CN112823054A

CN112823054A - 用于检测生物标志物的方法

Info

Publication number: CN112823054A
Application number: CN201980053474.3A
Authority: CN
Inventors: 约书亚·凯恩·索尔多; 斯科特·道格拉斯·伯格曼; 卡门·利亚·威利
Original assignee: Villavis Co
Current assignee: Villavis Co
Priority date: 2018-07-27
Filing date: 2019-07-26
Publication date: 2021-05-18
Also published as: US20210302416A1; EP3829759A1; EP3829759A4; KR20210049107A; WO2020023901A1; AU2019311175A1; CA3107883A1; IL291166A; JP2021533384A

Abstract

本发明涉及使用包括各自独立地包含本申请所述的捕获部分的表面的多种颗粒来分离和表征生物标志物(例如，用于阻塞性睡眠呼吸暂停)的方法。

Description

用于检测生物标志物的方法

相关申请的交叉引用

本申请要求2018年7月27日提交的美国临时专利申请号62/711,415和2018年10月17日提交的美国临时专利申请号62/747,017的优先权权益。出于所有目的，上述每个申请的全部内容通过引用并入本申请。

技术领域

本发明涉及使用含有表面的多种颗粒(例如，微粒、纳米颗粒；磁性的、非磁性的)来分离和表征生物标志物(例如，用于阻塞性睡眠呼吸暂停)的方法，所述表面各自独立地包含本申请所述的捕获部分。

背景技术

实验室测试在健康评估、医疗保健乃至公众健康方面都起着至关重要的作用，并影响到每个生命阶段的人们。几乎每个人在其一生中都会经历一项或多项实验室测试。仅在美国，每年估计要进行70到100亿次实验室测试，并且实验室测试结果会影响大约70％的医疗决策。

此外，由于医疗保险和医疗补助服务中心(CMS)于2018年1月1日根据《保护性医疗保险法》(PAMA)的要求实施了新的临床实验室收费表(CLFS)，因此PAMA正在减少实验室测试的报销。更为关键的是，实验室结果在第一时间是准确的，故障排除的工作减少或花费更少的时间，并且不会影响实验室工作流程。

干扰物是存在于患者样本中的物质，它可以例如通过干扰物抗体结合来改变诊断测试结果的正确值，或者可以通过桥接、位阻或自身抗体机制增加或减少测定信号。虽然已知免疫测定容易受到干扰物，但是如果仪器(分析仪)或实验室未识别并标记出错误结果，或者如果医师未告知实验室患者结果不符合临床情况，则临床实验室仍可能报告错误结果。如果没有实际的方法来预先识别可能会引起问题的标本，则任何标本都可能意外地出现错误结果。这种干扰物的结果是错误的结果可能导致假阴性和假阳性测试结果，从而影响患者的护理，并可能导致不必要的侵入性、诊断性或治疗性程序或无法治疗患者。

尽管存在干扰物带来的复杂性，但生物标志物的筛选和诊断测试可能仍然很困难，例如，由于它们在生物样品中的存在率低或含量低。

用于阻塞性睡眠呼吸暂停(OSA)的尿液和/或血液生物标志物可以用于促进儿童和成人疾病的诊断和成本有效治疗。尿液和/或血液生物标志物的总体目标是解决和测量OSA的最佳生物标志物信号。OSA是儿童和成人中高度流行的疾病，与心血管疾病、糖尿病和其他慢性病的风险增加相关。不幸的是，多达90％的OSA患者尚未得到诊断，也没有接受适当的治疗方法来治疗这种疾病。尽管关于对OSA的病理生理学和后果是已知的，但OSA的分子机制仍知之甚少。然而，基于蛋白质组学的技术的进步有利于发现新型生物标志物，这些生物标志物是包括OSA在内的许多疾病的潜在诊断和治疗靶标。

流行病学研究表明OSA影响6-13％的成年群体和1-4％的儿科群体。与一般人群相比，患有心脏病或代谢性疾病的患者的OSA患病率≥50％。未经治疗的OSA会恶化生活质量，并带来长期后果，包括心血管疾病、高血压、糖尿病、肥胖症、中风、抑郁症和各种代谢性疾病。在儿童中，OSA可能导致认知和行为障碍，并可能被误诊为注意力缺陷障碍(ADD)。

当前，OSA的明确诊断需要使用基于实验室的多导睡眠图(PSG)进行的过夜睡眠研究。然而，诊断儿童和成人的OSA的睡眠研究费力、昂贵、难以获得且不方便。虽然鼓励使用便携式睡眠监视器进行家庭无人值守研究，但仍有56％的家庭诊断OSA仍需要实验室PSG睡眠研究的确认。需要通过简单且廉价的筛查或诊断测试来早期确认患者中的OSA，以防止OSA后果，例如以下技术：1)简化了已知OSA阳性患者样品中潜在OSA生物标志物的发现和分析，以及2)将多种生物标志物组合在一起可达到所需的敏感度和特异性，以准确诊断OSA并获得OSA治疗的功效。

需要开发阻塞性睡眠呼吸暂停(OSA)诊断测试方案，其中对低丰度生物标志物的准确、精确和灵敏的测量是正确加入/排除OSA和改善患者预后的关键。4300万美国人可能患有OSA，它可能导致肥胖、高血压、心脏病、糖尿病、行为问题和学习问题，并可能被误诊为儿童的注意力缺陷多动障碍(ADHD)。CDC估计，美国小儿OSA的患病率约为100万。OSA是当今诊断最多的疾病之一，而OSA诊断通常需要昂贵且不便的睡眠研究(多导睡眠图)。在儿科人群中，父母通常不愿意，孩子们可能不合作来接受睡眠研究。

因此，临床上需要一种简单、廉价、可自动化且有效的解决方案，以在诊断测试之前消除或最小化样品干扰物并富集生物标志物浓度，而不影响实验室工作流程和周转时间。

发明内容

本申请描述的是用于简单、有效和具有成本效益的检测生物样品中一种或多种生物标志物的方法，以例如管理和减轻多种已知的样品特异性干扰物，这些干扰物会导致错误的测试结果并增加患者安全风险，例如已用单克隆小鼠抗体治疗或已接受它们以用于诊断的患者体内的异源抗体。本申请所述的方法还可以管理和减轻由生物素引起的样品特异性干扰物，这些生物素可能来自消费者为健康和美容、减肥或治疗例如多发性硬化症的治疗而采取的非处方(OTC)补充剂、多种维生素和草药。

在一个方面，本申请提供了一种从生物样品中去除生物标志物的方法，所述方法包括：a)将所述样品与多种颗粒合并，其中每种颗粒独立地包含捕获部分(即，捕获部分的类型或种类)，以提供混合物；b)混合所述混合物，以提供一种或多种生物标志物的颗粒复合物；c)去除或分离所述颗粒复合物，以提供消除的溶液；从而从所述生物样品中去除生物标志物。

在一个方面，本申请提供了一种从生物样品中分离生物标志物的方法，所述方法包括：a)将所述样品与多种颗粒合并，其中每种颗粒独立地包含捕获部分(即，捕获部分的类型或种类)，以提供混合物；b)混合所述混合物，以提供一种或多种生物标志物的颗粒复合物；c)去除或分离所述颗粒复合物，以提供消除的溶液和富集的分离物；从而从所述生物样品中分离生物标志物。

具体实施方式

本申请描述了在生物样品中分离或富集一种或多种阻塞性睡眠呼吸暂停(OSA)的生物标志物的方法，该方法包括将本申请所述的多种颗粒与本申请所述的生物样品结合。

在一个方面，本申请描述了一种从生物样品中去除OSA的生物标志物的方法，该方法包括：a)将样品与多种颗粒合并，其中每种颗粒独立地包含捕获部分(即，捕获部分的类型或种类)，以提供混合物；b)混合所述混合物，以提供一种或多种生物标记物的颗粒复合物；c)去除或分离所述颗粒复合物，以提供消除的溶液；从而从生物样品中去除生物标记。

在一个方面，本申请描述了一种从生物样品中分离生物标志物的方法，该方法包括：a)将样品与多种颗粒合并，其中每个颗粒独立地包含捕获部分(即，捕获部分的类型或种类)，以提供混合物；b)混合所述混合物，以提供一种或多种生物标志物的颗粒复合物；c)去除，或分离所述颗粒复合物以提供消除的溶液和富集的分离物；从而从生物样品中分离生物标志物。在一些实施方式中，多种颗粒包括多种捕获部分(例如，多种颗粒各自独立地共价地或非共价地结合到多种捕获部分上)。

在一些实施方式中，在样品与多种颗粒合并之前，将调节剂添加到生物样品中。在一些实施方式中，调节剂是pH调节剂、摩尔调节剂、干扰阻断剂或解放或释放剂。

在一些实施方式中，多种颗粒包括包含第一捕获部分的第一颗粒。在一些实施方式中，多种颗粒包括包含第二捕获部分的第二颗粒。在一些实施方式中，多种颗粒包括包含第三捕获部分的第三颗粒。在一些实施方式中，多种颗粒包括包含第四捕获部分的第四颗粒。在一些实施方式中，多种颗粒包括包含第五捕获部分的第五颗粒。在一些实施方式中，多种颗粒包括包含第六捕获部分的第六颗粒。在一些实施方式中，多种颗粒包括包含第七捕获部分的第七颗粒。在一些实施方式中，多种颗粒包括包含第八捕获部分的第八颗粒。在一些实施方式中，多种颗粒包括包含第九捕获部分的第九颗粒。在一些实施方式中，多种颗粒包括包含第十捕获部分的第十颗粒。在一些实施方式中，该方法包括从生物样品中去除或分离第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九或第十生物标志物。

在一些实施方式中，该方法进一步包括向该混合物中加入裂解试剂或释放剂以提供富集的分离物。

在一些实施方式中，该方法进一步包括对生物标志物进行诊断测试(例如，在本申请所述的去除方法或分离方法之后)。在一些实施方式中，诊断测试同时检测两种或多种生物标志物的存在或不存在。

在一些实施方式中，所述第一颗粒在尺寸、形状、化学、颜色或其他特征上与所述第二颗粒不同。在一些实施方式中，所述第一颗粒在尺寸、形状、化学、颜色或其他特征上与所述第三颗粒不同。在一些实施方式中，所述第一颗粒在尺寸、形状、化学、颜色或其他特征上与所述第四颗粒不同。在一些实施方式中，所述第一颗粒在尺寸、形状、化学、颜色或其他特征上与所述第五颗粒不同。在一些实施方式中，所述第一颗粒在尺寸、形状、化学、颜色或其他特征上与所述第六颗粒不同。在一些实施方式中，所述第一颗粒在尺寸、形状、化学、颜色或其他特征上与所述第七颗粒不同。在一些实施方式中，所述第一颗粒在尺寸、形状、化学、颜色或其他特征上与所述第八颗粒不同。在一些实施方式中，所述第一颗粒在尺寸、形状、化学、颜色或其他特征上与所述第九颗粒不同。在一些实施方式中，所述第一颗粒在尺寸、形状、化学、颜色或其他特征上与所述第十颗粒不同。在一些实施方式中，所述特征是对本申请所述生物标志物的选择性、亲和力或亲合力。

在一些实施方式中，所述尺寸为直径50-1000nm，例如直径50-500nm、直径50-300nm、直径50nm至100nm、直径200nm至600nm、直径400nm至600nm、或直径为100nm至500nm。在一些实施方式中，所述尺寸为直径1-3微米。在一些实施方式中，颗粒的直径为5nm至100nm。

在一些实施方式中，第一颗粒群以比第二颗粒群更高的浓度存在。在一些实施方式中，第一颗粒群以比第三颗粒群更高的浓度存在。在一些实施方式中，第一颗粒群以比第四颗粒群更高的浓度存在。在一些实施方式中，第一颗粒与第二颗粒的比例为1：1、1：2、1：3、1：4、1：5、1：6、1：7、1：8、1：9、1：10。颗粒的浓度以每单位体积中的质量单位(例如mg/mL、g/L)或％固体(w/v)提供。例如，0.50％w/v相当于5mg/mL或5g/L。

在一些实施方式中，第一颗粒以第一浓度存在。在一些实施方式中，第二颗粒以第二浓度存在。在一些实施方式中，第三颗粒以第三浓度存在。在一些实施方式中，第四颗粒以第四浓度存在。在一些实施方式中，第五颗粒以第五浓度存在。在一些实施方式中，第六颗粒以第六浓度存在。在一些实施方式中，第七颗粒以第七浓度存在。在一些实施方式中，第八颗粒以第八浓度存在。在某些实施例中，第九颗粒以第九浓度存在。在一些实施方式中，第十颗粒以第十浓度存在。

在一些实施方式中，第一颗粒是对照颗粒(例如，包含标记物或指示剂(例如，已知量、丰度的标记物或指示剂)的颗粒)。在一些实施方式中，标记物或指示剂提供样品的浓度或体积的测量。在一些实施方式中，标记物或指示剂提供样品批号或批次号的指示。在一些实施方式中，标记物或指示剂提供产率或颗粒回收率的测量。

在一些实施方式中，生物标志物是生物素、HAMA、RF、嗜异性或抗SAv。在一些实施方式中，生物标志物是细菌感染的指示剂。在一些实施方式中，生物标志物是细菌的捕获部分。

在一些实施方式中，去除或分离颗粒复合物包括裂解、洗脱或选择性释放捕获部分-生物标志物复合物。在一些实施方式中，捕获部分(例如，捕获部分-生物标志物复合物的捕获部分)包含在测试系统中用于测量的信号检测分子(或用信号检测分子预标记)。合适的信号检测分子包括但不限于HRP、ALP、吖啶酯、异鲁米诺/鲁米诺、钌、N-(4-氨基丁基)-N-乙基异鲁米诺(ABEI)/环ABEI或荧光素。

在一些实施方式中，在本申请公开的用于去除或分离生物标志物的方法中的合并步骤a)之前，对样品进行预处理以去除或消除干扰物。在一些实施方式中，干扰物的去除或消除包括：(i)将样品与包含对生物标志物缺乏特异性的捕获部分的颗粒合并，以提供混合物；(ii)混合所述混合物，以提供所述干扰物的颗粒复合物；和(iii)去除或消除所述颗粒复合物，以提供消除的溶液。在一些实施方式中，步骤(iii)的去除或消除通过磁性、物理或化学方式进行。

