CN117074701B - 一种gfap定量检测试剂盒及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种GFAP定量检测试剂盒及应用，属于医学检测诊断领域。本发明所提供试剂盒包括硝酸纤维素薄膜、聚酯垫、样品垫；所述的硝酸纤维素薄膜上包括检测用GFAP抗体和质控抗体；所述的聚酯垫上包括荧光微球标记抗体偶联物；所述的样品垫经过样品垫缓冲液浸泡，并提供了样品垫缓冲液的配方。本发明的试剂盒实际检测时更为便捷，节省时间，且灵敏度较高，有很好的临床应用前景。

Description

一种GFAP定量检测试剂盒及应用
技术领域
本发明属于医学检验诊断领域，具体涉及一种GFAP定量检测试剂盒及应用。
背景技术
创伤性脑损伤（TBI）是由外力引起的大脑损伤，会破坏大脑正常功能，导致人的认知能力或身体机能受损。疑似TBI的医疗护理流程分为三步。首先是使用15分格拉斯哥昏迷量表（GCS）对神经进行评估，以评定脑损伤严重度，然后进行结构性神经影像学检查，最常见的是通过头部CT扫描来可视化骨折和颅内病变。最后根据CT结果制定治疗方案、留院观察或出院。
目前，CT扫描是广泛用于帮助临床医师评估TBI的唯一客观、简单且可靠的选择。然而，CT结果的正确性与CT设备的准确性及医师的阅片水平直接相关，和其他检测方法相比，是一种相对主观的判断方法。约90%轻度TBI（有时被称为“脑震荡”）的CT扫描结果呈阴性（Toth，2015）。这些患者中只有不到1%的人需进行神经外科干预（Papa L，2012）。
胶质纤维酸性蛋白（GFAP）是一种Ⅲ型中间纤丝蛋白。人的GFAP由432个氨基酸组成，主要分布于中枢神经系统的星形胶质细胞，参与细胞骨架的构成并维持其张力强度。GFAP是一种神经系统特异性蛋白。其在脑损伤中对神经系统功能的恢复有重要影响（梁彦涛，胶质纤维酸性蛋白基础与临床研究进展，2009）。
在TBI中，GFAP在1小时内会通过血脑屏障进入血液，导致血清GFAP显著升高。对TBI的早期诊断，鉴别诊断和判断预后有重要的意义（刘霞，胶质纤维酸性蛋白的生物学特性及临床研究进展，2015），临床上主要用于脑外伤的辅助诊断。
中国专利申请CN111094983A中公开了使用泛素羧基末端水解酶L1(UCH-L1)、胶质细胞原纤维酸性蛋白(GFAP)或其组合帮助诊断和评价已遭受骨科损伤并遭受或可能已遭受头部损伤诸如轻度创伤性脑损伤(TBI)的受试者的方法、以及用于在所述方法中使用的试剂盒。还公开了基于GFAP和/或UCH-L1的水平帮助确定已遭受骨科损伤并遭受或可能已遭受头部损伤的受试者是否将受益于并因此接受成像程序诸如MRI或头部计算机断层(CT)扫描的方法、以及用于在所述方法中使用的试剂盒。这些方法涉及在受试者已遭受或可能已遭受头部损伤后48小时内的时间点取自所述受试者的生物样品中检测GFAP和/或UCH-L1的水平和水平变化。
但现有技术中的检测方法都较为复杂，涉及各种试剂的配制使用，制成简便易测的血清检测试剂条对于临床检测十分必要。但在实践中发现，直接将所需检测标记抗体、检测抗体等的溶液喷涂于试剂条时，检测效果并不理想，不管是灵敏度还是重复性，表现效果都较差，推测可能是喷涂干燥等步骤影响了抗体的结合效力，另外样本的处理也可能影响检测效果。开发一种方便快捷，且与普通检测方法效果一致的快检试剂盒十分必要。
发明内容
本发明的目的是为了能够快速、简便地检测人外周血中脑特异性蛋白产物的含量，而提供的一种操作简便、能为创伤性脑损伤提供辅助诊断的体外诊断试剂条（盒）及其制备方法和使用。本试剂盒是一种采用时间分辨荧光分析法定量分析人外周血脑特异性蛋白产物的水平，用于创伤性脑损伤等神经系统疾病的辅助诊断。
