CN104640999A - 用于微阵列的组合编码方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种编码和解码微阵列的方法，所述微阵列用于检测在样品中一种或多种靶分析物的存在。本发明还公开了根据这些方法生产的微阵列和它们的用途。

Description

用于微阵列的组合编码方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2012年7月20日递交的英国专利申请No.1212902.9的优先权权益，为所有目的将其内容通过引用整体并入本文。
技术领域
本发明总体上涉及一种用于编码和解码微阵列的方法。本发明还涉及一种微阵列。
发明背景
微阵列是用于研究和临床环境(clinical setting)的诊断应用的重要工具。微阵列制造中的一个主要过程是将生物分子(如蛋白和DNA)以受控的方式构图至固相支持物上。在传统的微阵列中，通过点样技术将生物分子(如蛋白和DNA)直接引入至固相基底表面上。但是，点样技术精确度差和可重复性低导致产生带有众多不准确的微阵列。
另一方面，珠微阵列携带依次被缀合至生物分子的微珠。相比传统点样微阵列，珠微阵列具有显著优点，如一致性、灵活性和更快的动力学。珠微阵列提供更大的灵活性，因为可调整珠的表面化学以满足生物分子被缀合至珠上。潜在地，任何微阵列(如药物微阵列、代谢物微阵列、脂质微阵列或碳水化合物微阵列)可采用珠制备。此外，因为珠的尺寸可以被制成相同的，珠微阵列确保一致性的结果。
但是，珠微阵列的主要问题之一是，编码和解码单个珠以确定珠的身份和珠所携带的分子的类型。
目前，珠阵列通常以“液体阵列”或“平面阵列”的形式出现。在液体阵列中，珠保持在悬液中并通过物理标记(例如颜色标签)在基于流式细胞仪(如，VeraCodeTM分析(assays)，Illumina Inc.,San Diego,California,United States of America；和xMAPTM配准(referencing)，Luminex Corporation of Austin,Texas,United States of America)的分析过程中被读出并解码。
在平面阵列中，珠沉积于基底材料上并通常通过物理标记(例如颜色标签、寡核苷酸序列、珠形状和大小或其它方式)被识别。所述阵列通常采用显微镜或微阵列扫描仪通过采集图片进行分析。
两种方法均受制于需要针对每个微珠的物理标签以区别其表面上携带不同功能分子的不同珠群体。制备不同标签或具有所需大小的1000-100000种不同标签的标签文库是复杂的，并且迄今为止仅被部分地解决。目前，市售的是最大数量约500种标签的文库。此外，标签的使用增加了微阵列制造的复杂性和成本。标签还可能干扰分析物结合以及随后珠的读出。
因此，需要提供一种用于不需要标签的微阵列编码和解码的方法，所述方法克服或至少缓解上述一个或多个缺点。
还需要提供一种微阵列，其克服或至少缓解上述一个或多个缺点。
发明概述
根据第一个方面，提供一种编码微阵列的方法。所述方法包括a)将至少一个批次的颗粒沉积到微阵列的基底上，其中每个批次的颗粒包含至少两个子批次的颗粒，并且其中在沉积超过一个批次的颗粒的情况下每个批次的颗粒分别沉积，并且在沉积之后对所述微阵列上每个批次的颗粒采集图像，以识别每个批次的颗粒在所述微阵列上的位置，其中(i)在只有一个批次的颗粒沉积的情况下，每个子批次的颗粒的数量对该子批次的颗粒是独一无二的，这导致对于所述一个批次独一无二的颗粒数量比；或(ii)在至少两个批次的颗粒沉积的情况下，对于每个批次颗粒数量比是相同的或者互相不同；其中沉积在所述微阵列上的每个子批次的颗粒能够结合特异性的靶分析物，其中与各自批次的所有其它子批次相比，一个批次的每个子批次结合不同的靶分析物；以及b)记录关于一个或多个批次的颗粒的位置信息和在a)中针对根据该方法产生的每个微阵列所获得的一个或多个批次的颗粒数量比的信息；其中批次内的颗粒位置和颗粒数量比允许确定哪种靶分析物存在于要用该微阵列分析的测试样品中，或者在仅有一个批次沉积的情况下该批次的颗粒数量比允许确定哪种靶分析物存在于要用该微阵列分析的测试样品中。
根据第二个方面，本发明提供了解码通过上述方法获得的微阵列的方法。其中所述方法包括：a.分析从一个实体获得的图像，所述实体采用根据权利要求1中所述的微阵列进行筛选测试；其中所述图像的分析包括：(i)确定可检测信号的位置和数量或强度，所述可检测信号获取自所述靶分析物与沉积在所述微阵列上的颗粒的结合；以及(ii)通过将在(i)中所获得的信息与权利要求1的步骤b)中所记录的信息进行比较来对(i)中所获得的信息进行解码，以识别与所述微阵列的颗粒结合的靶分析物。
根据第三个方面，本发明提供了用于检测样品中一种或多种靶分析物的存在的微阵列，所述微阵列包含：
其上具有一个或多个用于与所述样品中存在的所述一种或多种靶分析物结合的结合位点的颗粒的阵列，其中所述颗粒阵列包含至少两个颗粒子集，每个子集具有针对一种或多种对该子集是独一无二的靶分析物的至少一个结合位点，并且其中每个子集的颗粒数量是已知的，并且每个子集的已知的颗粒数量用于产生颗粒子集的比值，以检测在该样品中两种或更多种靶分析物的存在。
在一个实施方案中，提供了如本文所述的微阵列，其中所述比值在100/1和1/1之间。
在另一个实施方案中，提供了如本文所定义的微阵列，其中所述比值在11/1和1/1之间。
在一个实施方案中，提供了如本文所定义的微阵列，其中所述比值是质数。
在另一个实施方案中，提供了如本文所定义的微阵列，其中每个子集的已知的颗粒数量对该子集是独一无二的。
在一个实施方案中，提供了如本文所定义的微阵列，其中当靶分析物结合颗粒的至少一个结合位点时每个颗粒发射可检测信号的变化。
在一个实施方案中，提供了如本文所定义的微阵列，其中所述颗粒的可检测信号的变化是光学信号。
在一个实施方案中，提供了如本文所定义的微阵列，其中一个子集的颗粒的结合位点仅结合一种靶分析物。
在一个实施方案中，提供了如本文所定义的微阵列，其中所述颗粒选自微珠和生物实体。
在一个实施方案中，提供了如本文所定义的微阵列，其中所述微珠具有选自以下形状：微球、微胶囊、微棒、微立方体和微管。
在一个实施方案中，提供了如本文所定义的微阵列，其中所述微珠由选自以下的材料形成：塑料、陶瓷、玻璃、金属、金属氧化物、二氧化硅、聚苯乙烯、甲基苯乙烯、丙烯酸聚合物、琼脂糖、纤维素、尼龙、交联的胶束、特氟龙、顺磁材料、氧化钍溶胶、碳石墨、二氧化钛、乳胶、交联的葡聚糖和用于肽、核酸和有机部分合成的组合物或其混合物如金属填充的聚合物颗粒。
在一个实施方案中，提供了如本文所定义的微阵列，其中所述生物实体选自：细胞、细菌或病毒颗粒。
在一个实施方案中，提供了如本文所定义的微阵列，其中所述颗粒大小为0.1-500μm、或0.1-200μm、或0.1-100μm、或1-100μm、或1-10μm。
在一个实施方案中，提供了如本文所定义的微阵列，其中每个颗粒包含一种或多种能够与一种或多种靶分析物结合的活性剂。
在一个实施方案中，提供了如本文所定义的微阵列，其中每个颗粒上一种或多种活性剂的结合位点数量是已知的，并用于产生结合位点的比值，以表明两种或更多种靶分析物的存在。
在又一个实施方案中，提供了如本文所定义的微阵列，其中所述颗粒包含能够检测至少两种靶分析物的至少两种活性剂，并且其中每个颗粒上的结合位点数量是已知的，并用于产生结合位点的比值，以表明所述样品中两种或更多种靶分析物的存在。
在另一个实施方案中，提供了如本文所定义的微阵列，其中所述活性剂是化学活性剂或生物活性剂。
在又一个实施方案中，提供了如本文所定义的微阵列，其中所述活性剂选自：肽、蛋白、核酸、代谢物、碳水化合物、酶、抗体、激素、凝集素、药物、农药(pesticide)、过敏原、抗原、受体、脂肪酸、寡肽、有机小分子、配位复合物、适体、细胞、细胞碎片、病毒颗粒、多糖、多核苷酸、脂质及其混合物。
在一个实施方案中，提供了如本文所定义的微阵列，其中所述颗粒用标识加标签。
在另一个实施方案中，提供了如本文所定义的微阵列，其中所述标识选自：荧光标签、条形码、化学标识、量子点、微结构、核酸标识、雕刻和射频标签。
在第四个方面中，提供了确定样品中一种或多种靶分析物的存在的系统，所述系统包括：
微阵列，其具有颗粒的阵列，所述颗粒上具有一个或多个用于与所述样品中存在的所述一种或多种靶分析物结合的结合位点，其中所述颗粒阵列包含至少两个颗粒子集，每个子集具有针对一种或多种对该子集是独一无二的靶分析物的至少一个共同的结合位点，并且其中每个子集的颗粒数量是已知的，并且每个子集的已知的颗粒数量用于产生颗粒子集的比值，以表明在该样品中两种或更多种靶分析物的存在；
检测器，其被配置为用于检测由所述颗粒发射的可检测信号的变化；
处理器，其被配置为基于在可检测信号中所检测到的变化对发射可检测信号的变化的颗粒计数，以确定对所述颗粒子集是独一无二的一种或多种靶分析物的存在或不存在。
在一个实施方案中，提供了如本文所定义的系统，还包括：
成像器，被配置为用于对所述微阵列成像；
存储器，被配置为用于基于由成像器获得的图像记录每个颗粒的位置；以及
其中所述处理器被配置为用于查询存储器，并将所记录的每个颗粒的位置与从检测器所接收的数据进行比较，以识别对所述颗粒子集是独一无二的一种或多种靶分析物的存在或不存在。
在又一个实施方案中，提供了如本文所定义的系统，其中当靶分析物结合颗粒的至少一个结合位点时，每个颗粒发射可检测信号的变化。
在另一个实施方案中，提供了如本文所定义的系统，其中所述颗粒的可检测信号的变化是光学信号。
在另一个实施方案中，提供了如本文所定义的系统，其中所述检测器是光学检测器。
在一个实施方案中，提供了如本文所定义的系统，其中所述比值在100/1和1/1之间。
在另一个实施方案中，提供了如本文所定义的系统，其中所述比值在11/1和1/1之间。
在另一个实施方案中，提供了如本文所定义的系统，其中所述比值是质数。
在又一个实施方案中，提供了如本文所定义的系统，其中每个子集的已知的颗粒数量对该子集是独一无二的。
在另一个实施方案中，提供了如本文所定义的系统，其中一个子集的颗粒的结合位点仅结合一种靶分析物。
在另一个实施方案中，提供了如本文所定义的系统，其中每个颗粒包含一种或多种能够与一种或多种靶分析物结合的活性剂。
