크로어레이 내에서 용이하게 구별될 수 있다. 사실, 반응성 부위 ACO2 (541-555)와 연관된 디코딩 표에서의 엔트리는 표 1에서 *신호 부재* 주에 의해 나타내어진 바와 같이, 3297.60의 m/z에서 신호의 부재에 대한 구체적 언급을 임의로 함유할 수 있다. 더욱이, 도 7에 관하여, ACO2 및 ACO2 (541-555) 스펙트럼 둘 다는 또한 몇몇 추가의 보다 낮은 강도 피크를 함유함이 보여질 수 있다. 이들 피크는 그들의 각각의 항체에 대해 특이적이며, 따라서, 그들의 MW, m/z 또는 TOF 값에 관한 정보는 표적 식별에서의 신뢰성을 추가로 증가시키기 위해 디코딩 표에 포함될 수 있다.
표 1
4-플렉스 마이크로어레이에 대한 마이크로어레이 디코딩 표
Figure pct00001
이전에 기재된 마이크로어레이에 대한 디코딩 표의 단순화된 버전을 표 2에 나타낸다. 이 실시예에서, 반응성 부위에 의해 포획된 표적의 아미노산 서열은 제공되지 않으며, 반응성 부위는 단지 질량 스펙트럼에서 검출된 1개 이상의 신호에 기반하여 식별된다. 더욱이, 반응성 부위는 표 2에서 반응성 부위 ACO2 (541-555)에 대해 나타내어진 바와 같이, 질량 스펙트럼에서 특정한 m/z에서 검출되지 않는 신호에 기반하여 식별될 수 있다.
이 실시예에서, ACO2 반응성 부위는 2개의 별개의 값을 포함하는 조합과 회합된다: 2301.49 및 3297.60. 조합은 그 반응성 부위의 포획제에 특이적으로 결합하는 표적을 식별하기에 필요하고도 충분하다.
표 2
4-플렉스 마이크로어레이에 대한 단순화된 마이크로어레이 디코딩 표
Figure pct00002
일부 실험에서, 에버레스트 바이오테크로부터의 2종의 염소 항-GAPDH (내부) 항체를 마이크로어레이에 첨가하였다: 카탈로그 번호 EB07069, 면역원성 펩티드 서열 C-GVNHEKYDNSLK (서열식별번호: 27) 및 카탈로그 번호 EB06377, 면역원성 펩티드 서열 C-HQVVSSDFNSDT (서열식별번호: 28). 후자의 항체에 의해 인식되는 에피토프는 트립신에 의해 인식되는 단백질분해성 절단 부위를 결여한 반면, 전자의 항체에 의해 인식되는 에피토프는 이러한 부위, 즉, 내부 리신을 함유한다.
실시예 18
샘플에서의 표적 분석물의 상대 풍부도의 추정치를 제공하기
마이크로어레이를 이전에 기재된 항체 #4858 및 #9644, 뿐만 아니라 셀 시그널링 테크놀로지로부터의 포스포-p44/42 MAPK (Erk1/2) (Thr202/Tyr204) (D13.14.4E) XP® 토끼 모노클로날 항체, 카탈로그 번호 4370을 사용하여 이전의 실시예에 기재된 바와 같이 제조하였다. 2017년 3월 25일에 액세스된 제조자의 웹사이트 상에 제공된 설명에 따르면, #4370 항체는 "... Erk1의 Thr202 및 Tyr204 (Erk2의 Thr185 및 Tyr187)에서 이중으로 인산화되고, Thr202에서 단일로 인산화되는 경우 p44 및 p42 MAP 키나제 (Erk1 및 Erk2)의 내인성 수준을 검출한다".
상기 열거된 3종의 항체의 각각은 트립신 소화된 MKN-45 세포 용해물로부터의 몇몇 표적에 특이적으로 결합할 수 있었음이 실험적으로 결정되었다. 또한, 동일한 항체에 의해 포획되는 다수의 표적으로부터의 신호의 상대 강도는, 세포 배양물 및 샘플 제조 조건이 유사하게 잔류한, 예를 들어 동일한 세포 배양 배지 및 동일한 소화 효소가 사용된 한, 상이한 샘플 제제 사이에서 상당히 다양하지 않았음이 실험적으로 결정되었다. 예를 들어, 각각 1469.6 및 1313.4의 m/z를 갖는 4E-BP1의 단백질분해성 단편 RAGGEESQFEMDI (서열식별번호: 1) 및 AGGEESQFEMDI (서열식별번호: 2)로부터 기록된 피크의 강도 비는 일관되게 10:1 초과였다. 펩티드 RLSSLRASTSKSESSQK (서열식별번호: 7)의 이중으로- 및 삼중으로-인산화된 형태로부터의 피크는 4 또는 5개의 포스페이트를 함유한 펩티드 RLSSLRASTSKSESSQK (서열식별번호: 7)로부터의 피크보다 약 2배 더 강하였으며, 이는 다시 6 또는 7개의 포스페이트를 함유하는 동일한 펩티드로부터의 피크보다 약 3배 더 강하였다. 2305.3의 m/z 부근의 VADPDHDHTGFL[pT]E[pY]VATR (서열식별번호: 29) (Erk2)로부터의 신호는 2333.3의 m/z 부근의 IADPEHDHTGFL[pT]E[pY]VATR (서열식별번호: 30) (Erk1)로부터의 신호에 비해 5 내지 20배 더 강하였다.