一方面，本发明提供了一种GFAP定量检测试剂盒，包括硝酸纤维素薄膜、聚酯垫、样品垫。
所述的硝酸纤维素薄膜上包括检测用GFAP抗体和质控抗体；
所述的聚酯垫上包括荧光微球标记抗体偶联物；
所述的样品垫经过样品垫缓冲液浸泡，所述的样品垫缓冲液的成分为：每1L中含三羟甲基氨基甲烷12.0-15.0 g、S9 3.0-12 g、胆酸0.2-2.0 g、酪蛋白0.2-5g、PVP-40 5-30g，余量为水，pH值7.8-9.0。
本发明中，S9指环氧丙烷-环氧乙烷-乙烯基二元胺共聚物，是典型的的两性离子表面活性剂，商品名Tetronic1307。
优选地，所述的样品垫缓冲液的成分为：每1L中含三羟甲基氨基甲烷12.0 g、S910 g、胆酸1.0 g、酪蛋白1g、PVP-40 10g，余量为水，pH值8.5。
所述的聚酯垫在固定荧光微球标记抗体偶联物前经过聚酯垫缓冲液浸泡，所述的聚酯垫缓冲液的成分为：每1L中含NaH2PO4·2H2O 2.9-9.2g、PVA 1.0-10.0g、曲拉通X1000.1-5mL，余量为水，pH值7.5-9.0。
优选地，所述的聚酯垫缓冲液的成分为：每1L中含NaH2PO4·2H2O 7.8g、PVA 5.0g、曲拉通X100 1mL，余量为水，pH值8.5。
所述的荧光微球标记抗体偶联物为混合物，包括荧光微球标记的GFAP抗体1和荧光微球标记的抗人IgG多克隆抗体。
所述的抗人IgG多克隆抗体包括但不限于兔抗人IgG多克隆抗体、鼠抗人IgG多克隆抗体。
所述的荧光微球标记的GFAP抗体1和荧光微球标记的抗人IgG多克隆抗体的混合比例为质量比1-2：1-2，优选为1：1。
所述的荧光微球标记抗体偶联物的缓冲液为每1L中含硼酸0.2-1.0 g、氢氧化钠0.1-2g、牛血清白蛋白3.0-20g、蔗糖50-300g、海藻糖10-100g、叠氮钠0.1-1g，余量为纯化水，pH值9.0-11.0。
优选地，所述的荧光微球标记抗体偶联物的缓冲液为每1L中含硼酸0.55 g、氢氧化钠0.13g、牛血清白蛋白10g、蔗糖125g、海藻糖20g、叠氮钠0.4g，余量为纯化水，pH值9.0。
所述的荧光微球标记抗体偶联物的封闭缓冲液为每1L中含碳酸氢钠0.05-0.5 g、无水碳酸钠0.02-0.4 g、牛血清白蛋白5-100g、甘氨酸10-50g、酪蛋白1-10g，余量为纯化水，pH值9.0-11.0。
本发明同时提供了一种用于GFAP血清检测的缓冲液组合。
所述的缓冲液组合中包括前述的任意一种或多种缓冲液。
具体地，可以包括前述的样品垫缓冲液、聚酯垫缓冲液、荧光微球标记抗体偶联物的缓冲液、封闭缓冲液中的一种或多种。
进一步具体地，还可以包括清洗缓冲液或终止液。
本发明的GFAP定量检测试剂盒有时也别称为GFAP血清检测试剂条或GFAP检测试剂条。
另一方面，本发明提供了前述的GFAP定量检测试剂盒的制备方法。
所述的方法中包括包括将样品垫经过样品垫缓冲液浸泡，所述的样品垫缓冲液的成分为：每1L中含三羟甲基氨基甲烷12.0-15.0 g、S9 3.0-12 g、胆酸0.2-2.0 g、酪蛋白0.2-5g、PVP-40 5-30g，余量为水，pH值7.8-9.0。
优选地，所述的制备方法中包括：
（1）荧光微球标记抗体1及纯化；
（2）荧光微球标记抗人IgG多克隆抗体及纯化；
（3）硝酸纤维素膜的包被和干燥；
（4）将样品垫经过样品垫缓冲液浸泡；
（5）聚酯垫浸泡在聚酯垫缓冲液后装入荧光微球标记抗体1和荧光微球标记抗人IgG多克隆抗体；
（6）组装。