在又一个实施方案中，提供了如本文所定义的系统，其中每个颗粒上一种或多种活性剂的结合位点数量是已知的并用于产生结合位点的比值以表明两种或更多种靶分析物的存在。
在又一个实施方案中，提供了如本文所定义的系统，其中所述颗粒包含能够检测至少两种靶分析物的至少两种活性剂，并且其中每个颗粒上活性剂的结合位点数量是已知的，并用于产生结合位点的比值，以表明所述样品中两种或更多种靶分析物的存在。
上述关于第一个至第三个方面所记载的进一步的特征也同样适用并因此在第四个方面重申。
在第五个方面中，提供了制备微阵列的方法，包括以下步骤：
i)提供至少两个子集的颗粒，所述颗粒上具有一个或多个用于与所述样品中存在的所述一种或多种靶分析物结合的结合位点，
ii)制备至少两个子集的颗粒的混合物，其中每个子集的颗粒数量是已知的，并且每个子集的已知的颗粒数量用于产生颗粒子集的比值，以表明样品中两种或更多种靶分析物的存在，
iii)将颗粒子集的混合物沉积至基底上以形成微阵列。
在一个实施方案中，提供了如本文所述的方法，还包括对其上具有沉积的颗粒的基底成像的步骤。
在另一个实施方案中，提供了如本文所定义的方法，还包括依次重复上面所定义的步骤。
在另一个实施方案中，提供了如本文所定义的方法，其中所述比值在100/1和1/1之间。
在另一个实施方案中，提供了如本文所定义的方法，其中所述比值在11/1和1/1之间。
在又一个实施方案中，提供了如本文所定义的方法，其中所述比值是质数。
在另一个实施方案中，提供了如本文所定义的方法，其中每个子集的已知的颗粒数量对该子集是独一无二的。
在又一个实施方案中，提供了如本文所定义的方法，其中每个子集的已知的颗粒数量对该子集是独一无二的。
在另一个实施方案中，提供了如本文所定义的方法，其中一个子集的颗粒的结合位点仅结合一种靶分析物。
在另一个实施方案中，提供了如本文所定义的方法，其中每个颗粒包含一种或多种能够与一种或多种靶分析物结合的活性剂。
在又一个实施方案中，提供了如本文所定义的方法，其中每个颗粒上一种或多种活性剂的结合位点的数量是已知的，并用于产生结合位点的比值，以表明两种或更多种靶分析物的存在。
在又一个实施方案中，提供了如本文所定义的方法，其中所述颗粒包含能够检测至少两种靶分析物的至少两种活性剂，并且其中每个颗粒上的结合位点的数量是已知的，并用于产生比值或颗粒数量比，以表明所述样品中两种或更多种靶分析物的存在。
在一个实施方案中，提供了如本文所定义的方法，其中所述基底选自：聚合材料、有机材料、无机材料、金属、陶瓷、塑料、橡胶、玻璃、纤维材料、石墨或硅、二氧化硅、氮化硅、改性硅、玻璃、改性的或功能化的玻璃、无机玻璃、塑料、丙烯酸树脂、聚苯乙烯、苯乙烯的共聚物、聚丙烯、聚乙烯、聚丁烯、聚氨酯、特氟龙、多糖、尼龙、硝酸纤维素、树脂、硅石、基于硅石的材料和碳。
上述关于第一个至第四个方面所记载的进一步的特征也同样适用并因此在第五个方面重申。
在第六个方面中，提供了用于确定样品中一种或更多种靶分析物的存在的方法，所述方法包括以下步骤：
将所述样品与颗粒的阵列接触，所述颗粒上具有一个或多个用于与所述样品中存在的所述一种或多种靶分析物结合的结合位点，当靶分析物结合颗粒的至少一个结合位点时所述颗粒发射可检测信号的变化，其中所述颗粒阵列包含至少两个颗粒子集，每个子集具有针对一种或多种对该子集是独一无二的靶分析物的至少一个结合位点，并且其中每个子集的颗粒数量是已知的；
检测由颗粒发射的可检测信号的变化；以及
基于在可检测信号中所检测到的变化对发射可检测信号的变化的颗粒的数量计数，以确定对所述颗粒子集是独一无二的一种或多种靶分析物的存在或不存在。
在又一个实施方案中，提供了如本文所定义的方法，还包括以下步骤：
检测由颗粒发射的可检测信号的变化幅度；以及
基于可检测信号的变化确定已经结合至靶分析物的位点数量，以确定对所述颗粒子集是独一无二的一种或多种靶分析物的存在或不存在。
在一个实施方案中，提供了如本文所定义的方法，还包括以下步骤：
对微阵列成像；
基于所获得的图像记录每个颗粒的位置；以及
将可检测信号中所检测到的变化与每个颗粒所记录的位置进行比较，以识别对所述颗粒子集是独一无二的一种或多种靶分析物的存在或不存在。
在一个实施方案中，提供了如本文所定义的方法，还包括以下步骤：
基于颗粒子集仅当与特定试剂接触时发射可检测信号的变化，将颗粒与该试剂接触以识别对所述颗粒子集是独一无二的一种或多种靶分析物的存在或不存在。
在另一个实施方案中，提供了如本文所定义的方法，其中所述试剂是荧光标记的结合分子、或抗体、或受体、或适体。
在一个实施方案中，提供了如本文所定义的方法，其中所述可检测信号是光学信号。
在一个实施方案中，提供了如本文所定义的方法，其中所述靶分析物是无机分子或有机分子。
在另一个实施方案中，提供了如本文所定义的方法，其中所述靶分析物是选自：环境污染物、化学品、生物分子、全细胞、细菌、病毒和孢子。
在一个实施方案中，提供了如本文所定义的方法，其中所述环境污染物是选自：农药(pesticide)、杀虫剂(insecticide)和毒素。
在一个实施方案中，提供了如本文所定义的方法，其中所述化学品选自：溶剂、聚合物和有机材料。
在一个实施方案中，提供了如本文所定义的方法，其中所述生物分子选自：激素、细胞因子、蛋白、核酸、脂质、过敏原、碳水化合物、酶、抗体、抗原、细胞膜抗原和受体或它们的配体。
在一个实施方案中，提供了如本文所定义的方法，其中所述全细胞选自：真核细胞、原核细胞、哺乳动物细胞、肿瘤细胞、血细胞、上皮细胞、神经细胞和肌肉细胞。
在一个实施方案中，提供了如本文所定义的方法，其中所述病毒选自：逆转录病毒、疱疹病毒、腺病毒和慢病毒。
在一个实施方案中，提供了如本文所定义的方法，其中标识被加至靶分析物。
在另一个实施方案中，提供了如本文所定义的方法，其中所述标识选自：荧光标签、条形码、化学标识、量子点、微结构、核酸标识、雕刻和射频标签。
在又一个实施方案中，提供了如本文所定义的方法，其中所述标识与靶分析物直接缀合或通过接头分子的方式与靶分析物间接缀合。
上述关于第一个至第五个方面所记载的进一步的特征也同样适用并因此在第六个方面重申。而且，上述关于第五个方面所记载的进一步的特征也同样适用并因此在第一个至第三个方面重申。
定义
本文所使用的以下词语和术语应当具有如下所示的含义：
本文所使用的术语“组合(combinatory)编码”或“组合(combination)编码”是指所公开的微阵列的编码和解码过程。
本文所使用的术语“微阵列”或“阵列”是指固相支持物上的颗粒的阵列，其中每个颗粒具有选定的、能够与特异性靶分析物结合的活性剂。在其它例子中，活性剂能够与超过一种靶分析物结合。
术语“颗粒”是指纳米颗粒或微颗粒。在一个例子中，颗粒具有的颗粒大小为在微米大小的范围内、或从0.1微米至大约1000微米、或从1微米至500微米。在一个实施方案中，当颗粒在形状上基本上呈球形时，颗粒大小是指颗粒的直径，其是在微米大小的范围中。当颗粒是球形的，所述“颗粒”则被称为“珠”，例如纳米珠或微珠。在另一个实施方案中，其中颗粒并不具有球形的形状，颗粒大小可以是指相当于球形颗粒的颗粒的等效直径或可以是指非球形颗粒的尺寸(长度、宽度、高度或厚度)。
本文所使用的术语“子批次”或“子集”是指相同种类并在其表面上携带相同生物识别分子或“活性剂”的颗粒。子批次或子集的珠互相相同并通过它们表面上的活性剂与相同的靶分析物结合。
本文所使用的术语“批次”是指由两个或更多个子批次形成的多个颗粒。子批次的珠数量比或比值可以相等和/或不同。
本文所使用的术语“超级批次”是指由两个或更多个批次形成的多个颗粒。批次的珠数量比或比值可以相等和/或不同。
本文所使用的术语“群体”是指沉积在微阵列上的颗粒的总集合。
本文所使用的术语“多个颗粒”是指大于1的任意数量的颗粒；通常为大量颗粒。
术语“已知”是指固定的或预先确定的数量。例如，子集中的颗粒的数量可以是固定的或预定的，或每个颗粒上结合位点的数量可以是固定的或预定的。
本文所使用的术语“编码”是指子批次、批次或超级批次中微珠的识别，以确定微珠所携带的“活性剂”或微珠所检测的分析物。
术语“锁定接合(lockingly engaged)”或其语法变体是指珠稳定沉积至表面上；其中珠在其它珠沉积和进行生物测定的过程中将保持其在基底上的空间位置。
术语“活性剂”是指任何具有化学活性的化学剂或具有生物活性的生物剂，并且其能够结合或者与靶分析物或结合靶分析物的媒介物进行反应。活性剂可以显示化学活性并可能包含环境污染物如有机材料(例如脂族烃化合物、含芳族的化合物和氯化的化合物)或无机材料(例如金属和硝酸盐)；化学战剂(例如神经毒剂如沙林、梭曼、塔崩和环沙林，血剂如胂和氰化氢，或催泪剂如催泪瓦斯和胡椒喷雾)；除草剂；农药(pesticide)；代谢物；药物；脂质、碳水化合物或化学催化剂。活性剂可以显示生物活性,并可以在说明书中指“生物活性剂”。
示例性生物活性剂包括蛋白、抗体、寡肽、有机小分子、配位复合物、适体、细胞、细胞碎片、病毒颗粒、抗原、多糖、脂质和多核苷酸，其可被粘附或结合至颗粒。因此，术语“生物活性颗粒”是指本文所定义的具有活性剂的颗粒，所述活性剂具有生物活性或本身是生物活性的。
术语“化学活性颗粒”是指上述所定义的具有活性剂的颗粒，所述活性剂具有化学活性。术语“活性剂”还可以是指显示物理活性的药剂，如以预定的方式响应物理刺激，包括诸如激发时发射光、在电磁辐射或微波的吸收时排放热量的过程。
术语“靶分析物”是指能够结合活性剂的待检测物质。靶分析物还可以是用于校准目的的待检测物质。示例性靶分析物包括但不限于，核酸、多核苷酸、药物、激素、蛋白、酶、抗体、碳水化合物、受体、细菌、细胞、病毒颗粒、孢子、脂质、过敏原和抗原。靶分析物可以用标签直接或间接标记以产生信号。通常的但不是限制性的标签是：荧光标签、染料、量子点、颗粒、酶、电化学活性化合物或其它信号产生实体。
术语“特异性结合物质”可以指对某种物质具有特异性亲和力的物质。例如，在样品中的靶分析物可以能够与活性剂进行特异性结合反应。特异性的物质与特异性结合物质的组合的例子包括：抗原与相应的抗体分子、核酸序列与其互补序列、效应子分子与受体分子、酶与抑制剂、激活剂或底物、含有糖链的化合物与凝集素、适体与其结合配体、抗体分子与特异性针对前者抗体的另一种抗体分子、受体分子与相应的抗体分子等组合。特异性结合物质的其它例子包括已被化学改性的程度为其特异性结合活性仍然保持完整的化合物，和化合物结合其它成分的复合体。这种类型的特异性结合物质与特异性物质的组合的例子包括：生物素化学改性的抗体分子或多核苷酸与抗生物素蛋白、抗生物素蛋白结合的抗体分子与生物素等组合。