在一些实施方式中，捕获部分是人抗-动物抗体(例如，小鼠IgG、绵羊IgG、山羊IgG、兔IgG、牛IgG、猪IgG、马IgG)。在一些实施方式中，捕获部分是嗜异性抗体(例如，FR(Fc-特异性)、Fab、F(ab)’2、聚合的IgG(1型、2a型、2b型IgG和IgG片段、血清组分)。在一些实施方式中，捕获部分是测定特异性结合剂(例如，生物素、荧光素、抗-荧光素聚/Mab、抗-生物素聚/Mab、链霉亲和素、中性亲和素)。在一些实施方式中，捕获部分是测定特异性信号分子(例如，HRP、ALP、吖啶酯、异鲁米诺/鲁米诺、钌、N-(4-氨基丁基)-N-乙基异鲁米诺(ABEI)/环ABEI)。在一些实施方式中，捕获部分是测定特异性阻断剂(例如，BSA、鱼皮明胶、酪蛋白、卵清蛋白、PVP、PVA)。在一些实施方式中，捕获部分是测定特异性缀合物连接剂(例如，LC、LC-LC、PEO4、PEO16)。在一些实施方式中，捕获部分是抗原自身抗体(例如游离T3、游离T4)。在一些实施方式中，捕获部分是蛋白质自身抗体(例如，MTSH、TnI、TnT、非心脏TnT(骨骼肌疾病))。在一些实施方式中，捕获部分是化学发光底物(例如，鲁米诺、异鲁米诺、异鲁米诺衍生物、ABEI、ABEI衍生物、钌、吖啶酯)或荧光标记(例如，荧光素或其他荧光团和染料)。在一些实施方式中，捕获部分是链霉亲和素、中性亲和素、亲和素、Poly A、Poly DT、适体、抗体、Fab、F(ab)’2、抗体片段、重组蛋白、酶、蛋白质、生物分子、聚合物或分子印迹聚合物。在一些实施方式中，捕获部分是生物素、荧光素、Poly DT、Poly A、抗原等。

在一个方面，本申请描述了一种包括多种颗粒和说明书的试剂盒。在一些实施方式中，该试剂盒包括多种颗粒、收集管和说明书。在一些实施方式中，该试剂盒包括多种颗粒、磁体、收集管和说明书。

方法的多重应用

本申请描述了本申请所述的方法的多重应用。例如，在一个实施方式中，多于一种的颗粒(例如，本申请所述的颗粒)用于结合或复合生物样品中的一种或多种生物标志物。在一些实施方式中，第一颗粒包含第一捕获部分，第二颗粒包含第二部分，其中第一捕获部分结合或去除第一生物标志物(例如，本申请所述的生物标志物)，第二捕获部分结合或去除第二生物标记物(例如，本申请所述的生物标志物)，其中当第一颗粒和第二颗粒与生物样品(例如，本申请所述的生物样品)结合时，第一生物标志物和第二生物标志物被结合或从生物样品中去除。

在一些实施方式中，第一颗粒具有与第二颗粒不同的物理特性(例如，尺寸、颜色)。

例如，用于本申请所述方法的多重应用的试剂盒包括1)涂覆有抗人IgG的蓝色珠子；2)涂覆有抗人IgM的红色珠子；3)涂覆有生物素-PEG的黑色珠子。检测试剂是这3种不同珠子的混合物，用于定性视觉检测。如果使用荧光计或荧光酶标仪读取珠子，还可以用具有不同发射/激发的独特荧光团标记珠子，以进行多重检测以及半定量或定量结果。除了使用彩色珠子以外，还可以对纳米颗粒进行标记，以进行分析(荧光、UV/vis、化学发光、电化学发光等)检测。

珠子可以是非磁性染色的珠子，例如乳胶纳米珠(例如蓝色、红色、黑色、绿色、黄色、紫色、白色)、染色的磁珠(例，黄色、红色、绿色)或未染色的磁珠(棕色)，其中珠子表面经过功能化以用于共价固定抗体、蛋白质、抗原、抗体片段、适体、寡核苷酸(PolyA、PolyDT)、分子印迹聚合物等。

微阵列表征试剂盒包含固定(即，共价、亲和相互作用)在每个孔/点上的一种或多种不同的干扰物标靶或分析物，其中每个孔/点将对至少一种干扰机制具有特异性。当纯净或稀释的样品添加到每个孔/点时，样品特异性干扰物(仅在样品中存在时)与固定的干扰物靶标或分析物(例如生物标志物，例如，干扰物)相互作用，仅当存在样品-特异性干扰时。例如，如果样品包含人抗山羊IgG干扰物，则人IgG将特异性结合到固定在特定孔/点上的山羊IgG。作为另一个例子，如果样品包含人抗链霉亲和素IgM，则人IgM将特异性结合到固定在特定孔/点上的链霉亲和素。作为另一个例子，如果样品中存在游离的生物素，它将特异性结合到固定在特定孔/点上的链霉亲和素、中性亲和素、抗生物素蛋白或抗生物素IgG。作为另一个例子，如果样品包含2种或更多种不同的干扰物，例如人抗绵羊IgG和人抗钌IgM，当将样品添加到包含固定在该孔/点上的绵羊IgG的孔/点中，只有人抗绵羊IgG特异性结合到该孔/点，而人抗钌IgG不结合，当将同一样品添加到包含固定在该孔/位点上的钌的其他孔/点上时，只有人抗钌IgM会特异性结合到该孔位/点上，而人抗绵羊IgG则不会结合。

在每个孔/点与样品一起温育之后，洗涤孔/点，仅使得存在于样品中的人IgG、人IgM和/或生物素干扰物将保留在给定孔/点中，仅当它对于固定在给定孔/位点中的干扰物靶标是特异的。如果对于固定在孔/点上的给定干扰物靶标不存在样品特异性干扰物，则在洗涤后，孔/点中将没有可检测量的人IgG、人IgM或生物素。

为了表征可能的样品干扰，将这3种不同的珠子的混合物添加至每个孔或反应点，并且蓝色和/或红色珠子仅结合至给定点，如果人IgG和/或人IgM已经通过与干扰物靶标的特异性结合相互作用结合到孔/点的情况下，而黑色珠子将永远不会结合，因为它们仅对生物素具有特异性。如果样品中游离生物素的量小于生物素结合能力或游离生物素的阈值，则黑色珠子仅与固定化链霉亲和素、中性链霉菌素、抗生物素IgG的孔/反应结合。如果样品中的游离生物素超过了生物素结合能力或游离生物素的阈值，则所有生物素结合位点均已被占据或饱和，并且没有黑色珠子会结合。

作为对照，可以存在3个或更多孔/点，其中固定了人IgG、人IgM或抗生物素蛋白(链霉亲和素、中性亲和素、抗生物素蛋白或抗生物素IgG)。如果将此3种珠子(蓝色、红色和黑色)的混合物添加到给定的对照孔/点中，则仅对人IgG(蓝色珠子)、人IgM(红色珠子)或抗生物素蛋白(黑色珠子)具有特异性的彩色珠子将与对照孔/点结合，而其他两种颜色则不结合。例如，如果将对照孔/点固定在人IgM上，并添加3个彩色珠子的混合物，则只有红色珠子会结合(涂覆有抗人IgM的红色珠子)，而没有蓝色或黑色珠子会结合。作为另一个例子，如果将对照孔/点固定在抗生物素蛋白上，并加入3个彩色珠子的混合物，则只有黑色珠子会结合(涂覆有生物素-PEG的黑色珠子)，而没有有蓝色或红色珠子结合。但是，如果错误的彩色珠子与对照孔/点结合，或者有多于1种的彩色珠子与对照孔/点结合，则对照失败。只有当正确的彩色珠子与正确的对照孔/点结合时，对照才通过。

然而，除了人IgG(免疫球蛋白G)和IgM(免疫球蛋白M)之外，还有3种其他类型的人抗体：IgA(免疫球蛋白A)、IgD(免疫球蛋白D)和IgE(免疫球蛋白E)。由于存在五类人抗体，因此可以考虑在检测试剂混合物中使用其他彩色珠子(N＝6色)来检测这些可能的干扰机制。例如，试剂盒可包括：1)涂覆有抗人IgG的蓝色珠子；2)涂覆有抗人IgM的红色珠子；3)涂覆有抗人IgA的黄色珠子；4)涂覆有抗人IgE的绿色珠子；5)涂覆有抗人IgD的棕色珠子；6)涂覆有生物素-PEG的黑珠。

作为另一个例子，可以使用用于检测两种或更多种人抗体类型的单色珠子，例如共涂覆抗人IgA、抗人IgE和抗人IgD的黄色珠子，或者三种单独批号/批次的黄色珠子，其中每批号/每批次都涂覆有一种抗人抗体，并且所有批次合并或掺入单批次黄色珠子中，包括3种不同批号的对人IgA、IgE或IgD有特异性的黄色珠子。例如，检测试剂混合物中的其他彩色珠子(N＝4色)可用于检测这些可能的干扰机制：1)涂覆有抗人IgG的蓝色珠子；2)涂覆有抗人IgM的红色珠子；3)涂覆有抗人IgA、抗人IgE和抗人IgD的黄色珠子，或一批/池的3种不同批次的黄珠，其中一批次涂覆有抗人IgA，第二批次涂覆有抗人IgE，第三批次涂覆有抗人IgD；4)涂覆有生物素-PEG的黑色珠子。

由于IgG是二价的(具有2个Fabs，每摩尔IgG可以结合2摩尔抗原)，而IgM是十价的(具有10个Fabs，每摩尔IgM可以结合10摩尔抗原)，如果固定在磁性纳米颗粒表面的相同干扰物靶标也固定在微阵列点或微量滴定板孔上，则磁性纳米颗粒消除剂也可以用作测定干扰特征试剂盒中的特征标记是可能的。例如，在测试之前，如果磁性纳米颗粒消除剂被涂覆绵羊IgG并被添加到具有人抗绵羊IgG和/或人抗绵羊IgM干扰物的样品中作为样品预处理，以消除人抗绵羊抗体(HASA)干扰，则任何人抗绵羊IgG和/或人抗绵羊IgM都会与固定在磁性纳米颗粒表面的绵羊IgG结合。样品预处理温育完成后，可以使用磁性、物理或化学分离方法从样品中分离出磁性纳米颗粒，并进行洗涤以去除样品中未结合的物质。洗涤后的磁性纳米颗粒可以在水或缓冲液中重构，并添加到测定干扰特征试剂盒的孔或点中。如果孔/点的表面上也固定有绵羊IgG，则在磁性纳米颗粒表面上与绵羊IgG结合的任何二价(人IgG)和/或十价(人IgM)也可以捕获/结合在孔/点中固定的绵羊IgG以形成特定的三明治复合体：

[磁性纳米颗粒]-(绵羊IgG)-{人抗绵羊IgG/IgM}-(绵羊IgG)-[微阵列点或微量滴定板孔)。

洗涤孔/点后，检测到样品中残留任何棕色(即磁性纳米颗粒)＝阳性结果或在样品中检测到人抗绵羊抗体。如果洗涤后孔/点是透明的或无颜色＝阴性结果或在样品中未检测到人抗绵羊抗体。

分离方法

在添加生物样品之前，可以将本申请所述的颗粒添加至收集装置，例如初次血液采集管、24小时尿液收集装置、尿液收集装置、唾液收集管、粪便收集装置、精液收集装置、血液采集袋、或任何样品收集管或装置。

在将样品收集到收集装置中之后，或将样品从主要收集装置转移到存储或转移装置例如塑料或玻璃管、小瓶、瓶子、烧杯、烧瓶、袋、罐、微量滴定板、ELISA板、96孔板、384孔板、1536孔板、比色杯、反应模块、容器或任何适合于容纳、存储或处理液体样品的容器之后，将本申请所述的颗粒添加至样品中。

在一些实施方式中，本申请所述的颗粒被添加到包含生物样品的收集装置中。在一些实施方式中，在添加生物样品之前，将本申请所述的颗粒添加至收集装置。

在一个方面，本申请描述了一种用于释放颗粒的装置，该装置包括本申请描述的包含生物样品的收集装置(即触发释放机制的螺帽)，例如尿液收集装置。例如，该装置是配备有螺帽的管，该螺帽在螺帽关闭时释放本申请所述的颗粒。

在一个方面，本申请描述了一种装置，该装置包括将颗粒化学释放到包含生物样品(即，包封的组合物或以限定的速率或时间点溶解在溶液中的组合物)的容器。在一些实施方式中，本申请描述的装置被配置为延迟添加本申请描述的颗粒，例如以在诊断测试之前提供样品的预处理。

在一些实施方式中，在添加本申请所述的颗粒之前，可以用化学药品、蛋白质、阻滞剂、表面活性剂或其组合对本申请所述的样品进行预处理，例如以调节pH、消除或竞争样品特异性干扰物和/或在将纳米粒子添加、引入、分散或混合到样品中之前，应对特定于基质的挑战，以改善纳米粒子与目标生物标志物的特异性和结合动力学。通过在样品预处理之后将纳米颗粒添加到样品中，可以物理地控制在样品预处理之后将纳米颗粒延迟添加到样品中。如果纳米颗粒通过化学药品、聚合物或糖壳、涂层或聚合反应进行封装、屏蔽或保护，使得化学药品、聚合物或糖需要在纳米颗粒在样品中释放、添加、分散或混合之前溶解，则纳米颗粒也可以在样品预处理期间存在于样品中。纳米颗粒的延迟释放可以使用本领域技术人员已知的化学方法，例如今天使用的药物延迟释放技术。

