CN111263886A - 用于蛋白质组学的多重微球阵列 - Google Patents

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Abstract

公开了适用于通过质谱法分析的微球阵列。在一个实施方式中，微球阵列包括多个反应位点，每个反应位点能够结合多种不同的靶标分析物。

Description

用于蛋白质组学的多重微球阵列
相关申请的交叉引用
本申请根据35U.S.C.119(e)要求发明人Vladislav B.Bergo于2017年9月7日提交的美国临时专利申请号62/555,235的权益，其公开内容通过引用并入本文。
联邦赞助的研究或开发
本发明利用美国国立卫生研究院(NIH)授予的基金号GM103348和美国国家科学基金会(NSF)授予的基金号1456224的政府支持完成。政府拥有本发明的某些权利。
序列表
本申请包含序列表，该序列表已经以ASCII格式电子提交，并且通过引用以其整体并入本文。创建于2018年9月7日的所述ASCII拷贝命名为84025PCT_SL.txt，并且大小为14,638个字节。
技术领域
本文公开的实施方式一般地涉及微球阵列(bead array)领域，更具体地涉及编码微球阵列中的微球的领域。本文公开的实施方式还涉及基于微球的分析测定、蛋白质组学、蛋白质定量、亲和分离和质谱法的领域。
背景技术
生物阵列是已在生命科学——特别是在基因组学、代谢组学、脂质组学、糖组学、蛋白质组学、组织学和细胞学领域中发现多种应用的多重(multiplexed)分析平台技术。生物阵列通常以固定在固体支撑物(比如玻璃显微镜载玻片或微球)上的大量不同的捕获剂为特征。捕获剂能够结合靶标分析物。根据所选择的固体支撑物的类型，可以将生物阵列分类为印刷阵列或微球阵列。印刷阵列与微球阵列之间的主要区别在于，微球阵列通常缺乏位置编码。因此，可能无法从微球的空间位置推断出结合到特定微球的捕获剂的身份，并且必须使用其他微球编码手段。
编码微球阵列的各种方法在本领域中是已知的。这类方法利用光学标记、荧光标记、光学条形码、标识符结合配体和质量标签。
某些类型的微球阵列不需要微球编码。例如，可能能够通过质谱法直接分析捕获剂，并基于其测量的分子量、酶切图谱或MS-MS碎片化图谱(fragmentation profile)鉴定这种捕获剂。
也可能能够通过质谱法直接分析靶标分析物，并基于其测量的分子量、酶切图谱或MS-MS碎片化图谱鉴定这种靶标分析物。
名称为“Methods of quantitation and identification of peptides andproteins”的美国专利7,846,748公开了使用基质辅助激光解吸电离质谱法(MALDI MS)来分析与单个微球结合的未标记和同位素标记的肽的混合物。公开了可以通过使用串联MALDI质谱法(MALDI MS-MS)测量肽碎片化图谱，随后进行数据库搜索或通过进行从头鉴定(de novo identification)，来确定与微球结合的肽的氨基酸序列。还公开了定量测量肽丰度的可能性，这需要使用同位素标记的肽，即含有2H和18O同位素的肽。
名称为“Decoding of array sensors with microspheres”的美国专利7,033,754公开了使用质谱法来鉴定结合至已经含有生物活性剂的微球体的标识符结合配体(IBL)。在该公开的方法中，IBL的功能类似于微球质量标签。还公开了可以通过使用质谱法直接进行生物活性剂的表征。
名称为“Microarray compositions and methods of their use”的美国专利9,618,520公开了微阵列可能不具有常规的编码活性剂的手段，该专利通过引用以其全部并入本文。因此，活性剂可以用作其自身的代码，并且微阵列解码过程可以包括从其相应的微球释放活性剂，然后使用质谱法鉴定该活性剂。
公开号为US 2012-0202709A1的美国专利申请序列号13/369,939公开了提供关于存在于或可能存在于微球阵列中的化合物的分子量的信息，其通过引用以其全部并入本文。这种化合物可以包括捕获剂、靶标、探针、二级探针、接头和微球质量标签。公开了分子量信息可用于指导质谱数据的获取，也可用于鉴定存在于各个微球上的分析物。
名称为“MALDI Immunoscreening(MiSCREEN):A Method for Selection ofAnti-peptide Monoclonal Antibodies For Use in Immunoproteomics”的文章(RazawiM et al,J.Immunol.Methods 2011,364,50–64)公开了适合于免疫亲和富集的抗肽抗体。还公开了含有蛋白质靶标、相应的胰蛋白酶肽、其氨基酸序列和预测分子量的列表。
名称为“Precision of Heavy–Light Peptide Ratios Measured by MALDI-TOFMass Spectrometry”的文章(Anderson NL et al,J.Proteome Res.2012,11,1868-1878)公开了在用缀合至蛋白质G Dynabeads的抗肽抗体温育消化的人血浆之后记录的MALDITOF质谱。在质谱的1,000-1,500m/z区域中检测到多个(超过20个)不同的峰。这些峰中的数个被归属为被微球缀合的抗体特异性捕获的肽。另一个峰被归属为源自人血清白蛋白的蛋白水解肽，其与抗体缀合的微球非特异性结合。大多数峰未被归属为特定分析物，并且它们的起源仍然未知。
现有技术没有教导或建议靶标编码的微球阵列，其中反应位点仅由特异性结合至反应位点的捕获剂的靶标分析物的分子量编码。具体地，现有技术没有公开如此靶标编码的微球阵列，其中反应位点的捕获剂能够结合两种、三种、四种或更多种不同的靶标分析物并且反应位点由两个、三个、四个或更多数量的值的组合编码，每个值均源自特异性结合至反应位点的捕获剂的靶标分析物的分子量。
因此，仍然需要能够分析微球阵列的方法和组合物。
发明内容
在一方面，本说明书描述了微球阵列，其至少包括第一反应位点和第二反应位点。第一反应位点包括第一微球和与第一微球缔合的第一捕获剂。第一捕获剂特异性地识别天然存在的表位，并特异性地结合含有这种表位的至少两个不同的靶标。不同的靶标可以是具有不同分子量的蛋白质化合物。不同的靶标可以是单个前体蛋白的蛋白水解片段或不同前体蛋白的蛋白水解片段。第二反应位点包括第二微球和第二捕获剂，该第二捕获剂在化学上与第一捕获剂不同，与第二微球缔合并特异性地识别未被第一反应位点的捕获剂识别的表位。第一和第二反应位点中的每个均与独特的组合相关联，该独特的组合包括至少两个不同的值，其源自特异性地结合至相应反应位点的靶标的分子量。与第一反应位点相关联的组合不同于与第二反应位点相关联的组合。
在另一方面，本说明书描述了使用微球阵列进行亲和结合的方法，其包括以下步骤：使微球阵列与样品接触，将来自样品的第一靶标和第二靶标结合至微球阵列的第一位点，并且将来自样品的第三靶标结合至微球阵列的第二反应位点。第一和第二反应位点含有微球和捕获剂，第一反应位点的捕获剂不同于第二反应位点的捕获剂。第一靶标和第二靶标是分子量小于5000Da并含有天然存在的表位的蛋白质化合物，该天然存在的表位被第一反应位点的捕获剂识别。第三靶标含有被第二反应位点的捕获剂识别而不被第一反应位点的捕获剂识别的表位。
在又另一方面，本说明书描述了一种对微球阵列进行解码的方法，该方法包括以下步骤：接收通过分析微阵列的反应位点而产生的质谱，检测质谱中的第一信号和第二信号并验证第一信号的m/z值和第二信号的m/z值或其等效值是否与存在于与微阵列的至少一个反应位点相关联的组合中的值相匹配。
在又另一方面，本说明书描述了一种制造微球阵列的方法。该方法包括评估微球阵列的各个反应位点以确定靶标分析物的身份和分子量的步骤，该靶标分析物可以特异性地或非特异性地结合至每个反应位点。该方法可以任选地包括将关于靶标分析物的身份和分子量的信息输入到解码表中的步骤，然后将该解码表与微球阵列一起包括。
在又另一方面，本说明书描述了鉴定微球阵列内的靶标分析物的数种方法。所描述的方法中的一些涉及测量源自靶标分析物的分子量的值，并且随后使用与微阵列一起提供的解码表来确定靶标分析物的身份。所描述的方法可以用于分析各种类型的生物样品，包括无细胞蛋白转录-翻译反应物、细菌细胞培养物、哺乳动物细胞培养物、细胞培养物上清液、动物模型、异种移植物、组织活检样品、生物流体等。
本说明书中描述的分析方法和组合物可以在广泛的应用中使用，所有应用包括基础研究、药物发现和药物开发、疾病诊断和预后、生物标志物发现和确认、个性化医疗、精确医疗、系统生物学等。
附图说明
将参考附图进一步解释当前公开的实施方式，其中贯穿若干视图，相似的结构由相似的数字表示。所显示的附图不一定按比例绘制，而是通常将重点放在说明当前公开的实施方式的原理上。
图1A示意性地描绘了包括若干不同的反应位点的微球阵列。每个反应位点均包括微球和捕获剂的多个拷贝，这些捕获剂能够特异性地结合两种或多种不同的靶标分析物。
图1B示意性地描绘了包括含有关于靶标分析物的信息的若干条目的解码表，该靶标分析物特异性地结合至微球阵列的各个反应位点。关于靶标分析物的信息包括其身份，比如名称、数据库ID和/或序列及其分子量、质荷比和/或飞行时间值。
图2A示意性地描绘了用于进行亲和结合的方法，其中前体蛋白的不同蛋白水解片段被捕获在微球阵列的不同反应位点上。
图2B示意性地描绘了用于进行亲和结合的方法，其中源自不同前体蛋白的蛋白水解片段被捕获在微球阵列的相同反应位点上。
图3是在置于磁性微球分离架上的微量离心管内的含有多个不同的反应位点的悬浮微球阵列的照片。
图4是微孔载玻片的照片，该微孔载玻片附连至8孔
Figure BDA0002452781050000041
模块上并且位于用于弹簧模块的
Figure BDA0002452781050000042
托盘的中间部分。
图5是微球阵列的照片，其中400μm磁性琼脂糖微球排列在微孔载玻片上的500μm孔内。
图6A是含有CHCA MALDI基质晶体的直径为500μm的微点阵列的亮场显微镜图像，其中一些微点还含有由于干燥而尺寸减小的琼脂糖微球。
图6B是在去除琼脂糖微球之后，含有CHCA MALDI基质晶体的直径为500μm的微点阵列的亮场显微镜图像。
图7显示了在将阵列暴露于酶促消化的MKN-45细胞裂解物之后，从4重微球阵列的各个反应位点记录的示例性质谱。
具体实施方式
术语“微阵列(microarray)”和“微球阵列(bead arrary)”在整个本说明书中可互换使用，并且是指包括至少两个反应位点的组。
术语“反应位点”是指微球和与该微球缔合的捕获剂的组合。
术语“捕获剂”是指能够特异性结合化合物的分子或分子复合物。捕获剂的非限制性实例是单克隆抗体。术语“捕获剂”的单数形式可以指多个分子或多个分子复合物。例如，它可以指多个抗体分子。
术语“靶标分析物”和“靶标”在整个说明书中可互换使用，并且通常是指捕获剂的结合伴侣(partner)。靶标分析物的非限制性实例是肽。术语“靶标分析物”和“靶标”的单数形式可以指多个分子，例如，多个肽分子。
术语“肽”和“多肽”在整个本说明书中可互换使用，并且是指含有通过酰胺键连接的至少两个氨基酸的化合物，该酰胺键也称为肽键。
术语“蛋白质”具有与生物化学、生物物理学和分子生物学领域中常用的含义相同的含义。它通常是指含有至少一种多肽的分子或分子复合物。
术语“蛋白质化合物”涵盖肽、多肽和蛋白质。
术语“孔”和“微孔”在整个本说明书中可互换使用，并且是指能够容纳液体介质、颗粒或两者的拓扑学特征，比如凹坑(pit)或凹陷(depression)。
术语“值”通常被定义为由代数项表示的数字量；数量、量或数字。
在一个实施方式中，如图1A中所示意性描绘的，本说明书描述了微阵列，即微球阵列，其包括第一反应位点102和第二反应位点103。第一反应位点包括结合到第一微球111的第一捕获剂112的多个拷贝。第一捕获剂112配置为特异性结合第一靶标121和第二靶标122。第一靶标和第二靶标二者均为包含表位128的蛋白质化合物，该表位128被第一捕获剂特异性地识别。第一靶标的分子量和第二靶标的分子量小于5000道尔顿(Da)。第一靶标的分子量不同于第二靶标的分子量。第一靶标的分子量可与第二靶标的分子量相差小于1Da或多达数千Da。在一个实施方式中，第一靶标的分子量与第二靶标的分子量之间的差大于5Da。例如，第一靶标和第二靶标之间的分子量差可以大于10Da、大于20Da、大于50Da、大于100Da、大于200Da、大于500Da或大于1,000Da。第二反应位点包括与第二微球113结合的第二捕获剂114的多个拷贝。第二捕获剂不同于第一捕获剂并且配置为特异性地结合第一靶标123、第二靶标124和第三靶标125。第二反应位点的捕获剂特异性地识别表位129，该表位未被第一反应位点的捕获剂识别。三个靶标123、124和125中的每个具有不同的分子量。三个靶标123、124和125中的每个均含有表位129。第一微球和第二微球可以由生物相容性材料制成，比如玻璃、聚苯乙烯、聚丙烯、其他类型的聚合物、琼脂糖、纤维素、其他类型的水凝胶或复合材料。第一捕获剂和第二捕获剂中的每个可以是单克隆抗体、多克隆抗体、抗体片段、单结构域抗体、适体、
Figure BDA0002452781050000051
试剂、亲和体(affimer)、蛋白质、多肽、受体、配体、酶、酶底物、酶抑制剂或任何其他能够亲和结合的化合物。例如，可以选择单克隆或多克隆抗体以识别特定的表位，使得缀合至第一微球的抗体识别与缀合至第二微球的抗体不同的表位。
在一个实施方式中，第一和第二微球以及第一和第二捕获剂是未标记的，即，它们不包括可检测的标记。例如，微球和捕获剂二者都可能缺乏光学标记和质量标签。此外，第一和第二微球也可能缺乏位置编码。其中反应位点缺乏位置编码的微阵列不允许基于反应位点的位置鉴定捕获剂。
优选地，存在于第一和第二微球上的捕获剂的量足以使至少100阿摩尔的每种靶标结合至它们各自的反应位点。取决于微球的特定性质和捕获试剂的属性，每种反应位点可以具有结合超过1皮摩尔或者甚至超过10皮摩尔的其各自靶标的能力。
微阵列可以进一步包括至少一种反应位点的至少一个重复品。例如，图1A中示意性描绘的第一反应位点的复制品可以包括微球和与第一反应位点的捕获剂在化学上不可区别的与微球连接的捕获剂。该微阵列可以含有特定反应位点的1至100个的复制品。对于某些分析应用，可能优选的是，微阵列含有特定反应位点的相对少量的复制品。例如，微阵列可含有特定反应位点的少于20个、少于15个、少于10个或少于5个的复制品。实际上，提供特定反应位点的1、2、3或4个复制品通常就足够了。一方面，具有特定反应位点的低数量的复制品可以帮助确保低丰度分析物不会在许多相同的反应位点之间被过度稀释，这将导致从单个反应位点获取的信号强度降低。另一方面，具有低数量的复制反应位点可通过减少试剂——例如，制造这种微阵列所需的抗体的量来帮助降低微阵列制造的成本。又另一方面，具有低数量的复制反应位点可以帮助提高特定的基于微球的测定的复用(multiplexing)能力，因为可以在较小的反应体积中组合大量的非复制反应位点并且随后在固体支撑物上进行分析。要注意的是，本说明书中公开的方法和组合物能够高效地操作和分析单个微球，并使在整个微球阵列处理步骤中丢失微球的可能性最小化。本说明书中公开的方法和组合物可用于防止在整个微球阵列处理步骤中损失甚至单个微球，并允许最终用户分析微阵列内的每个微球。本说明书中描述的微阵列操作程序使得组装其中至少一些反应位点是唯一的微阵列，即，在微阵列内没有复制品成为可能。这可导致许多低丰度分析物的检测灵敏度提高。
在一个实施方式中，如图1B中所示意性描绘的，微阵列进一步包括解码表130。解码表包括关于特异性结合至微阵列的各个反应位点的靶标的身份和分子量的信息。例如，与第一反应位点相关联并且被示意性地描绘为“反应位点1(REACTIVE SITE 1)”的条目131含有关于特异性结合至第一反应位点的第一靶标的身份和分子量的信息，其在解码表的132和133栏中分别被示意性地描绘为“靶标1-1(TARGET 1-1)”和“值1-1(VALUE 1-1)”。条目131进一步含有关于特异性结合至第一反应位点的第二靶标的身份和分子量的信息，其分别被示意性地描绘为“靶标1-2(TARGET1-2)”和“值1-2(VALUE 1-2)”。同样，与第二反应位点(其被示意性地描绘为“反应位点2(REACTIVE SITE 2)”)相关联的条目，含有关于特异性结合到第二反应位点的三个不同靶标的每个的身份和分子量的信息。