术语“结合位点”是指特异性结合物质或活性剂的区域或结构域，其能够与靶分析物结合。
术语“试剂”(regent/regeats)是指特异性检测一种靶分析物的物质或物质的混合物。通常，试剂是荧光标记的结合分子、抗体、受体或适体。试剂可以被混合以制备用于检测超过一种靶分析物的试剂。
本文所使用的术语“蛋白”可以定义为两个或更多个共价键合的氨基酸，其包括蛋白、多肽、寡肽和肽。
本文所使用的术语“氨基酸”和“肽”分别是指天然存在和合成的氨基酸和氨基酸链。
术语“基本上”并不排除“完全”，例如“基本上不含”Y的组合物可以完全不含Y。必要时，词语“基本上”可以从本文的定义中删除。
除非另有说明，术语“包含/包括(comprising)”和“包含/包括(comprise)”及其语法变体旨在表示“开放式”或“包含(inclusive)”语言，使得它们包括(include)所记载的元素但也允许包括额外的、未记载的元素。
本文所使用的术语“大约”，在制剂成分的浓度的上下文中，通常是指所述值的+/-5％，更通常地是指所述值的+/-4％，更通常地是指所述值的+/-3％，更通常地是指所述值的+/-2％，甚至更通常地是指所述值的+/-1％，以及甚至更通常地是指所述值的+/-0.5％。
本文整个公开内容中，某些实施方案可以以范围的形式进行公开。应当理解的是，范围形式的描述仅仅是为了方便和简洁，不应被解释为对所公开范围的保护范围的硬性限制。因此，范围的描述应当被认为已经具体公开了所有可能的子范围以及在该范围内的单个数值。例如，如从1至6的范围的描述应当被认为是具有具体公开的子范围，如从1至3、从1至4、从1至5、从2至4、从2至6、从3至6等等，以及在该范围内的单个数字，例如1、2、3、4、5和6。不管范围的宽度这个皆适用。
在本文中，某些实施方案还可以被广泛地和一般性地描述。每个落在属的公开范围内的更窄的种和亚属分组也构成本文公开内容的一部分。这包括实施方案的属的描述，所述实施方案具有从该属中去除任何主题的条件或负面的限制，不管所去除的材料是否在本文中具体地描述了。
发明详述
现在将公开本文的示例性的、非限制性实施方案。
在一个例子中，描述了一种编码微阵列的方法。该方法可以在第一个步骤中包括在微阵列上沉积至少一个批次的颗粒，其中每个批次的颗粒包含至少两个子批次的颗粒。在沉积超过一个批次的颗粒的情况下，每个批次的颗粒分别沉积，并且在沉积之后对所述微阵列上的每个批次的颗粒采集图像，以识别每个批次的颗粒在所述微阵列上的位置。在只有一个批次的颗粒沉积的情况下，每个子批次的颗粒的数量对该子批次的颗粒是独一无二的，这导致对于所述一个批次独一无二的颗粒数量比。在另一个例子中，在至少两个批次的颗粒沉积的情况下，对于每个批次颗粒数量比是相同的或者互相不同。沉积在所述微阵列上的每个子批次的颗粒能够结合特异性的靶分析物，其中与各自批次的所有其它子批次相比或与所沉积的所有批次的所有其它子批次相比，一个批次的每个子批次结合不同的靶分析物。此外，所述方法可以包括记录关于一个或多个批次的颗粒的位置信息和在根据该方法产生的每个微阵列之前所获得的针对一个或多个批次的颗粒数量比的信息。颗粒的位置和批次内的颗粒数量比允许确定哪种靶分析物存在于要用该微阵列分析的测试样品中，或者在仅有一个批次沉积的情况下，该批次的颗粒数量比允许确定哪种靶分析物存在于要用该微阵列分析的测试样品中。
在另一个例子中，本文提供了解码通过上述的方法获得的微阵列的方法。该方法可以在第一个步骤中包括分析从一个实体获得的图像，所述实体采用根据本文所述的微阵列进行筛选测试。所述图像的分析可以包括确定可检测信号的位置和数量或强度，所述可检测信号获取自所述靶分析物与沉积在所述微阵列上的颗粒的结合。它还可以包括通过将上述所获得的信息与从所述微阵列所记录的信息进行比较，以识别与所述微阵列的颗粒结合的靶分析物，从而对上述所获得的信息进行解码。
在另一个例子中，本文公开了用于解码珠微阵列的方法，其不依赖于物理标签或标记，从而确定每个单独的微珠的身份，其中所述珠微阵列是通过珠批次的单独沉积形成的，并且其中所述珠批次是从至少三个子批次的珠预混合的，并且其中所述子批次的珠具有不同的珠数量比以互相区分子批次的珠，并且每个子批次的珠在其表面上携带不同的结合配体以检测不同分析物，并且其中在其各自分析物存在的情况下所述子批次的珠产生光学信号，并且产生光学信号的该子批次的珠的身份通过将产生光学信号的珠与未产生光学信号的珠进行比较的珠数量比来进行解码。如本文所公开的，单个珠的身份只有通过分析源自多个珠的信号来进行解码；相比而言现有技术仅教导通过携带物理标识的自我解码的珠来进行珠的识别。该解码信息存在于多个珠中，而不是存在于每个单独珠中。
有利地，在另一个例子中，提供了用于检测样品中一种或多种靶分析物的存在的微阵列，所述微阵列包含：
其上具有一个或多个用于与所述样品中存在的所述一种或多种靶分析物结合的结合位点的颗粒的阵列，当靶分析物结合颗粒的结合位点时所述颗粒发射可检测信号的变化，其中所述颗粒阵列包含至少两个颗粒子集，每个子集具有针对一种或多种对该子集是独一无二的靶分析物的共同的结合位点，并且其中每个子集的颗粒数量是已知的。
多个颗粒可以存在于一个或多种批次中，使得每个批次的颗粒可以包含多个子批次(或子集)的颗粒。
所述可检测信号可以是光学信号。
有利地，所公开的方法可以允许通过以下的组合来编码和解码微阵列：(i)基于存在于构成该特定批次的每个子批次中的颗粒的具有不同颗粒数量比的批次颗粒的沉积，和(ii)与存在于所述子批次或批次颗粒中的已知并且预定的一种或多种靶分析物反应的试剂或试剂混合物的使用。
如果沉积超过一个批次，每个批次沉积之后，可以采集微阵列的图像以捕获该批次的颗粒在微阵列中的位置。当前微阵列的图像将‘扣除’之前微阵列的图像，使得获取每个批次的精确图像，而不是累计批次的图像。通过了解构成每个批次的颗粒的位置，可以确定与靶分析物反应的确切批次。
可以预先确定基于构成该批次的每个子批次的颗粒数量的颗粒比。通过了解颗粒比，可以确定与靶分析物反应的确切子批次。例如微阵列的批次的颗粒比(也称为颗粒数量比)是5/3/1。根据该比5/3/1，该批次的三个子批次的每一个包括不同量的颗粒或珠，其中5代表子批次1，3代表子批次2，并且1代表子批次3。例如分别为500颗珠、300颗珠和100颗珠。现在，将样品与该微阵列接触，所述微阵列被怀疑包含能够与三个不同子批次的活性剂结合的靶分析物。所测量的信号等于400。这将意味着该样品包含所述靶分析物，所述靶分析物以比5/3/1特异性结合该批次的子批次2和3。
因此，由于所使用的试剂是特异性针对与活性剂结合的靶分析物，通过了解从以上确定的确切批次和子批次，可以识别靶分析物，并且无需使用物理标签或与颗粒连接的标识即可解码微阵列。
通常，但不限于，结合至颗粒的活性剂可以是抗体(捕获抗体)，靶分析物是相应的抗原，并且试剂是荧光标记的抗体(检测抗体)，从而形成三明治免疫测定。颗粒群体及其相应的靶分析物通过解码荧光信号并采用所公开的组合编码方法来进行识别。因为珠批次是通过带有相同荧光团的针对所有珠批次的组合编码试剂来进行识别的，来自所有珠批次的荧光信号可以通过单独波长来进行测量。
如果采用一个批次，不必对所述微阵列成像，并且采用组成上述示例性批次的各种子批次的颗粒比可对所述微阵列进行解码。
更有利地，所公开的方法可以允许无需采用与颗粒粘附的物理标签或标识并且在光学测试的情况下仅采用单独波长对微阵列进行编码和解码。“无需采用物理标签或标识”意味着在由微阵列获得的信息的解码过程中，仅所测量的光学信号不足以确定哪个靶分析物存在于测试样品中。只有知道珠比(在微阵列上单独批次的情况下)或珠比和知道不同批次的每个珠的位置(在微阵列上包含超过一个批次的情况下)，允许识别哪个靶分析物被包含在所测试的样品中。
因此，所公开的方法可以克服现有技术相关的问题，例如在每个批次中对每个单独颗粒加标签并使用多个读出波长。
所公开的方法还克服了荧光团和用于对荧光团加标签的染料和用于信号产生的染料之间的干扰。因为不需要用于加标签的染料，复杂的光学测定(例如FRET测定)可以很容易地掺入本发明的珠中。
信号强度比之前用于识别珠批次。但是关于信号强度比的所有现有技术是基于掺入珠中的光学标记或标签的强度。例如，WO2011/127042教导了通过“多峰分布模式”的珠的识别，其定义为“以珠计数相对于标记强度绘制曲线的至少两种加标签的珠的数据集”，其中加标签的珠是指“任何粘附标记的珠，即独一无二的彩色珠…”。在WO2011/1270和US2003/0073086中所采用的微珠是自我编码的；珠的解码可以通过已经掺入单独珠的信息，通常是彩色编码。相比之下，本发明的信号强度比并不起源于预先掺入的标记或标签。本发明并不依赖于粘附至珠的物理标记，并且珠不是自我编码的。相反，这些解码信息是包含在多个珠中而不是在每个单独的珠中。仅通过观察多个珠，通常是成百上千的珠，并确定多个珠的信号强度比，子批次的珠可以被解码。
如上所述，可以在每个批次沉积之后对微阵列成像，以确定在每个沉积步骤之后所有加入的颗粒的空间位置。通过图像分析确定一个特定批次“M”的所有颗粒的位置；其中之前的图像“M-1”被从当前图像“M”扣除。以这种方式，产生具有批次“M”的所有颗粒的位置的数据表格。批次“M”是由子批次“m”至“m+x”的混合物形成；其中“x+1”是“M”的子批次的总数。形成批次“M”的子批次具有不同的颗粒数量比。在进行生物测定之后，通过颗粒信号的分析确定子批次颗粒的身份，并通过所有批次“m”至“m+x”的已知颗粒比进行编码，其中x通常是但不限于在1和10之间，即，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。由此，可以以单独沉积批次的形式确定一些高达“x+1”的靶分析物，所述批次不必采用物理标签或标识来确定哪种靶分析物结合至颗粒。超过一个批次可以依次沉积，并在每次沉积之后成像。例如，一个典型的批次可以由5个子批次组成，以允许从单个的颗粒沉积步骤分析5种不同的靶分析物。
