JP4018746B1 - 免疫学的測定法およびチップ - Google Patents

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Abstract

本発明は、チップ上での実施に適した免疫学的測定法を提供する。反応チャンバ７において測定対象抗原２と抗体３とが結合した状態にある抗原抗体複合体を得た後、試料溶液８を用いて反応チャンバ７を洗浄することにより、抗原抗体複合体と、測定対象抗原に結合していない抗体とを分離する、免疫学的測定法とする。本発明によれば、タンパク質などの測定対象抗原を含有しない状態にある、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファーに代表される洗浄液を使用することなしに、測定対象抗原の量を反映したシグナルを、洗浄液を使用した場合に匹敵する精度で検出できる程度にまで、反応チャンバを洗浄することができる。これにより、洗浄液をチップの外部から供給したりチップ上に予め保持させたりする必要がなくなるため、チップ上で容易に免疫学的測定法を実施できる。
【選択図】図２

Description

本発明は、抗原抗体反応を利用して試料溶液中の特定成分の量を測定する免疫学的測定法に関し、特に、チップ上での実施に適した免疫学的測定法に関する。また、本発明は、この免疫学的測定法の実施に適したチップに関する。
生体試料（例えば、血液）に含有されるアレルギー反応の原因物質、ウイルスおよび細菌などのタンパク質を、高精度に同定および定量する方法として、免疫学的測定法が注目されている。
免疫学的測定法は、免疫比濁法と、標識化免疫法とに大別される。免疫比濁法は、抗原抗体反応によって生じる抗原抗体複合体に起因する、試料溶液の濁度変化を測定する方法である。標識化免疫法は、標識物質で標識された抗体を使用し、抗原抗体反応後の標識物質量の変化を測定する方法である。
標識化免疫法は、標識物質の種類に応じて細分化される。例えば、標識物質として放射性同位元素を使用するラジオイムノアッセイ、酵素を使用するエンザイムイムノアッセイ（ＥＩＡ）、蛍光体を使用する蛍光イムノアッセイなどが挙げられる。ＥＩＡは、他の標識化免疫法と比較すると、標識物質の安全性が高く、簡便な操作によって実施でき、測定精度も高いため、盛んに利用されている。
代表的なＥＩＡとしては、固相酵素免疫検定法（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay；ＥＬＩＳＡ）が例示できる。ＥＬＩＳＡの一例について、図１を参照して説明する。
（工程１−Ａ：固相抗原の形成）
測定対象抗原のエピトープと同一のエピトープを有する捕獲抗原を含有する溶液を、反応チャンバ７に導入し、所定温度で所定時間保持することにより、当該捕獲抗原を反応チャンバ７の表面に吸着させる。その後、吸着させた捕獲抗原を、後の抗原抗体反応および酵素反応には関与しないタンパク質で覆う（ブロッキング）。これにより、反応チャンバ７の内部に固相抗原６を形成する。固相抗原６は、反応チャンバ７の表面に固定された状態にあり、後述する洗浄によって反応チャンバ７から除去されない。
（工程１−Ｂ：測定対象抗原および固相抗原と、抗体との結合反応）
試料溶液９に、測定対象抗原２に特異的に結合する抗体３を添加する。抗体３は、標識物質（例えば酵素）４で標識された状態にある。その後、当該抗体３を含有する試料溶液９を、反応チャンバ７に導入する。これにより、反応チャンバ７において、固相抗原６および測定対象抗原２と、抗体３との間で、抗原抗体反応が進行する。
（工程１−Ｃ：未反応の抗体および抗原抗体複合体の除去）
Tris-HClバッファーに代表される洗浄液１０を用い、反応チャンバ７の内部を洗浄する。これにより、測定対象抗原２に抗体３が結合することにより形成された抗原抗体複合体と、固相抗原６に結合しなかった抗体３とが、反応チャンバ７から除去され、固相抗原６と抗体３との結合体が、反応チャンバ７に残される。
続いて、反応チャンバ７に残された、固相抗原６と抗体３との結合体が有する標識物質４の量を測定する。当該測定は、例えば次のようにして実施される。まず、標識物質４と反応する測定用試薬（例えば、酵素の基質）を含有する溶液を調製する。次に、当該溶液を反応チャンバ７に導入することにより、反応チャンバ７において、固相抗原６と抗体３との結合体と、測定用試薬と、を含有する測定溶液を得る。測定溶液中で、測定用試薬と標識物質４との反応を進行させた後、反応生成物の量を反映したシグナルを検出する。
試料溶液９中の測定対象抗原２の量は、当該測定の結果、固相抗原６の量、および工程１−Ｂにおいて反応チャンバ７に導入した試料溶液９の量に基づき算出される。