颗粒磁分离的方法

在一个方面，本申请提供了一种用于从生物样品中去除干扰物的方法(例如，在诊断测试之前)，或者用于分离或隔离磁性颗粒(例如，在初次血液采集管内、定制样品采集装置内、二次转移管或定制样品装置内)。例如，基于磁体的装置迅速(少于2分钟；优选少于30秒)将磁性纳米颗粒分离到侧面和/或底部，以形成基本上无颗粒的上清液。随后可以抽吸无颗粒的上清液，而不会破坏包含颗粒的沉淀物，并将其分配到单独的转移管中进行诊断测试。在一些实施方式中，将沉淀物分离或进行诊断测试。在一些实施方式中，用于磁分离的磁体是多磁体设备，所述多磁体设备在机架中包含2至12个磁体，该机架被设计成用于在大型移液机上容纳1至12个样品制备管。这种移液机的例子包括但不限于汉密尔顿(Hamilton)或特坎(Tecan)制造的那些。在一些实施方式中，用于磁分离的磁体是包含96或384个磁体的多磁体装置，该磁体被设计为向96孔或384孔微量滴定板提供磁化。

颗粒物理分离的方法

在一个方面，本申请描述了通过物理力(例如重力)去除本申请所述的颗粒的方法。在一些实施方式中，本申请所述的颗粒通过物理力从生物样品中隔离、分离或去除(例如，通过离心)。在一些实施方式中，在应用本申请所述的诊断测试方法之前，例如在一级血液采集管、定制样本收集装置、二级转移管或定制样本装置内使用所述方法。在一些实施方式中，去除颗粒的方法是过滤。

例如，磁性纳米颗粒对纤连蛋白和/或其他凝血因子特异或对血凝块组分/成分特异、细胞碎片(即对红细胞膜特异的)无效，随后通过在离心机转子和/或试管固定器中集成强磁体或磁性技术捕获或结合“血凝块”(血清中)和/或捕获或结合细胞碎片(在血清或血浆中)以提高离心速度和效率(缩短旋转时间以提高实验室效率、工作流程和通量)。这种来自离心的RCF或Gs与磁性纳米颗粒复合物(即凝块+磁性珠、细胞碎片+磁性珠)的磁性分离的结合，可以更快、更有效地分离样品并在样品管的侧面或底部形成上清液以使样品澄清用于后续分析。例如，在大多数实验室中，该离心步骤为4分钟或更长，并且可以通过将离心与磁性纳米颗粒凝块/细胞碎片复合物的磁隔离/分离相结合而减少到2分钟或更少(优选为1分钟或更少)。

此外，如果纳米颗粒或多种磁性纳米颗粒也对一种或多种不同的样品干扰物机制例如1、5、10、20、30或更多种不同的干扰物机制具有特异性，如果存在，则这些干扰物将被捕获，并且通过离心或通过本申请所述的离心和磁分离组合的物理分离后，从样品中去除纳米颗粒并从样品中去除。

尽管这些磁性纳米粒子也不需要对通过在离心机中离心或离心和磁分离相结合的待分离的血凝块或细胞碎片具有特异性，但它们的表面可以用一种以上的抗体和/或抗原包覆或固定，其中一种或多种抗体对血凝块和/或细胞碎片具有特异性，而其他抗体和/或抗原对样品干扰物具有特异性。在这方面，纳米颗粒将特异性地结合到样品干扰物以及血凝块和/或细胞碎片上，以用于随后通过离心或离心和磁分离的组合进行物理隔离或分离。

通过磁性纳米颗粒的特异性结合并将所有物质拉到磁性层以进行磁性隔离和分离，对血凝块和/或细胞碎片具有特异性的纳米颗粒的使用可提高凝血速度。基于血凝块的强制接近或由纳米颗粒和随后的磁体特异性捕获凝血因子，由磁场和强度形成的这种基于珠子的沉淀物还加速了血凝块的形成。

颗粒化学分离的方法

在一些实施方式中，通过化学分离方法从生物样品中隔离、分离或去除本申请所述的颗粒。在一些实施方式中，化学分离方法在应用诊断测试方法之前使用，例如在一级血液采集管、定制样本采集装置、二级转移管或定制样本装置内。

在一个方面，本申请提供了一种用于颗粒化学分离的方法，所述方法包括提供一种或多种盐、溶剂、聚合物或清洁剂。

在一些实施方式中，化学分离方法，例如液-液相分离，将颗粒分成A相，而无纳米颗粒的样品将被分成B相，在B相中进行测试。用于液-液相分离(化学相分离)的试剂可以是盐、可溶性聚合物和清洁剂。

例如，可以通过将非极性溶剂如已烷添加到极性水样品中来进行液-液相分离，其中颗粒分配为非极性相，而留下无纳米颗粒的水相，用于通过本申请所述的诊断测试进行测试。在一些实施方式中，本申请所述的分离方法提供有机相中的纳米颗粒。在一些实施方式中，本申请所述的分离方法提供了水相中的纳米颗粒。

一种在生物样品中分离颗粒的方法，所述方法包括向颗粒和生物样品提供非极性溶剂和水性极性溶剂，以提供非极性溶剂层和极性溶剂层，去除包含非极性溶剂的非极性溶剂层，分离包含颗粒的水性极性溶剂，从而分离颗粒。

在抽吸和丢弃非极性相之前，可以通过添加和使用内标例如用于LC-MS/MS的氘代内标或内部对照颗粒来调整或校正样品回收率。

在一些实施方式中，分离是与磁分离结合使用的物理分离。例如，在一个方面，提供了一种装置(例如，磁化离心机或配备有磁体的离心机，该磁体有助于通过磁体的重力和磁力进行分离)。在一个方面，本申请提供了一种用于分离本申请所述的颗粒的装置，该装置包括磁体和离心机。在一些实施方式中，该装置显著减少了离心时间。

去除或富集生物标志物的方法

本申请描述了用于富集或增加生物样品中生物标志物浓度的方法。“富集”定义为目标分析物或生物标志物与生物样品(例如，人或动物血清、血浆、血液、全血、加工血液、尿液、唾液、粪便(液体和固体)、精液或精液、细胞、组织、活检材料、DNA、RNA或任何液体或固体)中的颗粒的全部或部分捕获和结合。在一些实施方式中，富集包括洗涤和浓缩生物样品，例如通过允许洗涤生物标志物-特异性纳米颗粒，然后在生物标志物表征和测量步骤之前分离以去除或最小化干扰物来进行。

在一些实施方式中，本申请所述的方法用于分离和纯化生物样品中的特异性靶标(例如，生物标志物)以用于随后的洗脱和测试，或者用于在诊断测试之前富集或增加生物标志物的浓度。

洗涤或分离生物标志物特异性颗粒后，在进行表征或测量步骤之前，可将颗粒分散、重构或重悬在缓冲液例如磷酸盐缓冲盐水(即PBS pH 7.2)或LC-MS/MS兼容的缓冲液中。这意味着通过颗粒捕获和富集的生物标志物的关键表征或测量步骤发生在缓冲液系统中，而不是在动物或人的基质中发生，与在血液、血浆、血清或尿液中测得的相同生物标志物相比，使用相同的表征、测量或测试方法或系统，会引起或导致在动物血液、血浆、血清或尿液中测量的生物标志物之间的基质效应或偏差。洗涤可以洗掉样品的基质、组分、蛋白质和细胞成分以及相关的干扰物或基质效应。

如果捕获了足够量的分析物用于后续诊断测试例如定量、半定量或定性分析，则富集定义为是完成的；如果捕获了足够数量的分析物或生物标志物以进行后续的半定量或定性分析，则富集定义为是部分的，或者如果可以捕获足够数量的目标分析物或生物标志物以及内标物以通过测量方法进行定量、半定量或定性分析，则富集也定义为是部分的，这些测量方法可使用内标物调整目标分析物或生物标志物例如LCMS和LC-MS/MS(即氘代内标)和HPLC(C14或氚代内部放射性同位素内标)的回收率。

本申请提供了一种在诊断测试之前在样品中富集生物标志物的方法，包括：a)向样品中添加颗粒(例如，纳米颗粒、微粒)；b)将样品与颗粒(例如，纳米颗粒、微粒)混合；c)将颗粒(例如，纳米颗粒、微粒)与样品一起温育，以将生物标志物结合并捕获到颗粒(例如，纳米颗粒、微粒)上；d)从样品中分离或去除颗粒(例如，纳米颗粒、微粒)；e)保存颗粒(例如，纳米颗粒、微粒)；f)使用适当的洗涤稀释剂洗涤颗粒(例如，纳米颗粒、微粒)以去除非特异性物质；g)使用针对生物标志物的定性、半定量或定量诊断测试测量由颗粒(例如，纳米粒子、微粒)捕获的生物标志物的量、质量、摩尔浓度、浓度或产率。在一些实施方式中，稀释剂包括水(例如去离子水、注射用水、生理盐水、缓冲水溶液)。

在一些实施方式中，本申请所述的富集方法包括洗涤步骤。洗涤步骤去除了本申请所述的干扰物和/或提供了洗涤、纯化或分离的目标生物标志物(例如，本申请所述的生物标志物)。在一些实施方式中，本申请所述的富集方法降低了基质效应或物种效应。在一些实施方式中，在比较不同来源的两种生物样品的诊断测试之前使用本申请所述的富集方法。在一些实施方式中，在比较动物样品和人类样品的诊断测试之前使用本申请所述的富集方法。在一些实施方式中，在比较血清样品和血浆样品的诊断测试之前使用本申请所述的富集方法。在一些实施方式中，本申请所述的富集方法用于高粘度的样品。

本申请所述的富集方法可用于缓解、减少或管理由于溶血、血脂、黄疸、胆红素、微纤维蛋白凝块、细胞碎片、血细胞、纤维蛋白原、其他干扰物质例如药物、代谢物、补品、草药和多种维生素等导致的测试错误的已知预分析和分析源，通过在生物标志物表征和测量步骤之前洗涤或分离生物标志物-特异性纳米颗粒，以消除和最小化所述干扰物。

在一些实施方式中，富集方法包括将富含生物标志物的第一生物样品与富含该生物标志物的第二生物样品结合。

本申请提供了一种测量被颗粒(例如，纳米颗粒、微粒)捕获和富集的目标生物标志物的量、质量、摩尔浓度、浓度或产率的方法，由此通过本申请所述的裂解试剂将生物标志物从颗粒(例如，纳米颗粒、微粒)洗脱、解离或释放，例如，通过使用洗脱策略破坏结合相互作用，例如通过pH(例如，用碱如碳酸氢钠增加pH，用酸如乙酸、三氯乙酸、磺基水杨酸、HCl、甲酸降低pH，和常见的pH洗脱缓冲液例如100mM甘氨酸·HCl，pH 2.5-3.0，100mM柠檬酸，pH 3.0，50-100mM三乙胺或三乙醇胺，pH 11.5，150mM氢氧化铵，pH 10.5)、置换剂或置换药剂、竞争性洗脱(例如>0.1M配体或类似物)、离子强度和/或离液效应(例如NaCl、KCl、在10mM Tris中的3.5-4.0M氯化镁pH 7.0、在10mM磷酸盐缓冲液中的5M氯化锂pH 7.2、2.5M碘化钠pH 7.5、0.2-3.0M硫氰酸钠)、表面活性剂、洗涤剂、浓无机盐、变性剂(例如2-6M盐酸胍、2-8M尿素、1％脱氧胆酸盐、1％SDS)、有机溶剂(例如，酒精、氯仿、乙醇、甲醇、乙腈、已烷、DMSO、10％二恶烷、50％乙二醇pH 8-11.5(也是离液的))、辐射或热量(温度升高)、构象变化、二硫键还原剂(2-巯基乙醇、二硫苏糖醇、三(2-羧乙基)膦)、酶失活、离液剂(尿素、氯化胍、高氯酸锂)、机械搅拌、超声处理和蛋白质消化酶(胃蛋白酶、胰蛋白酶)及其组合破坏结合相互作用。

除非另有说明或从本申请中隐含的，结合本申请描述的任何特定方法或组合物描述的任何实施方式可以与本申请描述的任何其他实施方式结合使用。

本发明的方法和组合物可以与本领域已知的任何合适的测定法结合使用，例如本领域已知的任何合适的亲和力测定法或免疫测定法，包括但不限于蛋白质-蛋白质亲和力测定、蛋白质-配体亲和力测定、核酸亲和力测定、间接荧光抗体测定(IFAS)、酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)和酶免疫测定(EIA)、直接或间接测定、竞争测定、夹心测定、CLIA或CLIA波形测试、LC-MS/MS、分析测定等。

一种在诊断测试之前消除样品干扰物并从同一样品中富集生物标志物的方法，包括：a)在向样品中添加生物标志物特异性颗粒(例如，纳米颗粒、微粒)之前，向样品中添加化学药品和/或生物试剂、添加剂或组合物，以阻断或消除样品特异性干扰物；b)在将样品与化学药品和/或生物试剂、添加剂或组合物进行预处理或温育后，向样品中添加生物标志物特异性颗粒(例如，纳米颗粒、微粒)；c)将生物标志物特异性颗粒(例如，纳米颗粒、微粒)与样品一起温育，以在所述颗粒(例如，纳米颗粒、微粒)上结合并捕获目标生物标志物；d)洗涤所述颗粒(例如纳米颗粒、微粒)或将其与样品和化学药品和/或生物试剂、物添加剂或组合物分离；e)使用诊断测试表征被所述颗粒(例如纳米颗粒、微粒)捕获和富集的生物标志物。

例如，在一个实施方式中，结合至CaptAvidin的颗粒将在中性pH下结合至样品中的生物素。当pH升高到10时，结合至CaptAvidin颗粒的生物素将释放生物素。