可以通过依次的试剂孵育将如上所述的颗粒的解码进行组合来提高来自可被编码的单个沉积批次的子批次的颗粒数量。第一个批次“M1”是由子批次“m1，1”至“m1，1+x1”的混合物形成；其中“x1+1”是“M1”的子批次的总数。然后，第二个批次“M2”是由子批次“m2，1”至“m2，1+x2”的混合物形成；其中“x2+1”是“M2”的子批次的总数。可以形成另外的批次“M2”至“Mn”以产生总数“n+1”的批次；其中“n”通常是但不限于1至10，即，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。在所有批次“M”至“Mn”中，子批次例如“m1”至“m1，1+x”是通过采用针对每个子批次的不同的颗粒比形成的。例如，可以采用针对四个子批次的比10/5/2/1。
基于该比可知，形成了批次，其包含与最后一个子批次相比10倍多的第一个子批次颗粒，和与最后一个子批次相比其包含5倍多的第二个子批次颗粒，和与最后一个子批次相比2倍多的第三个子批次颗粒。然后，批次“M”至“Mn”一起混合形成超级批次“S1”。沉积该超级批次并成像以确定超级批次的所有珠的空间位置。形成了相应于每个批次“M1”至“Mn”的一组试剂“R1”至“Rn”，其中例如“R1”包含检测批次的所有子批次所需的所有试剂。
通过依次应用试剂进行珠的解码。首先，将从超级批次“S1”的单个沉积形成的微阵列与样品接触以引起分析物与颗粒上其各自活性剂的结合。然后，施加试剂“R1”，并且如果各自分析物存在于样品中仅针对珠“m1，1”至“m1，1+x1”产生信号。因为在任何给定微阵列区域中沉积的颗粒总数是已知的，并且子批次的颗粒数量比是已知的，产生信号的颗粒可以被解码。
以这种方式，通过每个编码具有不同颗粒数量比的颗粒的5个子批次的3种试剂“R1至R3”的依次孵育，可以编码并检测总共例如15种分析物。应当注意的是，只进行一个颗粒沉积和一个成像步骤。
最优选地，质数颗粒比如11/7/5/3/1用于更强大的批次识别。
优选地，每个子集的已知颗粒数量对该子集是独一无二的。
微阵列还可以由超过一个超级批次形成，其中产生了超级批次“S1”至“Sn”。超级批次“S1”至“Sn”被依次沉积，并在每次沉积步骤之后成像，以确定各自超级批次的所有颗粒的位置。
样品孵育之后，通过依次与试剂“R1”至“Rn”孵育对颗粒进行解码；其中“R1”包含编码在每个超级批次中第一个批次“M1”的所有颗粒的所有试剂；“R2”包含编码在每个超级批次中第二个批次“M2”的所有颗粒的所有试剂，等等。珠的总数“T”，其可以通过这个方法编码：T＝批次的数量x子批次的数量x超级批次的数量。
还应当指出的是，可以形成具有不同数量的子批次、批次和超级批次以及不同颗粒比的其它微阵列，并且不限于上面的那些具体的例子。
将被编码的可能的靶分析物的数量，可以通过采用两个或更多个不同批次的同样子批次来进一步增加，并且那些批次依次沉积，以确定该批次中所有颗粒的空间位置。可以通过一个非限制性的例子来最好地公开这种高级组合编码方法。例如，制备6个批次“M1”至“M6”。每个批次由多个子批次“SB1”至“SBx”组成。现在，批次以如下的方式形成；产生批次中子批次的不同组合，例如，子批次SB1仅存在于批次M1中；子批次SB2存在于批次M1和M2中；子批次SB3存在于批次M1、M2和M3中；子批次SB4存在于批次M4中；子批次SB5存在于批次M2和M3中；子批次SB6存在于批次M2、M3和M4中；子批次SB7存在于批次M4和M5中；子批次SB8存在于所有批次中；等等。因此，批次M1包含SB1、SB2、Sb3和SB8；批次M2包含SB2、SB3、SB5、SB6和SB8；批次M3包含SB3、SB5、SB6和SB8；批次M4包含SB4、SB6、SB7和SB8；批次M5包含SB7和SB8；以及批次M6仅包含SB8。当达到批次中的子批次的每个组合时，达到最高编码数量。子批次组合全部是已知的，并且批次的所有颗粒的空间位置是已知的。通过采用单独的样品和试剂孵育，可以解码所有颗粒。例如，如果信号仅在批次M1、M2和M3中产生，那么存在相应于子批次SB3的颗粒的分析物。
该方法可以采用不同的颗粒数量比进一步组合以更好地互相区分子批次。采用这个强大的组合编码方法，可以编码非常大量的每个都检测不同分析物的不同子批次，可以用更少量的颗粒沉积步骤产生具有高度多重能力(high multiplex capabilities)的微阵列。
本发明的优选实施方案是采用Landau函数与质数珠比例组合，其中目的是对于给定的珠批次的数量，使珠子批次的数量最大化，以减少所需的颗粒沉积步骤的数量。对于给定的珠子批次‘n’的数量，批次以这样的方式分区，使得在珠批次的子组中没有珠子批次出现超过一次。每个子批次在珠批次的子组中仅出现一次的珠批次的最可能的分区用Landau函数g(n)表示。它定义每个自然数n为对称组Sn的元素的最大阶。等价地，g(n)是n的任意分区的最大最小公倍数(LCM)，或倍数的最大数量，在排列返回其起始序列之前，n个元素的排列可以递归地应用于其本身。
例如，5＝2+3，并且LCM(2,3)＝6。没有其它的5的分区可以获得更大的LCM，因此g(5)＝6。在组S5中的6阶元素可以写成循环符号如(1 2)(3 4 5)。
如果可以发现“s”个组合的比例，这样每个比例是独一无二的，并且比例的总和对所有可能的组合也是独一无二的。那么，通过沉积采用比例c*s的珠子批次，可以采用珠批次相同的数量编码珠子批次。对于例如n＝13，如果第一个珠子批次被编码在珠批次1和7中，那么我们预计第43个珠子批次也将被编码至珠批次1和7中(参见下表1)。以这样的方式，如果批次1的珠被编码在具有特定比例的珠池中，而批次43的珠被编码入不同比例的同样的两个池中，基于该比例仍然可以实现解码。有利地，使用质数比，这样比例的总和永远不会等于另一个比值，例如1：2：3：5 2+3加至高达5，这样的组合应当会被避免，并且相反可以按照如下1：3：5：7：11的比例，等等。
通过池化(Pooling)来解码
LCM＝6*7＝42(因为我们在6和7的子组中分了13个组)
表1—如何将通过固定的批次数量编码的珠子批次的数量最大化的例子。
通过在超过仅一对珠批次中沉积每个珠子批次还可进一步增加可被独一无二地编码的珠子批次的数量。例如，对于n＝20，在3个珠批次中沉积每个珠子批次，一个可能的值可能是c＝LCM(5,7,8)＝280。一般地，对于n个珠批次，并且如果将每个珠子批次沉积于k个珠批次中，那么，该独一无二的数量是c＝LCM(m1.m2.m3....mk)，这样m1+m2+m3+....+mk＝n。
应当注意的是，所公开的方法并不采用任何物理标签或标识，并仅依赖于组合编码/解码。批次中子批次的排列提供了所公开的方法的微阵列的解码密钥，并且只有解码密钥的持有者能够利用分析信息。
上述组合方法还进一步在下面的实施例1至6中进行阐述。需要注意的是，可以将不同的组合方法组合以实现更高级的编码。在这些实施例中给出的数量仅仅是为了说明的目的，并不代表对所述方法的限制。
颗粒可以是珠或生物实体例如细胞、细菌或病毒颗粒。在颗粒为微珠的实施方案中，微珠可以是不规则形状的微珠或规则形状的微珠。微珠还可以具有选自以下形状：微球、微胶囊、微棒、微立方体和微管。在一个实施方案中，微珠是微球。
微珠可以由选自由以下的材料形成：塑料、陶瓷、玻璃、金属、金属氧化物、二氧化硅、聚苯乙烯、甲基苯乙烯、丙烯酸聚合物、琼脂糖、纤维素、尼龙、交联的胶束、特氟龙、顺磁材料、氧化钍溶胶、碳石墨、二氧化钛、乳胶或交联的葡聚糖如琼脂糖、纤维素、尼龙、交联的胶束、特氟龙或具有用于肽、核酸和有机部分合成的相似的组合物或其混合物，例如，金属填充的聚合物颗粒。
将颗粒与微阵列的表面结合的方法是本领域已知的。在本发明中，认为颗粒可以例如通过接头粘附至微阵列的表面。也能够通过提供包含孔的砂粒(grit)将颗粒定位于微阵列的基底上。每个孔正好能够容纳一个颗粒。该方法可以与例如其中所述颗粒包括用于粘附至微阵列表面的接头的方法组合施用。
在颗粒为细胞的实施方案中，细胞可以是活细胞或死细胞。细胞颗粒可以作为包含单独细胞或一簇细胞的细胞悬液被施加，并通过上述任何方法沉积以产生细胞微阵列。
如果希望大的表面积，那么颗粒可以至少部分多孔的。对于多孔颗粒，要进行物理、化学、生化、酶或免疫测定的反应可以在颗粒表面和颗粒内部均进行。多孔颗粒可以具有由其孔隙度和通透性所控制的扩散性质，以排除不想要的分子或干扰分子，以免其扩散进入内部。多孔颗粒还可以具有扩散性质，以捕获活性剂如酶、抗体、DNA、细胞或试剂，使之不扩散出去并从而捕获或固定它们进入内部。因此，颗粒可以是至少部分多孔的或具有多孔的胶囊以允许希望的分析物通过进入颗粒内部。
所述颗粒可具有的颗粒大小范围为：大约0.1微米至大约500微米、或大约1微米至大约10微米的。每个颗粒可以包含至少一种活性试剂，其粘附至或掺入能够特异性结合至少一种靶分析物的颗粒结构内。在一个实施方案中，所述颗粒包含单独类型的活性剂。在另一个实施方案中，所述颗粒可以包含至少两种活性剂，每种药剂可以互相独立地为化学剂或生物活性剂。可以按已知的结合位点数量比提供该至少两种活性剂。
可粘附至颗粒的活性剂可以是有机化合物或无机化合物。有机活性剂可以包括，但不限于，肽、蛋白、核酸、代谢物、碳水化合物、酶、抗体、激素、凝集素、药物、农药(pesticide)、过敏原、抗原、受体、脂肪酸或其混合物。
蛋白可以是天然存在蛋白或人工合成的蛋白。蛋白可以获取自细胞提取物或自蛋白质的细胞提取物的随机或定向消化物。
核酸可以是天然存在的或人工合成的。核酸可以是单链或双链或同时含有双链或单链序列的部分。核酸可以是DNA、既是基因组又是cDNA、RNA或杂合体。
在粘附至颗粒之前可以通过常规化学、物理和生化方法修饰活性剂。
活性剂可以或者直接被合成于颗粒之上，或者它们被制备好了然后在合成之后粘附。在一个实施方案中，接头用于将活性剂粘附至颗粒，以提供更好的粘附，由于增加的灵活性改善与靶分子的相互作用，并减少不希望的或非特异性的结合。活性剂至颗粒上的粘附可以依赖于选自以下的化学相互作用：静电相互作用、离子键、共价键、氢键和偶极-偶极相互作用。在将活性剂粘附至颗粒之前，颗粒可以用化学反应性基团官能化以促进结合。
颗粒可以被置于基底支持物上。基底材料可以选自：合成的或天然存在的聚合材料、有机材料、无机材料、金属、陶瓷、塑料、橡胶、玻璃、纤维材料、石墨或硅。示例性的基底选自：硅、二氧化硅、氮化硅、改性硅、玻璃和改性的或功能化的玻璃、无机玻璃、塑料、丙烯酸树脂、聚苯乙烯、苯乙烯的共聚物、聚丙烯、聚乙烯、聚丁烯、聚氨酯、特氟龙、多糖、尼龙、硝酸纤维素、树脂、硅石、基于硅石的材料、碳和金属。在一个实施方案中，基底不是自发荧光的。