所述的步骤（3）中硝酸纤维素膜的包被为将GFAP抗体2和质控抗体分别进行装入，所述的装入方式可以是喷涂。
所述的步骤（4）中装入可以是喷涂。
所述的荧光微球标记抗体1的制备方法中包括：
S1、抗体的预处理；
S2、荧光微球的预处理；
S3、荧光微球的活化；
S4、活化荧光微球的清洗；
S5、抗体1和荧光微球的连接；
S6、抗体偶联物的终止和封闭；
S7、抗体偶联物的清洗。
所述的步骤S1中的抗体的预处理为浓缩。
所述的步骤S2中的荧光微球的预处理为使用清洗缓冲液进行清洗，所述的清洗缓冲液配方为：每1L包括碳酸氢钠0.05-0.5 g，无水碳酸钠0.02-0.4 g，余量为纯化水，pH值为9.0-11.0。
所述的步骤S2中的清洗为离心弃上清后加入清洗缓冲液，混匀，重复2-5次，优选为重复3次。
所述的步骤S4中的活化荧光微球的清洗为使用清洗缓冲液进行清洗，所述的清洗缓冲液配方为：每1L包括碳酸氢钠0.05-0.5 g，无水碳酸钠0.02-0.4 g，余量为纯化水，pH值为9.0-11.0。
所述的步骤S4中的活化荧光微球的清洗为离心弃上清后加入清洗缓冲液，混匀，重复2-5次，优选为重复3次。
所述的步骤S5中连接条件为：按抗体1与荧光微球质量比1:1~1:10的比例在抗体溶液中的加入荧光微球溶液；震荡混匀后，将混合物在2℃~8℃环境中避光反应。
所述的步骤S6中的终止液为0.8-1.2mg NaBH3CN溶于32μL纯水。
所述的步骤S6中的封闭缓冲液的配方为：每1L中含碳酸氢钠0.05-0.5 g、无水碳酸钠0.02-0.4 g、牛血清白蛋白5-100g、甘氨酸10-50g、酪蛋白1-10g，余量为纯化水，pH值9.0-11.0。
所述的步骤S7中的清洗缓冲液配方为：每1L包括碳酸氢钠0.05-0.5 g，无水碳酸钠0.02-0.4 g，余量为纯化水，pH值为9.0-11.0。
本发明的有益效果：
1、本发明使用免疫学检测手段对创伤性脑损伤进行血液检测，与影像学检测手段（主要为CT）相比，本发明更能客观的反映样本的真实情况，减少了因主观判断造成的误判和漏判。
2、本发明使用的时间分辨荧光分析法可以使检测灵敏度达到皮克级别（10-12g/mL），而CT依赖像素达到更高的分辨率。由于本发明是对脑损伤特异性标志物进行检测，检测窗口比CT提前很多。在CT阴性的情况下，即可对正常人和轻度TBI患者进行有效区分。
3、本发明使用仪器进行检测，只需加入血清样本，10分钟即可得到准确结果。而CT检测时间较长，一般需要等待4小时才可能取得检测结果。
4、本发明使用浓度数值进行判断，取得结果即可得知患者是否患病，客观性较强。而CT检测需要医师进行阅片，依医师的业务水平，主观判断性较强，容易造成漏判、误判。
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，下述实施例不用于限制本发明，仅用于说明本发明。以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1GFAP血清检测试剂条的制备方法
本实施例中，部分试剂配方如下：
稀释缓冲液1的配方为：每1L包括0.072 g碳酸氢钠，0.04 g无水碳酸钠，余量为纯化水，pH值为9.6。
清洗缓冲液的配方为：每1L包括碳酸氢钠0.36 g，无水碳酸钠0.2 g，余量为纯化水，pH值为9.6。
封闭缓冲液的配方为：每1L中含碳酸氢钠0.378 g、无水碳酸钠0.06 g、牛血清白蛋白50g、甘氨酸35g、酪蛋白3g，余量为纯化水，pH值9.0。
抗体偶联物缓冲液的配方为：每1L中含硼酸0.55 g、氢氧化钠0.13g、牛血清白蛋白10g、蔗糖125g、海藻糖20g、叠氮钠0.4g，余量为纯化水，pH值9.0。