試料溶液中の測定対象物質の量を、微量の試料溶液を用い、短時間に測定する観点から、チップ型のバイオセンサが注目されている。例えば、特開平２―０６２９５２号公報は、絶縁性の基板、基板上に配置された電極系、電極系上に配置された酵素反応層、ならびに電極系および酵素反応層が露出するように基板上に配置された、切り欠き部を有する絶縁層を備えた、チップ型のバイオセンサを開示する。酵素反応層は、酸化還元酵素および電子メディエーターなどに代表される、酵素サイクリング反応を誘導するための測定用試薬を含有する。酸化還元酵素としては、測定対象物質を基質とする酵素が使用される。例えば、グルコース量を測定する場合はグルコースオキシダーゼが、また例えば、コレステロール量を測定する場合はコレステロールオキシダーゼが使用される。このバイオセンサでは、切り欠き部に試料溶液を滴下し、測定用試薬を試料溶液に溶解させることにより、電子メディエーターを介した測定対象物質と酵素との反応（酵素サイクリング反応）が進行する。試料溶液中の測定対象物質の量は、酵素反応により還元された電子メディエーターを電気化学的に酸化することにより得られる、酸化電流値に基づいて算出される。
図１に示すような従来の免疫学的測定法では、上記のとおり、Tris-HClバッファーに代表される洗浄液を用いて工程１−Ｃを実施する。このため、当該免疫学的測定法をチップ上で実施するためには、洗浄液をチップの外部から供給する、または洗浄液を予めチップ上に保持させておく必要がある。しかし、洗浄液を外部から供給する場合、当該供給のための手間が余分にかかる。洗浄液をチップ上に保持させる場合は、当該液を、密封状態で、かつ洗浄時には反応チャンバに容易に導入できる状態で、チップ上に保持させることが望ましい。しかし、このような保持状態をチップ上で形成することは容易ではない。
本発明は、Tris-HClバッファーに代表される洗浄液をチップの外部から供給したりチップ上に予め保持させたりする必要のない、チップ上での実施に適した免疫学的測定法を提供することを目的とする。また、本発明は、この免疫学的測定法の実施に適したチップを提供することを目的とする。また、本発明は、このチップを用いた測定方法を提供することを目的とする。
従来、免疫学的測定法において、反応チャンバの洗浄には、タンパク質などの測定対象物質を含有しない、Tris-HClバッファーに代表される洗浄液を使用することが重要と考えられていた。ところが、本発明者は、意外にも、Tris-HClバッファーに代表される洗浄液に代えて、タンパク質などの測定対象物質を含有する生体試料を用いて反応チャンバを洗浄することによっても、測定対象物質の量を反映したシグナルを、洗浄液を用いた場合に匹敵する程度に優れた精度で検出できることを見出した。
本発明は、試料溶液に含まれる測定対象抗原の量を、チップを用いて測定する方法であって、前記チップは、反応チャンバ、洗浄液保持チャンバ、廃液チャンバ、および前記試料溶液が注入される注入孔を有し、前記注入孔と前記反応チャンバとの間は第１流路により接続されており、前記注入孔と前記洗浄液保持チャンバとの間は第２流路により接続されており、前記洗浄液保持チャンバと前記反応チャンバとの間は第３流路により接続されており、前記反応チャンバと前記廃液チャンバとの間は第４流路により接続されており、前記方法は、前記注入孔から前記試料溶液を注入し、前記試料溶液を、前記第１流路を通って前記反応チャンバと、前記第２流路を通って前記洗浄液保持チャンバに分ける工程、前記反応チャンバ内で、前記試料溶液に含まれる測定対象抗原と、前記測定対象抗原に特異的に結合する抗体とを結合させ、抗原抗体複合体を得る工程、前記反応チャンバに、前記洗浄液保持チャンバに保持されている前記試料溶液を、前記第３流路を介して注入し、前記抗原抗体複合体を有する前記反応チャンバを洗浄することにより、ｉ）前記抗原抗体複合体、およびii）前記測定対象抗原と結合していない前記抗体、から選ばれる一方を前記反応チャンバに残すとともに、もう一方を前記廃液チャンバに移動させて、前記抗原抗体複合体と、前記測定対象抗原と結合していない前記抗体と、を分離する工程、前記抗原抗体複合体または前記測定対象抗原と結合していない前記抗体の量を測定する工程、および測定された前記抗原抗体複合体または前記測定対象抗原と結合していない前記抗体の量から、前記試料溶液に含まれる前記測定対象抗原の量を算出する工程を有する、方法を提供する。
本発明は、その別の側面から、試料溶液に含まれる測定対象抗原の量を測定する方法であって、反応チャンバにおいて前記測定対象抗原と、前記測定対象抗原に特異的に結合する抗体とを結合させ、抗原抗体複合体を得る結合工程、前記試料溶液により前記反応チャンバを洗浄することにより、前記抗原抗体複合体と、前記測定対象抗原と結合していない前記抗体と、を分離する洗浄分離工程、前記抗原抗体複合体または前記測定対象抗原と結合していない前記抗体の量を測定する測定工程、および測定された前記抗原抗体複合体または前記測定対象抗原と結合していない前記抗体の量から、前記試料溶液に含まれる前記測定対象抗原の量を算出する工程を有する、方法を提供する。