靶分析物可以是有机或无机分子。靶分析物可以选自：环境污染物(包括农药(pesticide)、杀虫剂(insecticide)、毒素等)；化学品(包括溶剂、聚合物、有机材料等)；治疗分子(包括治疗和滥用药物、抗生素等)；生物分子(包括激素、细胞因子、蛋白、核酸、脂质、碳水化合物、酶、抗体、抗原、细胞膜抗原和受体(神经的、激素的、营养的和细胞表面的受体)或它们的配体等)；全细胞(包括原核(如病原性细菌)和真核细胞，包括哺乳动物肿瘤细胞)；病毒(包括逆转录病毒、疱疹病毒、腺病毒、慢病毒等)和孢子。靶分析物可以是核酸和蛋白(包括免疫球蛋白；酶、激素和细胞因子)。靶分析物与生物活性剂的特异性结合可以依赖于选自以下的化学相互作用：静电相互作用、离子键、共价键、氢键和偶极-偶极相互作用。
试剂可以是特异性检测一种靶分析物的物质。试剂可以是物质的混合物，混合物中的每种物质检测一种特异性靶分析物。试剂可以是荧光标记的结合分子、抗体、受体或适体。
当微阵列被用于分析潜在包含靶分析物的样品时，颗粒可以用标识加标签，所述标识包括但不限于：荧光标签、条形码、化学标识、量子点、微结构、核酸标识、雕刻和射频标签。标识还可以被加至靶分析物。
有利地，标识可以用于增强对颗粒位置和随后的颗粒上的活性剂的识别。
当微阵列用于分析潜在包含靶分析物的样品时，一种或多种靶分析物可以针对校准器进行交换。校准器是结合其相应的活性剂的试剂，并提供已知的光学信号强度。有利地，该信号强度可以用于标准化，以确定样品中分析物的定量浓度。
当活性剂结合至靶分析物时标识可以显示出变化。该变化可以在光学成像仪或比色仪下进行光学查看。在一个实施方案中，可以在包含靶分析物的样品已经结合至颗粒的活性剂后施加标识。
标识可以被缀合至靶分析物上，从而结合颗粒上相应的活性剂。标识可以直接缀合至靶分析物或通过接头分子或检测抗体或二抗的方式间接缀合至靶分析物。
在标识是荧光标签的实施方案中，荧光标签可以是报道染料的混合物。报道染料的混合物的组成的改变可以改变输出光学信号强度，提供了大量可能范围的独一无二的光学识别标志(signature)。
可以用检测器(如光学检测器)检测光学识别标志。光学检测器可以发送信号至计算机存储器，其然后被计算机处理器访问以产生图像文件。然后与图像文件相关的数据(如显示光学识别标志的颗粒的位置和类型)与每次颗粒批次沉积之后获得的数据进行比较，即编码/解码数据表格，以识别颗粒的身份或批次。显示光学识别标志的那些颗粒是那些已经与靶分析物结合的颗粒。因为针对颗粒的子群体的活性剂从编码/解码数据表格是已知的，所以能够识别样品中的靶分析物。
所公开的方法可以使得要生产的具有高度多重能力的颗粒微阵列成为可能。有利地，可以用单独颗粒沉积步骤、用不携带物理标识或标签的颗粒生产多重微阵列。
根据所公开的方法制备的颗粒阵列可以用于分析目的。这里，将样品与颗粒阵列接触。
当该样品包含结合颗粒上活性剂的靶分析物时，将产生作为该结合的结果的信号。例如，活性剂可以是抗体，靶分析物可以是结合该抗体活性剂的抗原。该抗原可以用荧光标签加标签，使得一旦抗体—抗原结合则产生荧光信号。分析物可以通过与荧光团进行化学反应直接标记或通过采用第二荧光标记的检测抗体。
用于不同分析物的测定可以具有不同的准确度、精确度和强度(robustness)。这一事实的原因是抗体或其它结合分子的内在不同，如不同的抗体质量、结合常数、结合动力学和杂质。在实践中，将会针对最大的颗粒数量选择具有更低的强度和/或精确度的测定，并且将会针对最小的颗粒数量选择最强的测定。
所公开的方法可以提供制造用于生物、化学或物理参数的分析和定量的颗粒微阵列装置的替代方法。
此外，提供了用于识别样品中一种或多种靶分析物的存在的微阵列系统，包括：包含基底的微阵列，所述微阵列具有多个与基底锁定接合的化学或生物学活性颗粒；记录每个颗粒的位置的存储器，所述每个颗粒的位置已经通过对基底成像确定了；用于一旦接触到样品则检测颗粒的变化的检测器；和响应程序指令以查询存储器并将从检测器接收的数据进行比较以基于每个颗粒的位置识别样品中一种或多种靶分析物存在的处理器。
颗粒位置的图像可以被记录于计算机的存储器中的编码/解码数据表格中。因此，图像可以易于被在计算机程序指令下作用的处理器所访问，以通过确定颗粒的位置和批次的颗粒数量比和所施加的试剂来解码微阵列。
在本发明的另一个实施方案中，颗粒数量比的概念被应用于相同颗粒批次上不同分析物的结合位点。
例如，针对3种靶分析物A1、A2和A3，制备两个颗粒批次B1和B2，并且颗粒上存在的结合位点的数量是已知的。然后，该数量用于产生已知的结合位点数量比。例如，B1颗粒批次可以针对靶分析物A1和A2分别以11/3的结合位点数量比携带结合位点，而B2颗粒批次可以针对靶分析物A2和A3分别以11/3的结合位点数量比携带结合位点。
在上面的例子中，针对颗粒批次B1/B2的检测的信号强度比3/11会表明只有靶分析物A2存在于该样品中。相反，如果信号仅在颗粒批次B1中被检测到，这会表明只有分析物A1存在于该样品中，而检测的信号仅在颗粒批次B2中会表明只有分析物A3存在于该样品中。上面的方法提供了用于减少珠批次数量的另一方式。有利地，这两个数量比方法可以组合起来提供多维编码方法。
计算机网络
本发明的实施方案的方法和系统可以采用计算机系统800来实现，示意性地显示于图3中。至少该实施方案的一部分可以作为软件实现，如在计算机系统800内执行的计算机程序，和指示计算机系统800进行示例实施方案的方法。
计算机系统800可以包括计算机模块802，输入模块如键盘804和鼠标806和多个输出装置如显示器808，和打印机810。
计算机模块802可以与计算机网络812通过合适的收发器814进行连接，以能够访问例如互联网或其它网络系统如局域网(LAN)或广域网(WAN)。
该例子中的计算机模块802可以包括处理器818，随机存取存储器(RAM)820和只读存储器(ROM)822。计算机模块802还可以包括一些数字输入/输出(I/O)接口，例如I/O接口824至显示器808，和I/O接口826至键盘804。
计算机模块802的组件通常可以经由互连总线828和以本领域技术人员已知的方式进行通信。
数据存储介质(如CD-ROM或闪速存储器的载体)上所编码的应用程序通常可提供给计算机系统800的用户，和利用数据存储装置830中相应的数据存储介质驱动器进行读取。可以通过处理器818执行读取和控制该应用程序。可以使用RAM 820实现程序数据的中间存储。
附图简述
图1是显示根据本发明的实施方案的系统的组件的示意图。
图2是显示根据本发明的实施方案用于确定样品中一种或多种靶分析物存在的方法中涉及的步骤的流程图。
图3是显示根据本发明的实施方案的计算机系统的组件的示意图。
图4A至4F是本发明的示例性微阵列的图。上图是光学显微镜图像，而下图是荧光显微镜图像。
图5和6提供了说明本发明的编码和解码方法的图。
图7在图A中显示了具有由分析物与珠结合产生的珠信号强度的微阵列和在图B中以颗粒数相对于信号强度绘制的直方图。
附图详述
图1是显示根据本发明的实施方案的系统的组件的示意图，其包括根据本发明的实施方案的微阵列100，用于检测由微阵列的颗粒发射的可检测信号的变化的检测器102，和用于对发射可检测信号的变化的颗粒的数量进行计数的处理器104。
图2是显示根据本发明的实施方案用于确定样品中一种或多种靶分析物存在的方法中涉及的步骤的流程图，包括：
将样品与颗粒的阵列接触，所述颗粒上具有一个或多个用于与所述样品中存在的所述一种或多种靶分析物结合的结合位点，当靶分析物结合颗粒的至少一个结合位点时颗粒发射可检测信号的变化，其中所述颗粒阵列包含至少两个颗粒子集，每个子集具有针对一种或多种对该子集是独一无二的靶分析物的至少一个结合位点，并且其中每个子集的颗粒数量是已知的(步骤200)；
检测由颗粒发射的可检测信号的变化(步骤202)；以及
基于在可检测信号中所检测到的变化对发射可检测信号的变化的颗粒的数量计数，以确定对所述颗粒子集是独一无二的一种或多种靶分析物的存在或不存在(步骤204)。
图3是显示根据本发明的实施方案的计算机系统的组件的示意图。
在该非限制性的例子中，计算机系统800包括计算机模块802，输入模块如键盘804和鼠标806以及多个输出装置如显示器808，和打印机810。
计算机模块802与计算机网络812通过合适的收发器814连接，以能够访问例如互联网或其它网络系统如局域网(LAN)或广域网(WAN)。
计算机模块802包括处理器818，随机存取存储器(RAM)820和只读存储器(ROM)822。计算机模块802还包括一些数字输入/输出(I/O)接口，例如I/O接口824至显示器808，和I/O接口826至键盘804。
计算机模块802的组件经由互连总线828和以本领域技术人员已知的方式通信。
数据存储介质(如CD-ROM或闪速存储器的载体)上所编码的应用程序提供给计算机系统800的用户，和利用数据存储装置830中相应的数据存储介质驱动器进行读取。通过处理器818执行读取和控制该应用程序。使用RAM 820实现程序数据的中间存储。
图4A至4F是本发明的当用于检测样品中一种或多种靶分析物存在时的示例性微阵列的图。上图是光学显微镜图像，而下图是荧光(FITC)显微镜图像。
图4A是微阵列的图像，其已经与只包含靶分析物A的样品孵育。
图4B是微阵列的图像，其已经与只包含靶分析物B的样品孵育。
图4C是微阵列的图像，其已经与只包含靶分析物C的样品孵育。
图4D是微阵列的图像，其已经与包含靶分析物A和B的样品孵育。
图4E是微阵列的图像，其已经与包含靶分析物A和C的样品孵育。
图4F是微阵列的图像，其已经与包含靶分析物B和C的样品孵育。
图5显示了本发明的编码方法以及接下来的解码方法的例子。在该例子中，仅采用了包含三个子批次的一个批次。但是，可以采用超过三个的子批次(1至n)。子批次混合在一起之后，将它们沉积并结合在要变成微阵列的材料的表面上。子批次的颗粒以不同的量混合在一起以产生特定颗粒数量比。例如，子批次1包含1000个颗粒，子批次2包含400个颗粒，和子批次3包含100个颗粒，产生10/4/1的珠比例。沉积之后，将微阵列与怀疑包含一种或多种靶分析物的测试样品接触，所述靶分析物可以特异性结合各自的子批次。在将微阵列与测试样品接触和孵育足够时间以允许靶分析物与颗粒结合之后，采集图像以确定哪个颗粒由于与其靶分析物结合而产生信号。