如果靶标是蛋白质或衍生自蛋白质，例如，经由蛋白质的酶消化，则关于靶标身份的信息可以是以下的一种或多种：蛋白质的名称、蛋白质的标识符、数据库中蛋白质的登录号、蛋白质的氨基酸组成、蛋白质内区域的氨基酸组成和蛋白质内位点的氨基酸组成。更一般地，关于靶标身份的信息可以包括以下的一种或多种：靶标的名称、其化学组成、其结构式等。关于靶标分子量的信息可以是源自靶标分子量的值。具体而言，可以为以下的一种或多种：靶标的分子量、靶标的质荷比(m/z)、靶标的飞行时间(TOF)值。它也可以是可以通过质谱法测量的另一个定量值，比如以下各项的m/z比或TOF值：(1)单电荷或多电荷形式的靶标，(2)靶标的氢加合物、铵加合物、钠加合物、钾加合物或其他加合物，(3)经受水、氨或其他修饰损失而导致其分子量降低等的靶标，(4)经受了的氧化或其他修饰导致分子量增加等的靶标。解码表还可以任选地含有关于相应捕获剂身份的信息。例如，如果捕获剂是抗体，则解码表可以含有关于被抗体识别的表位的序列、抗体的制造商、抗体的目录号等的信息。解码表中包括的数据可以存储在打印介质中，例如，打印在一张纸上；可选地，它可以被存储在电子介质中，例如，在计算机存储器中，在比如USB存储卡的可移动存储设备上，在基于云的存储器中等。解码表中包括的数据还可以经由其他手段获得，例如，发布在网站上或通过电子通讯例如电子邮件或短信发送和接收。可选地，包括在解码表中的数据可以通过软件程序或另一种形式的计算机算法按需生成。
提供解码表使得能够基于靶标分析物的分子量(MW)或其他性质来鉴定靶标分析物，其可以通过质谱法来测量，例如靶标分析物的荷质比(m/z)或靶标分析物的飞行时间(TOF)值。在一个实施方式中，源自靶标分子量的单一值与靶标的身份明确相关，因此足以在微阵列中明确鉴定靶标。在一个实施方式中，源自靶标的分子量的值是源自非碎片形式的靶标的分子量的值。换句话说，不需要通过串联质谱法对靶标进行碎片化以确定靶标的身份。此外，因为本公开的微阵列不使用液相色谱(LC)分离，所以与LC测量相关的关键分析参数，例如分析物保留时间，不需要包括在解码表中。
微阵列解码表不必须含有关于可以特异性结合特定反应位点的每一种不同靶标的身份和分子量的信息。换句话说，可以特异性结合特定反应位点的不同靶标的数量可以大于在解码表中可获得的关于身份和分子量信息的不同靶标的数量。例如，参考图1A和1B，第一反应位点102可以特异性结合超过2种不同的靶标，而第二反应位点103可以特异性结合超过3种的不同靶标。在微阵列解码表中可获得的关于身份和分子量的信息的不同靶标的数量应足以允许明确鉴定微阵列内的特定靶标、特定靶标组或特定反应位点。在一个实施方式中，解码表含有可以特异性结合至特定反应位点的2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12种不同靶标的身份和分子量信息。在一个实施方式中，关于可以特异性结合至特定反应位点的不同靶标的分子量的信息含有2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个不同的值。在某些情况下，微阵列中靶标的分子量可能足够独特，以允许基于单个测量的MW、m/z或TOF值明确鉴定靶标，其在图1B中被示意性地描绘为“反应位点N(REACTIVE SITE N)”、“靶标N(TARGET N)”和“值N(VALUE N)”。
在某些情况下，微阵列解码表可能含有特定反应位点的条目，其中为其提供了分子量信息的靶标的数量不同于为其提供了身份信息的靶标的数量。例如，为其提供了分子量信息的靶标的数量可以大于为其提供了身份信息的靶标的数量。这种情况在图1B中示意性地描绘为标记为“反应位点3(REACTIVE SITE 3)”的条目，其中为单个靶标提供身份信息，其被描绘为“靶标3(TARGET 3)”，而为两个不同靶标提供分子量信息，其被描绘为“值3-1(VALUE 3-1)”和“值3-2(VALUE 3-2)”。例如，当特定的反应位点能够特异性结合靶标(其身份未知)时，可能会发生这种情况。可选地，微阵列制造商可以选择不公开在解码表中提供了分子量信息的每一靶标的身份。
不仅在靶标的分子量唯一的情况下，而且在靶标的分子量不是唯一的，即，微阵列内的两个或更多个不同靶标具有相同或非常相似的分子量的情况下(其可能无法通过质谱法解析)，公开类型的微阵列都能够明确地鉴定靶标。例如，参考图1A，特异性结合至第一反应位点102的靶标122的分子量可以与特异性结合至第二反应位点103的靶标125的分子量非常接近或相同。如果两个不同的分析物具有相同或非常相似的分子量，它们可能无法通过MALDI TOF质谱法进行区分，尽管在一些情况下，它们可能会通过串联质谱法，例如，MALDI TOF-TOF MS或通过其他类型的质谱法进行区分。还可能的是，单一靶标能够特异性结合微阵列内的两个或更多个不同的反应位点。例如，特异性地结合到第一反应位点102的图1A中示意性描绘的靶标121也可以也可以特异性结合到第二反应位点103。在这种情况下，可以由微阵列的单个反应位点捕获并在单个质谱中一起检测到的两个、三个、四个、五个或者甚至更大量的不同靶标的分子量、m/z值或TOF值的组合——所谓的谱特征将足够独特，从而能够通过质谱法明确鉴定相应的靶标(一个或多个)。使用两个或更大数量的值来确定特定靶标分析物和/或特定反应位点的身份的优势可能包括对分析物鉴定的更高的置信度，以及对于基于微阵列的分析方法而言，更高的复用度。
所公开类型的微阵列还适用于其中由相同反应位点捕获的不同靶标的数量在不同样品之间，例如，不同的细胞系或已用不同化合物处理的细胞系之间变化的分析应用。
先前注意到，所公开的微阵列编码系统可能不需要通过质谱法对靶标分析物碎片化或测序以鉴定微阵列内的靶标分析物。然而，对于存在于微阵列中的一些或全部靶标分析物，可以任选地通过质谱法，例如，通过串联质谱法进行分析物测序，以便增加分析物鉴定的置信度或出于除了分析物鉴定之外的目的。例如，可以通过串联质谱法分析肽，以确定肽序列内翻译后修饰的位置。
通过质谱法的测序也可以专门用于鉴定由微阵列的反应位点捕获的各个靶标分析物的目的。在这种情况下，包含在解码表中的关于靶标分析物的分子量和身份的信息可能是多余的，因此，解码表可能不需要与微阵列一起提供。使用由微阵列捕获的各个靶标分析物的MS-MS测序对微阵列进行解码。这种方法的一个潜在好处是发现并鉴定与微阵列反应位点结合的新型分析物的可能性。然而，这将需要访问能够进行MS-MS(MS2)分析的更高级的MS仪器。
通过质谱法的测序也可以用于使用化学标记方法，比如串联质量标签(TMT)和用于相对和绝对定量的等压标签(iTRAQ)对多个样品中的蛋白质丰度变化进行定量分析。本说明书中包括的实验实例描述了大直径、高结合能力的磁性琼脂糖微球，其适用于进行基于TMT和iTRAQ的蛋白质定量研究。
在一个实施方式中，本公开的微阵列包括多个不同的反应位点和微阵列解码手段，例如，微球阵列解码表。这种微阵列的每个反应位点配置为特异性结合1至30种不同的靶标，每种靶标具有不同的分子量。每个反应位点包括微球和与微球缔合的捕获剂。每个反应位点都与含有1至30个不同值的组合相关联，每个值都源自与相应反应位点特异性结合的靶标的分子量。与特定反应位点相关联的组合用作代码，该代码能够使用靶标分析物的测量的分子量或等效参数(例如，m/z或TOF值)来鉴定靶标分析物。这种组合可以是微阵列解码表的一部分，其包括关于以下的信息：每种靶标的(1)身份和(2)分子量。解码表可以进一步包括关于可以特异性结合至特定反应位点的不同靶标的数量的信息。它还可以包括关于生物样品(比如生物流体或细胞裂解物)中各个不同靶标的丰度的信息。可以以定量或定性形式提供丰度信息。例如，解码表可以含有这样的陈述：在从特定细胞系制备的样品中不存在或不可检测到某些肽分析物。
本公开的微阵列可以包括2至100种不同的反应位点。可选地，本公开的微阵列可以包括超过100种不同的反应位点。在本说明书中提供了以多种反应位点为特征的微阵列的实验实例。
本公开的微阵列可以配置为特异性结合2至100种不同的靶标，每个不同的靶标具有不同的分子量。可选地，本公开的微阵列可以配置为特异性结合100至500种不同的靶标。可选地，本公开的微阵列可以配置为特异性结合超过500种不同的靶标。不同的靶标可以源自单一蛋白质或多种不同的蛋白质。例如，微阵列可以含有不同的捕获剂，其特异性地识别并结合天然存在的前体蛋白的不同的蛋白水解片段。由微阵列中包括的捕获剂识别的这类前体蛋白的不同蛋白水解片段的数量可以为2、3、4、5、6、7、8、9、10或大于10。结合源自相同前体蛋白的各个区域的蛋白水解片段能够分析蛋白质一级序列的相当大部分，直至完整的蛋白质序列。具体而言，微阵列可含有结合前体蛋白的不同蛋白水解片段的不同捕获剂，其共同占蛋白质一级序列长度的大于5％、大于10％、大于20％、大于30％、大于40％、大于50％、大于60％、大于70％、大于80％、大于90％、大于95％或100％。这类不同的捕获剂与不同的微球缔合，因此不同的蛋白水解片段被不同的反应位点捕获。在本说明书中提供了能够结合源自相同蛋白质的不同肽的微阵列的数个实例。
本公开的微阵列可以配置为进行少于100种不同靶标、100和1,000种之间的不同靶标或超过1,000种不同靶标的分析。可以使用本公开的微阵列分析的不同靶标的数量由数个因素确定，其包括各个靶标的化学组成、质谱仪的光谱分辨率和质谱仪的检测质量范围。例如，对于通过MALDI TOF MS以线性模式测量的蛋白水解肽，检测质量范围可以设置在大约800Da至8,000Da之间。如果各个蛋白水解肽的分子量相隔约5Da，这恰好在现代MALDITOF MS仪器的光谱分辨能力之内，则可以在这种微阵列中测量并明确鉴定超过1,000种不同的靶标分析物。
本公开的微阵列可以配置用于结合多个不同的靶标，每种不同的靶标具有大于700Da且小于30,000Da的分子量。本公开的微阵列还可以配置用于结合具有小于700Da或大于30,000Da的分子量的靶标。在本说明书中提供了能够结合具有低于1,000Da、在1,000-10,000Da之间和大于10,000Da的分子量的靶标的微阵列的实验实例。
本公开的微阵列可以配置为进行与源自邻近其C-末端的蛋白质区域的多个靶标的结合。为了实现这一点，可以选择抗体以识别位于蛋白质一级序列中的足够靠近C-末端的表位，例如，距离蛋白质C末端少于3个、少于5个、少于7个、少于10个、少于15个、少于20个或少于25个氨基酸。这种微阵列可用于检测C-末端区域中的蛋白质异质性、蛋白水解降解和/或蛋白质修饰，以及其他作用。
本公开的微阵列可以配置为进行与源自邻近蛋白质的N-末端的蛋白质区域的多个靶标的结合。为了实现这一点，可以设计抗体以识别位于一级序列中的足够接近蛋白质N-末端的表位，例如，例如距离蛋白质N-末端少于3个、少于5个、少于7个、少于10个、少于15个、少于20个或少于25个氨基酸。这种微阵列可用于检测引发剂甲硫氨酸的去除和/或蛋白质N-末端的乙酰化，以及其他作用。
在一个实施方式中，本公开的微阵列配置用于结合多个不同的靶标，并且包括解码表，该解码表含有关于不同的靶标的至少一个的碎片化模式的信息。关于特定靶标的碎片化模式的信息可以用于确认靶标的身份。在本说明书中提供了微阵列的实验实例，该微阵列包括解码表，该解码表含有关于靶标的碎片化模式的信息。
本公开的微阵列可以包括缺乏位置、光学和质量标签编码的一个或数个反应位点。在一个实施方式中，微阵列的所有反应位点都缺乏位置、光学和质量标签编码。此外，与多重夹心免疫测定法不同，本公开的微阵列的每个靶标分析物仅包括单一(捕获)抗体，并且每个靶标分析物不需要且不包括两种不同的抗体(捕获和检测)。
在一个实施方式中，本说明书公开了一种微阵列，其包括至少两个不同的反应位点和解码表。每个不同的反应位点都能够特异性结合至少一个靶标。解码表含有关于特异性结合至每个不同反应位点的靶标的身份和分子量的信息，以及关于样品中靶标的至少一个的丰度的信息。解码表还可以任选地包括对样品的描述，为其提供靶标丰度数据。
提供关于样品中靶标丰度的信息可以帮助增加在微阵列与样品反应后通过质谱法鉴定靶标的置信度。
特定靶标的丰度信息可以以各种形式提供。在一个实施方式中，提供丰度信息作为关于样品中靶标可能存在的信息，即，可以预期样品中存在或不存在特定靶标。例如，预期源自人细胞系的样品中不会存在小鼠来源的蛋白质。在另一个实例中，可能已知在特定细胞系、特定器官或特定组织类型中不表达特定蛋白质或蛋白质同工型，因此其在这类样品中的丰度将为零。在一个实施方式中，提供丰度信息作为关于样品中两个或更多个靶标的相对丰度的信息。例如，可以预期特定前体蛋白的两种同工型以一定比例存在，或者可以预期至少一种同工型比另一种更丰富。在另一个实例中，可以预期特定前体蛋白的两个PTM位点以一定比例存在，其中一个位点比另一个被更大程度修饰，例如，被磷酸化。在一个实施方式中，以定量形式提供丰度信息。例如，关于特定蛋白质在血清或血浆中的丰度的信息可以是已知的，至少近似并表示为浓度范围，例如，mg/ml、μg/ml、ng/ml或pg/ml。在另一个实例中，可以提供从特定分析物预期的质谱信号的近似强度。
为其提供靶标丰度数据的样品的描述可包括以下一项或多项：样品来源，例如，特定的细胞系、组织、生物流体等；样品处理条件，比如细胞系暴露于特定化合物；样品处理历史，例如，使用特定的消化酶。
以下提供了特异性结合至微阵列的不同反应位点的不同靶标分析物的数个非限制性实例，并且在说明书的实施例部分中对其进行了进一步描述。
肽同工型：这些是具有密切相关但不相同的氨基酸序列的肽。序列差异可包括氨基酸添加、氨基酸缺失、氨基酸取代和氨基酸修饰。氨基酸修饰可以是翻译后修饰(PTM)，比如磷酸化、乙酰化、甲基化、泛素化、糖基化等。单一肽序列可以含有一个以上的PTM位点和一个以上的PTM类型。例如，蛋白质磷酸化可在单一肽序列内的多个相邻位点上发生。
具有不同化学修饰的肽：肽的化学修饰通常涉及一个或多个化学基团与肽的共价连接，该化学基团或者与氨基酸的侧链或者与肽的N-或C-末端基团共价连接。已知许多能够修饰肽的试剂。例如，可以用含有N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯或亚氨酸酯(imidoester)的化合物对肽进行共价修饰，该化合物靶向赖氨酸侧链的伯胺和肽的N-末端。具体而言，可以用荧光染料，比如花青染料
Figure BDA0002452781050000111
3和
Figure BDA0002452781050000112
5、香豆素或香豆素衍生物对肽进行差异地标记。
在其他方面相同的氨基酸序列内含有不同数目的化学修饰的肽：例如，可以在N-末端胺以及赖氨酸侧链胺(一个或多个)处对肽进行化学修饰。因而，具有两个赖氨酸残基的肽可以含有0、1、2或3个化学修饰的胺。
内源肽和内标：通常将内标加标，即，添加到已经含有内源肽的样品中。内标可以是合成肽，其序列与内源肽的序列不同。
含有漏切(missed cleavage)位点的蛋白水解肽：通过消化酶比如胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、内切蛋白酶GluC、LysC、LysN、Arg-C、胃蛋白酶、弹性蛋白酶等消化前体蛋白可产生含有0、1、2、3、4、5、6或更大数量的漏切的多个肽。这类肽可以具有相同的表位，但是长度不同，因此分子量不同。此外，一些消化酶可展示非特异性活性，例如，某些胰蛋白酶制剂可能另外展示胰凝乳蛋白酶活性。在这种情况下，蛋白水解肽可以含有对于相应的消化酶而言不是典型或预期的切割位点。
通过肽键的非酶水解产生的肽：某些类型的肽键固有地具有低稳定性，并且即使在不存在消化酶的情况下也可能经历水解。这些包括在溴化氰存在下水解含甲硫氨酸的肽键，在甲酸存在下水解天冬氨酸-脯氨酸肽键，以及在羟胺存在下水解天冬酰胺-甘氨酸肽键。肽键的部分水解将导致出现两个或更多个不同长度的不同肽。
源自不同物种的肽：某些生物学技术，比如肿瘤异种移植物的产生与蛋白水解消化相结合，可以产生源自不同物种(例如，人类和小鼠)的肽的混合物。这种肽可以具有相同的表位，但是在表位之外的氨基酸组成不同。
衍生自在表位内共享相同或相似序列的蛋白质的肽，其被反应位点的捕获剂识别。这种蛋白质可以是相同的生物途径或不同的生物途径的组成成分。在后一种情况下，可以配置单一微阵列反应位点以特异性结合衍生自蛋白质的肽，这些蛋白质是2、3、4、5、6、7、8、9、10或更大数量的不同生物途径的组成成分。因此，单一微阵列反应位点可以配置为探测2、3、4、5、6、7、8、9、10或更大数量的不同生物途径的变化。