生物标志物

本申请描述了分离或用于分离或富集生物样品中存在的生物标志物的方法。如本申请所指，“生物标志物”定义为过程、事件或状况例如衰老或疾病的独特的生物学或生物学来源的指示剂(例如，代谢产物)。生物标志物可以是内源性和/或外源性分析物、抗原、小分子、大分子、药物、治疗剂、代谢物、异生物质、化学药品、肽、蛋白质、蛋白质消化物、病毒抗原、细菌、细胞、细胞裂解液、细胞表面标志物、表位、抗体、抗体片段、IgG、IgM、IgA、IgE、IgD受体、受体的配体、激素、激素的受体、酶、酶的底物、单链寡核苷酸、单链多核苷酸、双链寡核苷酸、双链多核苷酸、聚合物和适体。在一些实施方式中，生物标志物是本申请所述的干扰物(例如，存在于患者样品中的物质，其可以例如通过干扰抗体结合来改变诊断测试结果的正确值，或者可以通过桥接、位阻或自身抗体机制来增加或减少测定信号。如本申请所用，“干扰物”可以是但不限于嗜异性或类嗜异物干扰物，例如自身抗体、类风湿因子(RF)、人抗小鼠抗体(HAMA)、人抗动物抗体(HAAA)例如山羊、兔、绵羊、牛、小鼠、马、猪和驴的多克隆和/或单克隆抗体，以及用于测试设计或测定配方的制造测定-特异性干扰物，例如化学发光底物(鲁米诺、异鲁米诺、异鲁米诺衍生物、ABEI、ABEI衍生物、钌、吖啶酯)、荧光标记物(例如荧光素或其他荧光团和染料)、捕获部分(链霉亲和素、中性亲和素、亲和素、CaptAvidin、polyA、polyDT、适体、抗体、Fab、F(ab)’2、抗体片段、重组体蛋白质、酶、蛋白质、生物分子、聚合物)及其结合伴侣(即生物素、荧光素、PolyDT、Poly A、抗原等)、缀合连接剂(LC、LC-LC、PEO、PEOn)、牛血清白蛋白、人血清白蛋白、卵清蛋白、明胶、纯化的多-和单克隆例如小鼠、山羊、绵羊和兔子IgG、聚乙烯醇(PAA)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、Tween-20、Tween-80、Triton X-100、三嵌段共聚物例如Pluronic和Tetronic、以及市售的阻断剂、阻断蛋白和基于聚合物的阻断剂例如来自Surmodics和Scantibodies的阻断剂)，通常用于基于抗体的诊断测试、基于非抗体的诊断测试或样品预处理方法和设备的设计中，通过质谱分析(即HPLC、MS、LCMS、LC-MS/MS)、放射免疫测定(RIA)、酶-联免疫测定(ELISA)、化学发光免疫测定(CLIA)、分子诊断、侧向流动、即时点(PoC)、CLIA和CLIA放弃测试和设备。在一些实施方式中，在本申请所述的生物样品中发现了生物标志物。

纤维蛋白原。在组织和血管损伤期间，凝血酶将纤维蛋白原转化为纤维蛋白，随后导致形成基于纤维蛋白的血凝块。在一些实施方式中，本申请所述方法中使用的本申请所述颗粒(例如颗粒衍生的抗纤维蛋白原(例如小鼠抗纤维蛋白原))结合并允许全血中纤维蛋白原的分离(例如化学分离)。可以通过纤维蛋白从离心后的血清中分离并去除与血凝块结合的颗粒，以进行无颗粒血清测试。在一些实施方式中，生物标志物是纤维蛋白原。在一些实施方式中，本申请描述的方法使用颗粒衍生的抗纤维蛋白原来消除对样品(例如血液样品)进行离心的需要。

例如，在一些实施方式中，这些磁性纳米颗粒也不需要对通过离心或在离心机中离心和磁分离的组合分离的血凝块或细胞碎片具有特异性，它们的表面可以被共涂覆或固定一种或多种抗体和/或抗原，其中一种或多种抗体对血凝块和/或细胞碎片具有特异性，而其他抗体和/或抗原对样品干扰物具有特异性。在这方面，纳米颗粒将特异性地与样品干扰物以及凝块和/或细胞碎片结合，以用于随后的物理分离或通过离心或离心和磁分离的组合的分离。

通过磁性纳米颗粒的特异性结合并将所有物质拉到磁性层进行磁分离和分离，对血凝块和/或细胞碎片具有特异性的纳米颗粒的使用可以提高凝血速度。由磁场和强度形成的这种基于珠子的沉淀物还可加速血凝块的形成，这基于血凝块的强制接近或由纳米颗粒和随后的磁体特异性捕获的凝结因子。

创伤性脑损伤。在一实施方式中，生物标志物用于创伤性脑损伤。有九(9)个生物标志物与急性脑损伤的严重程度和大小以及血脑屏障(BBB)的完整性有关，但它们在血液中的循环浓度非常低，因此很难使用现有的免疫测定技术和测试平台进行检测和定量。虽然Banyan BTI测试(FDA于2018年2月14日批准)仅测量这些生物标志物中的2种，但本申请所述的方法和设备(例如，富集方法；富集装置)能够同时测量患者中所有9种生物标志物，以帮助近患者的诊断和预后。可以将对9种生物标志物中的每一种用捕获部分衍生的颗粒添加到怀疑患有TBI的患者的生物样品中。在一些实施方式中，创伤性脑损伤生物标志物选自由。在一些实施方式中，创伤性脑损伤生物标志物选自GFAP和UCH-L1。

在一些实施方式中，本申请所述的方法(例如，富集方法)用于分离或富集选自由S100B、GFAP、NLF、NFH、γ-烯醇酶(NSE)、α-II血影蛋白、UCH-L1、总tau和磷酸化tau组成的组的创伤性脑损伤生物标志物中的一种、两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种或九种的存在。

阿尔茨海默症。在一个实施方式中，生物标志物用于阿尔茨海默症。有两(2)种生物标志物与阿尔茨海默症的严重程度和大小相关。在一些实施方式中，阿尔茨海默症生物标志物选自β淀粉样蛋白、BACE1和可溶性Aβ前体蛋白(sAPP)组成的组。在一些实施方式中，阿尔茨海默症生物标志物选自由β淀粉样蛋白(1-42)、磷酸-tau(18lp)和总-tau组成的组。在一些实施方式中，本申请所述的方法(例如，富集方法)用于分离或富集选自由β淀粉样蛋白、BACE1和可溶性Aβ前体蛋白(sAPP)组成的组的阿尔茨海默症生物标志物中的一种、两种或三种的存在。在一些实施方式中，生物标志物是β淀粉样蛋白、BACE1或可溶性Aβ前体蛋白(sAPP)。在一些实施方式中，在生物样品(例如，CSF)中发现了阿尔茨海默症的生物标志物。

性传播疾病。在一个实施方式中，生物标志物用于性传播疾病(STD)。至少有十(10)个具有性传播疾病的传播特征的生物标志物。在一些实施方式中，STD生物标志物是衣原体、淋病、梅毒、滴虫、HPV、疱疹1型和2型、HSV、甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、HIV 1型和2型以及HIV抗体。在一些实施方式中，本申请所述的方法(例如，富集方法)用于分离或富集STD生物标志物：衣原体、淋病、梅毒、滴虫、HPV、疱疹1型和2型、HSV、甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、HIV 1型和2型和HIV抗体中的一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、十一个、十二个或十三个的存在。在一些实施方式中，生物标志物在尿液中(例如衣原体、淋病、滴虫)。在一些实施方式中，生物标志物在血液、血清或血浆中(例如，梅毒、HPV、疱疹1型和2型、HSV、甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、HIV 1型和2型和HIV抗体)。

细菌感染。在一个实施方式中，生物标志物用于细菌感染，例如败血症。当前细菌感染的金标准测试是血液培养，其可能需要24-48小时才能将阳性结果反映到诸如分子诊断的确定测试中。本申请描述了在短至30分钟或更短时间内排除/消除细菌感染的方法，其中时间对于成功治疗患者以预防或控制败血症至关重要，例如在60分钟或更短时间内(例如50分钟、40分钟、30分钟、20分钟或更短)。至少有三十(30)个具有细菌感染特征的生物标志物。在一些实施方式中，细菌生物标志物选自由用于引起败血症的细菌种类(例如粪肠球菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌)的生物标志物组成的组。在一些实施方式中，生物标志物是粪肠球菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌的生物标志物。在一些实施方式中，生物标志物是革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌的生物标志物。在一些实施方式中，生物标志物是酵母病原体(例如，与血流病原体相关的酵母病原体)的生物标志物。

在一些实施方式中，革兰氏阳性细菌是：肠球菌、单核细胞增生性李斯特菌、葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、链球菌、无乳链球菌、肺炎链球菌或化脓性链球菌。

在一些实施方式中，革兰氏阴性细菌是：鲍曼不动杆菌、流感嗜血杆菌、脑膜炎奈瑟氏球菌、铜绿假单胞菌、肠杆细菌科、阴沟肠杆菌复合体、大肠杆菌、产酸克雷伯菌、肺炎克雷伯菌、变形杆菌或粘质沙雷氏菌。

在一些实施方式中，酵母病原体是：白色念珠菌、光滑念珠菌、克鲁斯念珠菌、副念珠菌、热带念珠菌。

在一些实施方式中，接着是质谱法。方法设想是在细菌-颗粒合并复合物中加入裂解剂(例如，还原剂(例如，DTT或TCEP))以裂解连接剂(即，连接剂将粒子缀合至表面捕获部分)的方法。所得细菌在培养基中生长或通过MALDI-TOF质谱分析或分子诊断方法。

方法设想是在细菌-颗粒合并复合物中加入裂解剂(例如，还原剂(例如，DTT或TCEP))以裂解连接剂(即，连接剂将粒子缀合至表面捕获部分)的方法。所得细菌在培养基中生长或通过MALDI-TOF质谱分析或分子诊断方法。

甲状腺功能。在怀疑甲状腺激素过多(甲状腺功能亢进)或缺乏(甲状腺功能低下)的患者中，TSH浓度作为甲状腺功能测试的一部分进行测量。在一些实施方式中，本申请所述的方法用于评估甲状腺功能。在一些实施方式中，生物标志物是抗原(例如TSH)。在一些实施方式中，捕获部分是对抗原(例如TSH)具有特异性的自身抗体(例如，游离自身抗体、复合自身抗体)。

心功能。在一些实施方式中，本申请描述的方法用于评估心脏功能。血液中肌钙蛋白水平的升高是心脏病例如心肌梗塞的生物标志物。心脏I和T是心肌损伤的具体指示剂。肌钙蛋白的亚基也是心脏健康的标志。具体而言，cTnI和cTnT是急性心肌梗塞(AMI)例如1型和2型心肌梗塞、不稳定型心绞痛、手术后心肌创伤和相关疾病的生物标志物。在一些实施方式中，生物标志物是游离的cTnI、游离的cTnT、二元的cTnI-TnC或三元的cTnI-TnC-TnT。在一些实施方式中，生物标志物是心力衰竭的指示剂。在一些实施方式中，生物标志物是中风的指示剂(例如，如在https://www.ahajournals.org/doi/10.1161/STROKEAHA.117.017076和https://www.360dx.com/business-news/roche-test-helps-differentiate-bleeding-risk-stroke-risk-patients-considering#.W1jz0thKhcA中描述的，其全部内容通过引用并入本申请)。在一些实施方式中，生物标志物是纤维化的指示剂(例如，在http://www.onlinejacc.org/content/65/22/2449中所描述的，其全部内容通过引用并入本申请)。在一些实施方式中，生物标志物用于诊断急性冠状动脉综合征(ACS)。在一些实施方式中，生物标志物针对心脏肌钙蛋白(I、I-C、I-C-T、T)和其他心肌肌钙蛋白片段、利钠肽(BNP、ANP、CNP)、N-末端片段(即NT-proBNP、NT-proCNP)、糖基化、非糖基化、CRP、肌红蛋白、肌酐激酶(CK)、CK-MB、sST2、GDF-15、半乳凝素-3。

阻塞性睡眠呼吸暂停(OSA)。尿皮质素III肽、尿调节素肽、血清类粘蛋白1肽和激肽释放酶1肽可用于诊断OSA。在US 2006/0029980、US 2016/0161489、US 8,999,658和US9,435,814中已经描述了用于诊断OSA的方法和生物标志物，其全部内容通过引用并入本申请。在De Luca Canto et al.,Sleep Med.Rev.2015October；23:28-45中也描述了OSA的生物标志物，其全部内容通过引用并入本申请。在一些实施方式中，本申请描述的方法针对用于诊断OSA的改进方法。在一些实施方式中，用于OSA的生物标志物是尿皮质素III肽、尿调节素肽、血清类粘蛋白1肽、激肽释放酶1肽、IL-6、IL-10、高灵敏度C反应蛋白或其组合。在一些实施方式中，样品中生物标志物(例如，尿调节素肽)的丰度低。在一些实施方式中，捕获部分是对尿皮质素III肽、尿调节素肽、血清类粘蛋白1肽和激肽释放酶1肽或其组合具有特异性的抗体。

在一个方面，本申请描述了一种检测患者中尿皮质素III肽、尿调节素肽、血清类粘蛋白1肽、激肽释放酶1肽、IL-6、IL-10、高灵敏度C反应蛋白或其组合的方法，所述方法包括：a.从人类患者获得样品；和b.用多种颗粒检测样品中是否存在尿皮质素III肽、尿调节素肽、血清类粘蛋白1肽、激肽释放酶1肽、IL-6、IL-10、高灵敏度C反应蛋白或其组合，并检测尿皮质素III肽、尿调节素肽、血清类粘蛋白1肽、激肽释放酶1肽、IL-6、IL-10、高灵敏度C反应蛋白或其组合与多种颗粒之间的结合。在一个方面，本申请描述了一种诊断患者阻塞性睡眠呼吸暂停的方法，所述方法包括：a.从人类患者获得样品；b.通过使样品与多种颗粒接触，检测样品中是否存在尿皮质素III肽、尿调节素肽、血清类粘蛋白1肽、激肽释放酶1肽、IL-6、IL-10、高灵敏度C反应蛋白或其组合，并检测尿皮质素III肽、尿调节素肽、血清类粘蛋白1肽、激肽释放酶1肽、IL-6、IL-10、高灵敏度C反应蛋白或其组合与多种颗粒之间的结合；和c.当检测到样品中存在尿皮质素III肽、尿调节素肽、血清类粘蛋白1肽、激肽释放酶1肽、IL-6、IL-10、高灵敏度C反应蛋白或其组合时，诊断患者患有阻塞性睡眠呼吸暂停。在一些实施方式中，患者是人类。在一些实施方式中，人类的年龄为约9至约2岁。在一些实施方式中，该方法包括同时检测是否存在由尿皮质素III肽、尿调节素肽、血清类粘蛋白1肽、激肽释放酶1肽、IL-6、IL-10、高灵敏度C反应蛋白组成的组中的两种或多种蛋白质。