本発明は、その別の側面から、試料溶液に含まれる測定対象抗原の量を測定するためのチップであって、反応チャンバ、洗浄液保持チャンバ、廃液チャンバおよび前記試料溶液が注入される注入孔を有し、前記注入孔と前記反応チャンバとの間は第１流路により接続されており、前記注入孔と前記洗浄液保持チャンバとの間は第２流路により接続されており、前記洗浄液保持チャンバと前記反応チャンバとの間は第３流路により接続されており、前記反応チャンバと前記廃液チャンバとの間は第４流路により接続されており、前記注入孔から注入された前記試料溶液は、前記第１流路を通って前記反応チャンバと、前記第２流路を通って前記洗浄液保持チャンバとに流れ、前記反応チャンバ内では、前記測定対象抗原と、前記測定対象抗原に特異的に結合する抗体とを結合させ、抗原抗体複合体が得られ、前記反応チャンバには、前記洗浄液保持チャンバに保持されている前記試料溶液が前記第３流路を通って注入され、前記抗原抗体複合体を有する前記反応チャンバを洗浄することにより、ｉ）前記抗原抗体複合体、およびii）前記測定対象抗原と結合していない前記抗体、から選ばれる一方が前記反応チャンバに残されるとともに、もう一方が前記廃液チャンバに移動して、前記抗原抗体複合体と、前記測定対象抗原と結合していない前記抗体と、が分離される、チップを提供する。
本発明によれば、免疫学的測定法の実施に際し、Tris-HClバッファーに代表される洗浄液を使用することなしに、測定対象物質の量を反映したシグナルを検出できる程度にまで、反応チャンバを洗浄することができる。
本発明の免疫学的測定法の一例について、図２の工程図を用いて説明する。
（工程２−Ａ：固相抗原の形成）
試料溶液中に含有される特定のタンパク質（測定対象抗原２）のエピトープと同一のエピトープを有する捕獲抗原を、反応チャンバ７の表面に所定量固定することにより、固相抗原６を形成する。捕獲抗原の固定は、例えば、従来型のＥＬＩＳＡにおける工程１−Ａと同様にして行えばよい。
反応チャンバ７の材質としては、ポリスチレン、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリカーボネートおよびポリジメチルシロキサンなどの樹脂、ガラス、磁性体などを例示できる。反応チャンバ７は、チューブ型、マイクロプレートに代表されるウェル型などの、液体を保持可能な形状を有することが望ましい。
（工程２−Ｂ：結合工程）
試料溶液の一部１を所定量分注する。試料溶液としては、血液、尿、唾液、汗、涙などの液状の生体試料を例示できる。試料溶液の一部１に、標識物質４によって標識された抗体３を添加する。抗体３は、測定対象抗原２に特異的に結合する一次抗体である。試料溶液の他の一部８は、抗体３を添加しない状態で保存する。抗体３は、市販の抗体であってもよいし、実験動物を利用して独自に作成した抗体であってもよい。抗体３は、ポリクローナル抗体であってよいが、抗原抗体反応の特異性および感度などを高める観点からは、モノクローナル抗体が好ましい。測定対象抗原２としては、Ｃ反応性蛋白（ＣＲＰ）、血清アミロイドＡ、トロポニンＴ、クレアチニンキナーゼＭＢ、レチノール結合蛋白などの、臨床的な注目度の高いタンパク質を例示できる。標識物質４は、酵素が好ましいが、蛍光色素、さらには放射性同位体であってもよい。
標識された抗体３を添加した直後の状態にある、試料溶液の一部１を、固相抗原６が固定された反応チャンバ７に導入する。この操作により、試料溶液の一部１が反応チャンバ７に導入される。導入後の試料溶液の一部１を、所定温度で所定時間、反応チャンバ７に保持する。これにより、固相抗原６および測定対象抗原２と、抗体３との間で抗原抗体反応が競合的に進行し、反応チャンバ７において、測定対象抗原２と抗体３との結合体である抗原抗体複合体と、固相抗原６と抗体３との結合体とが形成される。固相抗原６と抗体３との結合体は、測定対象抗原２に結合していないため、本明細書では、抗体３と同様「測定対象抗原と結合していない抗体」として扱う。このように、本発明の免疫学的測定法は、反応チャンバに固相抗原が固定されており、結合工程において、抗原抗体複合体と、固相抗原に抗体が結合した状態にある、測定対象抗原と結合していない抗体と、を得るようにしてよい。
反応チャンバ７における抗原抗体反応は、非競合反応であってもよい。非競合反応は、標識された抗体３を添加した試料溶液の一部１を、反応チャンバ７に導入する前に所定温度で所定時間保持し、測定対象抗原２と標識された抗体３との反応を定常状態に到達させた後、当該試料溶液の一部１を反応チャンバ７に導入し、測定対象抗原２に結合していない抗体３と、固相抗原６とを反応させることより進行させればよい。抗原抗体反応を進行させるための温度および時間は、抗原および抗体の種類に応じて適宜設定すればよい。以降の抗原抗体反応においても同様である。
（工程２−Ｃ：洗浄分離工程）