图2A-2B示意性地描绘了微阵列的一些实例以及使用微阵列进行亲和结合的方法。参考图2A，微阵列，即微球阵列可以含有与不同的微球207、208和209缔合的不同的捕获剂。不同的捕获剂特异性识别天然存在蛋白质201的序列中存在的不同表位。如果在蛋白水解消化后保留表位，则不同的反应位点也将特异性识别并特异性结合含有相应表位的不同蛋白水解片段202、203、204和205。该微阵列可含有特异性识别多个不同蛋白水解片段的多种不同捕获剂，所述多个不同蛋白水解片段共同占蛋白质序列长度的10％以上、20％以上、30％以上、40％以上、50％以上、60％以上、70％以上、80％以上、90％以上、95％以上或100％。例如，如果蛋白水解片段不重叠，每个蛋白水解片段含有10个以上氨基酸，并且整个蛋白质含有少于100个氨基酸，则该蛋白质的两个蛋白水解片段共同占该蛋白序列长度的20％以上。
如果重叠的蛋白水解片段202和203含有相同的表位，其可能由于，例如，不完全的酶消化而发生，则它们将被相同的捕获剂识别并被相同的反应位点207捕获，如图2A中所示意性描绘的。
参考图2B，可能的是，两种不同蛋白质211和212的蛋白水解消化将产生相同的片段215，其将被微球阵列的相同反应位点219捕获。测量片段215的丰度将提供关于前体蛋白质211和212二者的丰度的信息，但是将不提供关于各个蛋白质的丰度的信息。包括特异性捕获分别源自蛋白质211和212的蛋白水解片段214和216的另外反应位点217和218，将能够进行蛋白质特异性定量。可选地，源自蛋白质211和212的片段215可能具有共同的表位，但是由于其在表位之外的氨基酸组成的差异而具有不同的分子量。在这种情况下，即使在单个反应位点上捕获时，片段也将通过质谱法对其进行区分。
微阵列中的不同捕获剂可以单独地识别分子量小于5000Da的蛋白质化合物内的不同表位。
由微阵列的捕获剂识别的表位可以是天然存在的序列，其存在于人蛋白质和小鼠蛋白质中，或更一般地，存在于来自不同物种的至少两种蛋白质中。因此，微阵列的反应位点可以结合源自人和小鼠蛋白质二者的蛋白水解片段。说明书中提供了这种微阵列的实例。
可以设计微阵列，使得由第一反应位点的捕获剂识别的表位自然存在于第一蛋白质和第二蛋白质中，而由第二反应位点的捕获剂识别的表位自然存在于第一蛋白质中，而不存在于第二蛋白质中。说明书中提供了这种微阵列的实例。
可以设计微阵列，使得被第一和第二反应位点的捕获剂识别的表位缺乏被胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶识别的蛋白水解切割位点。胰蛋白酶通常识别含有赖氨酸或精氨酸的蛋白水解切割位点，除非它们后面是脯氨酸或与磷酸化氨基酸比如磷酸丝氨酸、磷酸苏氨酸、磷酸酪氨酸相邻。在一些情况下，胰蛋白酶可能无法识别含有Lys-Lys、Arg-Arg、Lys-Arg或Arg-Lys序列的位点。胰凝乳蛋白酶通常识别含有大的疏水性氨基酸(比如酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸)的位点，但它也可以识别含有亮氨酸、异亮氨酸和甲硫氨酸的位点。这种微阵列可用于分析(profile)通过使用胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶的酶消化产生的样品。说明书中提供了这种微阵列的实例。
可以设计微阵列，使得被第一反应位点的捕获剂识别的表位缺乏被胰蛋白酶识别的蛋白水解切割位点，而被第二反应位点的捕获剂识别的表位含有这种蛋白水解切割位点。这种微阵列可用于分析通过使用胰蛋白酶或另一种蛋白酶的酶消化产生的样品。说明书中提供了这种微阵列的实例。
可以设计微阵列，使得被第一和第二反应位点的捕获剂识别的表位缺乏被至少两种消化酶(例如，被胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶、弹性蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、内切蛋白酶Arg-C、内切蛋白酶Glu-C和内切酶Asp-N中的至少两种)识别的蛋白水解切割位点。说明书中提供了这种微阵列的实例。
可以设计微阵列，使得第一反应位点的捕获剂特异性识别缺乏PTM的表位，并特异性结合第一靶标和第二靶标，其两者均含有该表位，但两者中只有一个靶标含有位于表位之外的PTM。说明书中提供了这种微阵列的实例。
可以设计微阵列，使得第一反应位点的捕获剂特异性识别含有第一PTM，例如，磷酸化的表位并特异性结合第一靶标和第二靶标，其二者均含有该表位，而至少一个靶标还含有位于表位之外的第二PTM，例如，乙酰化、甲基化、糖基化、泛素化或类泛素化(sumoylation)。第一PTM的位点可以与第二PTM的位点相隔少于10个氨基酸。说明书中提供了这种微阵列的实例。
可以设计微阵列，使得第一反应位点的捕获剂特异性识别含有至少2个PTM的表位，并特异性结合第一靶标和第二靶标，其至少一个进一步含有位于表位之外的另外的PTM。说明书中提供了这种微阵列的实例。
可以设计微阵列，使得微阵列的不同反应位点特异性结合天然存在的蛋白质的至少3个不同的蛋白水解片段。在一个实施方式中，每个不同的片段含有至少一个PTM。说明书中提供了这种微阵列的实例。
微阵列可包括捕获剂，其在蛋白质印迹、ELISA、流式细胞术、免疫组织化学、免疫沉淀或免疫荧光测定法中特异性识别其相应的表位。说明书中提供了这种微阵列的实例。
微阵列可以包括特异性结合两个不同靶标的捕获剂：第一靶标，其可以通过线性模式MALDI TOF MS检测，但不能通过反射器模式MALDI TOF MS检测；和第二靶标，其可以通过反射器模式MALDI TOF MS检测。通过线性模式MALDI TOF MS可检测的靶标包括如化合物，其是不稳定的，例如磷酸肽，或具有高分子量，例如大于10kDa。实施例14中详细描述的山羊抗乌头酸酶2抗体识别完整的ACO2蛋白(MW85,425Da，可使用芥子酸作为基质通过线性模式MALDI TOF MS检测)及其蛋白水解片段，该片段包括541至555位氨基酸(MW 4781.1Da，可使用α-氰基-4-羟基肉桂酸作为基质通过反射器模式MALDI TOF MS检测)。
微阵列可包括与两种不同靶标特异性结合的捕获剂，其需要不同的基质通过MALDI MS检测。这种不同基质的实例包括α-氰基-4-羟基肉桂酸(CHCA)和2,5-二羟基苯甲酸(DHB)、CHCA和芥子酸(SA)、CHCA和2',6'-二羟基苯乙酮(DHAP)以及其他组合。这种捕获剂的实例是前一段中描述的山羊抗乌头酸酶2抗体。
在一个实施方式中，两种不同的靶标不包括同位素标记，即，第一靶标和第二靶标具有相似的同位素丰度。例如，相对于其结构中存在的每种化学元素，第一靶标和第二靶标均可以具有天然同位素丰度。对于碳和氮，已知天然同位素丰度分别为约98.9％的12C和约99.6％的14N。
在一个实施方式中，两种不同的靶标具有不同的同位素丰度，例如，第一靶标、第二靶标或第一靶标和第二靶标二者均被同位素标记。肽的同位素标记可通过并入一种或数种稳定的同位素(比如2H，13C，15N和18O)来实现。肽的同位素标记也可以通过使用放射性同位素来实现。相对于相同氨基酸的未标记形式，单个氨基酸中同位素标记的存在通常会导致4和10Da之间的质量偏移。
应当注意，在典型的自下而上的蛋白质组学分析中，蛋白水解肽的未标记形式和同位素标记形式之间的质量差通常不超过10Da。部分地，这是因为最常见的消化酶——胰蛋白酶通常会产生含有单个赖氨酸或精氨酸残基的肽。赖氨酸和精氨酸的13C、15N同位素标记形式与其未标记的对应形式分别相差8Da和10Da。使用比如胰凝乳蛋白酶的其他消化酶可以产生含有数个赖氨酸和/或精氨酸残基的蛋白水解肽，但是也可以产生不含有这些氨基酸的肽。
在一个实施方式中，反应位点配置为能够以与通过质谱法分析第一靶标和第二靶标相容的形式从微球释放第一靶标和第二靶标。在整个本说明书中，主要使用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI TOF MS)的实例说明质谱法的使用。然而，应当注意，关于分析物电离和分析物检测二者，可以可选地使用许多其他质谱分析方法。特别地，可以使用各种电喷雾电离MS(ESI MS)分析方法，包括称为激光烧蚀电喷雾电离(LAESI)和解吸电喷雾电离(DESI)MS的方法。
在一个实施方式中，第一和第二靶标是肽，并且通过质谱法的分析是通过MALDITOF MS以线性模式进行的。与反射器模式相比，以线性模式测量肽的优势可能包括更高的检测灵敏度和最小化来自分析物碎片化的光谱贡献，比如，源内衰减(ISD)和源后衰减(PSD)。例如，已知许多磷酸肽在通过MALDI TOF MS测量时会在质谱仪内部经历强烈的碎片化。然而，与在反射器模式下采集的质谱图相比，在线性模式下采集的质谱图中其碎片化的光谱效应不太明显。对于通过MALDI TOF MS进行的肽分析，虽然也可以使用负检测模式，但更经常使用正检测模式。对于分子量低于大约10,000Da的分析物，可以在反射器模式下通过MALDI TOF MS进行测量。另外，可以以串联(MS-MS)模式进行通过MALDI TOF MS对某些分析物的测量。
质荷比(m/z)是通常通过质谱法测量的分析物性质之一。将测量的m/z比转换为分析物分子量(MW)通常很简单。例如，通过MALDI TOF MS以正模式测量的肽分析物通常被检测为单电荷质子化离子，其中电荷(z)为+1，并且质量(m)等于肽分析物的分子量加上质子的质量。因此，质谱法可用于确定所测量的分析物的分子量。分子量，也称为分子质量，通常以原子质量单位(amu)或道尔顿(Da)报告。在分析物结构中存在稳定的同位素(比如13C和15N)会导致在分析物质谱图中出现多个峰，这些峰相隔约1个m/z单位。这种多个峰被称为同位素峰组(isotopic envelope)。由于同位素峰组的存在，通过质谱法测量的分析物分子量可以报告为单同位素质量或平均质量。
在本说明书中公开的微阵列可以描述为靶标编码的微球阵列，其中可以通过对该靶标分析物的直接质谱测量来确定结合至特定微球的靶标分析物的身份。靶标编码的微球阵列可能不需要各个微球的位置、光学或质量标签编码。此外，靶标编码的微球阵列可能不需要对捕获剂进行质谱分析。因此，即使在相应的靶标分析物已从微球释放后，捕获剂仍可保持与微球的结合。在从微球中释放靶标分析物之后，将捕获剂保留在微球上可能有助于获得更高质量的质谱图，例如具有较低背景和较强分析物信号的质谱图。可选地，捕获剂可以以与通过质谱法分析不必须相容的形式从微球释放，例如，捕获剂的分子量可以在质谱仪的质量检测范围之外。
在靶标分析物与其各自的捕获剂发生结合后，例如，在微球阵列已经暴露于样品之后且优选地在已除去样品的未反应部分之后，对靶标编码的微球阵列进行解码。应当注意，通过质谱法的分析包括在多个m/z位置(多个质量通道)的信号强度的测量；因此，单个质谱测量可以提供足够的数据来确定特定靶标分析物的身份及其在样品中的丰度。
应当注意，靶标编码的微球阵列中靶标分析物的成功鉴定取决于样品中存在足够量的靶标分析物。如果样品中靶标分析物的量低于检测限，则将不会检测或鉴定靶标分析物。然而，这种阴性结果提供了有价值的信息，因为它揭示样品中不存在特定的靶标分析物，或者样品中的其丰度低于某个阈值。
以下公开了一种制造靶标编码的微球阵列的示例性方法，并且在说明书的实施例部分中对其进行了更详细的描述。在一个实施方式中，该方法包括以下步骤：(1)选择能够与微球结合并且当与微球结合时能够至少结合具有不同分子量的第一靶标和第二靶标的捕获剂，和(2)记录解码表，该解码表含有关于第一靶标的身份、源自第一靶标的分子量的值和源自第二靶标的分子量的值的信息。
步骤1：选择捕获剂。该步骤涉及选择并获得待在微球阵列中使用的抗体。可以出于以下目的选择抗体：分析特定的生物标志物，分析特定类型的蛋白质修饰，分析特定的生物学或细胞途径，分析多个细胞途径，分析与特定疾病或特定细胞状况相关的分子变化等。可以选择抗体以分析总蛋白质丰度，可选地，可以选择抗体以分析位点特异性蛋白质丰度，比如在特定蛋白质位点的蛋白质翻译后修饰(PTM)的程度。抗体可以从商业供应商处购买或定制生产。抗体可以是单克隆的或多克隆的。抗体可以在多种宿主物种例如兔、小鼠、山羊、马、鸡中产生，或者其可以被合成地产生。来自不同宿主物种的抗体可用在相同的微球阵列中。在一个实施方式中，免疫原是肽。在一个实施方式中，免疫原是全长蛋白质或生物细胞。优选地，表位序列或特定抗体的免疫肽的序列是已知的。然而，也可以利用表位序列或免疫肽序列未知的抗体。后者的实例在说明书的实施例部分中显示。
从商业供应商获得抗体可能是有利的，因为许多商业上可获得的抗体已经提供了已验证了这些抗体的应用列表，例如，蛋白质印迹(WB)、免疫沉淀(IP)、免疫荧光(IF)、免疫组织化学(IHC)、流式细胞术(FC)、染色质免疫沉淀(ChIP)、酶联免疫吸附测定(ELISA)、夹心免疫测定等。这种信息可能是有价值的，因为它能够将通过质谱法对特定蛋白质靶标进行的定量分析与在细胞培养物、组织、生物流体和动物模型中使用上述应用进行的对相同蛋白质靶标的后续研究整合。
当选择具有已知表位的抗体时的一个考虑是该表位应保留在靶标分析物中。具体而言，如果通过将蛋白质与消化酶一起温育来产生待分析的样品，则表位优选不应含有消化酶的切割位点。例如，对于通过与胰蛋白酶温育而产生的样品，表位优选不应含有内部精氨酸或赖氨酸。同样，对于通过与Lys-C或Lys-N温育而产生的样品，表位优选不应含有内部赖氨酸。然而，上述要求不是绝对的，因为即使表位中存在潜在的切割位点，消化酶的不完全消化也可以保留该表位。另外，某些蛋白质修饰可改变通常被消化酶识别的切割位点的模式。例如，与赖氨酸相邻的酪氨酸的磷酸化经常导致胰蛋白酶的漏切。选择具有已知表位的抗体的另一考虑是线性或连续表位通常优选用于进行肽免疫亲和富集。
总体而言，不同捕获剂的总数，例如，为特定的微球阵列选择的不同抗体可以少于10个，在10个和30个之间，在30个和100个之间，在100个和500个之间，在500个和1,000个之间，在1,000个和10,000个之间或大于10,000个。可以为每种捕获剂提供多个复制微球，例如，2个微球，3个微球，5个微球，10个微球或更多个。对于直径为大约300μm的球形微球，可以将约25个微球包装成1μL体积，可以将大约2,500个微球包装成100μL体积，并且可以将约25,000个微球包装成1ml体积。尺寸为25×75mm的标准显微镜载玻片的微孔板可用于排列超过5,000个300μm直径的微球。尺寸为86×128mm的标准微量滴定板的微孔板可用于排列超过25,000个300μm直径的微球。
步骤2：记录解码表。该步骤涉及阐明可与先前在步骤1中选择的各个抗体结合的肽的身份。具体而言，对于预期与特定抗体结合的肽，优选阐明包括可能的翻译后修饰(PTM)的肽的氨基酸序列和肽分子量。可以通过分析特定抗体的已知表位序列(一个或多个)并随后确定表位(一个或多个)外的肽氨基酸组成来产生这种数据以考虑与特定分析工作流程相关联的不同样品制备条件。例如，肽长度和分子量可能会受到用于制备样品的消化酶的选择的影响。使用常见的蛋白质组学技术(比如半胱氨酸还原和烷基化)也会影响所得肽的氨基酸序列和分子量。此外，正被分析的样品的性质也可能有助于不同靶标分析物的存在，例如，在引起蛋白质磷酸化水平升高的条件下培养的哺乳动物细胞，预期产生具有更多磷酸化位点的肽。
在本说明书中还公开了一种可选的方法，该方法涉及在限定条件下进行的各个抗体的实验测试和验证，这些条件随后可被记录。这种条件可以包括使用某种消化酶，使用某种样品类型例如细胞培养物，使用某种细胞系，使用某种质谱方法以及使用某种分析技术例如蛋白质磷酸化分析。在公开的方法中，单个抗体——其优选地结合至固体支撑物例如微球——暴露于含有靶标分析物(一种或多种)的样品中，然后进行免疫亲和捕获反应。随后将与抗体结合的靶标分析物(一种或多种)从固体支撑物中释放，并通过质谱法分析。通过质谱法的分析可以包括确定各个靶标分析物的分子量，以及确定各个靶标分析物的氨基酸序列，其使用已知的碎片化技术进行，比如，碰撞诱导解离(CID)、电子转移解离(ETD)、源中衰减(ISD)、源后衰减(PSD)等。然后对微球阵列中的其他抗体重复以上公开的步骤。
以下公开了使用靶标编码的微球阵列分析生物样品的示例性方法，并且在说明书的实施例部分中更详细地描述。在一个实施方式中，靶标编码的微球阵列包括至少一个反应位点和解码表。反应位点的实例是与微球结合的抗体。结合微球的抗体能够结合具有不同MW的至少两种不同的靶标分析物：第一靶标分析物和第二靶标分析物。解码表包括关于第一靶标分析物的身份的信息，关于第一靶标分析物的MW、m/z比和/或TOF值的信息，关于第二靶标分析物的身份的任选信息以及关于第二靶标分析物的MW、m/z比和/或TOF值的信息。因此，解码表含有足够的信息，以能够基于对质谱图中两个信号的检测来鉴定微球阵列中的第一靶标分析物，这两个信号与源自第一靶标分析物的MW和第二靶标分析物的MW的值相关联。在一些情况下，即使质谱图中单个信号的检测也可足以明确地鉴定第一靶标分析物。如果第一靶标分析物的分子量足够独特，即，没有任何其他被微球阵列捕获的靶标分析物具有相同或非常相似的分子量，则可能发生这种情况。