따라서, 표 3에 나타난 바와 같이, 이 경우 특이적 세포주 (예를 들어 MKN-45), 특이적 처리 조건 (예를 들어 DMSO 처리 또는 키나제 억제제 처리), 및 특이적 소화 조건 (예를 들어 질량 스펙 시퀀싱 등급 트립신)에 대해 주어진, 마이크로어레이 디코딩 표에서의 상대 피크 강도 데이터를 포함하는 것이 가능하다. 질량 스펙트럼에서의 피크의 상대 강도는 대개 샘플에서의 상응하는 분석물의 상대량과 직접적으로 관련되며, 디코딩 표에서 이러한 정보를 제공하는 것은 표적 분석물의 식별을 보조할 수 있다. 구체적으로, 표 3에서의 데이터는 Thr185 및 Tyr187에서 이중으로 인산화된 Erk2의 단백질분해성 단편이 Thr202 및 Tyr204에서 이중으로 인산화된 Erk1의 단백질분해성 단편보다 트립신-소화된 MKN-45 세포 용해물이 더 풍부함을 지시한다. 일부의 경우, 질량 스펙트럼에서의 신호의 강도 및 샘플에서의 분석물 풍부도 사이의 관계는 예를 들어 가변적 수의 PTM 부위를 갖는 펩티드에 대해 보다 복잡하다. 그럼에도 불구하고, 마이크로어레이 디코딩 표에서 풍부도 데이터를 포함하는 스펙트럼 패턴을 제공하는 것은 표적을 식별하는 유용한 방법이다. 예를 들어, 포스포-S6 리보솜 단백질 (Ser235/236) 및 포스포-p44/42 MAPK (Erk1/2) (Thr202/Tyr204) 반응성 부위 둘 다는 2333 Da 부근의 분자량을 갖는 표적에 특이적으로 결합할 수 있는 반면, 풍부도 정보를 함유하는 마이크로어레이 디코딩 표는 검출된 표적 분석물의 분명한 할당을 제공하는 것을 도울 수 있다. 이 실시예에서, 마이크로어레이의 별개의 포획제에 의해 인식되는 2개의 표적은 1 Da 미만만큼 상이한 분자량 (2332.9 및 2333.3)을 갖는 반면, 포획제에 의해 인식되는 다른 표적의 분자량은 분명한 할당을 보장하는 적어도 5 Da만큼 분리된다.
표 3
상대 표적 풍부도의 추정치를 포함하는 마이크로어레이 디코딩 표
Figure pct00003
실시예 19
단백질 내의 다수의 부위의 PTM 상태를 측정하도록 구성된 마이크로어레이
표적 분석물은 이전의 실시예에 기재된 리보솜 단백질 S6 (rpS6, 유니프롯 엔트리 번호 P62753)으로도 공지된 인간 S6 리보솜 단백질이다. 단백질 번역후 변형의 온라인 데이터베이스 (포스포사이트플러스(PhosphoSitePlus)®)에 따르면, rpS6은 단백질 C-말단에 위치한 잔기의 클러스터를 포함하는 다수의 부위에서 인산화될 수 있다: Ser235, Ser236, Ser240, Ser242, Ser244, Ser246, Ser247.