結合工程（工程２−Ｂ）において保存した、試料溶液の他の一部８を用いて、反応チャンバ７を洗浄する。当該洗浄は、例えば、次のように実施すればよい。まず、ピペットを使用し、反応チャンバ７の内部の試料溶液の一部１を除去する。次に、試料溶液の他の一部８を、ピペットを用いて反応チャンバ７の内部に滴下し、ピペッティングを数回行う。その後、試料溶液の他の一部８を反応チャンバ７から除去する。これにより、抗原抗体複合体が反応チャンバ７から取り除かれるとともに、測定対象抗原と結合していない抗体が反応チャンバ７に残され、結合工程（工程２−Ｂ）において得た、抗原抗体複合体と、測定対象抗原と結合していない抗体と、が分離される。こうして、Tris-HClバッファーに代表される洗浄液を使用せずに、試料溶液を用いて反応チャンバを洗浄する。上記のとおり、従来、反応チャンバの洗浄には、Tris-HClバッファーに代表される洗浄液を使用することが重要と考えられていた。抗原抗体複合体と、測定対象抗原と結合していない抗体と、を夾雑物なしに分離するためである。ところが、こうして試料溶液を用いて反応チャンバを洗浄しても、抗原抗体複合体と、測定対象抗原と結合していない抗体と、を高精度に分離できるようである。後述する実施例に示すように、Tris-HClバッファーに代表される洗浄液を使用して反応チャンバを洗浄した場合に匹敵する程度に優れた精度で、測定対象物質の量を反映したシグナルを検出できるためである。
（測定工程）
反応チャンバ７に残された、測定対象抗原と結合していない抗体における標識物質４の量を測定する。当該測定は、例えば次のように実施すればよい。まず、測定用試薬を含有した溶液を調製する。測定用試薬は、標識物質４の種類に応じて選択すればよい。例えば、標識物質４が酵素であれば、当該酵素の基質とすればよい。続いて、当該溶液を反応チャンバ７に導入し、反応チャンバ７において、測定対象抗原と結合していない抗体と測定用試薬とを含有する測定溶液を得る。測定溶液中で、測定対象抗原と結合していない抗体における標識物質４と測定用試薬との反応を進行させた後、公知の光学的測定手段および電気化学的測定手段などを用いて、反応生成物の量を反映するシグナル量を検出する。
（算出工程）
測定工程で得た測定結果に基づき、測定対象抗原の量を算出する。より具体的には、当該測定結果、反応チャンバ７に固定した固相抗原６の量、および結合工程（工程２−Ｂ）において反応チャンバに導入した試料溶液の一部１の量に基づき、測定対象抗原２の量を算出する。測定対象抗原の量とは、当該量に関連付けられる物理量、例えば濃度であってよい。こうして、測定工程において測定された、測定対象抗原と結合していない抗体の量から、または後述するように抗原抗体複合体の量から、試料溶液に含まれる測定対象抗原の量を算出する。
本発明の免疫学的測定法の別例について、図５の工程図を用いて説明する。この例は、抗体と測定対象抗原との抗原抗体反応を、サンドイッチ法によって実施する。
（工程５−Ａ：固相抗体の形成）
試料溶液中に含有される測定対象抗原２に結合する捕獲抗体を、反応チャンバ７の表面に所定量固定することにより、固相抗体１９を形成する。捕獲抗体の固定は、例えば、図２に示す免疫学的測定法における工程２−Ａと同様にして行えばよい。
（工程５−Ｂ〜Ｄ：結合工程）
試料溶液を所定量分注する。これにより、試料溶液の一部１および試料溶液の他の一部８を用意する。
試料溶液の一部１を、固相抗体１９が固定された反応チャンバ７に導入する（工程５−Ｂ）。この操作により、試料溶液の一部１が反応チャンバ７に導入される。導入した試料溶液の一部１を、反応チャンバ７において、所定温度で所定時間保持する。これにより、固相抗体１９と測定対象抗原２との間で抗原抗体反応が進行し、反応チャンバ７において、測定対象抗原２と固相抗体１９との結合体が形成される。
続いて、試料溶液の他の一部８を用いて、反応チャンバ７を洗浄する（工程５−Ｃ）。この際、試料溶液の他の一部８は、全てを使用せず、後述する洗浄分離工程（工程５−Ｅ）において使用するために残しておく。当該洗浄（工程５−Ｃ）は、図２に示す免疫学的測定法における工程２−Ｃと同様にして実施すればよい。ただし、試料溶液の当該他の一部８は、測定対象抗原２を含有するため、当該測定対象抗原２と固相抗体１９との間の抗原抗体反応が進行することがない程度に素早く、反応チャンバ７から除去することが望ましい。当該洗浄（工程５−Ｃ）により、工程５−Ｂにおいて固相抗体１９に結合しなかった測定対象抗原２が、反応チャンバ７から取り除かれ、測定対象抗原２と固相抗体１９との結合体が、反応チャンバ７に残される。
その後、溶液３０を反応チャンバ７に導入する。溶液３０は、標識物質４によって標識された抗体３を、測定対象抗原２のエピトープと同一のエピトープを有するタンパク質を含有しない溶媒に所定量添加することにより調製する。抗体３は、固相抗体１９に結合した状態にある測定対象抗原２に対しても結合できる一次抗体を使用する。溶液３０の溶媒としては、Tris-HClバッファーを例示できる。導入した溶液３０を、反応チャンバ７において、所定温度で所定時間保持する（工程５−Ｄ）。これにより、固相抗体１９に結合した状態にある測定対象抗原２と、標識された抗体３との間で抗原抗体反応が進行する。当該抗原抗体反応により、反応チャンバ７において、固相抗体１９と測定対象抗原２と抗体３との結合体である抗原抗体複合体と、標識された抗体３の残部２１である、測定対象抗原と結合していない抗体とが得られる。抗体３の残部２１は、反応チャンバ７の表面から遊離した状態で、溶液３０中に存在する。