稀释缓冲液2的配方为：每1L中含硼酸0.55 g、氢氧化钠0.13g，余量为水，pH值9.0。
辅料垫（样品垫）缓冲液的配方为：每1L中含三羟甲基氨基甲烷12.0 g、S9 10 g、胆酸1.0 g、酪蛋白1g、PVP-40 10g，余量为水，pH值8.5。
聚酯垫缓冲液的配方为：每1L中含NaH2PO4·2H2O 7.8g、PVA 5.0g、曲拉通X1001mL，余量为水，pH值8.5。
1.荧光微球标记抗体1及纯化
（1）抗体的预处理
使用稀释缓冲液1将抗体1（BioVision，货号：3206）稀释至0.2-0.5mg/mL。震荡混匀后，使用超滤浓缩管对上述稀释抗体进行浓缩，浓缩后的抗体浓度应＞5mg/mL。2-8℃环境保存待用。
（2）荧光微球的预处理
将荧光微球待处理溶液（涛宇国际，货号：EU400）进行离心。离心条件：4℃，14000rpm，5min。弃上清后，加入与弃液等体积的清洗缓冲液，使用超声清洗仪震荡混匀。再重复以上操作三次制备得到荧光微球预处理溶液。2-8℃环境保存待用。
（3）荧光微球的活化
称取适量1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）。按荧光微球：EDC：NHS摩尔比1:2:2-1:1:1的比例在荧光微球预处理溶液中加入EDC和NHS。37℃避光搅拌混匀2.5小时。
（4）活化荧光微球的清洗
将活化后的荧光微球预处理溶液进行离心。离心条件：4℃，14000rpm，5min。弃上清后，加入与弃液等体积的清洗缓冲液，使用超声清洗仪震荡混匀。再重复以上操作三次制备得到荧光微球溶液。2-8℃环境保存待用。
（5）抗体1和荧光微球的连接
按抗体1与荧光微球质量比1:1~1:10的比例在抗体溶液中的加入荧光微球溶液（即：1.0mg抗体加入1.0~10mg 荧光微球）。震荡混匀后，将混合物在2℃~8℃环境中避光反应18小时。
（6）抗体偶联物的终止和封闭
终止液为：称取1-10mgNaBH3CN（氰基硼氢化钠），用纯水溶解至31.25mg/mL，即每1mg NaBH3CN溶于32μL纯水。
按终止液与偶联混合物溶液体积比1:200~1:25的比例在偶联混合物溶液中加入终止液。将混合物在2℃~8℃环境中避光反应6小时。
避光反应完成后将待处理的偶联混合物溶液进行离心。离心条件：4℃，14000rpm，5min。弃上清后，加入与弃液等体积的清洗缓冲液，使用超声清洗仪震荡混匀。再重复以上操作三次，最后一次弃上清后，加入与弃液等体积的封闭缓冲液。将混合物在2℃~8℃环境中避光反应17小时。
（7）抗体偶联物的清洗
将封闭后的偶联混合物溶液进行离心。离心条件：4℃，14000rpm，5min。弃上清后，加入与弃液等体积的清洗缓冲液，使用超声清洗仪震荡混匀。再重复以上操作三次，最后一次弃上清后，加入与弃液等体积的抗体偶联物缓冲液。2-8℃环境保存待用。
2、荧光微球标记兔抗人IgG多克隆抗体及纯化
兔抗人IgG多克隆抗体的荧光微球标记方法与抗体1一致。区别在于荧光微球标记的抗体1与样本中的待测物在T线位置结合，荧光微球标记的兔抗人IgG多克隆抗体与样本中的人IgG在C线位置结合。
本试剂条是一个双系统检测方法，荧光微球标记的抗体1与样本在T线位置结合，结合的是待检测物质，一旦结合，说明样本年中含有该物质。荧光微球标记的抗体1与待测物样本与C线位置结合，结合的是人IgG，一旦结合面说明样本中含有人IgG蛋白。T线检测是否有待测物，C线检测是否为人样本。
3、硝酸纤维素膜的包被和干燥