rpS6 내의 개별적 부위의 인산화 상태를 측정하기 위한 마이크로어레이를 이전에 기재된 방법을 사용하여 제조하였다. 마이크로어레이는 그들의 각각의 비드에 개별적으로 접합된 3종의 상이한 항체를 포함하였다: (1) 셀 시그널링 테크놀로지로부터의 이전에 기재된 모노클로날 토끼 항체, 카탈로그 번호 4858; (2) 이랩사이언스(Elabscience) (미국 텍사스주 휴스턴)로부터의 폴리클로날 토끼 항체, 카탈로그 번호 E-AB-32812; (3) 또한 이랩사이언스로부터의 폴리클로날 토끼 항체, 카탈로그 번호 E-AB-32813. 이랩사이언스의 웹사이트 상에서 이용가능한 제품 설명에 따르면, E-AB-32812에 대한 면역원은 "Ser235의 비-인산화 부위 주위의" 인간 rpS6으로부터 유래된 합성 펩티드인 반면, E-AB-32813에 대한 면역원은 "Ser240의 비-인산화 부위 주위의" 인간 rpS6으로부터 유래된 합성 펩티드이다. 항체 #4858을 함유하는 반응성 부위는 Ser235/Ser236에서 이중으로 인산화된 rpS6의 단백질분해성 단편, 뿐만 아니라 Ser235/Ser236 외에도 Ser240, Ser242, Ser244, Ser246 및/또는 Ser247에서 인산화된 단백질분해성 단편에 결합할 것으로 예상된다. 따라서, 이 반응성 부위의 포획 시약에 의해 인식되는 에피토프는 2개의 PTM을 함유하는 반면, 반응성 부위에 결합하는 표적의 일부는 에피토프 외부에 위치한 1개 이상의 추가의 PTM을 함유한다. 항체 #E-AB-32812를 함유하는 반응성 부위는 비-인산화된 Ser 235를 함유하는 rpS6의 단백질분해성 단편에 결합할 것으로 예상된다. 항체 #E-AB-32813을 함유하는 반응성 부위는 비-인산화된 Ser 240을 함유하는 rpS6의 단백질분해성 단편에 결합할 것으로 예상된다. rpS6은 몇몇 별개의 부위에서 인산화될 수 있기 때문에, 마이크로어레이 반응성 부위의 각각은 상이한 분자량을 갖는 단백질분해성 펩티드에 결합할 것으로 예상된다.
제작된 마이크로어레이의 반응성 부위를 각각 이전에 기재된 바와 같이 제조된 MKN-45 세포의 트립신-소화된 용해물 200 μg과 반응시켰다. 이 실시예에서, 마이크로어레이 반응성 부위의 각각을 소화된 용해물과 함께 개별적으로 인큐베이션하고, 이어서 MS 분석을 위해 제조하였다. 따라서, 특정한 반응성 부위에 접합된 항체의 정체성은 MS 분석 전에 및 동안 공지되었다. MALDI TOF 질량 스펙트럼을 이전에 기재된 바와 같이 개별적 반응성 부위로부터 획득하였다. 항체 #4858에 의해 포획된 단백질분해성 펩티드의 질량 스펙트럼은 각각 2, 3, 4, 5, 6 및 7개의 인산화된 부위를 함유하는 rpS6의 C-말단 단편 (아미노산 233 내지 249)에 할당된 2013.1, 2093.0, 2173.0, 2252.9, 2332.9 및 2412.9의 평균 m/z 부근의 몇몇 현저한 피크를 나타내었다. 항체 E-AB-32813에 의해 포획된 단백질분해성 펩티드의 질량 스펙트럼은 각각 0 및 1개의 인산화된 부위를 함유하는 rpS6의 C-말단 단편 (아미노산 233 내지 249)에 할당된 1853.1 및 1933.0의 m/z 부근의 추가의 피크를 나타내었다. 1853.1 및 1933.0 피크는 적어도 2개의 인산화된 부위의 존재를 요구하는 항체 #4858을 사용하여 얻어진 질량 스펙트럼에서 검출되지 않았다. 마찬가지로, 2252.9, 2332.9 및 2412.9 피크는 적어도 1개 및 가능하게는 보다 많은 비-인산화된 부위의 존재를 요구하는 항체 E-AB-32813을 사용하여 얻어진 질량 스펙트럼에서 검출되지 않았다. 항체 E-AB-32812를 사용하여 얻어진 질량 스펙트럼은 rpS6의 비-인산화된 C-말단 단편에 상응하는 1853.1의 m/z 부근의 약한 피크를 나타내었고, 보다 높은 m/z에서는 검출가능한 피크를 나타내지 않았다. 이 신호의 낮은 강도는 그의 인산화된 대응물에 비해, 몇몇 내부 Arg 및 Lys 잔기를 함유하는 비-인산화된 rpS6의 보다 효율적인 트립신 소화에 기인할 수 있다. 이 실시예는 천연 발생 단백질의 서열에서 별개의 에피토프를 특이적으로 인식하는 별개의 포획제를 함유하는 마이크로어레이를 나타내며, 별개의 포획제는 별개의 비드와 회합된다. 이는 또한 PTM, 이 경우 인산화의 부재 하에서 및 존재 하에서 단백질 부위 (rpS6에서 Ser235)를 특이적으로 인식하는 별개의 포획제를 함유하는 마이크로어레이를 나타낸다.