このように、本発明の免疫学的測定法は、反応チャンバに固相抗体が配置されており、結合工程において、固相抗体および測定対象抗原を結合させ、さらに、固相抗体に結合した状態にある測定対象抗原に、抗体の一部を結合させることにより、固相抗体と測定対象抗原と抗体の上記一部との結合体である、抗原抗体複合体と、抗体の残部である、測定対象抗原と結合していない抗体と、を得るようにしてよい。
（工程５−Ｅ：洗浄分離工程）
工程５−Ｃにおいて残しておいた、試料溶液の他の一部８を用いて、反応チャンバ７を洗浄する。当該洗浄は、図２に示す免疫学的測定法における工程２−Ｃと同様にして実施すればよい。これにより、測定対象抗原と結合していない抗体が反応チャンバ７から取り除かれ、抗原抗体複合体が反応チャンバ７に残される。こうして、試料溶液を用いて反応チャンバを洗浄することにより、Tris-HClバッファーに代表される洗浄液を使用せずに、工程５−Ｄにおいて得た、抗原抗体複合体と、測定対象抗原と結合していない抗体と、を分離する。当該分離の精度も、Tris-HClバッファーに代表される洗浄液を使用して反応チャンバを洗浄した場合に匹敵する程度に優れると考えられる。
（測定工程）
反応チャンバ７に残された、抗原抗体複合体における標識物質４の量を測定する。当該測定は、図２に示す免疫学的測定法における測定工程と同様に実施すればよい。
（算出工程）
測定工程で得た測定結果に基づき、測定対象抗原の濃度を算出する。より具体的には、当該測定結果、反応チャンバ７に固定した固相抗体１９の量、および結合工程（工程５−Ｂ）において反応チャンバ７に導入した試料溶液の一部１の量に基づき、測定対象抗原２の量を算出する。測定対象抗原の量とは、上記のとおり、当該量に関連付けられる物理量、例えば濃度であってよい。
本発明の免疫学的測定法は、Tris-HClバッファーに代表される洗浄液を使用した場合に匹敵する程度に、測定対象物質の濃度を反映したシグナルを検出できる限り、操作および使用する器具を適宜変更してよい。例えば、図２および５に示す免疫学的測定法では、抗原抗体複合体または測定対象抗原と結合していない抗体を得るための一次抗体を標識物質で標識した場合について説明したが、これに代えて、図３の概念図に示すように、抗原抗体複合体または測定対象抗原と結合していない抗体を得るための一次抗体２２は非標識とし、当該非標識の一次抗体２２に結合させる二次抗体１８を標識物質で標識してもよい。また、図２および５に示す免疫学的測定法では、洗浄分離工程後に反応チャンバ７に残された、抗原抗体複合体および測定対象抗原と結合していない抗体から選ばれる一方を対象として測定工程を実施する場合について説明したが、これに代えて、洗浄分離工程により反応チャンバ７から除去された、抗原抗体複合体および測定対象抗原と結合していない抗体から選ばれるもう一方を対象として測定工程を実施してもよい。また、本発明の免疫学的測定法は、上記のとおり、チップ上での実施を容易にする観点から、反応チャンバとして、マイクロプレートに代表される、液体を保持可能な形状を有する基体を使用することが望ましいが、これに代えて、樹脂ビーズおよび磁性ビーズなどのビーズ体に代表される、液体の保持が容易でない形状を有する基体を使用することを排除しない。また、図２および５に示す免疫学的測定法では、試料溶液を分注し、反応チャンバにおいて抗原抗体反応を誘導するための溶液と、反応チャンバを洗浄するための溶液を準備する場合について説明したが、これに代えて、試料溶液を新たに採取することにより洗浄のための溶液を準備しても構わない。
図４は、本発明の免疫学的測定法の実施に適したチップの一例について説明するための図である。
チップ１００は、チップ基板１１と、当該基板１１に形成された、反応チャンバ１２、洗浄液保持チャンバ１４、廃液チャンバ１５および試料溶液の注入孔１７とを有する。チップ基板１１の材質としては、ＰＥＴに代表される、本発明の免疫学的測定法で使用する反応チャンバ７のための材質を例示できる。
注入孔１７と反応チャンバ１２は、チップ基板１１に形成された流路１６ａにより接続されている。また、注入孔１７と洗浄液保持チャンバ１４は、チップ基板１１に形成された流路１６ｂにより接続されている。流路１６ａおよび流路１６ｂは、互いに連通しない状態にある。このため、試料溶液を注入孔１７に注入すると、当該試料溶液は、流路１６ａを通って反応チャンバ１２と、流路１６ｂを通って洗浄液保持チャンバ１４とに分けられる。こうして、試料溶液の一部が反応チャンバ１２に送られ、また、試料溶液の他の一部が洗浄液保持チャンバ１４に送られて当該チャンバ１４に保持される。