在一个实施方式中，使用靶标编码的微球阵列分析生物样品的方法包括以下步骤：(1)使微球阵列的反应位点与含有或可能含有第一靶标和第二靶标的样品在允许第一靶标和第二靶标结合到反应位点的条件下接触；(2)在接触步骤之后，从反应位点获取质谱图，使得在质谱图中可以检测到或实际检测到来自第一靶标的信号和来自第二靶标的信号；(3)使用与微球阵列一起提供的解码表鉴定质谱图中来自第一靶标的信号和来自第二靶标的信号；和(4)测量来自第一靶标的信号的强度和来自第二靶标的信号的强度。
步骤1：使反应位点与样品接触。该步骤可以包括进行免疫亲和纯化(IAP)反应，然后从反应位点除去样品的未反应部分。进行基于微球的IAP反应的各种方法是本领域已知的。例如，可以将微球的悬浮液与含有样品的水溶液简单地混合并温育特定的时间量。
步骤2：获取质谱图。该步骤可以包括将结合的靶标分析物(一种或多种)从微球洗脱到固体支撑物比如MALDI靶标板上的斑点上，并且使用质谱法分析位于该斑点内的洗脱的分析物(一种或多种)。微球可能会保留在固体支撑物上；可选地，可以在通过质谱法测量之前从固体支撑物上去除微球。当通过质谱法的分析涉及使用MALDI MS时，应将洗脱的分析物与MALDI基质混合。应当选择MALDI质谱仪的电离激光束的强度，使得可以记录来自洗脱分析物(一种或多种)的足够强的信号，例如，如果信号的信噪比为至少3：1，优选至少10：1，更优选至少30：1，最优选至少100：1，则认为该信号足够强。在本说明书中公开的方法允许通过MALDI TOF MS检测从单个微球洗脱的分析物，其信噪比大于1000：1。应当注意，当测量含有不同分析物的多个斑点时，可能需要调节电离激光束的强度。
步骤3：鉴定来自第一靶标的信号和来自第二靶标的信号。在一个实施方式中，该步骤包括在获取的质谱图中搜索信号，例如，强度高于背景水平的峰，并且一旦在特定的m/z值处检测到这种峰，则搜索解码表以找到与质谱图中检测到的m/z值相同或足够接近的m/z值相关联的靶标分析物。如果质谱图中还存在其他峰，则重复该过程。在一些情况下，可以通过检测质谱图中的单个峰来完成靶标分析物的鉴定。可选地，可以通过检测质谱图中的两个或更多个峰来完成靶标分析物的鉴定。
步骤4：测量来自第一靶标的信号的强度和来自第二靶标的信号的强度。该步骤可以通过使用分析软件确定质谱图中检测到的峰(一个或多个)的强度来完成。信号强度可以报告为峰高、峰下面积或使用其他已知格式。
将样品与微阵列的各个反应位点一起温育可以导致一种或多种化合物与反应位点的非特异性结合。这种化合物可以结合到微球上，可选地，它们可以结合到捕获剂上，或者结合到连接体上，例如，蛋白A或蛋白G。为减轻非特异性结合的问题，解码表可含有关于与这种非特异性结合的化合物相关联的m/z值的信息。
在一个实施方式中，第一靶标分析物和第二靶标分析物是已被差异地修饰的肽。例如，两种肽可以在其N-末端、C-末端或二者处被差异地修饰。两种肽也可以在特定氨基酸，例如，赖氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸、组氨酸等处被差异地修饰。对于本说明书中公开的方法，合适的肽修饰包括用具有不同同位素丰度的化合物进行的修饰以及用具有相同的，例如，天然同位素丰度的化合物进行的修饰。
在一个实施方式中，第一靶标分析物和第二靶标分析物是未被差异地修饰的肽。例如，第一靶标分析物可以是通过生物样本的酶消化产生的内源肽，和第二靶标分析物可以是添加到含有第一靶标分析物的酶消化的生物样本中的内标肽。在该实例中，第一和第二靶标分析物可以具有相同的，例如，天然同位素丰度，但其氨基酸组成不同，氨基酸组成的不同是至少一个氨基酸的取代、修饰、添加或缺失。
在一个实施方式中，适合于通过本公开的微阵列分析的样品是消化的生物样本，比如培养的生物细胞、生物组织、生物流体或异种移植物的悬浮液或沉淀。可以使用酶或非酶化合物进行消化。此外，在进行消化反应之前，可以对生物样本进行细胞裂解。
然而，在某些应用中，在进行亲和富集步骤之前，不需要裂解和/或消化生物样品。例如，已知未分级的血清含有大量的循环肽。另一个实例是分析从培养细胞释放到细胞培养基中的分泌肽。
在本说明书中公开的微阵列适用于分析多种类型的蛋白质PTM，比如磷酸化、乙酰化、甲基化、糖基化、泛素化、类泛素化等。在一个实施方式中，微阵列反应位点含有特异性结合表位的抗体或适体，并且由微阵列反应位点特异性捕获的每个靶标都含有表位。在一个实施方式中，表位含有少于6个连续氨基酸，少于5个连续氨基酸或少于4个连续氨基酸。在一个实施方式中，表位是不连续的，即，被相应抗体识别的至少一些氨基酸彼此不相邻。在一个实施方式中，表位含有第一PTM，并且靶标中的至少一个含有位于表位之外的第二PTM。在一个实施方式中，表位不含有PTM，并且靶标中的至少一个含有PTM。在一个实施方式中，结合至微阵列反应位点的每个靶标含有在至少一个靶标中被翻译后修饰且在至少一个靶标中缺乏PTM的蛋白质位点。在一个实施方式中，由微阵列反应位点捕获的各个靶标源自作为不同生物途径的组成成分的不同蛋白质。
在以下实施例中描述了本公开，其提出旨在帮助理解本公开，并且不应解释为以任何方式限制如在所附权利要求中所限定的本公开的范围。提出以下实施例以向本领域普通技术人员提供关于如何制造和使用本公开内容的完整公开和描述，并且其不旨在限制本公开的范围，也不旨在表示以下实验是全部或仅进行的实验。已经尽力确保所用数字(例如，量、温度、体积、时间等)的准确性，但是应该考虑一些实验误差和偏差。
实施例
材料和设备
N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化的磁性6％琼脂糖微球由Cube Biotech(PlymouthMeeting，PA)定制制造。如通过光学显微镜所确定的，各个微球的直径在大约250μm和500μm之间。将这些多分散微球进一步分离成具有更窄尺寸分布的部分，其包括含有在<280μm、280-355μm、355-375μm、355-400μm、375-400μm、375-420μm、400-420μm、400-450μm和>450μm直径范围内的微球的部分。微球的分级是通过手动使微球悬浮液通过一系列聚酯筛网过滤器(ELKO Filtering Co,LLC)完成的，直到产生所需的尺寸部分为止。将尺寸分级的微球储存在纯异丙醇(Fisher Chemical,目录号A416-4)中，直至进一步使用。
对于某些应用，使用具有不同程度的琼脂糖交联的磁性琼脂糖微球。通过实验确定，当置于填充有水性介质的96孔多孔板的孔中时，具有较高琼脂糖交联度的微球能够经受住板的剧烈摇动，例如，以800RPM或更高的速度运转12个小时以上，而各个微球不会破裂。
对于某些应用，使用了琼脂糖含量大于6％的磁性微球，例如，含有7.5％或9％的琼脂糖的微球。通过实验确定，琼脂糖含量大于6％的微球在结合并随后洗脱各种肽分析物后会产生更强的MS信号。
对于某些应用，使用较大的磁性琼脂糖微球，例如，直径范围为700-790μm、790-910μm和>910μm的微球。
对于某些应用，使用了较小尺寸的磁性琼脂糖微球，例如，直径范围为160-200μm的微球。
目录号为237001的氧化铟锡(ITO)表面涂覆的玻璃显微镜载玻片来自BrukerDaltonics(Billerica,MA)。各个载玻片的尺寸为25mm×75mm×0.9mm，并设计为与MTP载玻片适配器II一起使用，以进行MALDI成像，其可从Bruker Daltonics(目录号235380)获得。
金表面涂覆的玻璃显微镜载玻片来自Fisher Scientific(目录号12-550-59)。
硅氧烷微孔垫片——也称为SILICONE ISOLATORSTM，是Grace Bio-Labs(Bend,OR)使用标准等级的聚二甲基硅氧烷(PDMS)定制制造的。硅氧烷垫片的整体尺寸为25mm×75mm×0.5mm。每个垫片含有26×88微孔的正方形网格阵列。每个微孔的内径为0.5mm，相邻的微孔之间间隔0.3mm的距离(中心至中心的距离测量为0.8mm)。外围孔和垫片边缘之间大约2.5毫米的区域不含有孔。
对于某些应用，使用具有较小的长度和/或宽度的硅氧烷垫片，其包括25mm×73mm×0.5mm、23mm×75mm×0.5mm和23mm×73mm×0.5mm。当固定在25mm×75mm ITO玻璃载玻片上时，具有较小的宽度和/或长度的硅氧烷垫片形成水密密封件，该水密密封件在手动操作其间破裂的风险较小，因为当从边缘握住载玻片时手指不大可能无意间从载玻片上拉出垫片。
包括1、2、3、4、8、16、24和64室的数种配置的
Figure BDA0002452781050000191
多孔室是从Grace Bio-Labs购买的。
蛋白A+G购自Abcam(目录号ab52213)。在制造商网站上发布的产品说明将蛋白A+G称为“……组合了蛋白A和蛋白G二者的IgG结合轮廓的基因工程化融合蛋白”。
除非另有说明，比如微型离心管、移液器头、称量皿等的消耗品为标准研究级。除非另有说明，否则试剂(比如有机溶剂、酸、盐、缓冲液、去污剂、MALDI基质等)均为标准研究级，其纯度为99％或更高，并且可按直接从制造商接收的使用，无需进一步纯化。标准实验室设备包括微量离心机、微量板离心机、磁性管架、微量滴定板振荡器、涡旋仪等。
用于沉积MALDI基质溶液的自动液体喷雾器iMatrixSpray购自Tardo GmbH(Subingen,Switzerland)。iMatrixSpray的设计和操作在最近的出版物中描述：CHIMIAInternational Journal for Chemistry(2014),Volume 68(3),pp.146-149。
实验结果
使用本申请公开的组合物和方法进行的一些实验以及所得的实验数据如下描述。
实施例1
制备蛋白A+G缀合的磁性琼脂糖微球
使用磁性QuicPick装置(Bio-Nobile，目录号24001)，将异丙醇中100至125的尺寸分级的Cube Biotech PureCube MagBeads XXL NHS活化的微球转移至含有约300μL异丙醇的0.65mL塑料微量离心管(Costar，目录号3208)中。随后除去异丙醇。向管中添加约640μL的1×PBS(Fisher Scientific，目录号BP24384)，并将管在室温下旋转5分钟。将1×PBS中的80μg重组蛋白A+G添加到管中。添加额外量的1×PBS，直到管装满。将管在管旋转器(Silent Shake Revolver from Crystal Industries，目录号HYQ-1130A)上在低速、4℃下温育最少3小时，通常过夜。将管从旋转器上移出并短暂离心少于2秒。去除上清液。添加20μL的10×三-甘氨酸缓冲液以淬灭剩余的反应性NHS基团。将管在管旋转器上以低速在室温下温育30分钟。去除三-甘氨酸缓冲液，并替换为300μL的1×PBS。通过使用磁性分离台(Promega，目录号Z5332)使微球移动通过溶液来洗涤微球。去除PBS，并将洗涤步骤再重复一次。添加400μL的1×PBS进行保存，并将微球保存在4℃下。在所描述的整个程序中，要小心避免用移液器吸头直接接触微球，避免强力移液器混合或过度涡旋。
实施例2
制备抗体缀合的磁性琼脂糖微球
将约20个如先前实施例中所述制备的蛋白A+G缀合的微球转移到干净的0.65mL的微量离心管中。去除存储溶液，并将300μL的1×PBS添加至微球。通过使用磁性分离台将微球移动通过PBS溶液来洗涤微球。除去PBS溶液，并将5μg Phospho-S6核糖体蛋白(Ser235/236)(D57.2.2E)
Figure BDA0002452781050000201
兔单克隆抗体，目录号4858(Cell Signaling Technology，DanversMA)添加到微球中。通过实验确定，在不含有牛血清白蛋白(BSA)或甘油的培养基中提供抗体时，可实现最佳结果。将抗体-微球混合物在管旋转器上在低速、4℃下温育最少3小时，通常过夜。将管从旋转器上移出并短暂离心少于2秒。从微球上去除未结合的抗体，并添加300μL的1×PBS。通过使用磁性分离台将微球移动通过溶液来洗涤微球。去除PBS溶液，并将洗涤步骤再重复一次。添加400μL的1×PBS进行存储，并将微球存储在4℃下。
实施例3
抗体与蛋白A+G磁性琼脂糖微球的交联
使用宽孔移液器吸头通过手动移液将如先前实施例中所述制备的抗体缀合的蛋白A+G微球转移至干净的微量离心管中。将微量离心管置于磁性台上，并去除随微球一起转移的PBS溶液。将300μL新鲜制备的pH值为8.2的0.2M三乙醇胺溶液(Sigma-Aldrich，目录号90279)添加至微球，将微球悬浮液短暂涡旋，然后离心并去除上清液。再次重复用三乙醇胺洗涤。将300μL新鲜制备的pH值为8.2的0.2M三乙醇胺中的25mM庚二亚氨酸二甲酯二盐酸盐溶液(DMP，Sigma-Aldrich，目录号D8388)添加至微球。将微球悬浮液短暂涡旋，然后离心。将含有微球悬浮液的微量离心管置于实验室旋转器上，并在室温下将微球旋转45分钟温育微球。随后将微球离心并去除上清液。添加300μL新鲜制备的pH值为8.2的0.1M乙醇胺溶液(Sigma-Aldrich，目录号398136)。将微球悬浮液涡旋然后离心并去除上清液。再次重复乙醇胺洗涤步骤。将含有微球悬浮液的微量离心管置于实验室旋转器上，并将微球在乙醇胺溶液中在室温下旋转温育1小时。随后去除上清液，用300μL的1×PBS缓冲液(FisherScientific，目录号BP24384300)洗涤微球两次，并在4℃下存储在1×PBS缓冲液中。
实施例4
组装多重靶标编码的微球阵列
对参与雷帕霉素机制性靶标(mTOR)和其他途径的蛋白靶标特异性的单克隆抗体购自Cell Signaling Technology(Danvers,MA)、R&D Systems(Minneapolis,MN)和ThermoFisher(Waltham,MA)。购自Cell Signaling Technology的抗体包括Phospho-p70S6 Kinase(Thr389)(108D2)兔单克隆抗体(目录号9234)、Phospho-p70 S6 Kinase(Thr389)(1A5)小鼠单克隆抗体(目录号9206)、p70 S6 Kinase(49D7)兔单克隆抗体(目录号2708)、Phospho-S6 Ribosomal Protein(Ser235/236)(D57.2.2E)
Figure BDA0002452781050000211
兔单克隆抗体(目录号4858)、Phospho-S6Ribosomal Protein(Ser240/244)(D68F8)
Figure BDA0002452781050000212
兔单克隆抗体(目录号5364)、S6Ribosomal Protein(54D2)小鼠单克隆抗体(目录号2317)、4E-BP1(53H11)兔单克隆抗体(目录号9644)、Phospho-4E-BP1(Thr37/46)(236B4)兔单克隆抗体(目录号2855)、Phospho-4E-BP1(Ser65)(D9G1Q)兔单克隆抗体(目录号13443)、Phospho-4E-BP1(Thr70)(D7F6I)兔单克隆抗体(目录号13396)、Phospho-Akt(Pan)(Ser473)(D9E)
Figure BDA0002452781050000213
兔单克隆抗体(目录号4060)、Phospho-Akt1(Ser473)(D7F10)
Figure BDA0002452781050000214
兔单克隆抗体(目录号9018)、Phospho-Akt(Pan)(Thr308)(D25E6)
Figure BDA0002452781050000215
兔单克隆抗体(目录号13038)、Akt(pan)(C67E7)兔单克隆抗体(目录号4691)、Akt1(C73H10)兔单克隆抗体(目录号2938)、Phospho-TSC2(Thr1462)(5B12)兔单克隆抗体(目录号3617)、TSC2(D93F12)
Figure BDA0002452781050000216
兔单克隆抗体(目录号4308)、Phospho-Gsk3b(Ser9)(D85E12)
Figure BDA0002452781050000217
兔单克隆抗体(目录号5558)和GSK3b(D5C5Z)
Figure BDA0002452781050000218