将膜贴到PVC板上中间部位，用稀释缓冲液2将GFAP抗体2（merck，货号：N1015）稀释为0.5mg/mL。用喷膜机将GFAP抗体2以1.0μL/cm的速度喷于硝酸纤维素膜上（检测线，T线）。将羊抗兔IgG多克隆抗体（普利莱，货号：C1711）用稀释缓冲液2稀释成0.7mg/mL。用喷膜机将以上抗体以1.0μL/cm的速度喷于硝酸纤维素膜上（对照线，C线）。C线与T线间距5mm。将包被好的板放置到干燥室中，35±2℃干燥10至15小时。
4、辅料垫（样品垫）的处理
从2-8℃环境中取出辅料垫缓冲液，倒入处理盘中。将聚酯垫完全浸泡在辅料垫缓冲液中，置于混匀器上。300rpm处理1小时，取出摆放整齐，置于干燥室中干燥过夜，条件为37℃、湿度小于20%。密封在2层铝箔袋中，加入少量干燥剂，做好标识待用。
5、聚酯垫的处理
（1）聚酯垫的预处理
从2-8℃环境中取出聚酯垫缓冲液，倒入处理盘中。将聚酯垫完全浸泡在聚酯垫缓冲液中，置于混匀器上。300rpm处理1小时，取出摆放整齐，置于干燥室中干燥过夜，条件为37℃、湿度小于20%。密封在2层铝箔袋中，加入少量干燥剂，做好标识待用。
（2）荧光微球标记抗体1和荧光微球标记兔抗人IgG多克隆抗体的干燥
将步骤1和步骤2制备的待干燥的荧光微球标记抗体1和荧光微球标记兔抗人IgG多克隆抗体质量比1:1混合。混匀后均匀喷在处理好的聚酯垫上。放置于干燥室中，温度37℃、湿度20%以下烘干3小时。密封在2层铝箔袋中，加入少量干燥剂，做好标识待用。
6、组装
以胶板作为载体，在胶板上依次组装吸水纸、硝酸纤维素薄膜、聚酯垫、辅料垫、箭头胶带。
将组装好的试纸板裁切成5mm等宽的试纸条，将切好的试纸条按箭头指示方向装入空白检测卡中，密封在1层铝箔袋中，加入少量干燥剂，完成检测试剂条的组装。
实施例2GFAP时间分辨荧光分析法免疫检测方法
1、检测原理
本试剂盒采用双抗体夹心法测定GFAP的含量。在硝酸纤维素膜上的检测线处包被GFAP抗体2，在质控线处包被质控抗体（羊抗兔IgG多克隆抗体）；在聚酯垫上包被荧光微球标记抗体1和荧光微球标记兔抗人IgG多克隆抗体复合物。
检测时，样本中含有的待测物（GFAP）浓度不少于最低检测限时，待测物会与预包被的荧光微球标记的抗体1反应形成抗原-荧光微球标记抗体1复合物，随后复合物通过毛细作用向前层析，则在检测线处被包被抗体（GFAP抗体2）捕获聚集，形成荧光微球标记GFAP抗体1-GFAP-GFAP抗体2的免疫复合物，使用365nm激发光，照射反应后的T线及C线，收集615nm发射光。T线的发射光强度与GFAP抗原呈正相关。无论样本中是否含有GFAP，C线处都应收集到固定范围的光强度，作为层析过程是否正常、试剂是否失效的内控标准。
2、含检测试剂条的试剂盒组分
GFAP试剂盒由实施例1制备的检测试剂条以及干燥剂组成。其中检测试剂条由聚酯垫（喷涂有荧光微球标记的GFAP单克隆抗体1和荧光微球标记的兔抗人IgG多克隆抗体）、辅料垫、硝酸纤维素膜（T线包被GFAP单克隆抗体2，C线包被羊抗兔IgG多克隆抗体）、吸水垫、聚氯乙烯板等组成。
3、检测方法
采用开放式荧光免疫免疫分析仪进行检测。反应所需样本量为100μL，自动检验流程为：
①免疫反应：将100μL样本滴入加样孔，在室温条件下反应10min。
②读值：将反应后的检测卡插入检测仪器，荧光微球发出光信号后用仪器检测相对发光强度（RLU）。
③根据检测的校准品数值可获得一条GFAP浓度-发光值标准曲线。该曲线使用四参数Logistic方程拟合。
④样本的检测值可以和这条曲线上获得唯一的浓度值对应，从而实现对未知样本的浓度检测。
4、检测指标
4.1准确度