反応チャンバ１２には、（１）固相抗原、および（２）固相抗体、から選ばれるいずれか一方が固定されていることが望ましい。試料溶液の上記一部が反応チャンバ１２に導入されるまでの経路上または反応チャンバ１２の内部には、試料溶液中の測定対象抗原に特異的に結合する一次抗体が、当該試料溶液に溶解できる状態で配置されていることが望ましい。一次抗体は、標識物質により標識された状態にあることが好ましい。試料溶液の上記一部が反応チャンバ１２に導入されると、（１）反応チャンバ１２に固相抗原が固定されている場合は、測定対象抗原と抗体との結合体である抗原抗体複合体と、固相抗原と抗体との結合体である、測定対象抗原と結合していない抗体とが得られ、（２）反応チャンバ１２に固相抗体が固定されている場合は、固相抗体と測定対象抗原と抗体との結合体である抗原抗体複合体と、抗体の残部である、測定対象抗原と結合していない抗体とが得られる。
反応チャンバ１２と廃液チャンバ１５は、チップ基板１１に形成された流路１６ｄにより接続されている。また、洗浄液保持チャンバ１４と反応チャンバ１２は、チップ基板１１に形成された流路１６ｃにより接続されている。洗浄液保持チャンバ１４に保持されている試料溶液（上記他の一部）は、反応チャンバ１２における抗原抗体反応が定常状態に達した後で、流路１６ｃを介して反応チャンバ１２に注入され、さらに流路１６ｄを介して反応チャンバ１２から廃液チャンバ１５に送られる。これにより、反応チャンバ１２に固相抗原が配置されている場合は、固相抗原と抗体との結合体である、測定対象抗原と結合していない抗体が、また、反応チャンバ１２に固相抗体が配置されている場合は、固相抗体と測定対象抗原と抗体との結合体である抗原抗体複合体が、それぞれ反応チャンバ１２に残される。こうして、試料溶液によって反応チャンバ１２が洗浄されることにより、抗原抗体複合体と、測定対象抗原と結合していない抗体と、が分離される。
このように、本発明のチップは、反応チャンバに固相抗原が固定されており、測定対象抗原と結合していない抗体が、固相抗原に結合した状態にあり、上記洗浄により、測定対象抗原と結合していない抗体が反応チャンバに残され、抗原抗体複合体が廃液チャンバに移動するようにしてよい。また、上述のように、本発明のチップは、反応チャンバに固相抗体が固定されており、抗原抗体複合体が、固相抗体と測定対象抗原と抗体との結合体であり、上記洗浄により、抗原抗体複合体が反応チャンバに残され、測定対象抗原と結合していない抗体が廃液チャンバに移動するようにしてもよい。
それぞれの流路を介した送液は、電気浸透流を利用する方法（例えば、Barkerら、Anal.Chem.;(Article);2000;72(24);5925-5929）、ポンプによる噴射力または吸引力を利用する方法（例えば、Hisamotoら、Anal.Chem.;(Article);2001;73(22);5551-5556）、遠心力を利用する方法（例えば、Duffyら、Anal.Chem.;(Article);1999;71(24);4669-4678）などの公知の送液方法により実施すればよい。
以上のように、本発明のチップによれば、Tris-HClバッファーに代表される洗浄液を使用しなくても抗原抗体複合体と、測定対象抗原と結合していない抗体と、を分離できる。本発明の免疫学的測定方法の説明で述べたように、当該分離の精度は高い。このため、本発明のチップによれば、Tris-HClバッファーに代表される洗浄液を使用した場合に匹敵する程度に、測定対象物質の濃度を反映したシグナルを検出できる。シグナルの検出は、反応チャンバ１２に残された抗原抗体複合体および測定対象抗原と結合していない抗体から選ばれる一方を対象として実施してもよいし、廃液チャンバ１５に移動させた、もう一方を対象として実施してもよい。このように廃液チャンバは、廃液の貯蔵以外に、酵素反応の実施にも使用でき、用語「廃液」によってその用途は限定されない。
本発明のチップは、Tris-HClバッファーに代表される洗浄液を使用した場合に匹敵する程度に良好な測定を実施できる限り、その設計を適宜変更してよい。例えば、抗原抗体反応をサンドイッチ法により実施できるように、標識された抗体を反応チャンバに導入するための流路を別途形成してよい。
以下、実施例により、本発明をさらに詳細に説明する。
（参考例）
まず、緩衝液（Tris-HClバッファー）を使用することにより、抗原抗体反応後の反応チャンバを洗浄した、参考例について説明する。
[試料溶液の調製]
４２．３μＭのＣＲＰ溶液をヒト正常血清と混合し、約０ｎＭ、１０ｎＭ、２０ｎＭ、５０ｎＭおよび１００ｎＭのＣＲＰの濃度を有する試料溶液を調製した。
[反応チャンバの作製]
厚さ１ｍｍのＰＥＴ板にφ５ｍｍの孔を複数個形成した。当該孔の一方の端部を覆うように、当該ＰＥＴ板の片面上に、別のＰＥＴ板を、公知の光硬化型接着剤（ラックストラック）を用いて貼り付けた。こうして反応チャンバを複数個作製した。
[ＣＲＰの固定化]
５０ｍＭのTris-HClバッファー（pH7.5）を用い、４２．３ｎＭのＣＲＰ溶液を調製した。当該ＣＲＰ溶液を、それぞれの反応チャンバに１０μＬずつ導入した。続いて、それぞれの反応チャンバを樹脂シート（９６穴用シート）でシールし、３５℃で１時間保持することにより、反応チャンバにＣＲＰを吸着させた。その後、反応チャンバを、５０ｍＭのTris-HClバッファー（pH7.5）を用いて洗浄した。次に、ブロッキング剤（生化学工業社製ApplieDuo, CatNo.200140)を、それぞれの反応チャンバに１０μＬずつ加え、３５℃で１時間保持した。こうして、吸着させたＣＲＰをブロッキングし、反応チャンバに固相抗原を形成した。その後、反応チャンバを、５０ｍＭのTris-HClバッファー（pH7.5）を用いて再度洗浄した。