兔单克隆抗体(目录号12456)。购自R&D Systems的抗体包括人Phospho-Histone H2AX(Ser139)(目录号AF2288)、人/小鼠/兔Phospho-ATM(Ser1981)(目录号AF1655)、人Phospho-BRCA1(Ser1423)(目录号AF1386)、人Phospho-Chk2(Thr68)(目录号AF1626)、人Phospho-Chk1(Ser345)(目录号AF2475)。独特的捕获试剂(即，微球阵列中包含的抗体)的总数大于50。使用先前实施例中描述的程序将各个抗体缀合至磁性琼脂糖微球。通过在与以上列出的抗体中的一种缀合的1和3个微球之间选择，随后在单个1.7mL微量离心管中组合与不同抗体缀合的微球，来组装用于分析在mTOR途径中的多个靶标的一系列多重微球阵列。例如，图3显示了用于测量两种蛋白质：4E-BP1和p70 S6激酶的总蛋白质丰度和位点特异性磷酸化的多重悬浮微球阵列。图3中所显示的微球阵列含有分别与700-790μm直径的磁性琼脂糖微球缀合的Cell Signaling Technology抗体#2855、#9644、#2708和#9234。该四重微球阵列的各个反应位点不具有可区分的光学性质或质量标签，它们也不具有位置编码。然而，由于在微球阵列解码表中提供了关于靶标分析物的身份和分子量的信息，因此通过质谱法可以容易地鉴定由该微球阵列捕获的靶标分析物。解码表中的数据是通过独立验证包含在微球阵列中的每种抗体生成的。抗体验证过程包括以下步骤：(1)使用缀合至特定抗体的单个微球从消化的细胞裂解物中进行肽分析物(一种或多种)的免疫亲和富集，(2)使用质谱法测量由微球缀合的抗体捕获的分析物(一种或多种)和(3)将检测到的分析物信号(一个或多个)(即，质谱图中的峰(一个或多个))归属为特定肽序列(一个或多个)。使用关于前体蛋白序列、抗体特异性例如可能的表位和消化酶特异性的信息进行峰归属。具体而言，在该实施例中，所有前体蛋白都是人源的，并且消化酶是质谱法测序级胰蛋白酶。通过实验确定，由该微球阵列的各个反应位点捕获的肽靶标具有足够独特的分子量，以使得能够基于源自靶标分子量的单个值来明确鉴定特定靶标。具体而言，用于测量4E-BP1的总蛋白丰度的含有抗体#9644的反应位点捕获了源自4E-BP1的C-末端的蛋白水解片段RAGGEESQFEMDI(SEQ ID NO：1)，该片段含有一个漏切位点，并且其计算的[MH]+m/z的平均值为1469.58。相同的反应位点还捕获了蛋白水解片段AGGEESQFEMDI(SEQ ID NO：2)，该片段不含漏切位点，并且其计算的[MH]+m/z的平均值为1313.39。含有用于测量Thr37和Thr46处的4E-BP1磷酸化的抗体#2855的反应位点捕获了蛋白水解片段VVLGDGVQLPPGDYSTTPGGTLFSTTPGGTR(SEQ ID NO：3)，该片段含有两个磷酸基团，并且其计算的[MH]+m/z的平均值为3209.32。含有抗体#2855的反应位点也捕获了具有相同序列但只有单个磷酸基团的蛋白水解片段，其计算的[MH]+m/z的平均值为3129.35。
实施例5
细胞裂解、蛋白质消化和肽提取
使用补充有20％FBS的RPMI 1640培养基培养MKN45人胃癌细胞。用冷PBS将平板上生长至约80％汇合的细胞洗涤两次，将1mL的尿素裂解缓冲液添加到平板中，将细胞从平板上刮下，并收集在50mL的FALCONTM离心管中。在15瓦输出下，使用微尖以每次3至5个脉冲串超声处理细胞悬浮液持续20秒。在脉冲串之间将细胞悬浮液在冰上冷却1min。通过在室温下以5,000g离心15分钟来清除裂解物，并将上清液转移到干净的管中进行酶消化。
将清除的细胞上清液进行还原、烷基化和酶消化。将1/278体积的1.25M DTT与上清液混合，并在40℃下温育30min。将该溶液在冰上短暂冷却直至达到室温。随后添加1/10体积的新鲜制备的100mM碘乙酰胺溶液，并在黑暗中在室温下温育15min。用0.2M碳酸氢铵消化缓冲液将该溶液稀释5倍。添加1/100体积的1mg/mL测序级胰蛋白酶储备液，并在混合下使消化反应在37℃下过夜进行。为了用胰凝乳蛋白酶消化，添加1/60体积的1mg/mL胰凝乳蛋白酶储备液代替胰蛋白酶，并在混合下使消化反应在37℃下过夜进行。
消化反应后，立即将消化的细胞裂解物在来自Waters Corporation的目录号为WAT051910的0.7mL
Figure BDA0002452781050000231
C18柱上纯化。在将来自蛋白质消化物的肽加载到柱上之前，通过添加1/20体积的10％TFA至最终浓度为0.5％TFA来酸化消化的裂解物。使溶液在冰上静置15分钟，这导致形成沉淀。将酸化的肽溶液在室温下在1,780g离心15min，然后将含肽的上清液转移到干净的50mL锥形管中，而无需取出沉淀的物质。
将由已去除柱塞的10cc注射器制成的储器连接至
Figure BDA0002452781050000232
柱的短端。施加5mL的100％MeCN将柱预湿润。依次用1mL、3mL和6mL的0.1％TFA溶液洗涤柱。将酸化且澄清的消化物加载到柱上，并依次用1mL、3mL和6mL的0.1％TFA溶液洗涤，接着用2mL的5％MeCN、0.1％TFA溶液洗涤。通过每次用2mL 0.1％TFA、50％乙腈依次洗涤3次来洗脱肽。将含有洗脱的肽的溶液置于-80℃的冰箱内至少2小时至过夜。使用标准冻干机将冷冻的肽溶液冻干至少2天，以确保已从样品中去除TFA。冻干的消化的肽可以在密封的微量离心管中在-80℃下保存数个月。
实施例6
使用抗体缀合的磁性微球由酶消化的细胞裂解物进行肽的多重免疫亲和富集
将如先前实施例中所述制备的冻干细胞裂解物悬浮在结合缓冲液(在25mM Tris、192mM甘氨酸中的2.5M NaCl，pH～8.3)中至最终浓度为约2mg/mL。通过重复手动移液使裂解物悬浮液均质化，同时避免在溶液中形成气泡。将细胞裂解物溶液在4℃下以14,000RPM离心5min。将澄清的上清液转移至新的1.7mL微量离心管中。使用宽孔移液器吸头，将含有如实施例4中所述制备的20个抗体缀合的磁性微球的悬浮微球阵列转移至干净的0.65mL微量离心管中。将澄清的细胞裂解物上清液添加至微球，同时避免在裂解物中形成气泡。接着是短暂的，例如，少于1秒的管离心以从管壁收集液滴。将与细胞裂解物上清液混合的微球的悬浮液在4℃在旋转器上下以低速温育至少3小时，在一些情况下，过夜或超过24小时。将管短暂离心，使用磁性QuicPick装置移出微球，然后转移到干净的0.65mL管中，该管含有300μL的去离子水中的2.5M NaCl溶液。将另外的340μL的2.5M NaCl溶液添加到该管中。将微球在室温下在旋转器上以低速温育10分钟。将管短暂离心，通过移液去除约300μL的溶液。使用磁性QuicPick装置将微球转移到含有300μL的去离子水的干净的0.65mL试管中。通过在磁性分离台上重复移动管来洗涤微球，然后在室温下进一步温育约2分钟。使用宽孔移液器吸头移液，将微球转移到干净的0.65mL的含有约200μL的去离子水的管中，并存储在4℃下。
实施例7
组装微孔载玻片
通过将硅氧烷垫片固定到ITO涂覆的玻璃显微镜载玻片的导电侧来制备微孔载玻片。具体而言，首先通过使用胶带条清除硅氧烷垫片的表面上的任何残留的灰尘颗粒。然后将垫片放在一张或两张低绒薄纸的顶部，比如放置在实验室工作台平表面上的
Figure BDA0002452781050000233
上。将载玻片的干燥的ITO涂覆的表面与硅氧烷垫片接触，然后将载玻片手动压入垫片中以形成水密密封件。目视检查密封件质量，并通过局部按压载玻片去除任何残留的气穴。所制造的微孔载玻片的整体尺寸为25mm×75mm×1.4mm。
实施例8
在微孔载玻片上形成微球阵列
如先前实施例中所述制备微孔载玻片，并将其附连到含有8个矩形腔室的
Figure BDA0002452781050000241
8孔载玻片模块上，每个腔室的内部尺寸为7mm×16mm。对于某些应用，标准的
Figure BDA0002452781050000242
载玻片模块中包含的1.6mm厚的透明硅氧烷垫片被更薄的1.3mm的透明硅氧烷垫片代替，以便更好地容纳1.4mm厚的微孔载玻片。通过
Figure BDA0002452781050000243
不锈钢弹簧夹将微孔载玻片固定到
Figure BDA0002452781050000244
模块。
随后将含有附连到
Figure BDA00024527810500002414
模块的微孔载玻片的组件放置在用于弹簧夹模块的三部分
Figure BDA0002452781050000245
托盘的中间部分，如图4所示。将约300μL的去离子水分配到8个腔室的每一个中，并在室温下将
Figure BDA0002452781050000246
托盘在2700RPM下离心5分钟，以利于水进入微孔载玻片的0.5mm直径的孔中。
通过移液将含有42个直径在0.375-0.420mm范围内的磁性琼脂糖微球的含水悬浮液拉入到宽孔移液器吸头，然后随机分配到
Figure BDA0002452781050000247
模块的8个腔室的2个中。将
Figure BDA0002452781050000248
托盘放置在标准实验室微量滴定板振荡器上，并进行机械搅拌1至2分钟，以帮助将微球分配到微孔中。随后在室温下将
Figure BDA0002452781050000249
托盘在2700RPM下离心1分钟，以帮助将微球下降到其各自微孔的底部。因此，所有微球都位于微孔载玻片表面下方约80至120微米处。
将附连至
Figure BDA00024527810500002410
模块的微孔载玻片从
Figure BDA00024527810500002411
托盘中移出，并将3"×1"×1/8"厚的镀镍全厚度磁化的钕磁体(K&J Magnetics，目录号BZ0X02)放置在不锈钢夹之间的模块下方，以帮助将微球保持在其位置。通过移液从每个腔室中抽出大量水，移液器吸头指向腔室的侧壁，以免干扰微球阵列，移出磁体和不锈钢夹，并将微孔载玻片从
Figure BDA00024527810500002412
模块上卸下。将微孔载玻片放置在磁体顶部，并通过将一张低绒吸水纸比如
Figure BDA00024527810500002413
或可选地纸巾轻轻按压在载玻片表面上，去除保留在表面上的残余液滴。如图5所见，没有保持位于载玻片表面下方约80至120微米处的微球被该程序移位。观察到，虽然从微孔载玻片的表面上完全除去了大量的水，但是各个0.5mm直径的微孔保留了足够量的液体，该液体在标准条件下，例如，10％和90％之间的相对湿度，18℃和32℃之间的温度下保持在微孔内约5至10分钟。只要微孔中保留有一些量的液体，琼脂糖微球就会保持其完全水合的尺寸。仅在残留液体从微孔中蒸发后，由于干燥，微球才收缩到其原始尺寸的部分。
实施例9
从微球阵列洗脱分析物
使用先前实施例中描述的程序在微孔载玻片上制备含有13个微球的微球阵列。微球阵列中的所有各个微球都与先前描述的Phospho-S6核糖体蛋白(Ser235/236)单克隆抗体#4858缀合，并含有捕获的在Ser235和Ser236处被双重磷酸化的S6核糖体蛋白的蛋白水解片段。
通过用吸水纸轻轻接触载玻片表面去除在与
Figure BDA0002452781050000251
模块分离后存在于微孔载玻片表面上的水滴。将微孔载玻片立即放置在iMatrixSpray的基质沉积区域的中心处，并将10个循环的基质沉积应用于微球阵列。注意，第一基质沉积循环应在从载玻片表面去除水滴之后不迟于5分钟，优选在3分钟内开始，以便实现MALDI基质溶液与微孔内保留的残余液体的最佳混合。iMatrixSpray的基质沉积参数设置如下：高度：60mm；线距：0.5毫米；速度：60mm/s；密度：5μL/cm2；循环次数：10；延迟：0sec；喷涂区域宽度：80mm；喷涂区域深度：30mm。基质溶液含有5mg/mL的α-氰基-4-羟基肉桂酸(CHCA)、50％乙腈(v/v)、0.4％三氟乙酸和4mM柠檬酸二铵。
一旦完成最后的基质沉积循环，就使微球阵列风干，这需要约25至30分钟。目视检查微孔载玻片，以验证没有微孔含有残余的液体，并且所有微球由于干燥而减小了尺寸。将硅氧烷垫片与显微镜载玻片分离。一些干燥的琼脂糖微球粘附在硅氧烷上，并与垫片一起从载玻片上去除。使用被导向载玻片表面的来自空气除尘器的压缩空气流将保留的微球去除。观察到，虽然干燥的琼脂糖微球很容易被压缩气体从其位置移位，但MALDI基质的晶体仍牢固地附连在载玻片表面上，并位于其各自的微点内。
图6A是含有CHCA MALDI基质的斑点阵列的亮场显微镜图像，其在通过压缩空气从载玻片上去除微球之前被记录。由于干燥而减小尺寸的琼脂糖微球在9个斑点中可见。在另外的4个斑点中，不存在微球，而是斑点形状，例如，CHCA基质的不均匀分布表明先前存在微球，其很可能已与硅氧烷垫片一起从载玻片上去除。保留的斑点不含有微球，并且横跨斑点显示出更均匀的基质分布。图6B是含有CHCA MALDI基质的斑点的不相关阵列的亮场显微镜图像，其中所有微球已使用压缩空气从载玻片上去除。注意，在最初含有微球的位置上形成的斑点展现出特征性的“新月”或“甜甜圈”形状——该区域含有很少或不含CHCA基质。相反，在最初没有微球的位置中形成的斑点通常展现出更均匀的基质覆盖。图6A和图6B中所示的图像是在来自BioTek(Winooski，VT)的CYTATIONTM 3多模式阅读器上获取的。
实施例10
从微点阵列中获取质谱数据
使用先前实施例中描述的程序制备显微镜载玻片的ITO涂覆的表面上的微点阵列。将载玻片放入用于MALDI成像的MTP载玻片适配器II。由Bruker Daltonics(Billerica,MA)提供的定制几何文件能够从2288个斑点的正方形网格阵列连续获取质谱数据，每个斑点具有高达600μm的可变直径。在一些情况下，数据是从阵列中较小的部分获取的，其含有50和500个之间的斑点。
MALDI TOF MS数据是使用与仪器一起提供的flexControl软件在来自BrukerDaltonics的Bruker Autoflex Speed MALDI TOF-TOF质谱仪上获取的。使用2kHz的激光重复率，以线性正模式在1,000至7,000m/z的质量范围内获取数据。通常从单个微阵列斑点中收集并共添加总共20,000个单次脉冲谱，尽管在一些情况下，从少至100次脉冲即可获得高质量谱。在一些情况下，从单个微阵列斑点收集了超过100,000个单次脉冲谱，而没有完全耗尽该斑点中存在的分析物。使用都在flexControl软件中提供的随机游走法或反向螺旋法从每个斑点内的多个位置获取谱。
实施例11
分析质谱数据
使用来自Bruker Daltonics的flexAnalysis和BIOTOOLSTM软件分析MS数据集。在一些情况下，含有MS数据的文件会转换为.txt格式，并使用公共领域软件mMass进行分析。分析质谱以确定关键参数，比如质量准确度、光谱分辨率以及特定质谱图中存在的信噪比、相对强度和各个峰的峰面积。
实施例12
配置用于捕获多种靶标分析物的微阵列反应位点
在该实施例中，捕获剂是单克隆抗体Phospho-Met(Tyr1234/1235)(D26)兔单克隆抗体，目录号3077，其从Cell Signaling Technology(Danvers，MA)获取。Met，也称为肝细胞生长因子受体(HGFR)，是一种酪氨酸激酶，分子量为145kDa。UniProt(UniversalProtein Resource)数据库中该蛋白质的条目号和条目名称分别为P08581和MET_HUMAN。根据制造商网站上提供的产品描述(2017年2月20日访问)，#3077抗体“…仅在Tyr1234/1235处磷酸化时才检测到Met的内源性水平”。对#3077抗体验证应用，其包括蛋白质印迹、免疫沉淀、免疫组织化学(石蜡)、免疫组织化学(冷冻)、免疫荧光(免疫细胞化学)和流式细胞术。使用先前实施例中描述的程序，将#3077抗体缀合至蛋白A+G琼脂糖微球，并与1mg裂解的MKN-45细胞的胰蛋白酶消化物一起温育。在进行免疫亲和纯化(IAP)反应并从单个微球洗脱结合的分析物后，以线性正模式记录质谱图。MS测量也以反射器正模式进行(数据未显示)。在质谱图中检测到三个强峰，其m/z值为1853.06、2210.27和2647.54。基于以下数据将这些峰归属到特定的肽分析物：前体蛋白(即，Met激酶)的已知氨基酸序列、消化酶(即，胰蛋白酶)的已知特异性和可能的表位。对于后者，虽然没有公开精确的表位序列，但是制造商的网站指出“单克隆抗体是通过用合成的磷酸肽免疫动物而产生的，该磷酸肽对应于人Met的Tyr1234/1235周围的残基”。基于以上信息，进行以下峰归属：将1853.06峰归属为肽DMYDKE[pY][pY]SVHNK(SEQ ID NO：4)，其MH+计算值为1852.82；将2210.27峰归属为肽DMYDKE[pY][pY]SVHNKTGAK(SEQ ID NO：5)，其MH+计算值为2210.23；和将峰2647.54归属为肽DMYDKE[pY][pY]SVHNKTGAKLPVK(SEQ ID NO：5)NO：6)，其MH+计算值为2647.81。在以上列出的氨基酸序列中，[pY]表示磷酸化的酪氨酸。注意，峰归属不需要通过质谱法或使用串联质谱法(MS-MS)进行肽碎片化。在该实施例中，多种靶标分析物是前体蛋白的蛋白水解片段，其包含不同数量的漏切位点。