在一些实施方式中，样品是尿液样品。在一些实施方式中，样品是血液样品。在一些实施方式中，在儿科患者的尿液样品中使用了多标记方法(尿调节素、尿皮质素、血清类粘蛋白1、激肽释放酶)。在一些实施方式中，成人人群中尿脂脂蛋白型前列腺素D合酶(L-PGDS)浓度的测量值用作鉴定患有严重OSA的患者的标志物。在一些实施方式中，成年人群中的氧化应激多生物标志物方法(L-PGDS、F2-异前列腺素等)可用于预测OSA。在一些实施方式中，使用色谱法和/或MS方法评估OSA的生物标志物。在一些实施方式中，蛋白质和代谢物，包括脂质谱、肾上腺素/多巴胺能生物标志物和衍生物、氨基酸、氧化应激生物标志物和其他微分子，被用于诊断和/或有效治疗OSA。在一些实施方式中，IL-6和/或hsCRP用作生物标志物以区分成人中有和没有发病的OSA患者。在一些实施方式中，髓样相关蛋白(MRP)8/14用于区分儿童中有无发病的OSA患者。在一些实施方式中，血清sLOX-1水平用作OSA存在的独立预测因子。在一些实施方式中，升高的血清YKL-40浓度用作OSA存在的独立危险因子。在一些实施方式中，升高的血清趋化素(chemerin)水平用作OSA的存在和严重性的独立预测标志物。

在一些实施方式中，样品是尿液并且OSA生物标志物是尿调节素、尿皮质素、血清类粘蛋白1、激肽释放酶、脂质运载蛋白型前列腺素D合酶(L-PGDS)、F2-异前列腺素或其组合。在一些实施方式中，样品是基于血清或血液的，并且OSA生物标志物是IL-6、hsCRP、sLOX-1、YKL-40、髓样相关蛋白(MRP)8/14、趋化素(chemerin)或其组合。

在一些实施方式中，通过能够测试大的样品体积(即1mL、10mL、100mL、1000mL等)以及很小的样本体积(例如，新生儿、儿科、老年人)以提高检测非常稀或低浓度生物标志物的可能性的准确性和精密度，很小的样本量通常目前无法测试，或者在测试前需要对样本进行稀释，从而降低了测试的灵敏度、准确性和准确性。在一些实施方式中，生物样品在1mL、10mL、100mL、1000mL或更大的体积中。在一些实施方式中，生物样品在0.5mL、0.25mL、0.1mL、0.05mL或更小的体积中。

本申请还提供了一种方法，所述方法用于在诊断测试之前使用颗粒样品预处理以辅助生物标志物富集，所述方法通过在生物标志物表征步骤或测试方法之前进行清洗步骤或颗粒分离、然后从颗粒中选择性释放或洗脱捕获生物标志物、或选择性释放或洗脱捕获部分-生物标志物复合物。

使用“裂解剂”或“释放剂”会破坏颗粒表面捕获部分与生物标志物之间的键，例如酸性或碱性pH、高摩尔盐、糖，化学置换剂、清洁剂、表面活性剂和/或螯合剂、或它们的组合，而不置换或洗脱捕获部分，仅置换或洗脱生物标志物。在用磁体从样品基质中洗涤或分离颗粒之后，随后可以用含有释放剂的洗脱溶液处理颗粒，以选择性地将生物标志物释放到溶液中。可以将颗粒快速(少于2分钟；理想的是少于30秒)分离到样品装置(小瓶、试管等)的侧面和/或底部，以形成基本无颗粒的样品上清液。随后可以吸出无颗粒的上清液，而不会破坏包含颗粒的沉淀物，并将其分配到单独的传输管中或直接注入分析系统(即LC-MS/MS或MALDI-TOF)中用于测试生物标志物。

例如，本申请所述的裂解试剂或释放剂破坏本申请所述的颗粒与本申请所述的捕获部分之间的本申请所述的结合相互作用或可裂解键，例如，使用洗脱策略例如pH(例如，用碱例如碳酸氢钠增加pH，用酸例如乙酸、三氯乙酸、磺基水杨酸、HCl、甲酸降低pH和常用的pH洗脱缓冲液例如100mM甘氨酸·HCl，pH 2.5-3.0，100mM柠檬酸，pH 3.0，50-100mM三乙胺或三乙醇胺，pH 11.5，150mM氢氧化铵，pH 10.5)、置换剂或置换药剂、竞争性洗脱(例如>0.1M的反向配体或类似物)、离子强度和/或离液效应(例如NaCl、KCl、在10mM Tris中的3.5-4.0M氯化镁pH 7.0、在10mM磷酸盐缓冲液中的5M氯化锂pH 7.2、2.5M碘化钠pH 7.5、0.2-3.0M硫氰酸钠)、表面活性剂、洗涤剂、浓无机盐、变性剂(例如2-6M盐酸胍、2-8M尿素、1％脱氧胆酸盐、1％SDS)、有机溶剂(例如，酒精、氯仿、乙醇、甲醇、乙腈、已烷、DMSO、10％二恶烷、50％乙二醇pH 8-11.5(也是离液的))、辐射或热量(温度升高)、构象变化、二硫键还原剂(2-巯基乙醇、二硫苏糖醇、三(2-羧乙基)膦)、酶失活、离液剂(尿素、氯化胍、高氯酸锂)、机械搅拌、超声处理和蛋白质消化酶(胃蛋白酶、胰蛋白酶)及其组合。

表征方法

本申请描述了用于消除和/或富集生物标志物以用于随后的表征或诊断测试的方法。本申请描述的生物标志物的表征(例如，干扰物)包括本申请描述的生物标志物(例如，本申请描述的干扰物)的鉴定和/或定量。

本申请所述的生物标志物的表征可包括信号放大技术(例如化学发光、荧光、金属增强的荧光)以提高检测的灵敏度。

例如，生物标志物表征可以使用单重或多重表征方法，其中可以使用标记的颗粒进行视觉检测(彩色珠子)或测量特定信号(UV/vis吸光度、荧光、化学发光、电化学发光、浊度法等)。

在一些实施方式中，通过MALDI-MS确定生物标志物的存在。在一些实施方式中，通过分子诊断方法确定生物标志物的存在。在一些实施方式中，通过免疫测定法确定生物标志物的存在。

本发明的颗粒

本申请描述的颗粒用于分离、消除和/或富集生物样品。在一些实施方式中，颗粒包含不可裂解键和捕获部分(例如，颗粒表面官能化以呈现一种或多种捕获部分)。在一些实施方式中，本申请所述的颗粒包含捕获部分(例如，对本申请所述的生物标志物具有高度特异性的捕获部分)。在一些实施方式中，本申请所述的颗粒(例如，本申请所述的颗粒表面，未结合本申请所述的捕获部分的颗粒表面)是惰性的(例如不具有出与本申请所述的生物标志物的显著结合)。在一些实施方式中，本申请所述的颗粒可用于本申请所述的诊断测试中，而无需对该颗粒或诊断测试做进一步的修饰。在一些实施方式中，本申请所述的颗粒可以在不改变样品的情况下(例如，不添加或去除另外的生物标志物(例如，干扰物))添加至样品和从样品中去除。颗粒在本申请中也称为珠子。

本申请所述的颗粒足够小，其平均直径为0.050微米至3.00微米，或在直径上优选为0.100微米至1.1微米，或更优选为0.200微米至0.600微米，甚至在直径上更优选为0.100微米至0.500微米。在一些实施方式中，颗粒的直径为5nm至100nm。在一些实施方式中，颗粒的直径为50nm至100nm。在一些实施方式中，颗粒的直径为100nm至500nm。

在一些实施方式中，本申请所述的颗粒(例如，微粒、纳米颗粒)包含核或载体，其中所述核或载体是选自由氧化铁、铁磁氧化铁、Fe₂O₃和Fe₃O₄、磁赤铁矿或其组合组成的组中的顺磁性或超顺磁性材料。

在一些实施方式中，颗粒表面包含有机聚合物或共聚物，其中有机聚合物或共聚物是疏水的。在一些实施方式中，颗粒(例如，纳米颗粒、微粒)表面包含有机聚合物或共聚物，例如选自但不限于由陶瓷、玻璃、聚合物、共聚物、金属、胶乳、二氧化硅、胶体金属(如金、银或合金)、聚苯乙烯、衍生化的聚苯乙烯、聚(二乙烯基苯)、苯乙烯-酰化共聚物、苯乙烯-丁二烯共聚物、苯乙烯-二乙烯基苯共聚物、聚(苯乙烯-氧乙烯)、聚甲基丙烯酸甲酯、聚甲基丙烯酸酯、聚氨酯、聚戊二醛、聚乙烯亚胺、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚丙烯酸、N,N’-亚甲基双丙烯酰胺、聚烯烃、聚乙烯、聚丙烯、聚氯乙烯、聚丙烯腈、聚砜、聚(醚砜)、热解材料、嵌段共聚物、以及它们的共聚物、硅酮或二氧化硅、羟甲基三聚氰胺、可生物降解的聚合物例如右旋糖酐或聚(乙二醇)-右旋糖酐(PEG-DEX)或其组合组成的组中的材料。

在一些实施方式中，颗粒表面包含官能团或用于捕获部分的共价连接(偶合、缀合或结合)的多个官能团，例如羧基、甲苯磺酰基、环氧基、胺、巯基、羟基、酯、氯甲烷和马来酰亚胺，点击化学官能团[铜(I)-催化的叠氮化物-炔烃环加成(CuAAC)、应变促进的叠氮化物-炔烃环加成(SPACC)、应变促进的炔-硝酮环加成(Spanc)、以及应变烯烃如烯烃和叠氮化物[3+2]环加成、烯烃和四嗪逆需求狄尔斯-阿尔德(diels-Alder)的反应，和烯烃和四唑光引发剂反应]、基于腙的偶合官能团例如S-HyNic(琥珀酰亚胺基-6-肼基-烟酰胺)和S-4FB(N-琥珀酰亚胺基-4-甲酰基苯甲酰胺)杂双功能交联剂和光反应性化学药品。

如本申请所用，“阻断剂“是指蛋白质、聚合物、表面活性剂、清洁剂或其组合。在一些实施方式中，捕获部分在本申请所述的颗粒(例如，纳米颗粒、微粒)上的结合被阻断剂例如蛋白质、聚合物、表面活性剂、清洁剂或其组合阻断。阻断剂选自由蛋白质例如白蛋白、牛血清白蛋白、人血清白蛋白、卵清蛋白、明胶、酪蛋白、酸水解酪蛋白、伽马球蛋白、纯化的IgG、动物血清、多克隆抗体和单克隆抗体、聚合物如聚乙烯醇(PVA)和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、蛋白质和聚合物的组合物、肽、PEG化试剂如(PEO)n-NHS或(PEO)n-马来酰亚胺、三嵌段共聚物如Pluronic F108、F127和F68、非离子型清洁剂如Triton X-100、聚山梨酯20(Tween-20)和Tween 80(非离子型)、两性离子清洁剂如CHAPS、离子型清洁剂如十二烷基硫酸钠(SDS)、脱氧胆酸盐、胆酸盐和沙克糖基、表面活性剂、糖例如蔗糖和市售阻断剂如嗜异性封闭剂(Scantibodies)、MAK33(罗氏诊断公司)、免疫球蛋白抑制剂(IIR)(Bioreclamation)、杂合阻断剂(Omega Biologicals)、Blockmaster(JSR)、TRU Blockk(迈迪安生命科学公司)，以及

&

(Surmodics)。在一些实施方式中，阻断剂结合至本申请所述的颗粒(例如，共价结合、非共价结合)。在一些实施方式中，所述阻断剂不结合(例如，共价结合、非共价结合)至本申请所述的颗粒。

捕获部分。本申请提供的颗粒包含结合本申请所述干扰物或本申请所述生物标志物的一种或多种捕获部分。如本申请所指，“捕获部分”选自由抗体、抗体的结合片段、IgG、IgM、IgA、IgE、IgD、受体、受体的配体、激素、激素的受体、酶、酶的底物、单链寡核苷酸、单链多核苷酸、双链寡核苷酸、双链多核苷酸、抗原、肽、聚合物、分子印迹聚合物、适体和蛋白质组成的组。

在一些实施方式中，捕获部分是蛋白质。蛋白质可以是例如单体、二聚体、多聚体或融合蛋白。在具体的实施方式中，蛋白质包含白蛋白例如，例如，抗体、抗体的片段、BSA、卵清蛋白、BSA的片段、卵清蛋白的片段、小鼠IgG、聚合的小鼠IgG、抗体片段(Fc、Fab、F(ab)’2)和靶向HAMA和RF干扰物机制的小鼠IgG的不同亚类(IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgE、IgD)、靶向HAAA干扰物的纯化的动物多克隆抗体(即牛、山羊、小鼠、兔、绵羊)、链霉亲和素、ALP、HRP、靶向MASI干扰物的BSA(与异鲁米诺、钌、吖啶酯缀合)以或其混合物中的至少一种。

在至少一个实施方式中，本发明提供了具有两个或更多种不同捕获部分的结合表面。

捕获部分的产生。一方面，提供了一种制备捕获部分的方法，所述方法包括生产或产生针对游离自身抗体或自身抗体复合物的复合物-特异性或构象-特异性抗体。游离自身抗体是尚未与其抗原靶标形成复合物的自身抗体。复合的自身抗体是已经与其抗原靶标形成复合物的自身抗体。