실시예 20
단백질의 다수의 단백질분해성 단편을 측정하기 위한 마이크로어레이
단백질은 이전에 기재된 인간 진핵생물 번역 개시 인자 4E-결합 단백질 1 (4E-BP1, 유니프롯 엔트리 번호 Q13541)이다. 포스포사이트플러스® 데이터베이스에 따르면, 4E-BP1은 Thr37, Thr46, Ser65, Thr70, Ser101 및 Ser112를 비롯한 다수의 부위에서 인산화될 수 있다.
4E-BP1 내의 개별적 부위의 인산화 상태를 측정하기 위한 마이크로어레이를 이전에 기재된 방법을 사용하여 제조하였다. 마이크로어레이는 그들의 각각의 비드에 개별적으로 접합된 모두 셀 시그널링 테크놀로지로부터 구입한 4종의 항체를 포함하였다: (1) 포스포-4E-BP1 (Thr37/46) (236B4) 토끼 mAb (카탈로그 번호 2855); (2) 포스포-4E-BP1 (Ser65) (D9G1Q) 토끼 mAb (카탈로그 번호 13443); (3) 포스포-4E-BP1 (Thr70) (D7F6I) 토끼 mAb (카탈로그 번호 13396) 및 (4) 4E-BP1 (53H11) 토끼 mAb (카탈로그 번호 9644). 이 목록 상의 처음 3종의 항체는 인간 4E-BP1의 상응하는 인산화된 부위를 인식하도록 설계된 반면, #9644 항체는 4E-BP1의 총량을 탐색하도록 설계된다. 따라서, 마이크로어레이는 4E-BP1 내의 상이한 부위를 탐색할 수 있는 4개의 별개의 반응성 부위를 함유하였다. 마이크로어레이는 4개의 별개의 반응성 부위의 각각의 5개 미만의 복제물을 함유하였다.
제조자의 웹사이트 상의 제품 설명에 따르면, #9644 항체는 "인간 4E-BP1의 Ser112 주위의 잔기에 상응하는 합성 펩티드로 토끼를 면역화함으로써 제조된다". 이 항체를 함유하는 반응성 부위는 서열 RAGGEESQFEMDI (서열식별번호: 1)를 함유하는 합성 펩티드를 효율적으로 포획하였지만, 4E-BP1의 Ser112에 상응하는 잔기가 인산화된 서열 RAGGEE[pS]QFEMDI (서열식별번호: 31)를 함유하는 펩티드에는 결합하지 않았음이 실험적으로 검증되었다. 따라서, #9644 항체는 동일한 아미노산 서열을 함유하는 포스포 펩티드의 존재 하에서 비-인산화된 펩티드를 특이적으로 인식하였다.
제작된 마이크로어레이를 이전에 기재된 바와 같이 제조된 MKN-45 세포의 트립신-소화된 용해물 200 μg과 함께 인큐베이션하였다. 개별적 반응성 부위 상에 포획된 펩티드를 선형 및 리플렉터 MALDI TOF MS에 의해 측정하고, 또한 브루커 오토플렉스(Bruker Autoflex)의 LIFT 모드를 사용하여 MS-MS 시퀀싱으로 처리하였다. 개별적 반응성 부위 상에 포획된 펩티드의 서열을 LIFT에 의해 결정한 후, 이들을 항체 특이성에 기반하여 어레이에 포함된 4종의 항체의 각각에 할당하는 것이 가능하였다. #9644 항체를 함유하는 반응성 부위는 펩티드 RAGGEESQFEMDI (서열식별번호: 1) (1개의 상실된 절단, MW 1469.57) 및 AGGEESQFEMDI (서열식별번호: 2) (0개의 상실된 절단, MW 1313.39)를 포획하였다. #2855 항체를 함유하는 반응성 부위는 펩티드 VVLGDGVQLPPGDYST[pT]PGGTLFSTTPGGTR (서열식별번호: 32) (0개의 상실된 절단, MW 3129.36), VVLGDGVQLPPGDYSTTPGGTLFST[pT]PGGTR (서열식별번호: 33) (0개의 상실된 절단, MW 3129.36) 및 VVLGDGVQLPPGDYST[pT]PGGTLFST[pT]PGGTR (서열식별번호: 34) (0개의 상실된 절단, MW 3209.3449)을 포획하였다. 또한, 1 및 2개의 상실된 절단 부위를 함유하는 펩티드, 예컨대 VVLGDGVQLPPGDYST[pT]PGGTLFSTTPGGTRIIYDRK (서열식별번호: 35)는 또한 포획되었다. #13443 항체를 함유하는 반응성 부위는 펩티드 FLME[camC]RN[pS]PVTKTPPR (서열식별번호: 36) (2개의 상실된 절단 부위, MW 2014.28) 및 FLME[camC]RN[pS]PVTKTPPRDLPTIPGVTSPSSDEPPMEASQSHLR (서열식별번호: 37) (3개의 상실된 절단 부위, MW 4745.29)을 포획하였다. #13396 항체를 함유하는 반응성 부위는 펩티드 FLME[camC]RNSPVTK[pT]PPR (서열식별번호: 38) (2개의 상실된 절단 부위, MW 2014.28) 및 FLME[camC]RNSPVTK[pT]PPRDLPTIPGVTSPSSDEPPMEASQSHLR (서열식별번호: 39) (3개의 상실된 절단 부위, MW 4745.29)을 포획하였다. [camC]는 카르브아미도메틸 시스테인을 나타낸다. 모든 펩티드는 천연 동위원소 풍부도를 가졌다.