实施例13
配置用于捕获可变数量的靶标分析物的微阵列反应位点
在该实施例中，捕获剂是Phospho-S6核糖体蛋白(Ser235/236)(D57.2.2E)
Figure BDA0002452781050000261
兔单克隆抗体，目录号4858，其购自Cell Signaling Technology。根据制造商网站上提供的描述(2017年2月20日访问)，#4858抗体“……仅在Ser235和236处磷酸化时才检测到核糖体蛋白S6的内源性水平”。UniProt数据库中人S6核糖体蛋白的条目号和条目名称分别为P62753和RS6_HUMAN。使用先前实施例中描述的程序进行抗体与磁性琼脂糖微球的缀合和免疫亲和富集反应。免疫亲和富集独立于两个样品进行，这两个样品由在不存在和存在过氧化氢的条件下培养的MKN-45细胞的胰蛋白酶消化的裂解物制备。已知哺乳动物细胞暴露于过氧化氢会导致蛋白质磷酸化水平升高。
从在不存在过氧化氢的情况下生长的MKN-45细胞的消化的裂解物中捕获的蛋白水解肽的质谱图展现出总共4个不同的峰，它们相隔约80m/z单位。从在存在过氧化氢下生长的MKN-45细胞的消化的裂解物中捕获的蛋白水解肽的质谱图展现出总共6个不同的峰。在两个质谱图中，四个峰出现在相同的m/z位置，而过氧化氢处理的细胞独有的另外两个峰则出现在更高的m/z处，并且也相隔约80m/z。使用关于蛋白质序列、抗体特异性和消化酶特异性的可用信息，将所有检测到的峰归属为蛋白水解肽RLSSLRASTSKSESSQK(SEQ ID NO：7)，其由人S6核糖体蛋白的233至249位氨基酸组成并且含有3个漏切位点和可变数量的磷酸化位点。差异磷酸化肽的预测平均m/z值为：2013.1(2个磷酸化位点)、2093.0(3个磷酸化位点)、2173.0(4个磷酸化位点)、2252.9(5个磷酸化位点)、2332.9(6个磷酸化位点)和2412.9(7个磷酸化位点)。注意，由于抗体的特异性——该抗体仅在Ser235和Ser236二者处均被磷酸化时才识别肽序列，未检测到不含磷酸化位点或含有单个磷酸化位点的肽。此外，在检测到的肽中存在多个漏切位点与该消化酶的特异性一致，因为已知胰蛋白酶可能不会在靠近磷酸化残基的Lys或Arg残基之后切割。在该实施例中，微阵列反应位点能够结合至少6种不同的肽分析物，其翻译后修饰位点的数量不同。
实施例14
配置用于捕获人源和小鼠源的蛋白水解肽的微阵列反应位点
在该实施例中，捕获剂是山羊抗乌头酸酶2(aa541-555)多克隆抗体，目录号为EB09858，由Everest Biotech(Upper Heyford,Oxfordshire UK)供应。捕获剂识别蛋白ACO2(其也称为线粒体乌头酸水合酶)的内部序列。UniProt数据库中人ACO2的条目号和条目名称分别是Q99798和ACON_HUMAN。UniProt数据库中小鼠ACO2的条目号和条目名称分别为Q99KI0和ACON_MOUSE。用于抗体产生的免疫肽的序列是QDTYQHPPKDSSGQH(SEQ ID NO：8)。使用先前实施例中描述的程序进行抗体与磁性琼脂糖微球的缀合和免疫亲和富集反应。免疫亲和富集独立于两个样品进行，即，培养的MKN-45细胞的胰蛋白酶消化的裂解物和小鼠脑组织的胰蛋白酶消化的裂解物。用于样品制备的消化酶是来自WorthingtonBiochemical Corp(Lakewood，NJ)的牛胰蛋白酶，目录号为LS02119。
从消化的MKN-45裂解物捕获的蛋白水解肽的质谱图展现出在4,400和4,800m/z之间的一对主峰和在2,200和2,400m/z之间的另一对峰。使用关于蛋白质序列、抗体特异性和消化酶特异性的可用信息，将在较高m/z范围内观察到的一对峰归属为蛋白水解肽LEAPDADELPKGEFDPGQDTYQHPPKDSSGQHVDVSPTSQR(SEQ ID NO:9)和FRLEAPDADELPKGEFDPGQDTYQHPPKDSSGQHVDVSPTSQR(SEQ ID NO:10)，预测的平均m/z值分别为4477.7和4781.1。将在较低的m/z范围内观察到的一对峰归属为相同肽的双电荷形式。
从消化的小鼠脑组织捕获的蛋白水解肽的质谱图展现出在3,800至4,000m/z之间的一对主峰和在2500m/z以下的一系列较小的峰。使用关于蛋白质序列、抗体特异性和消化酶特异性的可用信息，将在3,800至4,000m/z之间观察到的一对峰归属为蛋白水解肽FKLEAPDADELPRSDFDPGQDTYQHPPKDSSGQR(SEQ ID NO:11)和KFKLEAPDADELPRSDFDPGQDTYQHPPKDSSGQR(SEQ ID NO:12)，预测的平均m/z值分别为3846.1和3974.3。将在较低的m/z范围内观察到的峰中的两个归属为相同肽的双电荷形式。
在该实施例中，因为表位序列保留在这些蛋白质中，所以该抗体识别并特异性结合源自人和小鼠形式的ACO2的蛋白水解肽。人和小鼠源的蛋白水解肽之间检测到的m/z值的差异归因于下述两个因素的组合：(1)消化酶(例如，相应的前体蛋白中的胰蛋白酶)的不同识别位点，这导致蛋白水解肽的长度不同，和(2)相应的前体蛋白中的氨基酸取代，这不会改变消化酶的识别位点，但会引起质量差异。
该实施例证明了检测和定量源自两个不同物种，即，人(智人)和小鼠(小家鼠)的蛋白质的方法。这项技术的一个应用是对细胞、组织和器官移植物(例如，肿瘤异种移植物)中蛋白质表达和/或蛋白质修饰的单重(single-plex)或多重分析。
实施例15
配置用于捕获由不同消化酶产生的蛋白水解肽的微阵列反应位点
在该实施例中，捕获剂是Phospho-4E-BP1(Thr37/46)(236B4)兔单克隆抗体，目录号为2855，其购自Cell Signaling Technology。根据制造商网站(2017年2月20日访问)上的描述，#2855抗体“…仅在Thr37和/或Thr46处磷酸化时才检测到4E-BP1的内源水平。当在等效位点磷酸化时，该抗体可能与4E-BP2和4E-BP3交叉反应”。UniProt数据库中人真核翻译起始因子4E结合蛋白1的条目号和条目名称分别是Q13541和4EBP1_HUMAN。使用先前实施例中描述的程序进行抗体与磁性琼脂糖微球的缀合和免疫亲和富集反应。由若干样品进行了含有抗体识别位点的蛋白水解肽的免疫亲和富集，这些样品通过使用以下消化酶的MKN-45细胞裂解物的酶消化制备：测序级修饰胰蛋白酶(Promega目录号V5117)、测序级胰凝乳蛋白酶(Promega目录编号V1061)、胃蛋白酶(Promega目录编号V1959)、MS级Lys-C蛋白酶(ThermoFisher目录编号90051)、MS级Lys-N蛋白酶(ThermoFisher目录编号90300)、MS级Glu-C蛋白酶(ThermoFisher目录编号90054)、测序级Arg-C蛋白酶(Promega目录编号V1881)、嗜热菌蛋白酶(Promega目录编号V4001)、弹性蛋白酶(Promega目录编号V1891)。
如先前实施例中所述，以线性正模式进行免疫亲和富集后从微球洗脱的蛋白水解肽的质谱分析。在质谱图中观察到的峰的位置与预测的用特定酶消化后4E-BP1的含表位片段的m/z值一致。例如，在胰蛋白酶消化的4E-BP1质谱图中，在m/z 3129.4和3209.3附近观察到两个强峰，其分别对应于含有人4E-BP1的21至51位氨基酸的肽VVLGDGVQLPPGDYSTTPGGTLFSTTPGGTR(SEQ ID NO：3)的单磷酸化和双磷酸化形式的计算平均m/z值。同样，胃蛋白酶消化的4E-BP1的质谱图在1393.5的m/z附近展现出一个强峰，其对应于含有人4E-BP1的43至54位氨基酸的肽FSTTPGGTRIIY(SEQ ID NO：13)的单磷酸化形式。胰凝乳蛋白酶消化的4E-BP1的质谱图在1246.3和2053.3的m/z附近展现示出一对强峰。前一个峰归属为肽STTPGGTRIIY(SEQ ID NO：14)的单磷酸化形式，其含有人4E-BP1的第44至54位氨基酸和0个胰凝乳蛋白酶漏切，而后一个峰归属为肽FSTTPGGTRIIYDRKFL(SEQ IDNO：15)的单磷酸化形式，其含有人4E-BP1的第43至59位氨基酸，以及3个胰凝乳蛋白酶漏切。
胃蛋白酶消化的样品还含有肽ST[pT]PGGTL(SEQ ID NO：16)(0个漏切，MW813.78)，其被#2855抗体识别。该肽源自两种蛋白质：4E-BP1和4E-BP3(UniProt条目号O60516)。相比之下，被先前描述的#9644抗体识别的胃蛋白酶消化的肽GGEESQFEMDI(SEQID NO：17)(1个漏切，MW 1242.31)源自4E-BP1，而不是4E-BP3。因而，包含#2855和#9644抗体二者创建微阵列，其中一种捕获剂识别在两种不同蛋白质中发现的表位，而另一种捕获剂识别仅在这些蛋白质的一种中发现的表位。
在另一个实验中，将含有先前描述的抗体#4858的反应位点添加至微阵列。#2855和#4858抗体二者均识别表位，这些表位缺乏由至少两种以下消化酶识别的蛋白水解切割位点：胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶、内切蛋白酶Glu-C和内切蛋白酶Asp-N。
实施例16
靶标分析物与微阵列的不同反应位点的非特异性结合
使用在先前实施例中描述的三种磷酸特异性抗体#2855、#3077和#4858，产生了以不同反应位点为特征的若干相同的微阵列。每个微阵列中包含少于十个(三到五个)含有相同类型抗体的复制微球。因而，每个微阵列含有总共九个反应位点，其能够结合源自磷酸-4E-BP1(Thr37/46)、磷酸-Met(Tyr1234/1235)和磷酸-S6核糖体蛋白(Ser235/236)的蛋白水解肽。所制造的微阵列与一系列消化的MKN-45细胞裂解物一起温育，这些细胞裂解物使用先前实施例中列出的酶制备，即，胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、Glu-C蛋白酶、Lys-C蛋白酶和Lys-N蛋白酶。如实施例6中所述，由每个消化的细胞裂解物进行免疫亲和富集，不同的是，在结合反应期间从结合缓冲液中省略2.5M NaCl，并在1×PBS缓冲液中代替2.5M NaCl溶液洗涤微球。如前所述，通过质谱法分析由每个微阵列的各个反应位点捕获的分析物。结合和洗涤缓冲液中不存在2.5M NaCl对从胰蛋白酶消化的细胞裂解物中捕获的分析物的质谱图没有显著影响。相反，在从胰凝乳蛋白酶消化的细胞裂解物进行的免疫亲和富集期间，未在结合和洗涤缓冲液中使用高盐对质谱图有显著影响，在从每个反应位点记录的质谱图中，无论缀合抗体如何，在2222.5的m/z附近观察到一个强峰。除分析物特异性峰外，质谱图中还存在非特异性2222.5峰，该峰与胰凝乳蛋白酶消化后对应的前体蛋白的蛋白水解片段的预期m/z值匹配。例如，除了在先前实施例中鉴定的1246.3和2053.3峰外，从磷酸-4E-BP1反应位点记录的质谱图还展现出2222.5峰。为了鉴定负责2222.5峰的非特异性结合化合物，从牛血清白蛋白(BSA)缀合的琼脂糖微球收集洗脱液，其已暴露于胰凝乳蛋白酶消化的MKN-45细胞裂解物。通过Edman降解分析洗脱液，产生肽序列KAQKKDGKKRKRSRKESY(SEQ IDNO：18)——其具有2222.6的预测的平均[M+H]+值和对人组蛋白H2B类型1-C/E/F/G/I的21至38位氨基酸的初步归属(tentative assignment)。UniProt数据库中人组蛋白H2B类型1-C/E/F/G/I的条目号和条目名称分别为P62807和H2B1C_HUMAN。数据随后用于在微阵列解码表中进行输入，该解码表含有关于这种非特异性结合化合物的分子量以及该化合物可能出现在人源样品(比如已经历胰凝乳蛋白酶消化的人细胞培养物)的质谱图中的事实的信息。
实施例17
靶标分析物与微阵列的不同反应位点的特异性结合
用作捕获剂的多克隆抗体来自Everest Biotech。这些包括：(1)山羊抗乌头酸酶2抗体(目录号EB09857，免疫原性肽序列C-QHVDVSPTSQRLQ(SEQ ID NO：19))；和(2)山羊抗乌头酸酶2(aa541-555)抗体(目录号EB09858，免疫原性肽序列C-QDTYQHPPKDSSGQH(SEQ IDNO：20))；(3)山羊抗GPI/神经白细胞素抗体(目录号EB09739，免疫原性肽序列C-YREHRSELNLRR(SEQ ID NO：21))和(4)山羊抗IDH3B(aa369-383)抗体(目录号EB10997，免疫原性肽序列C-TTDFIKSVIGHLQTK(SEQ ID NO：22))。
使用先前实施例中描述的程序将各个抗体缀合至磁性琼脂糖微球。通过选择与以上列出的四种抗体之一缀合的2个微球，然后在单个1.7mL微量离心管中组合与不同抗体缀合的微球，组装含有8个反应位点的4重微球阵列。随后使组装的微阵列与如先前实施例中所述制备的2mg胰凝乳蛋白酶消化的MKN-45细胞裂解物反应。将反应的微球阵列转移到微孔载玻片上，从微球中洗脱分析物，并通过MALDI TOF MS进行分析，如先前实施例中所述的。
总共鉴定出8个质谱图，在1,000-5,000m/z的质量范围内，有一个或若干个峰的信噪比大于3：1，这与微阵列中存在的反应位点的数量相匹配。鉴定出四对不同的质谱图，其对应于微阵列的四个不同的反应位点。从复制反应位点记录的质谱图非常相似，例如，具有相同数量的峰，m/z值在不同谱图之间变化小于0.1。图7显示了从各个反应位点获取的示例性质谱图。表1显示了该微阵列的解码表。在该实施例中，具有QHPPKDSSGQHVDVSPTSQRL(SEQID NO：23)序列和2301.49的m/z的相同肽靶标被微阵列的两个不同的反应位点(即，含有抗体EB09857和EB09858的反应位点)捕获。这些抗体识别人乌头酸酶2中的相邻序列，这允许它们特异性结合相同的蛋白水解肽。然而，抗体EB09857另外地捕获了具有QHVDVSPTSQRLQLLEPFDKWDGKDLED(SEQ ID NO：24)序列和3297.60的m/z的肽，其未被抗体EB09858捕获。因此，如表1所显示，在微阵列中可以很容易地区分两个反应位点(ACO2和ACO2(541-555))，因为两者均结合m/z为2301.49的靶标，而只有前者结合了m/z为3297.60的靶标。实际上，与反应位点ACO2(541-555)相关联的解码表中的条目可以任选地含有对3297.60的m/z处不存在信号的特定参考，如表1中的*信号不存在(SIGNAL ABSENT)*注释所描绘的。此外，参考图7，可见ACO2和ACO2(541-555)谱图都还含有若干另外的较低强度的峰。这些峰对它们各自的抗体是特异性的，因此关于其MW、m/z或TOF值的信息可包含在解码表中，以进一步提高靶标鉴定的置信度。
表14重微阵列的微阵列解码表
Figure BDA0002452781050000311
先前描述的微阵列的解码表的简化形式显示在表2中。在该实施例中，未提供由反应位点捕获的靶标的氨基酸序列，并且仅基于质谱图中检测到的一个或多个信号来鉴定反应位点。此外，可以基于在质谱图的特定m/z处未检测到的信号来鉴定反应位点，如在表2中针对反应位点ACO2(541-555)所显示的。
在该实施例中，ACO2反应位点与包括2个不同值的组合相关联：2301.49和3297.60。该组合对于鉴定与该反应位点的捕获剂特异性结合的靶标既必要又充分。
表24重微阵列的简化微阵列解码表
反应位点 质谱图中检测到的信号(m/z)
ACO2 2301.49和3297.60
ACO2(541-555) 2301.49，但无3297.60
GPI 1090.19
IDH3 2021.29