一方面，提供了一种制备捕获部分的方法，所述方法包括生产或产生针对自身抗体复合物如MTSH的复合物特异性或构象特异性抗体。在一些实施方式中，自身抗体是三碘甲状腺素(T3)或甲状腺素(T4)。在一些实施方式中，自身抗体复合物是MTSH。例如，复合物特异性或构象特异性抗体可以形成自身抗体复合物例如MTSH，可以从人血清中纯化该自身抗体复合物或用作捕获部分。这样，所产生的抗体将仅对具有TSH的hIgG或hIgM复合物具有特异性。可以基于技术和公开的方法或由蛋白质生物化学和纯化领域的技术人员纯化MTSH。在一些实施方案中，将具有最大自身抗体测定干扰物可能性的自身免疫疾病患者用于生产或产生自身抗体。例如，参见用于BNP的Hy Test SES测定、WO2014114780、WO2016113719和WO2016113720，将其全部内容引用作为参考。

甲状腺-特异性自身抗体。例如，在一个实施方式中，自身抗体是抗-甲状腺自身抗体(例如，抗甲状腺过氧化物酶抗体、促甲状腺激素受体抗体、甲状腺球蛋白抗体)。抗甲状腺自身抗体是针对甲状腺中一种或多种成分的自身抗体。

在一些实施方式中，自身抗体是游离的自身抗体(例如促甲状腺激素(TSH))。

在一些实施方式中，自身抗体是复合的自身抗体(例如MTSH)。在一些实施方式中，本申请所述的捕获部分是对复合的自身抗体具有特异性或对已经结合其抗原靶标例如MTSH的hIgG和/或hIgM具有确认特异性而产生的抗体。在一些实施方式中，自身抗体是T3和T4。

下文逐项列出了物质的非限制性列表，取决于要设计的亲和力测定的应用，其可以充当由分析物结合剂(捕获部分)和分析物组成的结合对中的一种或另一种。这样的物质可以例如用作捕获部分(分析物结合剂)或可以用于产生捕获部分(例如，通过将它们用作半抗原/抗原以产生特异性抗体)，其可以与本发明一起使用。可以根据本发明设计亲和力测定，包括免疫测定法，以检测这些物质在样品中是分析物时的存在和/或水平。在特定的实施方式中，本发明的分析物-结合捕获部分可以用于检测这些在样品中作为分析物的物质。或者，根据本发明，下面列出的物质可以与固相支持物表面关联，并用于捕获与其相互作用的分子(诸如，例如，对所列物质具有特异性的抗体或其片段、结合蛋白、或酶)。

可以充当由分析物结合剂(捕获部分)和分析物组成的结合对中的一种或另一种的物质的非限制性列表包括：诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、CA19-9、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-t、IL-5、IL-7、IL-10、IL-12、IL-13、sIL-2R、sIL-4R、sIL-6R、SIV核抗原、IL-1RA、TNF-α、IFN-γ、GM-CSF；PSA(前列腺特异性抗原)亚型，例如PSA、pPSA、BPSA，在PSA中，非α₁-抗胰凝乳蛋白酶-复合的PSA、α₁-抗胰凝乳蛋白酶-复合PSA、前列腺激肽释放酶例如hK2、hK4和hKl5、ek-rhK2、Ala-rhK2、TWT-rhK2、Xa-rhK2、HWT-rhK2和其他激肽释放酶；HIV-1p24；铁蛋白、L铁蛋白、肌钙蛋白I、BNP、痩蛋白、地高辛、肌红蛋白、B型利钠肽或脑利钠肽(BNP)、NT-proBNP、CNP、NT-proCNP(1-5)、NT-CNP-53(5l-8l)、CNP-22(82-103)、CNP-53(51-103)、心钠素(ANP)；人生长激素、骨碱性磷酸酶、人卵泡素、人亮氨酸激素、催乳激素；人绒毛膜促性腺激素(例如CGα、CGβ)；可溶性ST2、甲状腺球蛋白；抗甲状腺球蛋白；IgE、IgG、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、炭疽芽孢杆菌保护性抗原、炭疽芽孢杆菌致死因子、炭疽芽孢杆菌抗原、杜氏杆菌LPS、金黄色葡萄球菌肠毒素B、鼠疫杆菌荚膜F1抗原、胰岛素、甲胎蛋白(例如AFP 300)、癌胚抗原(CEA)、CA 15.3抗原、CA 19.9抗原、CA 125抗原、HAV Ab、HAV Igm、HBc Ab、HBc Igm、HIV1/2、HBsAg、HBsAb、HCV Ab、抗-p53、组胺；新嘌呤；s-VCAM-1、血清素、sFas、sFas配体、sGM-CSFR、slCAM-1、胸苷激酶、IgE、EPO、内在因子Ab、触球蛋白、抗心磷脂、抗-dsDNA、抗Ro、Ro、抗-La、抗-SM、SM、抗-nRNP、抗组蛋白、抗Scl-70、Scl-70、抗-核抗体、抗-着丝粒抗体、SS-A、SS-B、Sm、Ul-RNP、Jo-l、CK、CK-MB、CRP、缺血修饰的白蛋白、HDL、LDL、oxLDL、VLDL、肌钙蛋白T、肌钙蛋白I、肌钙蛋白C、微量白蛋白、淀粉酶、ALP、ALT、AST、GGT、IgA、IgG、白蛋白原、抗-链球菌溶血素、衣原体、CMV IgG、毒素IgG、毒素IgM、载脂蛋白A、载脂蛋白B、C3、C4、备解素因子B、白蛋白、α₁-酸性糖蛋白、α₁-抗胰蛋白酶、α₁-微球蛋白、α₂-巨球蛋白、抗链球菌溶血素O、抗凝血酶-III、载脂蛋白A1、载脂蛋白B、β₂-微球蛋白、铜蓝蛋白、补体C3、补体C4、C-反应蛋白、DNase B、铁蛋白、游离kappa轻链、游离λ轻链、触珠蛋白、免疫球蛋白A、免疫球蛋白A(CSF)、免疫球蛋白E、免疫球蛋白G、免疫球蛋白G(CSF)、免疫球蛋白G(尿)、免疫球蛋白G亚类、免疫球蛋白M、免疫球蛋白M(CSF)、kappa轻链、λ轻链、脂蛋白(a)、微量白蛋白、前白蛋白、备解素B、类风湿因子、铁蛋白、转铁蛋白、转铁蛋白(尿)、风疹IgG、甲状腺球蛋白抗体、弓形虫IgM、弓形体IgG、IGF-1、IGF结合蛋白(IGFBP)-3、蛋白酶、pim-1激酶、E-cadherein、EZH2和a-甲基酰基-辅酶A消旋酶、TGF-β、IL6SR、GAD、IA-2、CD-64、中性粒细胞CD-64、CD-20、CD-33、CD-52、细胞色素P450的亚型、s-VCAM-1、sFas、sICAM、乙型肝炎表面抗原、凝血活酶、HIV p24、HIV gp4l/l20、HCV C22、HCV C33、血红蛋白Alc和GAD65、IA2、维生素D、25-OH维生素D、l、25(OH)2维生素D、24,25(OH)2维生素D、25,26(OH)2维生素D、维生素D的3个末端、FGF-23、硬化蛋白、降钙素原、降钙素、c.小肠毒素A&B、h.幽门螺杆菌、HSV-1、HSV2。

取决于要设计的亲和力测定所针对的应用，合适的物质可以充当由分析物结合剂(捕获部分)和分析物组成的结合对中的一种或另一种，并且可以用于本发明，还包括比如对任何WHO国际生物参考标准品制备、表征和/或由世卫组织国际生物标准实验室分发(获得于http://www.who.int/bloodproducts/re_materials，2005年6月30日更新，其中列出了本领域众所周知的物质；该列表通过引用并入本申请)的具有特异性的部分，例如抗体或其片段。

WHO确定的编码的在该物质后的括号内的此类适合的国际参考标准的部分清单包括：人重组凝血活酶(rTF/95)、兔凝血活酶(RBT/90)、促甲状腺抗体(90/672)、重组人组织纤溶酶原激活物(98/714)、高分子量尿激酶(87/594)、前列腺特异抗原(96/668)、前列腺特异抗原90:10(96/700)；人血浆蛋白C(86/622)、人血浆蛋白S(93/590)、类风湿关节炎血清(W1066)、血清淀粉样蛋白A蛋白(92/680)、链激酶(00/464)、人凝血酶(01/580)、牛联合凝血活酶(OBT/79)、抗-D阳性对照静脉内免疫球蛋白(02/228)、胰岛细胞抗体(97/550)、脂蛋白a(IFCC SRM 2B)、人细小病毒B19 DNA(99/800)、人纤溶酶(97/536)、人纤溶酶原激活物抑制剂1(92/654)、血小板因子4(83/505)、激肽释放酶原激活物(82/530)、人脑控制型CJD和人脑散发型CJD制剂1和人脑散发型CJD制剂2和人脑变异型QJD(无；在WHO TRS ECBS报告号926，53报告中分别引用，脑匀浆)、人血清补体成分Clq、C4、C5、B因子和完整功能补体CH50(W1032)、人血清免疫球蛋白E(75/502)、人血清免疫球蛋白G、A和M(67/86)、人血清蛋白白蛋白、α-1-抗胰蛋白酶、α-2-巨球蛋白、铜蓝蛋白、补体C3、转铁蛋白(W1031)、抗-D阴性对照静脉注射免疫球蛋白(02/226)、甲型肝炎RNA(00/560)、乙型肝炎表面抗原亚型adw2基因型A(03/262和00/588))、乙型肝炎病毒DNA(97/746)、丙型肝炎病毒RNA(96/798)、HIV-1p24抗原(90/636)、HIV-1RNA(97/656)、HIV-1RNA基因型(10 101/466组)、人类纤维蛋白原浓缩物(98/614)、人类血浆纤维蛋白原(98/612)、升高的A2血红蛋白(89/666)、升高的F血红蛋白(85/616)、血红蛋白氰化物(98/708)、低分子量肝素(85/600和90/686)、普通肝素(97/578)、凝血因子VIII和血管性血友病因子(02/150)、人凝血因子VIII浓缩物(99/678)、人血凝血因子XIII血浆(02/206)、人凝血因子II、VII、IX、X(99/826)、人凝血因子II和X浓缩物(98/590)、人癌胚抗原(73/601)、人类C-反应蛋白(85/506)、重组天然人铁蛋白(94/572)、载脂蛋白B(SP3-07)、β-2-微球蛋白(B2M)、人β-血球蛋白(83/501)、人凝血因子IX浓缩物(96/854)、人血凝血因子IXa浓缩物(97/562)、人凝血因子V莱顿、人gDNA样品FV野生型、FVL纯合子、FVL杂合子(03/254、03/260、03/248)、人凝血因子VII浓缩物(97/592)、人凝血因子VIIa浓缩物(89/688)、人抗-梅毒血清(HS)、人抗-破伤风免疫球蛋白(TE-3)、人抗凝血酶浓缩物(96/520)、人血浆抗凝血酶(93/768)、人抗甲状腺球蛋白血清(65/93)、抗-弓形虫血清(TOXM)、人-抗弓形虫血清(IgG)(01/600)、人抗-水痘带状疱疹免疫球蛋白(W1044)、载脂蛋白A-l(SP1-01)、人抗-干扰物素β血清(G038-501-572)、人抗-麻疹血清(66/202)、抗-核核糖核蛋白血清(W1063)、抗-核-因子(均质)血清(66/233)、抗-细小病毒B19(IgG)血清(91/602)、1,2,3型抗-脊髓灰质炎病毒血清(66/202)、人抗-狂犬病免疫球蛋白(RAI)、人抗-风疹免疫球蛋白(RUBI-1-94)、抗-平滑肌血清(W1062)、人抗-双-链DNA血清(Wo/80)、人抗-E全血型血清(W1005)、人抗-棘球菌血清(ECHS)、人抗-A型肝炎免疫球蛋白(97/646)、人抗-B型肝炎免疫球蛋白(W1042)、人抗-E型肝炎血清(95/584)、抗-人血小板抗原-Ia(93/710)、抗-人血小板抗原-5b(99/666)、人抗-干扰物素α血清(B037-501-572)、人甲胎蛋白(AFP)、安克洛酶(74/581)、人抗-A血型血清(W1001)、人抗-B血型血清(W1002)、人抗-C全血型血清(W1004)、抗-D(抗Rh0)全血-血型试剂(99/836)、人抗-D(抗-Rh0)不完全血-血型血清(W1006)和人抗-D免疫球蛋白(01/572)。

取决于要设计的亲和力测定所针对的应用，可以用作由分析物结合剂(捕获部分)和分析物组成的结合对中的一种或另一种的合适物质的其他实例包括：用作半抗原以生成能够识别化合物的抗体的化合物，包括但不限于以下的任何一种盐、酯或醚：激素，包括但不限于孕酮、雌激素和睾丸激素、孕激素、皮质类固醇和脱氢表雄酮，以及被WHO列为国际参考标准的任何非蛋白质/非多肽抗原。WHO确定的编码的在该物质后的括号内的此类适合的国际参考标准的部分清单包括维生素B12(WHO 81.563)、叶酸(WHO 95/528)、同型半胱氨酸、反钴胺素、T4/T3以及国际生物参考制剂(可在WHO网站上获得，例如，页面http://www.who.int/bloodproducts/ref_materials/，2005年6月30日更新)的WHO目录中公开的其他物质，其通过引用并入本申请。本申请所述的方法和组合物可包含一种或多种前述的WHO参考标准品或包含参考标准品的混合物。