이 실시예에서, 마이크로어레이는 별개의 비드와 회합되고, 5000 Da 미만의 분자량을 갖는 인간 4E-BP1의 단편 내에 각각 포스포-Ser65 및 포스포-Thr70을 함유하는 별개의 에피토프를 개별적으로 인식하는 별개의 포획제, 즉, 항체 #13443 및 #13396을 함유하였다. 제1 PTM의 부위 (포스포-Ser65)는 제2 PTM의 부위 (포스포-Thr70)로부터 10개 미만의 아미노산만큼 분리된다.
이 실시예에서, 항체 #2855에 의해 인식되는 에피토프, 즉, ST[pT]P 서열 (서열식별번호: 40)은 인간 및 마우스 4E-BP1 둘 다에서 천연적으로 발생한다.
이 실시예에서, 항체 #2855 및 #9644에 의해 인식되는 에피토프는 트립신 및 키모트립신에 의해 인식되는 단백질분해성 절단 부위를 결여한다.
이 실시예에서, 단백질의 3개의 별개의 PTM-함유 단편은 마이크로어레이의 별개의 반응성 부위 상에 포획되었다.
이 실시예에서, 단백질분해성 펩티드를 포획하는데 사용된 항체는 웨스턴 블롯, 면역침전, 면역형광, 면역조직화학, 유동 세포측정 및 ELISA를 비롯한 검정에 대해 제조자에 의해 입증되었다.
4E-BP1의 서열 길이는 118개 아미노산이다. 마이크로어레이의 개별적 반응성 부위에 의해 포획된 4E-BP1의 단백질분해성 단편의 길이는 13개 아미노산 내지 42개 아미노산 범위였다. 마이크로어레이에 의해 포획된 모든 비-중첩 단백질분해성 단편의 조합된 서열 길이는 단백질의 서열 길이의 70% 초과인 86개 아미노산이었다. 이 실시예에서, 10개 미만의 별개의 포획제를 함유하는 마이크로어레이를 사용하여 단백질의 실질적 부분, 예를 들어 단백질의 서열 길이의 50% 초과를 탐색하는 것이 가능하였다.
별개의 실험에서, 동일한 마이크로어레이를 MKN-45 세포의 키모트립신-소화된 용해물과 반응시켰다. 항체 #9644를 함유하는 반응성 부위는 펩티드 RNSPEDKRAGGEESQFEMDI (서열식별번호: 41) (1개의 상실된 절단 부위, MW 2296.44) 및 RN[pS]PEDKRAGGEESQFEMDI (서열식별번호: 42) (1개의 상실된 절단 부위, MW 2376.42)를 포획하였다. 이 반응성 부위의 포획제에 의해 인식되는 에피토프는 PTM을 함유하지 않은 반면, 포획된 펩티드 표적 중 하나는 인간 4E-BP1의 Ser101에 상응하는 위치에서 PTM, 즉, 인산화를 함유하였다.
실시예 21
상이한 PTM 유형을 함유하는 표적에 결합하도록 구성된 마이크로어레이 반응성 부위
알앤디 시스템즈 (미국 미네소타주 미네아폴리스) 인간/마우스/래트 포스포-CDC2/CDK1 (Y15) 항체, 카탈로그 번호 AF888은 N-말단에 아세틸화 및 인간 CDC2의 Tyr15에 상응하는 아미노산의 인산화 둘 다를 함유하는 인간 시클린-의존성 키나제 2 (유니프롯 엔트리 번호 P24941) [Ac]MENFQKVEKIGEGT[pY]GVVY (서열식별번호: 43) (2개의 상실된 절단, MW 2314.52)의 키모트립신-소화된 단편을 인식한다. 제1 PTM (인산화)은 에피토프 내에 위치하는 반면, 제2 PTM (아세틸화)은 에피토프 외부에 위치한다. 이 실시예에서, 제1 PTM의 부위는 제2 PTM의 부위로부터 4000 Da 미만의 분자량을 갖는 펩티드 내의 10개 초과의 아미노산만큼 분리된다.