在测量1000个信号的情况下，可以得出结论的是，结合子批次1的靶分析物包含在测试样品中。在测量100个信号的情况下，只有结合第三个子批次的靶分析物包含在测试样品中。在所有颗粒产生信号的情况下，很明显的是所有3种靶分析物存在于测试样品中。
需要注意的是，在该样品中，其中仅采用一个批次，成像步骤对于靶分析物包含在测试样品中的后者的解码不是必须的。在该样品中，仅颗粒数量比即足以确定针对子批次1、2或3的靶分析物是否存在于测试样品中。
图6也显示了本发明的编码和解码方法。与图5中所显示的例子相比，图6中所显示的例子不仅采用了一个批次而且采用了几个批次。要将信号分配至结合的特定靶分析物，不仅必须知道颗粒数量比而且必须知道每个批次的颗粒的位置。因此，在每个批次沉积之后采集图像，以确定在微阵列表面的一个批次的每个颗粒的空间位置。
图7A显示了微阵列，其由具有预先定义的和已知的珠数量比例1：2：4：8，而在珠上不采用任何物理标签或标记的4个子批次形成的批次形成。在分析物孵育之后，可以采用任何方式来产生来自已经与各自的分析物结合的珠的信号。由珠产生的信号强度表示为根据信号强度的不同长度的箭头。如图7A中所示，存在四个珠子批次，其中一个没有产生信号，并且三个产生由箭头所示的不同强度的信号。强度的差异是由于在样品中存在不同的分析物浓度，或者不同的子批次具有不同的灵敏度并且存在同样的分析物浓度，或其混合。图7B显示了以颗粒数或数量相对于信号强度绘制的图7A的微阵列的直方图。通过采用这样的曲线图(plot)或分析颗粒数量和信号强度，所有子批次的所有珠可以在微阵列上被识别出来。图7B显示了具有相对颗粒数量8(与其它的多个珠相比)的多个珠，其具有信号强度接近或为零(0)；使得能够识别该子批次及其相关分析物并得出结论：当信号强度为零时不存在分析物。在直方图中可以看到三个(3)子批次群体具有增强的信号强度并且相对颗粒数分别为1：4：2。因为在这三个群体中观察到信号，所以分析物存在于样品中。通过进行校准可对分析物定量；例如通过测量分析物的几个标准并将信号强度与分析物浓度相关联。正如从所公开的图7可以看到的，可以在不知道分析物浓度的情况下，通过分析相对信号强度和确定各自珠数量来进行解码。在这种方式中，可以进行分析物的存在或不存在(是或否)的定量分析。为了确定定量的分析物浓度，可以进行校准。用于测量定量分析物浓度的方法是本领域已知的。
实施例
本发明的非限制性实施例和比较例将参考特定的实施例进一步更详细地说明，其不应被解释为以任何方式限制本发明的范围。
实施例1—组合方法1(单独沉积和单独试剂孵育)
该实施例证实了采用5个不同珠比例的子批次用单独珠沉积和试剂孵育来编码5种不同的珠(或靶分析物)。
在第一个步骤中，通过混合如下表2中所示的不同珠比例的子批次来形成批次“M”。
表2—用于组合方法1的珠数量比
批次 珠比例 总共沉积的珠 在子批次中的珠
M 16/8/4/2/1 31000 16000/8000/4000/2000/1000
接下来，批次M被以单独沉积步骤的方式沉积到基底上形成微阵列。然后，将微阵列与样品孵育。接下来，将微阵列与试剂“R”孵育。然后对微阵列进行成像并且分析珠信号。由于5种分析物的每一种与特定的珠数量比相关，样品中存在的分析物的身份可以从珠的总信号强度来确定。例如，如果获得等价于3000颗珠的珠总信号，这表明与珠数量比1和2相关的分析物存在于该样品中(因为3000＝1000+2000)。因此，可以采用以上方法对所有5种不同靶分析物进行解码。
实施例1－1：概念实验的证明
将分别包覆有抗-PSA抗体(珠批次A)、抗-hCG抗体(珠批次B)和寡核苷酸探针(珠批次C)的三种微珠混合在一起。以针对A、B和C分别为2575颗珠/微升、1900颗珠/微升和2300颗珠/微升的珠数量制备用于检测靶分析物A、B和C的三个不同批次的珠。然后，采用对A没有稀释、对B 3.7x稀释和对C 22.3x稀释的相等体积混合该批次，得到对于A：B：C为2575：515：103或100：20：4的相对珠比例。
然后，珠被基于胶垫(gel pad)随机沉积到微阵列基底上。施加如下的样品溶液：其包含(1)仅PSA(即仅靶分析物A)；(2)仅hCG(即仅靶分析物B)；(3)仅靶寡核苷酸(即仅靶分析物C)；(4)既有PSA又有hCG(即靶分析物A和B)；(5)既有PSA又有靶寡核苷酸(即靶分析物A和C)；(6)既有hCG又有靶寡核苷酸(即靶分析物B和C)，并孵育1小时，接着用PBS洗涤。施加荧光标记(FITC)的检测抗体至阵列上，并孵育1小时，接着用PBS缓冲液洗涤为结合的抗体缀合物。采用荧光显微镜对阵列成像。然后，计数所有微珠和荧光微珠的数量，并计算总珠对检测到的珠(结合分析物的珠)的比例。
结果示于图4A至4F中，并且定量数据呈现于下表中。
表3—概念实验的证明结果
结果显示了要针对每个靶分析物被检测的珠的理论预期数量和所检测到的珠的实际数量之间存在密切相关性，从而表明了该方法的可操作性。
因此，该实施例清楚地证实了包含不带有物理标签的颗粒的微阵列可以通过颗粒的单独沉积、使用单独的试剂和与每种靶分析物相关的不同珠比例的方式被成功解码。
实施例2—组合方法2(多重沉积和单独试剂孵育)
该实施例证实了使用3个批次、每个包含不同的珠数量比的子批次，采用多重珠沉积和单独试剂孵育来编码15种不同珠(或靶分析物)。
在第一个步骤中，通过混合如下表4中所示的不同珠数量比的子批次来形成批次M1、M2和M3。
表4—用于组合方法2的珠数量比
批次 比例 总共沉积的珠 在子批次中的珠
M1 16/8/4/2/1 31000 16000/8000/4000/2000/1000
M2 16/8/4/2/1 31000 16000/8000/4000/2000/1000
M3 16/8/4/2/1 31000 16000/8000/4000/2000/1000
接下来，批次M1、M2和M3被依次沉积到基底上。每个批次沉积了之后，对基底进行成像。微阵列被完全制造好之后，将微阵列与样品孵育。接下来，将微阵列与试剂“R”孵育。然后对微阵列进行成像并且分析珠信号。
通过在微阵列制造过程中早期获得的三个图像的比较来确定每个批次的空间位置。因此，可以确定每个批次的身份。然后，通过采用与每个靶分析物相关的特定珠数量比，对每个批次内每个靶分析物(子批次)的身份进行解码。
采用上面的方法，可以对所有15种不同的靶分析物进行解码。
该实施例证实了包含不带有物理标签的颗粒的微阵列可以通过在每次沉积后成像的颗粒多重沉积、使用单独的试剂和与每种靶分析物相关的不同珠比例的方式被成功解码。
实施例3—组合方法3(超级批次的单独沉积和多重试剂孵育)
该实施例证实了使用包含3个批次的超级批次，每个批次包含5个不同珠数量比的子批次，采用单独沉积步骤和多重试剂孵育来编码15种不同珠(或靶分析物)。
在第一个步骤中，通过混合批次M1、M2和M3形成超级批次。每个包含不同珠数量比的子批次的批次如下表5中所示。
表5—用于组合方法3的珠数量比
批次 比例 总共沉积的珠 在子批次中的珠
M1 16/8/4/2/1 31000 16000/8000/4000/2000/1000
M2 16/8/4/2/1 31000 16000/8000/4000/2000/1000
M3 16/8/4/2/1 31000 16000/8000/4000/2000/1000
接下来，超级批次被以单独沉积步骤沉积到基底上以制造微阵列。然后，对完成的微阵列进行成像。因此，不存在每个批次沉积之后单独成像。接下来，将微阵列与样品孵育。
这之后，将微阵列与试剂“R1”孵育，试剂“R1”包含检测批次M1内所有子批次所必须的所有试剂。然后分析珠信号，并且基于与每种靶分析物相关的特定珠数量比来识别批次M1内的靶分析物。
然后，将微阵列与试剂“R2”孵育，试剂“R2”包含检测批次M2内所有子批次所必须的所有试剂。然后如之前那样，分析珠信号以识别批次M2内的不同的分析物。
最后，将微阵列与试剂“R3”孵育，试剂“R3”包含检测批次M3内所有子批次所必须的所有试剂。然后如之前那样，分析珠信号以识别批次M3内的不同的靶分析物。
采用上面的方法，可以对所有15种不同的靶分析物进行解码。
该实施例证实了包含不带有物理标签的颗粒的微阵列，可以通过颗粒的单独沉积、使用依次施加的多重试剂和与每种靶分析物相关的不同珠比例的方式被成功解码。
实施例4—组合方法4(多重沉积和多重试剂孵育)
该实施例证实了使用包含3个批次，每个批次包含相同珠数量比的子批次，采用多重珠沉积和多重试剂孵育来编码15种不同珠(或靶分析物)。
在第一个步骤中，通过混合具有相同珠数量比的子批次形成批次M1、M2和M3，如下表6中所示。
表6—组合方法4中的珠数量比
批次 比例 总共沉积的珠 在子批次中的珠(A/B/C/D/E)
M1 1/1/1/1/1 50000 1000/1000/1000/1000/1000
M2 1/1/1/1/1 50000 1000/1000/1000/1000/1000
M3 1/1/1/1/1 50000 1000/1000/1000/1000/1000
接下来，批次M1、M2和M3被依次沉积到基底上。每个批次沉积了之后，对基底进行成像。微阵列被完全制造好之后，将微阵列与样品孵育。
接下来，将微阵列与试剂“R-a”孵育，试剂“R-a”包含检测批次M1、M2和M3的子批次A所必须的所有试剂。然后分析珠信号，并且基于每个批次已知的空间位置来确定不同分析物(子批次)的身份。
然后，将微阵列与试剂“R-b”孵育，试剂“R-b”包含检测批次M1、M2和M3的子批次B所必须的所有试剂。然后分析珠信号，并且基于每个批次已知的空间位置来确定不同分析物(子批次)的身份。
上面的过程，采用分别针对批次M1、M2和M3的子批次C、D和E的试剂“R-c”、“R-d”和“R-e”，再重复三次。
以这种方式，可以对所有15种不同的靶分析物进行解码。
该实施例证实了包含不带有物理标签的颗粒的微阵列，可以通过颗粒的单独沉积、使用依次施加的多重试剂和与每种靶分析物相关的不同珠比例的方式被成功解码。
实施例5—多重小组(Panel)微阵列
该实施例证实了使用本发明的方法用于对包含3个不同分析物小组的微阵列进行编码和解码，例如癌症小组、细胞因子小组和传染病小组。每个小组能够检测7种不同的分析物。例如，细胞因子小组能够检测INFγ、TNFα、GMCSF、IL1α、IL1β、IL2和IL4。