取决于要设计的亲和力测定所针对的应用，可以用作由分析物结合剂(捕获部分)和分析物组成的结合对中的一种或另一种的合适物质的其他实例包括滥用药物。滥用药物包括，例如，以下药物及其代谢物(例如，血液、尿液和其他生物材料中存在的代谢物)及其任何盐、酯或醚的清单如下：海洛因、吗啡、氢吗啡酮、可待因、羟可酮、氢可酮、芬太尼、度冷丁、美沙酮、达尔丰、施达妥、镇痛新、复方樟脑酊、buprenex；兴奋剂，例如苯丙胺、甲基苯丙胺；甲基安非他明、乙基安非他明、哌醋甲酯、麻黄碱、伪麻黄碱、麻黄素、麻黄、亚甲基二氧安非他明(MDS)、苯丁胺、苯丙醇胺；氨苯唑、贝咪嗪、苄非他明、溴丹、氯苯丁胺、克罗酰胺、巴豆酰胺、二乙基丙酸、二甲基苯丙胺、多沙普仑、乙胺万、芬卡明、甲氯芬酯、哌醋甲酯、尼克乙酰胺、匹莫林、戊四唑、苯二甲恶嗪、吩甲嗪、苯丁胺、苯丙醇胺、吡罗托辛、哌普拉多、脯氨酸，士的宁、辛弗林和类似物例如天使粉、PCP、氯胺酮；镇静剂，例如巴比妥酸盐、苯乙哌啶酮、甲喹酮和甲氨酯、甲氧西他汀、噻虫胺、硫喷妥钠、氨巴比妥、戊巴比妥、司可巴比妥、丁巴比妥、丁巴比妥、他巴比妥和戊巴比妥、苯巴比妥、甲基苯巴比妥；苯并二氮杂卓，例如艾司唑仑、氟西泮、替马西泮、三唑仑、咪达唑仑、阿普唑仑、氯安定、氯西泮、地西泮、哈拉西泮、劳拉西泮、奥西泮、普西泮、奎西泮、氯硝西泮、氟西泮；GBH药物例如γ-羟基丁酸和γ-丁内酯；谷氨酰胺、甲喹酮、异丙基甲酸酯、卡立普多、唑吡坦、扎来普隆；大麻素药物、例如四氢大麻酚及其类似物；可卡因、3-4亚甲二氧基甲基苯丙胺(MDMA)；致幻剂例如甲斯卡灵和LSD。

实施例

实施例1:低丰度生物标志物富集

使用涂覆有链霉亲和素并随后涂覆有生物素化的抗TSH抗体(VERAPREP浓缩TSH试剂)或生物素化抗-PTH单克隆抗体(VERAPREP浓缩PTH试剂)的550nm超顺磁性纳米颗粒富集40mL PBS中非常低水平的生物标志物，浓度为0.0195μIU TSH/mL或0.497pg PTH/mL)。

在第一项研究中，通过用生物素化的抗-TSH捕获抗体涂覆550nm VERAPREP生物素来制备VERAPREP浓缩TSH试剂。将0.08mL TSH抗原(10μIU/mL ELISA校准物)在4lmL PBS缓冲液中稀释至0.0195μIU/mL，低于DRG TSH超敏感ELISA(部件号EIA-1790，批号.RN58849)的功能灵敏度(<0.054μIU/mL)，并保存1mL为基线样品(富集之前)。使用VERAPREP浓缩TSH方案处理40mL样品，以产生1.0mL富集样品，用于随后的TSH ELISA测试：

1.将80μL 10μIU/mL TSH标准品在41.0mL PBS中稀释至0.0195μIU/mL，并保存1.0mL作为基线样品(富集之前)

2.将80μL 10μIU/mL TSH标准品在1.0mL VERAPREP裂解液中稀释至0.80μIU/mL作为对照

3.在50mL Falcon试管中加入40mL的PBS中的0.0195μIU/mL TSH

4.加入VERAPREP浓缩TSH，混合

5.在室温下混合温育60分钟

6.使用

50SX磁分离VERAPREP浓缩TSH 60分钟

7.倒出并将40mL PBS丢弃至废弃物中

8.加入4.0mL PBS洗涤缓冲液，混合

9.使用

50SX在4mL PBS洗涤缓冲液中磁分离VERAPREP浓缩TSH30分钟

10.倒出并将4mL PBS丢弃至废弃物中

11.加入1mL PBS洗涤缓冲液，混合

12.将1mL VERAPREP浓缩TSH转移到1.75mL锥形底部卡口小瓶中

13.使用Dexter

1.5S在1mL PBS洗涤缓冲液中磁分离VERAPREP浓缩TSH10分钟。

14.吸出并将1mL PBS丢弃到废弃物中

15.加入1mL VERAPREP裂解液，混合

16.使用Dexter

1.5S在1mL VERAPREP裂解液中磁分离VERAPREP浓缩TSH10分钟

17.吸出并保存1mL上清液(富集样品)，并测试对照、基线样品和富集样品。

在1mL VERAPREP裂解液缓冲液中，将0.08mL TSH抗原(10μIU/mL ELISA校准物)稀释至0.800μIU/mL作为对照。通过DRG TSH超敏感ELISA测试基线样品、富集样品和对照，富集样品的TSH％回收率计算为[富集样品结果]/[对照结果]x 100％。如预期的，稀释的TSH基准样品无法通过超敏感ELISA测试，且读数为0.00μIU/mL。仅使用0.80mg试剂，VERAPREP浓缩TSH成功地将稀释的TSH从无法检测到的浓度富集到0.73μIU/mL(表1)。与对照相比，回收率达到98.6％，但在可抑制测定信号的TSH ELISA中VERAPREP裂解液缓冲液可能具有基质效应(表2)。

表1

表2

在第二项研究中，通过用生物素化的抗-PTH捕获抗体涂覆550nm VERAPREP生物素来制备VERAPREP浓缩PTH试剂。将0.021mL PTH抗原(971pg/mL ELISA校准物)在4lmL PBS缓冲液中稀释至0.497pg/mL，低于DRG PTH(甲状旁腺)Intact ELISA(部件号EIA-3645，批号2896)的功能灵敏度(<1.56pg/mL)，并保存1mL作为基线样品(富集之前)。使用VERAPREP浓缩PTH方案处理40mL样品，以产生1.0mL富集样品，用于随后的PTH ELISA测试：

1.将21μL 971pg/mL PTH标准品在41.0mL PBS中稀释至0.497pg/mL，并保存1.0mL作为基线样品(富集之前)

2.将21μL 971pg/mL PTH标准品在1.0mL VERAPREP裂解液中稀释至20.4pg/mL作为对照)

3.在50mL Falcon试管中加入40mL的PBS中的0.497pg/mL PTH

4.加入VERAPREP浓缩PTH试剂，混合

5.在室温下混合温育30分钟

6.使用Dexter

50SX磁分离VERAPREP浓缩PTH 15分钟

7.倒出并将40mL PBS丢弃至废弃物中

8.加入4.0mL PBS洗涤缓冲液，混合

9.使用Dexter

50SX在4mL PBS洗涤缓冲液中磁分离VERAPREP浓缩PTH

10.倒出并将4mL PBS丢弃至废弃物中

11.加入1mL PBS洗涤缓冲液，混合

12.将1mL VERAPREP浓缩PTH转移到1.75mL锥形底部卡口小瓶中

13.使用Dexter

1.5S在1mL PBS洗涤缓冲液中磁分离VERAPREP浓缩PTH10分钟

14.吸出并将1mL PBS丢弃到废弃物中

15.加入1mL VERAPREP裂解液，混合

16.使用Dexter

1.5S在1mL VERAPREP裂解液中磁分离VERAPREP浓缩PTH10分钟

在1mL VERAPREP裂解液缓冲液中，将0.021mL PTH抗原(971pg/mL ELISA校准物)稀释至20.4pg/mL作为对照。通过DRG PTH(甲状旁腺)Intact ELISA测试基线样品、富集样品和对照，富集样品的PTH％回收率计算为[富集样品结果]/[对照结果]x 100％。由于在ELISA分析中VERAPREP裂解液缓冲液的基质效应，因此稀释的PTH基线样品读数为13.5pg/mL。这种基质效应导致增强的测定信号。仅使用0.80mg试剂，VERAPREP浓缩PTH成功地将稀释的PTH富集至42.3pg/mL(表3)。与对照相比，回收率为109％(表4)。

表3

表4

实施例4:用于随后的质谱分析(LC-MS/MS或MALDI-MS)的尿液中低丰度生物标志物的富集

以下描述了质谱样品预处理方案，该方案使用涂覆有生物标志物特异性捕获部分的超顺磁性纳米颗粒从大量尿液样品中富集低丰度生物标志物和加标内标(ISTD)。完全相同的方案还可以使用混合在一起或合并在一起的多种不同的超顺磁性纳米粒子种群，其中每个种群都涂覆有不同的捕获部分，以便从同一样品中多路复用和富集多于1种的生物标志物和相应的加标ISTD。2种或多种生物标志物的富集和表征有助于使用一种算法来进行疾病的临床诊断和/或预后，而单个生物标志物的表征是不可能的。例如，为了诊断尿液阻塞性睡眠呼吸暂停(OSA)，VERAPREP浓缩试剂可包含4种不同的抗体来捕获和富集激肽释放酶-1、尿调节素、尿皮素-3和α-酸性糖蛋白-1，或7种不同的抗体来捕获和富集激肽释放酶-1、尿调节素、尿皮素-3和α-酸性糖蛋白-1、IL-6、IL-10和高敏感性C-反应蛋白：

1.采集患者尿液(使用标准尿液采集方案例如尿液采集杯)

2.混合尿液采集样品

3.在50mL Falcon试管中添加40mL尿液

4.添加氘代内标物以富集生物标志物，混合

5.添加VERAPREP条件，混合

6.加入VERAPREP浓缩液，混合

7.温育：生物标志物+VERAPREP浓缩液捕获氘代内标物

8.使用Dexter

50SX在40mL尿液中磁分离VERAPREP浓缩液

9.吸出并将尿液丢弃至废弃物中

10.加入4mL PBS洗涤缓冲液，混合

11.使用Dexter

50SX在4mL PBS洗涤缓冲液中磁分离VERAPREP浓缩液。

12.吸出并将尿液丢弃至废弃物中

13.重复步骤12两次以上(2X)

14.加入1mL VERAPREP裂解液，混合(质谱兼容缓冲液)

15.使用Dexter

1.5S在1mL VERAPREP裂解液中磁分离VERAPREP浓缩液。

16.通过LC-MS吸出并测试1mL上清液样品

17.根据以下确定最终的生物标志物浓度：1)40mL尿液样品量；2)生物标志物的LC-MS定量；3)根据氘代内标物回收率调整报告的生物标志物值

捕获的或富集的生物标志物的选择性释放或裂解可以通过改变pH值(酸性pH值例如甘氨酸pH 2.5洗脱，然后中和，或碱性pH值10.0或更高)，使用可裂解的连接剂例如用还原剂如TCEP或DTT裂解的二硫键，或使用竞争性洗脱得以实现，竞争性洗脱例如摩尔过量的D-生物素与单体亲和素或摩尔过量的糖与伴刀豆球蛋白A，其竞争伴刀豆球蛋白A上的结合位点。

实施例5：低丰度生物标志物富集之前用于消除样品干扰物的样品预处理

下面描述了在富集低丰度生物标志物之前用于消除样品干扰物的样品预处理方案。在该方案中，样品用试剂A预处理，该试剂A包含与试剂B中的微粒完全相同的微粒，不同之处在于试剂A微粒上的捕获部分对要富集的生物标记物没有特异性。在用于消除样品干扰物的样品预处理后，从样品中以磁、物理地或化学地去除试剂A珠子。接下来，在没有干扰物的情况下，将干扰物消除的样品或游离样品加入试剂B或与试剂B混合以捕获和富集生物标记。

该方法在液体处理系统(例如Hamilton或Tecan)上是自动的，使用甲板上的磁体来捕获磁性的、顺磁性的或超顺磁性的微粒，例如96孔板和384孔板磁体：

1.样品架装载到系统上；

2.将样品吸出并分配到反应容器A例如试管、96孔板孔或384孔板孔中；

3.吸出混合试剂A(磁性微粒)并分配到反应容器A中，混合并温育，以捕获和消除样品特异性干扰物；

4.将反应容器A放置在磁体位置(例如，用于试管的单个磁体，或96孔或384孔磁体分离器)，以分离试剂A；

5.吸出经过预处理的样品并分配到反应容器B例如试管、96孔板孔或384孔板孔中；

6.将混合的试剂B添加到反应容器B中，混合并温育，以在不存在干扰物的情况下(通过试剂A样品预处理消除并去除)捕获生物标志物或富集生物标志物；

7.将反应容器B放置在磁体位置(例如，用于试管的单个磁体，或96孔或384孔磁体分离器)，以分离试剂A；

8.析出/去除并丢弃样品上清液和基质，以洗涤试剂B；

9.直接在测量系统中测试试剂B，以测量捕获的生物标志物，或从试剂B中裂解、洗脱或选择性释放的生物标志物，或从试剂B中裂解、洗脱或选择性释放的捕获部分-生物标志物复合物，或从试剂B中裂解、洗脱或选择性释放的(预标记的捕获部分)-生物标记复合物顺式，用于在测试系统中进行测量。

缩略语

ABEI N-(4-氨基丁基)-N-乙基异鲁米诺

ALP 碱性磷酸酶

BSA 牛血清白蛋白

Fab 抗体-结合片段

Fc 片段，可结晶的

HAAA 人抗-动物抗体

HAMA 人抗-小鼠抗体

HASA 人抗-绵羊抗体

IFU 使用说明书

IgG 抗体或免疫球蛋白

IgM 免疫球蛋白M

HRP 辣根过氧化物酶

LC-MS/MS 液相色谱串联-质谱

LDT 实验室开发的测试

Mab 单抗单克隆抗体

MASI 干扰物特异性测定制造

MFG IVD 制造商

PMP 超顺磁微粒

PBCT 初次血液采集管

RF 类风湿因子

RLU 相对光单位或测定响应信号

Sav 抗体链霉亲和素

STT 二次转移管

TAT 周转时间

WF 工作流程

定义

如本申请所用，“样品”或“生物样品”是指任何人或动物的血清、血浆(即，EDTA、肝素锂、柠檬酸钠)、血液、全血、加工血液、尿液、唾液、粪便(液体和固体)、精液或精液、羊水、脑脊髓液、细胞、组织、活检材料、DNA、RNA、或任何流体、可溶性固体或加工固体材料，以进行诊断、预后、筛查、风险评估、风险分层和监测例如治疗药物监测。在一些实施方式中，样品是大体积样品。在一些实施方式中，样品包括多种样品(例如，来自相同或不同受试者的一个以上样品。在一些实施方式中，样品包含在样品中以低丰度存在的生物标志物。