실시예 22
별개의 생물학적 경로의 구성요소인 별개의 단백질로부터 유래된 표적에 결합하도록 구성된 포획제
인간 STAT1 (유니프롯 엔트리 번호 P42224)에서 발견되는 아미노산 서열 PKEAP (서열식별번호: 44)를 인식하는 항체는 또한 전사 인자 p65 (유니프롯 엔트리 번호 Q04206)에서 발견되는 아미노산 서열 PKPAP (서열식별번호: 45)를 인식한다. 전자의 단백질은 신호 유도제 및 전사 활성화제인 반면, 후자는 전사 인자이다. 이들 서열을 함유하는 STAT1 및 p65의 MALDI MS - 검출가능한 단편은 이전에 기재된 방법을 사용한 MKN-45 세포의 용해물에서의 그들의 각각의 전구체 단백질의 키모트립신 소화에 의해 생성될 수 있다. 이러한 항체는 셀 시그널링 테크놀로지로부터 Stat1 (D1K9Y) 토끼 mAb, 카탈로그 번호 #14994로서 입수가능하다.
실시예 23
무손상 단백질 및 소분자 표적 분석물에 결합하도록 구성된 마이크로어레이
마이크로어레이는 그들의 각각의 제조자에 의해 무손상, 즉, 비-소화된 단백질 및 소분자 표적을 인식하는 것으로 입증된 항체를 포함하였다. 인간 인슐린 (MW 5807.6 Da)을 인식하는 마우스 모노클로날 항체는 노부스 바이올로지칼즈(Novus Biologicals), 카탈로그 번호 NBP2-32975로부터의 것이었다. 전장 인간 C 반응성 단백질 (MW 25039 Da)을 인식하는 토끼 폴리클로날 항체는 압캠, 제품 코드 ab31156으로부터의 것이었다. 코르티솔 (MW 362.46)을 인식하는 마우스 모노클로날 항체는 압캠, 제품 코드 ab116600으로부터의 것이었다. 테스토스테론 (MW 288.43)을 인식하는 마우스 모노클로날 항체는 노부스 바이올로지칼즈, 카탈로그 번호 NBP1-78562로부터의 것이었다.
마이크로어레이는 700 Da 미만의 MW를 갖는 소분자를 인식하는 항체, 뿐만 아니라 5000 Da 및 10000 Da 초과의 MW를 갖는 무손상 단백질 (각각 인슐린 및 CRP)을 인식하는 항체를 함유하였다.
마이크로어레이는 또한 단백질 A+G에 접합된 비드를 함유하였다. 가교의 부재 하에서, 이 실시예에 열거된 항체를 단백질 A+G 접합된 비드로부터 용리하고, 매트릭스로서 시나핀산을 사용하여 MALDI TOF MS에 의해 검출하였다. 항체는 특이적 항체 서열에 따라 대략 130 kDa 내지 170 kDa의 분자량 범위에서 검출되었다. 이 실시예는 단백질 A+G가 단백질, 예를 들어 100 kDa 초과의 분자량을 갖는 항체에 결합하기 위한 포획 시약으로서 기능할 수 있음을 나타낸다.
본원에 인용된 모든 특허, 특허 출원, 및 공개된 참고문헌은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 본 개시내용은 그의 구체적인 실시양태와 관련하여 기재되었지만, 추가의 변형이 가능함이 이해될 것이다. 더욱이, 이 출원은 본 개시내용이 속하는 기술분야에서 공지되거나 통상적인 실시 내에 있는 바와 같이, 및 첨부된 청구범위의 범위 내에 해당하는 바와 같이, 본 개시내용으로부터 이러한 일탈을 포함하여, 본 개시내용의 임의의 변형, 용도, 또는 적응을 커버하는 것으로 의도된다.
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Claims (29)

  1. 제1 반응성 부위 및 제2 반응성 부위를 포함하는 비드 어레이로서, 제1 및 제2 반응성 부위의 각각이 비드 및 포획제를 포함하고, 포획제의 각각이 항체를 포함하고, 제1 반응성 부위의 포획제가 제2 반응성 부위의 포획제와 별개이며,
    여기서
    제1 반응성 부위의 포획제는 에피토프를 특이적으로 인식하고, 제1 표적 및 제2 표적에 특이적으로 결합하고,
    제2 반응성 부위의 포획제는 제1 반응성 부위의 포획제에 의해 인식되지 않는 에피토프를 특이적으로 인식하고,
    제1 및 제2 표적의 각각은 (i) 제1 반응성 부위의 포획제에 의해 인식되는 에피토프를 함유하고, (ii) 단백질성 화합물이고, (iii) 5000 Da 미만의 분자량을 가지며, 제1 표적의 분자량이 제2 표적의 분자량과 상이한 것인
    비드 어레이.