在一些实验中，将来自Everest Biotech的两种山羊抗-GAPDH(内部)抗体添加至微阵列：目录号EB07069，免疫原性肽序列C-GVNHEKYDNSLK(SEQ ID NO：27)和目录号EB06377，免疫原性肽序列C-HQVVSSDFNSDT(SEQ ID NO：28)。后一种抗体识别的表位缺乏胰蛋白酶识别的蛋白水解切割位点，而前一种抗体识别的表位含有这种位点，即内部赖氨酸。
实施例18
提供样品中靶标分析物的相对丰度的估计值
使用先前描述的抗体#4858和#9644以及来自Cell Signaling Technology的磷酸-p44/42MAPK(Erk1/2)(Thr202/Tyr204)(D13.14.4E)
Figure BDA0002452781050000312
兔单克隆抗体——其目录号为4370，如先前实施例所述生产微阵列。根据制造商网站上的描述(在2017年3月25日访问)，#4370抗体“…当在Erk1的Thr202和Tyr204(Erk2的Thr185和Tyr187)处双重磷酸化和在Thr202处单磷酸化时，检测到p44和p42 MAP激酶(Erk1和Erk2)的内源性水平”。
实验确定了以上列出三种抗体中的每一种都能够特异性结合来自胰蛋白酶消化的MKN-45细胞裂解物的若干靶标。实验还确定了，只要细胞培养物和样品制备条件保持相似，例如，使用相同的细胞培养基和相同的消化酶，相同抗体捕获的来自多个靶标的信号的相对强度在不同样品制品之间不会显著变化。例如，从4E-BP1的蛋白水解片段RAGGEESQFEMDI(SEQ ID NO：1)和AGGEESQFEMDI(SEQ ID NO：2)记录的峰强度比——其m/z分别为1469.6和1313.4——始终大于10：1。来自肽RLSSLRASTSKSESSQK(SEQ ID NO：7)的双磷酸化和三磷酸化形式的峰比含有4或5个磷酸酯的肽RLSSLRASTSKSESSQK(SEQ ID NO：7)的峰强度高约2倍，后者又比含有6或7个磷酸酯的相同肽的峰强度高约3倍。m/z为2305.3附近的来自VADPDHDHTGFL[pT]E[pY]VATR(SEQ ID NO：29)(Erk2)的信号比m/z为2333.3附近的来自IADPEHDHTGFL[pT]E[pY]VATR(SEQ ID NO:30)(Erk1)的信号强5至20倍。
因此，如表3所显示，可以在微阵列解码表中包括相对峰强度数据，在这种情况下，该相对峰强度数据是针对特定细胞系(例如，MKN-45)、特定治疗条件(例如，DMSO处理或激酶抑制剂处理)和特定的消化条件(例如，质谱测序级胰蛋白酶)给出。质谱图中峰的相对强度通常与样品中相应分析物的相对量直接相关，并且在解码表中提供这种信息可能有助于鉴定靶标分析物。具体而言，表3中的数据表明，在胰蛋白酶消化的MKN-45细胞裂解物中，在Thr185和Tyr187处双重磷酸化的Erk2的蛋白水解片段比在Thr202和Tyr204处双重磷酸化的Erk1的蛋白水解片段更丰富。在一些情况下，质谱图中信号强度与样品中分析物丰度之间的关系更复杂，例如，对于具有可变数量PTM位点的肽。然而，在微阵列解码表中提供包括丰度数据的谱模式是鉴定靶标的有用方法。例如，虽然磷酸-S6核糖体蛋白(Ser235/236)和磷酸-p44/42MAPK(Erk1/2)(Thr202/Tyr204)反应位点均能够特异性结合分子量接近2333Da的靶标，含有丰度信息的微阵列解码表可以帮助提供对检测到的靶标分析物的明确归属。在该实施例中，由微阵列的不同捕获剂识别的两个靶标的分子量相差小于1Da(2332.9和2333.3)，而由捕获剂识别的其他靶标的分子量相隔至少5Da以确保明确的归属。
表3
包括相对靶标丰度的估计值的微阵列解码表
Figure BDA0002452781050000321
Figure BDA0002452781050000331
实施例19
配置用于测量蛋白质中多个位点的PTM状态的微阵列
靶标分析物是人S6核糖体蛋白，也称为核糖体蛋白S6(rpS6，UniProt条目号P62753)，其在先前的实施例中已进行了描述。根据蛋白质翻译后修饰的在线数据库
Figure BDA0002452781050000332
rpS6可在多个位点处被磷酸化，其包括位于蛋白C-末端的一簇残基：Ser235、Ser236、Ser240、Ser242、Ser244、Ser246、Ser247。
使用先前描述的方法制备了用于测量rpS6内各个位点的磷酸化状态的微阵列。该微阵列包括三种不同的抗体，其分别与它们各自的微球缀合：(1)来自Cell SignalingTechnology的先前描述的单克隆兔抗体，其目录号为4858；(2)来自Elabscience(Houston,TX)的多克隆兔抗体，其目录号为E-AB-32812；(3)也来自Elabscience的多克隆兔抗体，其目录号为E-AB-32813。根据Elabscience网站上可获得的产品描述，E-AB-32812的免疫原是“在Ser235的非磷酸化位点附近”源自人rpS6的合成肽，而E-AB-32813的免疫原是“在Ser240的非磷酸化位点附近”源自人rpS6的合成肽。预期含有抗体#4858的反应位点将结合在Ser235/Ser236处双重磷酸化的rpS6的蛋白水解片段，以及除了Ser235/Ser236之外在Ser240、Ser242、Ser244、Ser246和/或Ser247处磷酸化的蛋白水解片段。因此，被该反应位点的捕获试剂识别的表位含有两个PTM，而与反应位点结合的一些靶标含有一个或多个另外的PTM，其位于表位之外。含有抗体#E-AB-32812的反应位点预期结合含有非磷酸化Ser235的rpS6的蛋白水解片段。含有抗体#E-AB-32813的反应位点预期结合含有非磷酸化Ser240的rpS6的蛋白水解片段。因为rpS6可在若干不同的位点处被磷酸化，所以每个微阵列反应位点都预期结合具有不同分子量的蛋白水解肽。
将所制备的微阵列的反应位点各自与200g的MKN-45细胞的胰蛋白酶消化的裂解物反应，该裂解物如先前所述制备。在该实施例中，将每个微阵列反应位点分别与消化的裂解物一起温育，随后准备进行MS分析。因此，在MS分析之前和期间，已知缀合至特定反应位点的抗体的身份。如前所述，从各个反应位点获取MALDI TOF质谱图。抗体#4858捕获的蛋白水解肽的质谱图在2013.1、2093.0、2173.0、2252.9、2332.9和2412.9的平均m/z附近展示了若干个主峰，这些峰被归属为分别含有2、3、4、5、6和7个磷酸化位点的rpS6的C-末端片段(氨基酸233至249)。抗体E-AB-32813捕获的蛋白水解肽的质谱图展示了m/z为1853.1和1933.0附近的另外的峰，这些峰被归属为分别含有0和1个磷酸化位点的rpS6的C-末端片段(氨基酸233至249)。在使用抗体#4858获得的质谱图中未检测到1853.1和1933.0峰，这需要存在至少2个磷酸化位点。同样，在使用抗体E-AB-32813获得的质谱图中未检测到2252.9、2332.9和2412.9峰，这需要存在至少一个和可能更多个非磷酸化位点。使用抗体E-AB-32812获得的质谱图展示了在m/z为1853.1附近的弱峰——其对应于rpS6的非磷酸化C-末端片段，并且在更高的m/z处没有可检测到的峰。该信号的低强度可能是由于与rpS6的磷酸化对应物相比，非磷酸化rpS6的更有效的胰蛋白酶消化，其含有若干个内部Arg和Lys残基。该实施例显示了一种微阵列，其含有特异性地识别天然存在蛋白质序列中不同表位的不同捕获剂，其中不同捕获剂与不同微球缔合。它还显示了一种微阵列，其含有在不存在PTM和存在PTM(在这种情况下为磷酸化)的情况下特异性识别蛋白质位点(rpS6中的Ser235)的不同捕获剂。
实施例20
用于测量蛋白质的多个蛋白水解片段的微阵列
该蛋白质是先前描述的人真核翻译起始因子4E-结合蛋白1(4E-BP1，UniProt条目号Q13541)。根据
Figure BDA0002452781050000341
数据库，4E-BP1可在包括Thr37、Thr46、Ser65、Thr70、Ser101和Ser112的多个位点处被磷酸化。
使用先前描述的方法制备了用于测量4E-BP1内各个位点的磷酸化状态的微阵列。该微阵列包括全部购自Cell Signaling Technology的4种抗体，其分别与它们各自的微球缀合：(1)磷酸-4E-BP1(Thr37/46)(236B4)兔单克隆抗体(目录号2855)；(2)磷酸-4E-BP1(Ser65)(D9G1Q)兔单克隆抗体(目录号13443)；(3)磷酸-4E-BP1(Thr70)(D7F6I)兔单克隆抗体(目录号13396)和(4)4E-BP1(53H11)兔单克隆抗体(目录号9644)。该列表中的前3个抗体被设计为识别人4E-BP1的相应磷酸化位点，而#9644抗体被设计为探测4E-BP1的总量。因而，微阵列含有4个不同的反应位点，其能够探测4E-BP1内的不同位点。该微阵列含有4个不同的反应位点中的每一个的少于5个复制品。
根据制造商网站上的产品描述，#9644抗体“通过用与人4E-BP1的Ser112周围的残基相对应的合成肽免疫兔而产生”。实验证实了含有该抗体的反应位点有效捕获了含有序列RAGGEESQFEMDI(SEQ ID NO：1)的合成肽，但未结合含有序列RAGGEE[pS]QFEMDI(SEQ IDNO：31)的肽，其中对应于4E-BP1的Ser112的残基被磷酸化。因而，#9644抗体在含有相同氨基酸序列的磷酸肽的存在下特异性识别非磷酸化肽。
将所制备的微阵列与200g的MKN-45细胞的胰蛋白酶消化的裂解物一起温育，该裂解物如先前所述制备。通过线性和反射器MALDI TOF MS测量捕获在各个反应位点上的肽，并使用Bruker Autoflex的LIFT模式对其进行MS-MS测序。通过LIFT确定捕获在各个反应位点上的肽序列之后，可能的是，基于抗体特异性将其归属为阵列中包含的4种抗体的每种。含有#9644抗体的反应位点捕获了肽RAGGEESQFEMDI(SEQ ID NO：1)(1个漏切，MW 1469.57)和AGGEESQFEMDI(SEQ ID NO：2)(0个漏切，MW 1313.39)。含有#2855抗体的反应位点捕获了肽VVLGDGVQLPPGDYST[pT]PGGTLFSTTPGGTR(SEQ ID NO：32)(0个漏切，MW 3129.36)、VVLGDGVQLPPGDYSTTPGGTLFST[pT]PGGTR(SEQ ID NO：33)(0个漏切，MW 3129.36)和VVLGDGVQLPPGDYST[pT]PGGTLFST[pT]PGGTR(SEQ ID NO：34)(0个漏切，MW 3209.3449)。另外，还捕获了含有1和2个漏切位点的肽，比如VVLGDGVQLPPGDYST[pT]PGGTLFSTTPGGTRIIYDRK(SEQ ID NO：35)。含有#13443抗体的反应位点捕获了肽FLME[camC]RN[pS]PVTKTPPR(SEQ ID NO：36)(2个漏切位点，MW 2014.28)和FLME[camC]RN[pS]PVTKTPPRDLPTIPGVTSPSSDEPPMEASQSHLR(SEQ ID NO：37)(3个漏切位点，MW4745.29)。含有#13396抗体的反应位点捕获了肽FLME[camC]RNSPVTK[pT]PPR(SEQ ID NO：38)(2个漏切位点，MW2014.28)和FLME[camC]RNSPVTK[pT]PPRDLPTIPGVTSPSSDEPPMEASQSHLR(SEQ ID NO：39)(3个漏切位点，MW 4745.29)。[camC]表示氨基甲酰甲基半胱氨酸。所有肽都具有天然同位素丰度。
在该实施例中，微阵列含有不同的捕获剂，即，抗体#13443和#13396，它们与不同的微球缔合，并且在分子量小于5000Da的人4E-BP1的片段内分别识别分别含有磷酸-Ser65和磷酸-Thr70的不同表位。第一PTM(磷酸-Ser65)的位点与第二PTM(磷酸-Thr70)的位点相隔少于10个氨基酸。
在该实施例中，由抗体#2855识别的表位，即，ST[pT]P序列(SEQ ID NO：40)在人和小鼠4E-BP1二者中天然存在。
在该实施例中，被抗体#2855和#9644识别的表位缺乏被胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶识别的蛋白水解切割位点。
在该实施例中，蛋白质的三个不同的含PTM的片段被捕获在微阵列的不同反应位点上。
在该实施例中，制造商已经验证了用于捕获蛋白水解肽的抗体用于包括蛋白质印迹、免疫沉淀、免疫荧光、免疫组织化学、流式细胞学和ELISA的测定。
4E-BP1的序列长度是118个氨基酸。由微阵列的各个反应位点捕获的4E-BP1的蛋白水解片段的长度范围为13个氨基酸至42个氨基酸。微阵列捕获的所有非重叠蛋白水解片段的组合序列长度为86个氨基酸，超过蛋白质序列长度的70％。在该实施例中，可能的是，使用含有少于10种不同捕获剂的微阵列探测蛋白质的主要部分，例如，蛋白质序列长度的50％以上。
在单独的实验中，相同的微阵列与MKN-45细胞的胰凝乳蛋白酶消化的裂解物反应。含有抗体#9644的反应位点捕获了肽RNSPEDKRAGGEESQFEMDI(SEQ ID NO：41)(1个漏切位点，MW 2296.44)和RN[pS]PEDKRAGGEESQFEMDI(SEQ ID NO：42)(1个漏切位点，MW2376.42)。被该反应位点的捕获剂识别的表位不含有PTM，而捕获的肽靶标中的一种在对应于人4E-BP1的Ser101的位置中含有PTM，即磷酸化。
实施例21
配置用于结合含有不同PTM类型的靶标的微阵列反应位点
R&D Systems(Minneapolis,MN)人/小鼠/大鼠磷酸-CDC2/CDK1(Y15)抗体——其目录号为AF888，识别人细胞周期蛋白依赖性激酶2的胰凝乳蛋白酶消化的片段(UniProt条目号P24941)[Ac]MENFQKVEKIGEGT[pY]GVVY(SEQ ID NO：43)(2个漏切，MW 2314.52)，其含有在N-末端处的乙酰化和对应于人CDC2的Tyr15的氨基酸的磷酸化二者。第一PTM(磷酸化)位于表位内，而第二PTM(乙酰化)位于表位外。在该实施例中，在分子量小于4000Da的肽内，第一PTM的位点与第二PTM的位点相隔超过10个氨基酸。
实施例22
配置用于结合源自不同蛋白质的靶标的捕获剂，这些蛋白质是不同生物途径的组成成分
识别在人STAT1(UniProt条目号P42224)中发现的氨基酸序列PKEAP(SEQ ID NO：44)的抗体也识别在转录因子p65(UniProt条目号Q04206)中发现的氨基酸序列PKPAP(SEQID NO：45)。前一种蛋白是信号转导和转录活化因子，而后者是转录因子。MALDI MS—使用先前描述的方法，可以通过胰凝乳蛋白酶消化MKN-45细胞裂解物中各自的前体蛋白来产生含有这些序列的STAT1和p65可检测片段。这种抗体可从Cell Signaling Technology作为Stat1(D1K9Y)兔单克隆抗体获得，其目录号为#14994。
实施例23
配置用于结合完整蛋白和小分子靶标分析物的微阵列
微阵列包括已被其各自制造商验证以识别完整的，即未消化的蛋白和小分子靶标的抗体。识别人胰岛素(MW 5807.6Da)的小鼠单克隆抗体来自Novus Biologicals，目录号为NBP2-32975。识别全长人C反应蛋白(MW 25039Da)的兔多克隆抗体来自Abcam，其产品代码为ab31156。识别皮质醇的小鼠单克隆抗体(MW 362.46)来自Abcam，其产品代码为ab116600。识别睾丸激素的小鼠单克隆抗体(MW 288.43)来自Novus Biologicals，其目录号为NBP1-78562。
微阵列含有识别MW小于700Da的小分子的抗体，以及识别MW大于5000Da和10000Da(分别为胰岛素和CRP)的完整蛋白的抗体。
微阵列还包含缀合至蛋白A+G的微球。在不存在交联的情况下，从蛋白A+G缀合微球洗脱出本实施例中列出的抗体，并使用芥子酸作为基质通过MALDI TOF MS进行检测。根据特定的抗体序列，在大约130kDa和170kDa之间的分子量范围内检测到抗体。该实施例显示蛋白A+G可以用作结合蛋白，例如，分子量大于100kDa的抗体的捕获试剂。
本文引用的所有专利、专利申请和公开的参考文献均通过引用以其全部并入本文。虽然已经结合本公开的特定实施例描述了本公开，但是应当理解，本公开能够被进一步修改。此外，本申请旨在涵盖本公开的任何变型、使用或更改，包括属于本公开所属领域的已知或惯用实践以及落入所附权利要求范围之内的这种与本公开的偏离。
序列表
<110> ADEPTRIX CORP.