在一些实施方式中，将样品收集到初次血液采集管(PBCT)、二次转移管(SST)、24小时(24-hr)尿液收集装置、BD真空采血管屏障管、纳米容器、唾液收集管、血斑滤纸或任何收集管或装置例如用于粪便和精液，含有肝素钠、肝素锂或肝素铵的浅绿色顶或绿色顶血浆分离器管(PST)，含有柠檬酸钠(即3.2％或3.8％)或柠檬酸盐、茶碱、腺苷、双嘧达莫(CTAD)的浅蓝色顶管、用于血清学的或用于在玻璃(无添加剂)或塑料管(包含凝块活化剂)中收集血清的免疫血液学的红色顶管、用于在玻璃(无添加剂)或塑料管(包含凝结活化剂)中收集血清的化学的红色顶管、用于在分子诊断和病毒载量检测中测试血浆的含有EDTAK2、EDTA K3、液体EDTA溶液(即8％)、或EDTA K2/凝胶管的紫色淡紫色顶管、用于血库EDTA的粉红色顶管、含有草酸钾和氟化钠、氟化钠/EDTA或氟化钠(无抗凝剂，将产生血清样品)的灰色顶管、含有ACD溶液A或ACD溶液B的黄色顶管、宝蓝色顶(血清，无添加剂或肝素钠)、白色顶管、或任何颜色或试管类型，用于任何应用或诊断测试类型，不含添加剂或任何添加剂或其组合，用于血液采集。

在一些实施方式中，样品是具有挑战性的样品类型，例如尿液、24小时尿液、唾液和粪便，或者可能稀释或难以测量的目标生物标志物。例如，由于患者人群(例如，新生儿、小儿、老年、孕妇、肿瘤、自身免疫疾病)，生物样品可能是具有挑战性的。例如，某些生物标志物太稀或浓度太低，例如在循环中或在尿液中，以致不能被现有的POCT和中央实验室分析仪可靠地检测和准确且精确地测量。在一些实施方式中，具有挑战性的样品是脑脊髓液(CSF)。

如本申请所用，“收集装置”可以是初次血液采集管(PBCT)、24小时尿液收集装置、尿液收集装置、唾液收集管、粪便收集装置、精液收集装置、血液采集袋，或在添加样品之前的任何样品收集管或装置。

PBCT和二次转移管(SST)可以是Becton Dickinson(BD)、Greiner、VWR和SigmaAldrich等公司的任何市售标准或定制收集管(带有或不带有凝胶分离器)、玻璃管、塑料管、含有肝素钠、肝素锂或肝素铵的浅绿色顶或绿色顶血浆分离器管(PST)，含有柠檬酸钠(即3.2％或3.8％)或柠檬酸盐、茶碱、腺苷、双嘧达莫(CTAD)的浅蓝色顶管、用于血清学的或用于在玻璃(无添加剂)或塑料管(包含凝块活化剂)中收集血清的免疫血液学的红色顶管、用于在玻璃(无添加剂)或塑料管(包含凝结活化剂)中收集血清的化学的红色顶管、用于在分子诊断和病毒载量检测中测试血浆的含有EDTA K2、EDTA K3、液体EDTA溶液(即8％)、或EDTA K2/凝胶管的紫色淡紫色顶管、用于血库EDTA的粉红色顶管、含有草酸钾和氟化钠、氟化钠/EDTA或氟化钠(无抗凝剂，将产生血清样品)的灰色顶管、含有ACD溶液A或ACD溶液B的黄色顶管、宝蓝色顶(血清，无添加剂或肝素钠)、白色顶管、或任何颜色或试管类型，用于任何应用或诊断测试类型，不含添加剂或任何添加剂或其组合，用于血液采集。

如本申请所用，“存储装置”或“转移装置”是指接收在收集设备中的样品和/或收集其他组分的装置。储存或转移装置可以是塑料或玻璃管、小瓶、瓶、烧杯、烧瓶、袋、罐、微量滴定板、ELISA板、96-孔板、384-孔板、1536-孔板、比色杯、反应模块、储液罐、或适合于容纳、存储或处理液体样品的任何容器。

如本申请所提到的，“诊断测试”包括但不限于任何基于抗体的诊断测试、基于非抗体的诊断测试、用于随后通过色谱法、分光光度法和质谱法(即HPLC、MS、LCMS、LC-MS/MS)进行分析的样品预处理方法或装置，例如免疫提取(IE)和固相萃取(SPE)、放射免疫测定(RIA)、酶联免疫测定(ELISA)、化学发光免疫测定(CLIA)、分子诊断、侧流(LF)、即时护理(PoC)、直接面向消费者(DTC)、CLIA和CLIA豁免的测试和设备、仅用于研究测试(RUO)、体外诊断(IVD)测试、实验室开发的测试(LDT)、伴随诊断以及用于诊断、预后、筛查、风险评估、风险分层和监测例如治疗药物监测的任何测试。在一些实施例中，诊断测试包括短周转时间(STAT)诊断测试、门诊测试、侧流测试、即使护理(PoC)测试、分子诊断测试、HPLC、MS、LCMS、LC-MS/MS、放射免疫测定(RIA)、酶联免疫测定(ELISA)、化学发光免疫测定(CLIA)、CLIA和CLIA豁免测试以及用于诊断、预后、筛查、风险评估、风险分层、治疗监测和治疗药物监测。

Claims

1.一种从生物样品中去除生物标志物的方法，所述方法包括：

a)将所述样品与多种颗粒合并，其中每种颗粒独立地包含捕获部分(即，捕获部分的类型或种类)，以提供混合物；

b)混合所述混合物，以提供一种或多种生物标志物的颗粒复合物；和

c)去除或分离所述颗粒复合物，以提供消除的溶液；

从而从所述生物样品中去除生物标志物。

2.一种从生物样品中分离生物标志物的方法，所述方法包括：

c)去除或分离所述颗粒复合物，以提供消除的溶液和富集的分离物；

从而从所述生物样品中分离生物标志物。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，在所述样品与所述多种颗粒合并之前，将调节剂添加到所述生物样品中。

4.根据权利要求3所述的方法，其中，所述调节剂是pH调节剂、摩尔调节剂、干扰阻断剂或解放或释放剂。

5.根据权利要求1或2所述的方法，其中，在对所述生物样品进行诊断测试之前执行所述方法。

6.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述多种颗粒包括多种捕获部分(例如，多种颗粒各自独立地共价或非共价地结合到多种捕获部分上)。

7.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述多种颗粒包括包含第一捕获部分的第一颗粒。

8.根据权利要求7所述的方法，其中，所述多种颗粒包括包含第二捕获部分的第二颗粒。

9.根据权利要求8所述的方法，其中，所述多种颗粒包括包含第三捕获部分的第三颗粒。

10.根据权利要求9所述的方法，其中，所述多种颗粒包括包含第四捕获部分的第四颗粒。

11.根据权利要求10所述的方法，其中，所述多种颗粒包括包含第五捕获部分的第五颗粒。

12.根据权利要求11所述的方法，其中，所述多种颗粒包括包含第六捕获部分的第六颗粒。

13.根据权利要求12所述的方法，其中，所述多种颗粒包括包含第七捕获部分的第七颗粒。

14.根据权利要求13所述的方法，其中，所述多种颗粒包括包含第八捕获部分的第八颗粒。

15.根据权利要求14所述的方法，其中，所述多种颗粒包括包含第九捕获部分的第九颗粒。

16.根据权利要求15所述的方法，其中，所述多种颗粒包括包含第十捕获部分的第十颗粒。

17.根据权利要求16所述的方法，包括从所述生物样品中去除或分离第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九或第十生物标志物。

18.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述方法还包括向所述混合物中加入裂解试剂或释放剂以提供富集的分离物。

19.根据权利要求1或2所述的方法，还包括对生物标志物进行诊断测试(例如，在所述的去除方法或分离方法之后)。

20.根据权利要求19所述的方法，其中，所述诊断测试同时检测两种或多种生物标志物的存在或不存在。

21.根据权利要求8所述的方法，其中，所述第一颗粒在尺寸、形状、化学、颜色或其他特征上与所述第二颗粒不同。

22.根据权利要求9所述的方法，其中，所述第一颗粒在尺寸、形状、化学、颜色或其他特征上与所述第三颗粒不同。

23.根据权利要求10所述的方法，其中，所述第一颗粒在尺寸、形状、化学、颜色或其他特征上与所述第四颗粒不同。

24.根据权利要求11所述的方法，其中，所述第一颗粒在尺寸、形状、化学、颜色或其他特征上与所述第五颗粒不同。

25.根据权利要求12所述的方法，其中，所述第一颗粒在尺寸、形状、化学、颜色或其他特征上与所述第六颗粒不同。

26.根据权利要求13所述的方法，其中，所述第一颗粒在尺寸、形状、化学、颜色或其他特征上与所述第七颗粒不同。

27.根据权利要求14所述的方法，其中，所述第一颗粒在尺寸、形状、化学、颜色或其他特征上与所述第八颗粒不同。

28.根据权利要求15所述的方法，其中，所述第一颗粒在尺寸、形状、化学、颜色或其他特性上与所述第九颗粒不同。

29.根据权利要求16所述的方法，其中，所述第一颗粒在尺寸、形状、化学、颜色或其他特征上与所述第十颗粒不同。

30.根据权利要求21-29中任一项所述的方法，其中，所述特征是对所述的生物标志物的选择性、亲和力或亲合力。

31.根据权利要求21-29中任一项所述的方法，其中，所述尺寸是直径为50-1000nm(例如，100-500nm、200-600nm)。

32.根据权利要求21-29中任一项所述的方法，其中，所述尺寸是直径为1-3微米。

33.根据权利要求1或2所述的方法，其中，第一颗粒群以比第二颗粒群更高的浓度存在。

34.根据权利要求33所述的方法，其中，第一颗粒与第二颗粒的比例为1：1、1：2、1：3、1：4、1：5、1：6、1：7、1：8、1：9、1：10。

35.根据权利要求7所述的方法，其中，所述第一颗粒以第一浓度存在。

36.根据权利要求8所述的方法，其中，所述第二颗粒以第二浓度存在。

37.根据权利要求9所述的方法，其中，所述第三颗粒以第三浓度存在。

38.根据权利要求10所述的方法，其中，所述第四颗粒以第四浓度存在。

39.根据权利要求11所述的方法，其中，所述第五颗粒以第五浓度存在。

40.根据权利要求12所述的方法，其中，所述第六颗粒以第六浓度存在。

41.根据权利要求13所述的方法，其中，所述第七颗粒以第七浓度存在。

42.根据权利要求14所述的方法，其中，所述第八颗粒以第八浓度存在。

43.根据权利要求15所述的方法，其中，所述第九颗粒以第九浓度存在。

44.根据权利要求16所述的方法，其中，所述第十颗粒以第十浓度存在。

45.根据权利要求7所述的方法，其中，所述第一颗粒是对照颗粒(例如，包含标记物或指示剂(例如，已知量、丰度的标记物或指示剂)的颗粒)。

46.根据权利要求45所述的方法，其中，所述标记物或指示剂提供样品的浓度或体积的测量。

47.根据权利要求45所述的方法，其中，所述标记物或指示剂提供产率或颗粒回收率的测量。

48.根据权利要求45所述的方法，其中，所述标记物或指示剂提供样品批号或批次号的指示。

49.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述生物标志物是生物素、HAMA、RF、嗜异性或抗SAv。

50.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述生物标志物是细菌感染的指示剂。

51.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述生物标志物是细菌的捕获部分。

52.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述去除或分离所述颗粒复合物包括裂解、洗脱或选择性释放捕获部分-生物标志物复合物。

53.根据权利要求52所述的方法，其中，所述捕获部分包含在测试系统中用于测量的信号检测分子。

54.根据权利要求1或2所述的方法，其中，在所述合并步骤a)之前，对所述样品进行预处理以去除或消除干扰物，包括：(i)将所述样品与包含对所述生物标志物缺乏特异性的捕获部分的颗粒合并，以提供混合物；(ii)混合所述混合物，以提供所述干扰物的颗粒复合物；和(iii)去除或消除所述颗粒复合物，以提供消除的溶液。

55.一种试剂盒，包括多种颗粒、磁体、管和说明书。

56.一种检测患者中尿皮质素III肽、尿调节素肽、血清类粘蛋白1肽、激肽释放酶1肽、IL-6、IL-10、高敏感性C反应蛋白或其组合的方法，所述方法包括：

a.从人类患者获得样品；和

b.用多种颗粒检测样品中是否存在尿皮质素III肽、尿调节素肽、血清类粘蛋白1肽、激肽释放酶1肽、IL-6、IL-10、高敏感性C反应蛋白或其组合，并检测尿皮质素III肽、尿调节素肽、血清类粘蛋白1肽、激肽释放酶1肽、IL-6、IL-10、高灵敏度C反应蛋白或其组合与多种颗粒之间的结合。

57.一种诊断患者阻塞性睡眠呼吸暂停的方法，所述方法包括：

a.从人类患者获得样品；

b.通过使样品与多种颗粒接触，检测样品中是否存在尿皮质素III肽、尿调节素肽、血清类粘蛋白1肽、激肽释放酶1肽、IL-6、IL-10、高灵敏度C反应蛋白或其组合，并检测尿皮质素III肽、尿调节素肽、血清类粘蛋白1肽、激肽释放酶1肽、IL-6、IL-10、高灵敏度C反应蛋白或其组合与多种颗粒之间的结合；和

c.当检测到样品中存在尿皮质素III肽、尿调节素肽、血清类粘蛋白1肽、激肽释放酶1肽、IL-6、IL-10、高灵敏度C反应蛋白或其组合时，诊断患者患有阻塞性睡眠呼吸暂停。

58.根据权利要求56或57所述的方法，其中，所述患者是人类。

59.根据权利要求58所述的方法，其中，所述人类的年龄为约9至约2岁。

60.根据权利要求56或57所述的方法，其中，所述方法包括同时检测是否存在由尿皮质素III肽、尿调节素肽，血清类粘蛋白1肽和激肽释放酶1肽、IL-6、IL-10、高灵敏度C反应蛋白组成的组中的两种或多种蛋白质。