  2. 제1항에 있어서, 비드 어레이가 천연 발생 단백질의 서열에서 별개의 에피토프를 특이적으로 인식하는 별개의 포획제를 함유하며, 별개의 포획제가 별개의 비드와 회합되는 것인 비드 어레이.
  3. 제1항에 있어서, 비드 어레이가 천연 발생 단백질의 별개의 단백질분해성 단편을 특이적으로 인식하는 별개의 포획제를 함유하며, 별개의 단백질분해성 단편이 집합적으로 단백질의 서열 길이의 20% 초과를 차지하고, 별개의 포획제가 별개의 비드와 회합되는 것인 비드 어레이.
  4. 제1항에 있어서, 비드 어레이가 천연 발생 단백질의 단백질분해성 단편 내의 별개의 비-중첩 에피토프를 개별적으로 인식하는 별개의 포획제를 함유하며, 별개의 포획제가 별개의 비드와 회합되는 것인 어레이.
  5. 제1항에 있어서, 제1 반응성 부위의 포획제에 의해 인식되는 에피토프가 인간 단백질에서 및 마우스 단백질에서 천연적으로 발생하는 것인 비드 어레이.
  6. 제1항에 있어서, 제1 반응성 부위의 포획제에 의해 인식되는 에피토프가 제1 단백질에서 및 제2 단백질에서 천연적으로 발생하고, 제2 반응성 부위의 포획제에 의해 인식되는 에피토프가 제1 단백질에서 천연적으로 발생하고 제2 단백질에서는 그렇지 않은 것인 비드 어레이.
  7. 제1항에 있어서, 제1 및 제2 반응성 부위의 포획제에 의해 인식되는 에피토프가 트립신에 의해 및 키모트립신에 의해 인식되는 단백질분해성 절단 부위를 결여한 것인 비드 어레이.
  8. 제1항에 있어서, 제1 반응성 부위의 포획제에 의해 인식되는 에피토프가 트립신에 의해 인식되는 단백질분해성 절단 부위를 결여하고, 제2 반응성 부위의 포획제에 의해 인식되는 에피토프가 단백질분해성 절단 부위를 함유하는 것인 비드 어레이.
  9. 제1항에 있어서, 제1 반응성 부위의 포획제에 의해 인식되는 에피토프가 번역후 변형 (PTM)을 결여하고, 제1 및 제2 표적 중 하나가 PTM을 함유하는 것인 비드 어레이.
  10. 제1항에 있어서, 제1 반응성 부위의 포획제에 의해 인식되는 에피토프가 제1 PTM을 함유하고, 제1 및 제2 표적 중 적어도 하나가 제2 PTM을 추가로 함유하며, 제2 PTM이 에피토프의 외부에 위치하고, 제1 PTM이 인산화이고, 제2 PTM이 아세틸화, 메틸화, 글리코실화, 유비퀴틴화 및 SUMO화 중 하나인 비드 어레이.
  11. 제1항에 있어서, 제1 및 제2 반응성 부위의 포획제가 또한 검정에서 그들의 상응하는 에피토프를 특이적으로 인식하며, 검정이 웨스턴 블롯, 효소-연결 면역흡착 검정 (ELISA), 유동 세포측정, 면역조직화학, 면역침전 및 면역형광 중 적어도 하나인 비드 어레이.
  12. 제1항에 있어서, 제1 반응성 부위의 복제물을 추가로 포함하며, 복제물이 제1 반응성 부위의 포획제와 동일한 포획제를 포함하고, 여기서 비드 어레이에 포함되는 복제물의 수량은 10개 미만인 비드 어레이.
  13. 제1항에 있어서, 제1 및 제2 반응성 부위가 위치적 및 광학적 인코딩을 결여한 것인 비드 어레이.
  14. 제1항에 있어서, 제1 반응성 부위의 비드가 6% 초과인 아가로스 함량을 갖고, 150 마이크로미터를 초과하는 직경을 갖는 것인 비드 어레이.
  15. 제1항에 있어서, 제1 반응성 부위가 2개의 별개의 값을 포함하는 조합과 회합되며, 2개의 별개의 값이 제1 표적의 분자량으로부터 및 제2 표적의 분자량으로부터 유래되고, 조합이 제1 반응성 부위의 포획제에 특이적으로 결합하는 표적을 식별하는데 필요하고 충분한 것인 비드 어레이.