采用如实施例4中所述的组合方法4，7个批次，每个包含3个具有相同珠数量比的子批次(来自每个小组的一个)，被依次沉积到基底上。每个批次沉积之后，采集基底的图像。
下表7显示了所使用的每个批次的珠数量比。在所有7个批次(M1至M7)中的子批次A(加粗显示)对细胞因子小组具有特异性。还表示出了每个子批次相关的特定的分析物。
表7—用于多重小组阵列的珠数量比
批次 比例 总共沉积的珠 在子批次中的珠(A/B/C)
M1 1/1/1 3000 1000(INFγ)/1000/1000
M2 1/1/1 3000 1000(TNFα)/1000/1000
M3 1/1/1 3000 1000(GMCSF)/1000/1000
M4 1/1/1 3000 1000(IL1α)/1000/1000
M5 1/1/1 3000 1000(IL1β)/1000/1000
M6 1/1/1 3000 1000(IL2)/1000/1000
M7 1/1/1 3000 1000(IL4)/1000/1000
为了使用该多重小组微阵列，首先将微阵列与感兴趣的样品孵育。接下来，最终用户选择他/她感兴趣的小组。每个小组对不同试剂组具有特异性。例如，试剂组“R-a”包含分析细胞因子小组所必须的试剂。因此，如果用户希望针对细胞因子小组的7种细胞因子分析物来分析样品，则将微阵列与试剂组“R-a”孵育，并且然后分析珠信号。然后可以基于每个子批次已知的空间位置确定7种细胞因子分析物中每一个的身份。
如果用户随后希望针对癌症小组分析样品，那么他/她可以将微阵列与对癌症小组具有特异性的试剂组孵育，并基于每个子批次的空间位置解码7种癌症分析物。因此，通过采用所述方法，可以仅用7个依次沉积步骤产生能够分析21种不同分析物的多重小组微阵列。此外，这样的多重小组微阵列允许最终用户通过简单地将微阵列与合适的试剂组孵育来灵活选择他/她希望分析的小组。
可以在基底上包含的小组的数量没有真正的限制。因此，所公开的方法可用于仅采用少量制造步骤来生产编码具有上千分析物的成百小组的通用芯片。
实施例6—用于减少制造微阵列所需的沉积步骤的数量的池化(Pooling)方法
下面证实了本发明的组合编码方法的非限制性的例子，采用池化方法以减少制造本发明的微阵列所必须的沉积步骤的数量。
在下面所示的表8中，104个子批次，每个对不同的靶分析物具有特异性(即在该样品中有104种靶分析物)，仅采用13个批次即可将其编码。
表8—池化策略的例子
根据表6，104个子批次混合成13个批次，其中所述数量表示相对珠比例。例如，子批次数量1存在于具有相对珠比例为1的批次号1和6中。子批次41存在于具有珠比例为1的批次号1中，和存在于具有比例为1的批次号6中，等等。通过采用具有不同相对珠比例的不同批次中的子批次的组合，所有104个子批次被编码于13个批次中。每个批次依次沉积到基底上之后采集图像。然后，使用这种方法制造的微阵列以下面的方式使用。
先将微阵列与样品孵育。之后，将微阵列与允许检测所有靶分析物的单独试剂孵育。然后，可以捕获发射光学信号的珠的图像。
接下来，如在之前的组合方法中所述，可以通过将沉积过程中所制得的图像进行比较来确定珠源自的批次。
然后，基于每个珠批次恰好存在于本实施例的2个不同池中的原理，用户可以识别特异性的子批次以及靶分析物的存在。所以如果子批次号1(即靶分析物号1)存在于该样品中，可以获得批次号1和6的光学信号。而且，如果例如信号仅在批次1中获得但没有获得批次号6的信号，这意味着珠批次号1不可能存在于该样品中。
为了进一步说明池化方法是如何工作的，假设例如仅获得批次号1和6的光学信号。在这种情况下，可以应用以下三种情况中任一种：
(a)源于子批次号1和41的光学信号。
(b)仅源于子批次号1的光学信号。
(c)仅源于子批次号41的光学信号。
为了确定哪种情况是正确的，采用不同的珠比例。在批次号1中，子批次号1具有1的珠数量比，而子批次号44具有2的珠数量比。因此，如果例如获得3的总珠信号，会表示情况(a)是正确的。相反，如果获得2的总珠信号，这会表示情况(c)是正确的。
因此，取决于靶分析物的存在，可获得信号的独一无二的组合，并且存在的靶分析物的身份可以如上所述地明确确定。
该实施例仅用于说明并且是非限制性的例子——任何其它批次和比例的组合能够解码更小或大得多的数量的子批次(以及更小或大得多的数量的靶分析物)。采用池化方法的本发明解决了减少珠微阵列的制造时间的问题，其依赖于依次珠沉积。仅沉积13个包括珠身份信息的珠池化的(pooled)批次，而不是依次沉积104个珠批次。这导致显著减少了制造时间和成本。
用于开发池化的布局表的指南
以下非限制性的例子提供了如何针对本发明的组合编码方法设计池化策略的规则和指南。在下文中，“B”是指批次数量(列)，“SB”是指子批次数量(行)，“F”是指在不同的池中针对珠比例归一化至1(一)的因子。带有“SB”和“B”的术语(SB：B)作为整数是指在池化表格中指定的位置。例如，(5：2)是指子批次号5和批次号2。
池化表格的非限制性的例子如表8中所示。产生这样的表格的指南如下：
1.在池化表格中的任意给定的位置上，可以存在或不存在珠子批次。
2.如果存在珠子批次，与该池化表格中其它子批次相比，该子批次可以具有任意由因子“F”(例如每体积的珠)表示的给定的珠比例。珠比例可以是任意数量，整数或非整数。
3.“n”表示频率，其为珠子批次在批次中存在的频率。例如，n＝5的珠子批次存在于每个第五批次中，而n＝1的珠子批次是指该珠子批次存在于每个批次中。
4.为了能够最终互相区分两个子批次，来自两个批次的因子“F”在所有的位置“B”绝不能相等。例如，对于表6中的珠子批次738，对于(7：B)或(38：B)必须有至少一个值“F”，其中对于同样的批次数量“F”是不同的，即必须有至少一个批次，其中在珠子批次7和38之间“F”是不同的。
5.为了提高编码/解码的稳健性(robustness)，可以采用大量不同的“F”值。对于“F”不同的位置的数量没有理论上的限制。因此，对于子批次和批次的给定数量，可以潜在地存在无穷数量的不同组合，因为在所有位置(SB：B)的“F”可以具有任何值。因此，对于给定的组合编码问题，有关的无穷数量的方案潜在地存在无穷数量的组合。也就是说，在优选的池化策略中，所有的批次将会具有相似的总珠数量，在池化表格中位置(SB：B)之间的因子“F”的差异可以保持为低的以使得所需的珠数量最小化，但仍然为大的且足以区分不同的比例。
通过应用上面的规则，可以通过采用少量批次对大量子批次进行编码，从而减少所需的沉积步骤数量。通过对给定数量的子批次采用更少的批次，需要更大量不同的珠比例用于编码。相反，当采用更多批次时需要更少量的珠比例。
优选的池化策略将会采用有限量的珠比例，例如，但不限于，在不同子批次之间“F”因子至少为二(2)的1：2：4：8的比例，以清除地区分这些不同的子批次。在这个非限制性例子中最大珠比例差异为八(8)，其避免在不同子批次中珠数量的极端差异。
批次还可以包含特定的子批次里没有珠，导致0：1：2：4：8的比例。虽然采用没有珠可以减少所需的珠数量，但其缺点是其减少了可编码的组合的潜在数量。例如，如果仅采用两个批次，尽管可以存在32(2^5)个不同组合，因为在两个批次中的零个珠的组合并不提供分析信息，因此，仅有总共31个有用的组合。
在该例子中，有可能对仅含有一种分析物的样品进行清楚和简单的解码。对于具有超过一种分析物的样品，在两个批次中的珠总数量的不同程度必须可以确定珠比例。对于具有超过一种分析物的样品，更大量的批次是优选的，以产生不同批次的珠总数量的更大差异和导致类似珠数量或数量彼此接近的更少组合。
应用
有利地，本文公开的方法提供了用于制备珠微阵列的改善的方法，其不需要珠上的物理标识或标签。更有利地，可以用大大减少制造时间和成本的单独珠沉积步骤来制造这种具有多重能力的珠微阵列。
本文公开的方法还可以与现有技术的微阵列方法组合，大幅度提高这类已知方法的性能。
显然，阅读上述公开内容后，在不脱离本发明的精神和范围下，本发明的各种其它修改和改编对本领域技术人员来说将是显而易见的，并且所有这样的修改和改编落在所附权利要求的保护范围内。

Claims (63)

1.编码微阵列的方法，其中所述方法包括：
a)将至少一个批次的颗粒沉积到基底上形成微阵列，其中每个批次的颗粒包括至少两个子批次的颗粒，并且其中在沉积超过一个批次的颗粒的情况下每个批次的颗粒分别沉积，并且在沉积之后对所述微阵列上的每个批次的颗粒采集图像，以识别每个批次的颗粒在所述微阵列上的位置，其中
(i)在只有一个批次的颗粒沉积的情况下，每个子批次的颗粒的数量对该子批次的颗粒是独一无二的，这导致对于所述一个批次独一无二的颗粒数量比；或
(ii)在至少两个批次的颗粒沉积的情况下，对于每个批次颗粒数量比是相同的或者互相不同；
其中形成所述微阵列的沉积在所述基底上的每个子批次的颗粒能够结合特异性的靶分析物，其中与各自批次的所有其它子批次相比，一个批次的每个子批次结合不同的靶分析物；以及
b)记录关于一个或多个批次颗粒的位置的信息和在a)中针对根据该方法产生的每个微阵列所获得的一个或多个批次的颗粒数量比的信息；
其中颗粒的位置和批次内的颗粒数量比允许确定哪种靶分析物存在于要用所述微阵列分析的测试样品中，或者在仅有一个批次沉积的情况下该批次的颗粒数量比允许确定哪种靶分析物存在于要用所述微阵列分析的测试样品中。
2.解码通过权利要求1中所述的方法获得的微阵列的方法，其中所述方法包括：
a.分析从一个实体获得的图像，所述实体采用权利要求1中所述的微阵列进行筛选测试；其中所述图像的分析包括：
(i)确定可检测信号的位置和数量或强度，所述可检测信号获取自所述靶分析物与沉积在所述微阵列上的颗粒的结合；以及
(ii)通过将在(i)中所获得的信息与权利要求1的步骤b)中所记录的信息进行比较，以识别与所述微阵列的颗粒结合的靶分析物，从而对(i)中所获得的信息进行解码。
3.用于检测样品中一种或多种靶分析物的存在的微阵列，所述微阵列包含：
其上具有一个或多个用于与所述样品中存在的所述一种或多种靶分析物结合的结合位点的颗粒阵列，其中所述颗粒阵列包含至少两个颗粒子集，每个子集具有针对一种或多种对该子集是独一无二的靶分析物的至少一个结合位点，并且其中每个子集的颗粒数量是已知的，并且每个子集的已知颗粒数量用于产生颗粒子集的比值，以检测所述样品中两种或更多种靶分析物的存在。
4.根据权利要求3所述的微阵列，其中所述比值在100/1和1/1之间。