[抗原抗体反応]
反応チャンバに、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）により標識された８８０ｎＭの抗ＣＲＰモノクローナル抗体１μＬ、試料溶液１μＬおよびヒト正常血清８μＬを導入し、３５℃で１５分間保持した。こうして固相抗原およびＣＲＰと、抗体との間の抗原抗体反応を進行させた。なお、それぞれの反応チャンバにおける、抗体の終濃度は、いずれも８８ｎＭであり、最終ＣＲＰ濃度はそれぞれ約０ｎＭ、１０ｎＭ、２０ｎＭ、５０ｎＭおよび１００ｎＭである。
[洗浄分離]
洗浄液２０μＬを反応チャンバに導入した後、除去した。洗浄液は、５０ｍＭのTris-HClバッファー（pH7.5）を用いた。こうして反応チャンバを洗浄した。これにより、ＣＲＰおよび抗体の結合体である抗原抗体複合体と、固相抗原および抗体の結合体である、測定対象抗原と結合していない抗体と、を分離した。より具体的には、抗原抗体複合体を反応チャンバから除去するとともに、測定対象抗原と結合していない抗体を反応チャンバに残した。
[測定]
それぞれの反応チャンバに、ｐ−ニトロフェニルリン酸溶液（Cygnus社製PNPP Liquid Substrate, CatNo.F008-1000; ｐＮＰＰ）１０μＬを導入した。これにより測定対象抗原と結合していない抗体におけるＡＬＰと、ｐＮＰＰとの間の酵素反応を進行させた。当該酵素反応の生成物であるｐ−ニトロフェノール（ｐＮＰ）の吸光度を、それぞれの反応チャンバから測定した。
（実施例）
洗浄液に代えて、試料溶液２０μＬを用いることにより、抗原抗体反応後の反応チャンバを洗浄したこと以外は、参考例と同様にして免疫学的測定を実施した。当該洗浄のための試料溶液は、抗原抗体反応を誘導するための試料溶液を分注することにより準備した。
（比較例）
抗原抗体反応後に反応チャンバを洗浄しなかったこと以外は、参考例と同様にして免疫学的測定を実施した。より具体的には、導入した洗浄液を除去しない状態で、さらにｐＮＰを反応チャンバに導入して、吸光度を測定した。
図６は、各例から得た吸光度の測定結果を示すグラフである。吸光度は、参考例における最終ＣＲＰ濃度が約０ｎＭである反応チャンバから得た吸光度を１とした場合の相対値として示す。
表１は、図６のグラフに基づき、それぞれの吸光度のバックグラウンドおよびバラツキの善し悪しについて評価した結果である。吸光度のバックグラウンドの評価は、平均値の絶対値が洗浄により最も下がっているものを「◎」、その次を「○」、バックグラウンドの影響をそのまま受けているものを「×」と表示した。吸光度のバラツキの評価は、標準偏差の最も小さいものを「◎」、それよりもやや大きいものを「○」、これらよりも明らかに大きいものを「×」と表示した。
Figure 0004018746
表１に示すように、反応チャンバの洗浄に試料溶液を使用しても、Tris-HClバッファーに代表される洗浄液を使用した場合に匹敵する程度に優れた洗浄効果が得られることがわかった。
本発明は、Tris-HClバッファーに代表される洗浄液をチップの外部から供給したりチップ上に予め保持させたりする必要がない免疫学的測定法を提供するものとして、チップ上での免疫学的測定法の実施が要求される各分野において多大な利用価値を有する。
図１は、従来の免疫学的測定法の一例について説明するための工程図である。 図２は、本発明の免疫学的測定法の一例について説明するための工程図である。 図３は、本発明の免疫学的測定法を、非標識の一次抗体および標識された二次抗体を用いて実施する場合の一例について説明するための図である。 図４は、本発明のチップの一例について説明するための図である。 図５は、抗体と測定対象抗原との抗原抗体反応を、サンドイッチ法により実施する場合の一例について説明するための工程図である。 図６は、吸光度の測定結果を示すグラフである。

Claims (9)

  1. 試料溶液に含まれる測定対象抗原の量を、チップを用いて測定する方法であって、
    前記チップは、反応チャンバ、洗浄液保持チャンバ、廃液チャンバ、および前記試料溶液が注入される注入孔を有し、
    前記注入孔と前記反応チャンバとの間は第１流路により接続されており、
    前記注入孔と前記洗浄液保持チャンバとの間は第２流路により接続されており、
    前記洗浄液保持チャンバと前記反応チャンバとの間は第３流路により接続されており、
    前記反応チャンバと前記廃液チャンバとの間は第４流路により接続されており、
    前記方法は、
    前記注入孔から前記試料溶液を注入し、前記試料溶液を、前記第１流路を通って前記反応チャンバと、前記第２流路を通って前記洗浄液保持チャンバに分ける工程、