  16. 하기 단계를 포함하는, 친화성 결합을 수행하는 방법:
    비드 어레이를 샘플과 접촉시키는 단계로서, 비드 어레이가 제1 반응성 부위 및 제2 반응성 부위를 포함하며, 제1 및 제2 반응성 부위의 각각이 비드 및 포획제를 포함하고, 포획제의 각각이 항체를 포함하고, 제1 반응성 부위의 포획제가 제2 반응성 부위의 포획제와 별개인 단계,
    샘플로부터의 제1 표적 및 제2 표적을 제1 반응성 부위에 결합시키는 단계로서, 여기서 제1 및 제2 표적의 각각은 (i) 제1 반응성 부위의 포획제에 의해 인식되는 천연 발생 에피토프를 함유하고, (ii) 단백질성 화합물이고, (iii) 5000 Da 미만의 분자량을 가지며, 제1 표적의 분자량이 제2 표적의 분자량과 상이한 것인 단계, 및
    샘플로부터의 제3 표적을 제2 반응성 부위에 결합시키는 단계로서, 여기서 제3 표적은 제2 반응성 부위의 포획제에 의해 인식되고, 제1 반응성 부위의 포획제에 의해 인식되지 않는 에피토프를 함유하는 것인 단계.
  17. 제16항에 있어서, 제1, 제2 및 제3 표적이 천연 발생 단백질의 별개의 단백질분해성 단편을 포함하는 것인 방법.
  18. 제16항에 있어서, 제1, 제2 및 제3 표적이 천연 동위원소 풍부도를 갖는 것인 방법.
  19. 제16항에 있어서, 제1 및 제2 반응성 부위의 포획제에 의해 인식되는 에피토프가 적어도 2종의 소화 효소에 의해 인식되는 단백질분해성 절단 부위를 결여하며, 적어도 2종의 소화 효소가 트립신, 키모트립신, 펩신, 엔도프로테이나제 Glu-C 및 엔도프로테이나제 Asp-N으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  20. 제16항에 있어서, 제1 표적이 제1 단백질로부터 유래되고, 제2 표적이 제2 단백질로부터 유래되며, 제1 및 제2 단백질이 별개의 생물학적 경로의 구성요소인 방법.
  21. 제16항에 있어서, 제1 표적이 인간 단백질로부터 유래되고, 제2 표적이 마우스 단백질로부터 유래되는 것인 방법.
  22. 제16항에 있어서, 제1 반응성 부위의 포획제에 의해 인식되는 에피토프가 제1 PTM을 함유하고, 제1 및 제2 표적 중 적어도 하나가 제2 PTM을 추가로 함유하며, 제1 PTM의 부위가 제2 PTM의 부위로부터 10개 미만의 아미노산만큼 분리되는 것인 방법.
  23. 제16항에 있어서, 제1 반응성 부위의 포획제에 의해 인식되는 에피토프가 인산화된 부위를 함유하고, 제1 및 제2 표적 중 적어도 하나가 인산화 이외의 PTM을 추가로 함유하는 것인 방법.
  24. 제16항에 있어서, 제1 반응성 부위의 포획제에 의해 인식되는 에피토프가 적어도 2개의 PTM을 함유하고, 제1 및 제2 표적 중 적어도 하나가 추가의 PTM을 추가로 함유하며, 추가의 PTM이 에피토프의 외부에 위치하는 것인 방법.
  25. 제16항에 있어서, 천연 발생 단백질의 별개의 단편을 비드 어레이의 별개의 반응성 부위에 결합시키는 단계를 추가로 포함하며, 별개의 단편이 집합적으로 단백질의 서열 길이의 20% 초과를 차지하는 것인 방법.
  26. 제16항에 있어서, 천연 발생 단백질의 적어도 3개의 별개의 단편을 비드 어레이의 별개의 반응성 부위에 결합시키는 단계를 추가로 포함하며, 적어도 3개의 별개의 단편의 각각이 PTM을 함유하는 것인 방법.
  27. 제16항에 있어서, 선형 모드 비행 시간 질량 분광법 (TOF MS: Time-of-Flight Mass Spectrometry)을 사용하여 제1 표적을 검출하고, 리플렉터 모드 TOF MS를 사용하여 제2 표적을 검출하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  28. 제16항에 있어서, 제1 및 제2 표적이 매트릭스 보조 레이저 탈착 이온화 (MALDI: Matrix Assisted Laser Desorption Ionization) MS에 의한 검출을 위한 상이한 매트릭스를 요구하는 것인 방법.
  29. 제16항에 있어서, 비드 어레이가 제1 반응성 부위의 5개 미만의 복제물을 함유하는 것인 방법.
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