<120> 用于蛋白质组学的多重微球阵列
<130> 84025PCT
<140>
<141>
<150> 62/555,235
<151> 2017-09-07
<160> 45
<170> PatentIn 版本 3.5
<210> 1
<211> 13
<212> PRT
<213> 智人
<400> 1
Arg Ala Gly Gly Glu Glu Ser Gln Phe Glu Met Asp Ile
1 5 10
<210> 2
<211> 12
<212> PRT
<213> 智人
<400> 2
Ala Gly Gly Glu Glu Ser Gln Phe Glu Met Asp Ile
1 5 10
<210> 3
<211> 31
<212> PRT
<213> 智人
<400> 3
Val Val Leu Gly Asp Gly Val Gln Leu Pro Pro Gly Asp Tyr Ser Thr
1 5 10 15
Thr Pro Gly Gly Thr Leu Phe Ser Thr Thr Pro Gly Gly Thr Arg
20 25 30
<210> 4
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (7)..(8)
<223> 磷酸-Tyr
<400> 4
Asp Met Tyr Asp Lys Glu Tyr Tyr Ser Val His Asn Lys
1 5 10
<210> 5
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (7)..(8)
<223> 磷酸-Tyr
<400> 5
Asp Met Tyr Asp Lys Glu Tyr Tyr Ser Val His Asn Lys Thr Gly Ala
1 5 10 15
Lys
<210> 6
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (7)..(8)
<223> 磷酸-Tyr
<400> 6
Asp Met Tyr Asp Lys Glu Tyr Tyr Ser Val His Asn Lys Thr Gly Ala
1 5 10 15
Lys Leu Pro Val Lys
20
<210> 7
<211> 17
<212> PRT
<213> 智人
<400> 7
Arg Leu Ser Ser Leu Arg Ala Ser Thr Ser Lys Ser Glu Ser Ser Gln
1 5 10 15
Lys
<210> 8
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人
<400> 8
Gln Asp Thr Tyr Gln His Pro Pro Lys Asp Ser Ser Gly Gln His
1 5 10 15
<210> 9
<211> 41
<212> PRT
<213> 智人
<400> 9
Leu Glu Ala Pro Asp Ala Asp Glu Leu Pro Lys Gly Glu Phe Asp Pro
1 5 10 15
Gly Gln Asp Thr Tyr Gln His Pro Pro Lys Asp Ser Ser Gly Gln His
20 25 30
Val Asp Val Ser Pro Thr Ser Gln Arg
35 40
<210> 10
<211> 43
<212> PRT
<213> 智人
<400> 10
Phe Arg Leu Glu Ala Pro Asp Ala Asp Glu Leu Pro Lys Gly Glu Phe
1 5 10 15
Asp Pro Gly Gln Asp Thr Tyr Gln His Pro Pro Lys Asp Ser Ser Gly
20 25 30
Gln His Val Asp Val Ser Pro Thr Ser Gln Arg
35 40
<210> 11
<211> 34
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 11
Phe Lys Leu Glu Ala Pro Asp Ala Asp Glu Leu Pro Arg Ser Asp Phe
1 5 10 15
Asp Pro Gly Gln Asp Thr Tyr Gln His Pro Pro Lys Asp Ser Ser Gly
20 25 30
Gln Arg
<210> 12
<211> 35
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 12
Lys Phe Lys Leu Glu Ala Pro Asp Ala Asp Glu Leu Pro Arg Ser Asp
1 5 10 15
Phe Asp Pro Gly Gln Asp Thr Tyr Gln His Pro Pro Lys Asp Ser Ser
20 25 30
Gly Gln Arg
35
<210> 13
<211> 12
<212> PRT
<213> 智人
<400> 13
Phe Ser Thr Thr Pro Gly Gly Thr Arg Ile Ile Tyr
1 5 10
<210> 14
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人
<400> 14
Ser Thr Thr Pro Gly Gly Thr Arg Ile Ile Tyr
1 5 10
<210> 15
<211> 17
<212> PRT
<213> 智人
<400> 15
Phe Ser Thr Thr Pro Gly Gly Thr Arg Ile Ile Tyr Asp Arg Lys Phe
1 5 10 15
Leu
<210> 16
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (3)..(3)
<223> 磷酸-Thr
<400> 16
Ser Thr Thr Pro Gly Gly Thr Leu
1 5
<210> 17
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人
<400> 17
Gly Gly Glu Glu Ser Gln Phe Glu Met Asp Ile
1 5 10
<210> 18
<211> 18
<212> PRT
<213> 智人
<400> 18
Lys Ala Gln Lys Lys Asp Gly Lys Lys Arg Lys Arg Ser Arg Lys Glu
1 5 10 15
Ser Tyr
<210> 19
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 19
Cys Gln His Val Asp Val Ser Pro Thr Ser Gln Arg Leu Gln
1 5 10
<210> 20
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
肽
<400> 20
Cys Gln Asp Thr Tyr Gln His Pro Pro Lys Asp Ser Ser Gly Gln His
1 5 10 15
<210> 21
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 21
Cys Tyr Arg Glu His Arg Ser Glu Leu Asn Leu Arg Arg
1 5 10
<210> 22
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 22
Cys Thr Thr Asp Phe Ile Lys Ser Val Ile Gly His Leu Gln Thr Lys
1 5 10 15
<210> 23
<211> 21
<212> PRT
<213> 智人
<400> 23
Gln His Pro Pro Lys Asp Ser Ser Gly Gln His Val Asp Val Ser Pro
1 5 10 15
Thr Ser Gln Arg Leu
20
<210> 24
<211> 28
<212> PRT
<213> 智人
<400> 24
Gln His Val Asp Val Ser Pro Thr Ser Gln Arg Leu Gln Leu Leu Glu
1 5 10 15
Pro Phe Asp Lys Trp Asp Gly Lys Asp Leu Glu Asp
20 25
<210> 25
<211> 8
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 未知的描述：GPI反应位点肽
<400> 25
Tyr Arg Glu His Arg Ser Glu Leu
1 5
<210> 26
<211> 19
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 未知的描述:
IDH3反应位点肽
<400> 26
Ser Thr Thr Thr Asp Phe Ile Lys Ser Val Ile Gly His Leu Gln Thr
1 5 10 15
Lys Gly Ser
<210> 27
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 27
Cys Gly Val Asn His Glu Lys Tyr Asp Asn Ser Leu Lys
1 5 10
<210> 28
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
肽
<400> 28
Cys His Gln Val Val Ser Ser Asp Phe Asn Ser Asp Thr
1 5 10
<210> 29
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (13)..(13)
<223> 磷酸-Thr
<220>
<221> MOD_RES
<222> (15)..(15)
<223> 磷酸-Tyr
<400> 29
Val Ala Asp Pro Asp His Asp His Thr Gly Phe Leu Thr Glu Tyr Val
1 5 10 15
Ala Thr Arg
<210> 30
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (13)..(13)
<223> 磷酸-Thr
<220>
<221> MOD_RES
<222> (15)..(15)
<223> 磷酸-Tyr
<400> 30
Ile Ala Asp Pro Glu His Asp His Thr Gly Phe Leu Thr Glu Tyr Val
1 5 10 15
Ala Thr Arg
<210> 31
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (7)..(7)
<223> 磷酸-Ser
<400> 31
Arg Ala Gly Gly Glu Glu Ser Gln Phe Glu Met Asp Ile
1 5 10
<210> 32
<211> 31
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (17)..(17)
<223> 磷酸-Thr
<400> 32
Val Val Leu Gly Asp Gly Val Gln Leu Pro Pro Gly Asp Tyr Ser Thr
1 5 10 15
Thr Pro Gly Gly Thr Leu Phe Ser Thr Thr Pro Gly Gly Thr Arg
20 25 30
<210> 33
<211> 31
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (26)..(26)
<223> 磷酸-Thr
<400> 33
Val Val Leu Gly Asp Gly Val Gln Leu Pro Pro Gly Asp Tyr Ser Thr
1 5 10 15
Thr Pro Gly Gly Thr Leu Phe Ser Thr Thr Pro Gly Gly Thr Arg
20 25 30
<210> 34
<211> 31
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (17)..(17)
<223> 磷酸-Thr
<220>
<221> MOD_RES
<222> (26)..(26)
<223> 磷酸-Thr
<400> 34
Val Val Leu Gly Asp Gly Val Gln Leu Pro Pro Gly Asp Tyr Ser Thr
1 5 10 15
Thr Pro Gly Gly Thr Leu Phe Ser Thr Thr Pro Gly Gly Thr Arg
20 25 30
<210> 35
<211> 37
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (17)..(17)
<223> 磷酸-Thr
<400> 35
Val Val Leu Gly Asp Gly Val Gln Leu Pro Pro Gly Asp Tyr Ser Thr
1 5 10 15
Thr Pro Gly Gly Thr Leu Phe Ser Thr Thr Pro Gly Gly Thr Arg Ile
20 25 30
Ile Tyr Asp Arg Lys
35
<210> 36
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(5)
<223> 氨基甲酰甲基半胱氨酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(8)
<223> 磷酸-Ser
<400> 36
Phe Leu Met Glu Cys Arg Asn Ser Pro Val Thr Lys Thr Pro Pro Arg
1 5 10 15
<210> 37
<211> 42
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(5)
<223> 氨基甲酰甲基半胱氨酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(8)
<223> 磷酸-Ser
<400> 37
Phe Leu Met Glu Cys Arg Asn Ser Pro Val Thr Lys Thr Pro Pro Arg
1 5 10 15
Asp Leu Pro Thr Ile Pro Gly Val Thr Ser Pro Ser Ser Asp Glu Pro
20 25 30
Pro Met Glu Ala Ser Gln Ser His Leu Arg
35 40
<210> 38
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(5)
<223> 氨基甲酰甲基半胱氨酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (13)..(13)
<223> 磷酸-Thr
<400> 38
Phe Leu Met Glu Cys Arg Asn Ser Pro Val Thr Lys Thr Pro Pro Arg
1 5 10 15
<210> 39
<211> 42
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(5)
<223> 氨基甲酰甲基半胱氨酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (13)..(13)
<223> 磷酸-Thr
<400> 39
Phe Leu Met Glu Cys Arg Asn Ser Pro Val Thr Lys Thr Pro Pro Arg
1 5 10 15
Asp Leu Pro Thr Ile Pro Gly Val Thr Ser Pro Ser Ser Asp Glu Pro
20 25 30
Pro Met Glu Ala Ser Gln Ser His Leu Arg
35 40
<210> 40
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (3)..(3)
<223> 磷酸-Thr
<400> 40
Ser Thr Thr Pro
1
<210> 41
<211> 20
<212> PRT
<213> 智人
<400> 41
Arg Asn Ser Pro Glu Asp Lys Arg Ala Gly Gly Glu Glu Ser Gln Phe
1 5 10 15
Glu Met Asp Ile
20
<210> 42
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (3)..(3)
<223> 磷酸-Ser
<400> 42
Arg Asn Ser Pro Glu Asp Lys Arg Ala Gly Gly Glu Glu Ser Gln Phe
1 5 10 15
Glu Met Asp Ile
20
<210> 43
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<220>
<223> N-term Ac
<220>
<221> MOD_RES
<222> (15)..(15)
<223> 磷酸-Tyr
<400> 43
Met Glu Asn Phe Gln Lys Val Glu Lys Ile Gly Glu Gly Thr Tyr Gly
1 5 10 15
Val Val Tyr
<210> 44
<211> 5
<212> PRT
<213> 智人
<400> 44
Pro Lys Glu Ala Pro
1 5
<210> 45
<211> 5
<212> PRT
<213> 智人
<400> 45
Pro Lys Pro Ala Pro
1 5

Claims (29)

1.一种微球阵列，所述微球阵列包含第一反应位点和第二反应位点，所述第一反应位点和第二反应位点中的每个均包含微球和捕获剂，所述捕获剂的每个均包含抗体，所述第一反应位点的捕获剂不同于所述第二反应位点的捕获剂，
其中
所述第一反应位点的捕获剂特异性识别表位并特异性结合第一靶标和第二靶标，
所述第二反应位点的捕获剂特异性识别所述第一反应位点的捕获剂不能识别的表位，和
所述第一靶标和所述第二靶标中的每个：(i)含有由所述第一反应位点的捕获剂识别的表位，(ii)是蛋白质化合物，并且(iii)具有低于5000Da的分子量，所述第一靶标的分子量不同于所述第二靶标的分子量。
2.根据权利要求1所述的微球阵列，其中所述微球阵列含有特异性识别天然存在的蛋白质序列中的不同表位的不同捕获剂，所述不同捕获剂与不同微球缔合。
3.根据权利要求1所述的微球阵列，其中所述微球阵列含有特异性识别天然存在的蛋白质的不同蛋白水解片段的不同捕获剂，所述不同蛋白水解片段共同占所述蛋白质的序列长度的20％以上，所述不同捕获剂与不同微球缔合。
4.根据权利要求1所述的微球阵列，其中所述微球阵列含有不同捕获剂，其分别识别天然存在的蛋白质的蛋白水解片段内的不同非重叠表位，所述不同捕获剂与不同微球缔合。
5.根据权利要求1所述的微球阵列，其中由所述第一反应位点的捕获剂识别的所述表位天然存在于人蛋白质和小鼠蛋白质中。
6.根据权利要求1所述的微球阵列，其中由所述第一反应位点的捕获剂识别的所述表位天然存在于第一蛋白质和第二蛋白质中，并且其中被所述第二反应位点的捕获剂识别的所述表位天然存在于所述第一蛋白质中而不存在于所述第二蛋白质中。
7.根据权利要求1所述的微球阵列，其中由所述第一反应位点和所述第二反应位点的捕获剂识别的所述表位缺乏被胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶识别的蛋白水解切割位点。
8.根据权利要求1所述的微球阵列，其中由所述第一反应位点的捕获剂识别的所述表位缺乏被胰蛋白酶识别的蛋白水解切割位点，并且其中所述第二反应位点的捕获剂识别的所述表位含有所述蛋白水解切割位点。
9.根据权利要求1所述的微球阵列，其中由所述第一反应位点的捕获剂识别的所述表位缺乏翻译后修饰(PTM)，并且其中所述第一靶标和第二靶标之一包含PTM。
10.根据权利要求1所述的微球阵列，其中由所述第一反应位点的捕获剂识别的所述表位含有第一PTM，并且其中所述第一靶标和所述第二靶标中的至少一个进一步含有第二PTM，所述第二PTM位于所述表位之外，所述第一PTM是磷酸化，所述第二PTM是乙酰化、甲基化、糖基化、泛素化和类泛素化中的一种。
11.根据权利要求1所述的微球阵列，其中所述第一反应位点和第二反应位点的捕获剂在测定中也特异性识别它们相应的表位，所述测定是蛋白质印迹、酶联免疫吸附测定(ELISA)、流式细胞术、免疫组织化学、免疫沉淀和免疫荧光中的至少一种。
12.根据权利要求1所述的微球阵列，其进一步包括所述第一反应位点的复制品，所述复制品包括与所述第一反应位点的捕获剂相同的捕获剂，其中包括在所述微球阵列中的所述复制品的数量少于10。
13.根据权利要求1所述的微球阵列，其中所述第一反应位点和第二反应位点缺乏位置和光学编码。
14.根据权利要求1所述的微球阵列，其中所述第一反应位点的所述微球具有大于6％的琼脂糖含量并且具有超过150微米的直径。
15.根据权利要求1所述的微球阵列，其中所述第一反应位点与包括2个不同值的组合相关联，所述2个不同值源自所述第一靶标的分子量和所述第二靶标的分子量，所述组合对于鉴定与所述第一反应位点的捕获剂特异性结合的靶标是必要且充分的。
16.一种用于进行亲和结合的方法，所述方法包括以下步骤：
使微球阵列与样品接触，所述微球阵列包括第一反应位点和第二反应位点，所述第一反应位点和第二反应位点的每个包括微球和捕获剂，所述捕获剂的每个均包括抗体，所述第一反应位点的捕获剂不同于所述第二反应位点的捕获剂，
将来自所述样品中的第一靶标和第二靶标结合到所述第一反应位点，其中所述第一靶标和第二靶标中的每个：(i)含有由所述第一反应位点的捕获剂识别的天然存在的表位，(ii))是蛋白质化合物，并且(iii)具有低于5000Da的分子量，所述第一靶标的分子量不同于所述第二靶标的分子量
和
将来自所述样品中的第三靶标结合至所述第二反应位点，所述第三靶标含有由所述第二反应位点的捕获剂识别但未由所述第一反应位点的捕获剂识别的表位。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述第一靶标、所述第二靶标和所述第三靶标包括天然存在的蛋白质的不同蛋白水解片段。
18.根据权利要求16所述的方法，其中所述第一靶标、所述第二靶标和所述第三靶标具有天然同位素丰度。
19.根据权利要求16所述的方法，其中由所述第一反应位点和第二反应位点的捕获剂识别的所述表位缺乏被至少两种消化酶识别的蛋白水解切割位点，所述至少两种消化酶选自胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶、内切蛋白酶Glu-C和内切蛋白酶Asp-N。
20.根据权利要求16所述的方法，其中所述第一靶标源自第一蛋白，并且所述第二靶标源自第二蛋白，所述第一蛋白和所述第二蛋白是不同生物途径的组成成分。
21.根据权利要求16所述的方法，其中所述第一靶标源自人蛋白质，并且所述第二靶标源自小鼠蛋白质。
22.根据权利要求16所述的方法，其中由所述第一反应位点的捕获剂识别的所述表位含有第一PTM，并且其中所述第一靶标和所述第二靶标中的至少一个进一步含有第二PTM，所述第一PTM的位点与所述第二PTM的位点相隔少于10个氨基酸。
23.根据权利要求16所述的方法，其中由所述第一反应位点的捕获剂识别的所述表位含有磷酸化位点，并且其中所述第一靶标和所述第二靶标中的至少一个进一步含有除磷酸化以外的PTM。
24.根据权利要求16所述的方法，其中由所述第一反应位点的捕获剂识别的所述表位含有至少2个PTM，并且其中所述第一靶标和所述第二靶标中的至少一个进一步含有另外的PTM，所述另外的PTM位于所述表位之外。
25.根据权利要求16所述的方法，其进一步包括将天然存在的蛋白质的不同片段结合至所述微球阵列的不同反应位点的步骤，所述不同片段共同占所述蛋白质的序列长度的20％以上。
26.根据权利要求16所述的方法，其进一步包括以下步骤：将天然存在的蛋白质的至少3个不同片段结合至所述微球阵列的不同反应位点，所述至少3个不同片段中的每一个含有PTM。
27.根据权利要求16所述的方法，其进一步包括以下步骤：使用线性模式飞行时间质谱法(TOF MS)检测所述第一靶标，并使用反射器模式TOF MS检测所述第二靶标。
28.根据权利要求16所述的方法，其中所述第一靶标和所述第二靶标需要不同的基质以便通过基质辅助激光解吸电离(MALDI)MS进行检测。
29.根据权利要求16所述的方法，其中所述微球阵列含有少于5个所述第一反应位点的复制品。
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