    前記反応チャンバ内で、前記試料溶液に含まれる測定対象抗原と、前記測定対象抗原に特異的に結合する抗体とを結合させ、抗原抗体複合体を得る工程、
    前記反応チャンバに、前記洗浄液保持チャンバに保持されている前記試料溶液を、前記第３流路を介して注入し、前記抗原抗体複合体を有する前記反応チャンバを洗浄することにより、
    ｉ）前記抗原抗体複合体、および
    ii）前記測定対象抗原と結合していない前記抗体、
    から選ばれる一方を前記反応チャンバに残すとともに、もう一方を前記廃液チャンバに移動させて、前記抗原抗体複合体と、前記測定対象抗原と結合していない前記抗体と、を分離する工程、
    前記抗原抗体複合体または前記測定対象抗原と結合していない前記抗体の量を測定する工程、および
    測定された前記抗原抗体複合体または前記測定対象抗原と結合していない前記抗体の量から、前記試料溶液に含まれる前記測定対象抗原の量を算出する工程
    を有する、方法。
  2. 前記反応チャンバに固相抗原が固定されており、前記測定対象抗原と結合していない前記抗体が、前記固相抗原に結合した状態にあり、前記分離する工程において、前記測定対象抗原と結合していない前記抗体が前記反応チャンバに残され、前記抗原抗体複合体が前記廃液チャンバに移動する、請求項１に記載の方法。
  3. 前記反応チャンバに固相抗体が固定されており、前記抗原抗体複合体が、前記固相抗体と前記測定対象抗原と前記抗体との結合体であり、前記分離する工程において、前記抗原抗体複合体が前記反応チャンバに残され、前記測定対象抗原と結合していない前記抗体が前記廃液チャンバに移動する、請求項１に記載の方法。
  4. 試料溶液に含まれる測定対象抗原の量を測定する方法であって、
    反応チャンバにおいて前記測定対象抗原と、前記測定対象抗原に特異的に結合する抗体とを結合させ、抗原抗体複合体を得る結合工程、
    前記試料溶液により前記反応チャンバを洗浄することにより、前記抗原抗体複合体と、前記測定対象抗原と結合していない前記抗体と、を分離する洗浄分離工程、
    前記抗原抗体複合体または前記測定対象抗原と結合していない前記抗体の量を測定する測定工程、および
    測定された前記抗原抗体複合体または前記測定対象抗原と結合していない前記抗体の量から、前記試料溶液に含まれる前記測定対象抗原の量を算出する工程
    を有する、方法。
  5. 前記反応チャンバに固相抗原が固定されており、前記測定対象抗原と結合していない前記抗体が、前記固相抗原に結合した状態にある、請求項４に記載の方法。
  6. 前記反応チャンバに固相抗体が固定されており、前記抗原抗体複合体が、前記固相抗体と前記測定対象抗原と前記抗体との結合体である、請求項４に記載の方法。
  7. 試料溶液に含まれる測定対象抗原の量を測定するためのチップであって、
    反応チャンバ、洗浄液保持チャンバ、廃液チャンバおよび前記試料溶液が注入される注入孔を有し、
    前記注入孔と前記反応チャンバとの間は第１流路により接続されており、
    前記注入孔と前記洗浄液保持チャンバとの間は第２流路により接続されており、
    前記洗浄液保持チャンバと前記反応チャンバとの間は第３流路により接続されており、
    前記反応チャンバと前記廃液チャンバとの間は第４流路により接続されており、
    前記注入孔から注入された前記試料溶液は、前記第１流路を通って前記反応チャンバと、前記第２流路を通って前記洗浄液保持チャンバとに流れ、
    前記反応チャンバ内では、前記測定対象抗原と、前記測定対象抗原に特異的に結合する抗体とを結合させ、抗原抗体複合体が得られ、
    前記反応チャンバには、前記洗浄液保持チャンバに保持されている前記試料溶液が前記第３流路を通って注入され、前記抗原抗体複合体を有する前記反応チャンバを洗浄することにより、
    ｉ）前記抗原抗体複合体、および
    ii）前記測定対象抗原と結合していない前記抗体、
    から選ばれる一方が前記反応チャンバに残されるとともに、もう一方が前記廃液チャンバに移動して、前記抗原抗体複合体と、前記測定対象抗原と結合していない前記抗体と、が分離される、
    チップ。
  8. 前記反応チャンバに固相抗原が固定されており、前記測定対象抗原と結合していない前記抗体が、前記固相抗原に結合した状態にあり、前記洗浄により、前記測定対象抗原と結合していない前記抗体が前記反応チャンバに残され、前記抗原抗体複合体が前記廃液チャンバに移動する、請求項７に記載のチップ。
  9. 前記反応チャンバに固相抗体が固定されており、前記抗原抗体複合体が、前記固相抗体と前記測定対象抗原と前記抗体との結合体であり、前記洗浄により、前記抗原抗体複合体が前記反応チャンバに残され、前記測定対象抗原と結合していない前記抗体が前記廃液チャンバに移動する、請求項７に記載のチップ。
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