5.根据权利要求4所述的微阵列，其中所述比值在11/1和1/1之间。
6.根据权利要求3-5任一项所述的微阵列，其中所述比值是质数。
7.根据权利要求3-6任一项所述的微阵列，其中每个子集的已知的颗粒数量对该子集是独一无二的。
8.根据权利要求3-7任一项所述的微阵列，其中当靶分析物结合所述颗粒的至少一个结合位点时，每个颗粒发射可检测信号的变化。
9.根据权利要求8所述的微阵列，其中所述颗粒的可检测信号的变化是光学信号。
10.根据权利要求3-9任一项所述的微阵列，其中一个子集的颗粒的结合位点仅结合一种靶分析物。
11.根据权利要求3-10任一项所述的微阵列，其中所述颗粒选自微珠和生物实体。
12.根据权利要求11所述的微阵列，其中所述微珠具有选自以下的形状：微球、微胶囊、微棒、微立方体和微管。
13.根据权利要求11-12任一项所述的微阵列，其中所述微珠由选自以下的材料形成：塑料、陶瓷、玻璃、金属、金属氧化物、二氧化硅、聚苯乙烯、甲基苯乙烯、丙烯酸聚合物、琼脂糖、纤维素、尼龙、交联的胶束、特氟龙、顺磁材料、氧化钍溶胶、碳石墨、二氧化钛、乳胶、交联的葡聚糖和用于肽、核酸和有机部分合成的组合物或其混合物如金属填充的聚合物颗粒。
14.根据权利要求11所述的微阵列，其中所述生物实体选自：细胞、细菌或病毒颗粒。
15.根据权利要求3-14任一项所述的微阵列，其中所述颗粒大小为0.1-500μm、或0.1-200μm、或0.1-100μm、或1-100μm、或1-10μm。
16.根据权利要求3-15任一项所述的微阵列，其中每个颗粒包含一种或多种能够与一种或多种靶分析物结合的活性剂。
17.根据权利要求16所述的微阵列，其中每个颗粒上一种或多种活性剂的结合位点数量是已知的，并用于产生结合位点的比值以表明两种或更多种靶分析物的存在。
18.根据权利要求16所述的微阵列，其中所述颗粒包含能够检测至少两种靶分析物的至少两种活性剂，并且其中每个颗粒上活性剂的结合位点数量是已知的，并用于产生结合位点的比值以表明所述样品中两种或更多种靶分析物的存在。
19.根据权利要求16-18任一项所述的微阵列，其中所述活性剂是化学活性剂或生物活性剂。
20.根据权利要求19所述的微阵列，其中所述活性剂选自：肽、蛋白、核酸、代谢物、碳水化合物、酶、抗体、激素、凝集素、药物、杀虫剂、过敏原、抗原、受体、脂肪酸、寡肽、有机小分子、配位复合物、适体、细胞、细胞碎片、病毒颗粒、多糖、多核苷酸、脂质及其混合物。
21.根据权利要求3-20任一项所述的微阵列，其中所述颗粒用标识加标签。
22.根据权利要求21所述的微阵列，其中所述标识选自：荧光标签、条形码、化学标识、量子点、微结构、核酸标识、雕刻和射频标签。
23.确定样品中一种或多种靶分析物的存在的系统，所述系统包括：
微阵列，其具有颗粒的阵列，所述颗粒上具有一个或多个用于与所述样品中存在的所述一种或多种靶分析物结合的结合位点，其中所述颗粒阵列包含至少两个颗粒子集，每个子集具有针对一种或多种对该子集是独一无二的靶分析物的至少一个结合位点，并且其中每个子集的颗粒数量是已知的，并且每个子集的已知的颗粒数量用于产生颗粒子集的比值，以表明所述样品中两种或更多种靶分析物的存在；
检测器，其被配置为用于检测由颗粒发射的可检测信号的变化；
处理器，其被配置为对基于在可检测信号中所检测到的变化发射可检测信号的变化的颗粒计数，以确定对所述颗粒子集是独一无二的一种或多种靶分析物的存在或不存在。
24.根据权利要求23所述的系统，还包括：
成像器，被配置为用于对所述微阵列成像；
存储器，被配置为用于基于由成像器获得的图像记录每个颗粒的位置；以及
其中所述处理器被配置为用于查询所述存储器，并将所记录的每个颗粒的位置与从检测器所接收的数据进行比较，以识别对所述颗粒子集是独一无二的一种或多种靶分析物的存在或不存在。
25.根据权利要求23-24任一项所述的系统，其中当靶分析物结合颗粒的至少一个结合位点时，每个颗粒发射可检测信号的变化。
26.根据权利要求23-25任一项所述的系统，其中所述颗粒的可检测信号的变化是光学信号。
27.根据权利要求23-26任一项所述的系统，其中所述检测器是光学检测器。
28.根据权利要求23-27任一项所述的系统，其中所述比值在100/1和1/1之间。
29.根据权利要求28所述的系统，其中所述比值在11/1和1/1之间。
30.根据权利要求23-29任一项所述的系统，其中所述比值是质数。
31.根据权利要求23-30任一项所述的系统，其中每个子集的已知的颗粒数量对该子集是独一无二的。
32.根据权利要求23-31任一项所述的系统，其中一个子集的颗粒的结合位点仅结合一种靶分析物。
33.根据权利要求23-32任一项所述的系统，其中每个颗粒包含一种或多种能够与一种或多种靶分析物结合的活性剂。
34.根据权利要求33所述的系统，其中每个颗粒上一种或多种活性剂的结合位点数量是已知的，并用于产生结合位点的比值以表明两种或更多种靶分析物的存在。
35.根据权利要求33所述的系统，其中所述颗粒包含能够检测至少两种靶分析物的至少两种活性剂，并且其中每个颗粒上活性剂的结合位点数量是已知的，并用于产生结合位点的比值以表明所述样品中两种或更多种靶分析物的存在。
36.制备微阵列的方法，包括以下步骤：
i)提供至少两个子集的颗粒，所述颗粒上具有一个或多个用于与样品中存在的一种或多种靶分析物结合的结合位点，
ii)制备至少两个子集的颗粒的混合物，其中每个子集的颗粒数量是已知的，并且每个子集的已知的颗粒数量用于产生颗粒子集的比值，以表明样品中两种或更多种靶分析物的存在，
iii)将颗粒子集的混合物沉积至基底上以形成微阵列。
37.根据权利要求36所述的方法，还包括对其上具有沉积的颗粒的基底成像的步骤。
38.根据权利要求36或37所述的方法，还包括依次重复权利要求36和37中所记载的步骤。
39.根据权利要求1、36-38任一项所述的方法，其中所述比值或颗粒数量比在100/1和1/1之间。
40.根据权利要求39所述的方法，其中所述比值或颗粒数量比在11/1和1/1之间。
41.根据权利要求1、36-40任一项所述的方法，其中所述比值或颗粒数量比是质数。
42.根据权利要求1、36-41任一项所述的方法，其中每个子集的已知的颗粒数量对该子集是独一无二的。
43.根据权利要求36-42任一项所述的方法，其中一个子集的颗粒的结合位点仅结合一种靶分析物。
44.根据权利要求1、36-43任一项所述的方法，其中每个颗粒包含一种或多种能够与一种或多种靶分析物结合的活性剂。
45.根据权利要求44所述的方法，其中每个颗粒上一种或多种活性剂的结合位点的数量是已知的，并用于产生结合位点的比值或颗粒数量比，以表明两种或更多种靶分析物的存在。
46.根据权利要求44所述的方法，其中所述颗粒包含能够检测至少两种靶分析物的至少两种活性剂，并且其中每个颗粒上活性剂的结合位点的数量是已知的，并用于产生比值或颗粒数量比以表明样品中两种或更多种靶分析物的存在。
47.根据权利要求1、35-46任一项所述的方法，其中所述基底选自：聚合材料、有机材料、无机材料、金属、陶瓷、塑料、橡胶、玻璃、纤维材料、石墨或硅、二氧化硅、氮化硅、改性硅、玻璃、改性的或功能化的玻璃、无机玻璃、塑料、丙烯酸树脂、聚苯乙烯、苯乙烯的共聚物、聚丙烯、聚乙烯、聚丁烯、聚氨酯、特氟龙、多糖、尼龙、硝酸纤维素、树脂、硅石、基于硅石的材料和碳。
48.用于确定样品中一种或多种靶分析物的存在的方法，所述方法包括以下步骤：
将样品与颗粒的阵列接触，所述颗粒上具有一个或多个用于与所述样品中存在的所述一种或多种靶分析物结合的结合位点，当靶分析物结合颗粒的至少一个结合位点时，所述颗粒发射可检测信号的变化，其中所述颗粒阵列包含至少两个颗粒子集，每个子集具有针对一种或多种对该子集是独一无二的靶分析物的至少一个结合位点，并且其中每个子集的颗粒数量是已知的；
检测由所述颗粒发射的可检测信号的变化；以及
基于在可检测信号中所检测到的变化对发射可检测信号的变化的颗粒计数，以确定对所述颗粒子集是独一无二的一种或多种靶分析物的存在或不存在。
49.根据权利要求48所述的方法，还包括以下步骤：
检测由所述颗粒发射的可检测信号的变化幅度；以及
基于可检测信号的变化确定已经结合至靶分析物的结合位点的数量，以确定对所述颗粒子集是独一无二的一种或多种靶分析物的存在或不存在。
50.根据权利要求48-49任一项所述的方法，还包括以下步骤：
对微阵列成像；
基于所获得的图像记录每个颗粒的位置；以及
将可检测信号中所检测到的变化与每个颗粒所记录的位置进行比较，以识别对所述颗粒子集是独一无二的一种或多种靶分析物的存在或不存在。
51.根据权利要求48-50任一项所述的方法，还包括以下步骤：
基于颗粒子集仅当与特定试剂接触时发射可检测信号的变化，将所述颗粒与该试剂接触以识别对所述颗粒子集是独一无二的一种或多种靶分析物的存在或不存在。
52.根据权利要求51所述的方法，其中所述试剂是荧光标记的结合分子、或抗体、或受体、或适体。
53.根据权利要求48-52任一项所述的方法，其中所述可检测信号是光学信号。
54.根据权利要求48-53任一项所述的方法，其中所述靶分析物是无机分子或有机分子。
55.根据权利要求54所述的方法，其中所述靶分析物选自：环境污染物、化学品、生物分子、全细胞、细菌、病毒和孢子。
56.根据权利要求55所述的方法，其中所述环境污染物选自：农药、杀虫剂和毒素。
57.根据权利要求55所述的方法，其中所述化学品选自：溶剂、聚合物和有机材料。
58.根据权利要求55所述的方法，其中所述生物分子选自：激素、细胞因子、蛋白、核酸、脂质、过敏原、碳水化合物、酶、抗体、抗原、细胞膜抗原和受体或它们的配体。
59.根据权利要求55所述的方法，其中所述全细胞选自：真核细胞、原核细胞、哺乳动物细胞、肿瘤细胞、血细胞、上皮细胞、神经细胞和肌肉细胞。
60.根据权利要求55所述的方法，其中所述病毒选自：逆转录病毒、疱疹病毒、腺病毒和慢病毒。
61.根据权利要求48-60任一项所述的方法，其中标识被加至所述靶分析物。
62.根据权利要求61所述的方法，其中所述标识选自：荧光标签、条形码、化学标识、量子点、微结构、核酸标识、雕刻和射频标签。
63.根据权利要求48-62任一项所述的方法，其中所述标识与靶分析物直接缀合或通过接头分子的方式与靶分析物间接缀合。
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