将浓度约为3000pg/mL(允许偏差±10%)的脑特异性蛋白产物（GFAP）液（A）加入到浓度范围0pg/mL-80pg/mL的样本B中，所加入GFAP抗原与样本B之间的体积比例为1:9，根据公式（1）计算回收率R，其回收率应在85%～115%范围内。参照公式（1）进行计算：
R=——（1）；
式中：
R—回收率；
V—样品A液的体积；
V0—血清样品B液的体积；
C—血清样品B液加入A液后的3次测量平均值；
C0—血清样品B液的3次测量平均值；
CS—样品A液的浓度。
4.2空白限
将不含任何分析物的样本重复测试20次，计算其平均值和标准差（SD），即为空白限。
4.3线性区间
将接近线性区间上限的高值样本与接近线性区间下限的低值样本或零浓度样本混合成不少于5个稀释浓度。对每一浓度的样本各重复测试3次得到发光值，记录各样品的测量结果，并计算各样品3次测量值的平均值（）。以稀释浓度（/>）为自变量，以测定结果均值（/>）为因变量求出线性回归方程。按公式（2）计算80～2560pg/mL的线性区间内的线性回归的相关系数（r）。
——（2）；
式中：
—相关系数；
—稀释比例；
—各个样本测定结果均值；
—稀释比例的均值；
—样本测定结果总均值。
4.4重复性
质控品是由GFAP抗原和质控品缓冲液配制的，浓度为20pg/mL、100pg/mL。
质控品缓冲液配方：每1L中包括4-吗啉乙磺酸15g；NaCl 8g；ZnCl21g；MgCl2·6H2O10g；牛血清白蛋白35g；酪蛋白5g；甘氨酸10g；聚乙二醇5g；海藻糖50g，余量为水。
同批号试剂盒重复测试质控品10次，计算10次测试结果的平均值和标准差SD。按公式（3）计算变异系数(CV)：
——（3）；
式中：s—样本测试值的标准差；
—样本测试值的平均值。
4.5批间差
用3个批号的试剂盒分别重复测试质控品10次，计算30次测试结果的平均值和标准差SD，根据公式（3）得出变异系数（CV）。
4.6特异性
在不含任何分析物的样本中加入5000pg/mL的胶质纤维酸性蛋白（GFAP），测3次取均值，按公式（4）计算结果：
RCR=M/C×100%——（4）；
式中：
RCR—交叉反应率；
M—交叉反应物测定结果均值；
C—交叉反应物标示值。
5、检测结果：
准确度97.2%；空白限7.2pg/mL；线性区间R=0.9992；重复性20pg/mL：5.3%，100pg/mL：3.1%；批间差20pg/mL：10.2%，100pg/mL：6.7%；特异性0.136%。
对比例
参照实施例1设置对比例，并参照实施例2的方法进行检测，具体设置如下：
检测效果如下：
以上实施例和对比例充分体现了本发明技术方案的优越性，本发明的检测方法在各项参数测定中都显著优于对比例。
需要说明的是，以上实施例仅用于说明本发明的技术方案，不用于限制本发明，本领域技术人员在本发明公开的内容基础上进行的常规手段的替换或优化，在不脱离本发明实质的情况下，均属于本发明保护的范围。

Claims (8)

1.一种GFAP定量检测试剂盒，包括硝酸纤维素薄膜、聚酯垫、样品垫，其特征在于：
所述的硝酸纤维素薄膜上包括检测用GFAP抗体和质控抗体；
所述的聚酯垫上包括荧光微球标记抗体偶联物；
所述的样品垫经过样品垫缓冲液浸泡，所述的样品垫缓冲液的成分为：每1L中含三羟甲基氨基甲烷12.0-15.0 g、S9 3.0-12 g、胆酸0.2-2.0 g、酪蛋白0.2-5g、PVP-40 5-30g，余量为水，pH值7.8-9.0；
所述的聚酯垫在固定荧光微球标记抗体偶联物前经过聚酯垫缓冲液浸泡，所述的聚酯垫缓冲液的成分为：每1L中含NaH2PO4·2H2O 2.9-9.2g、PVA 1.0-10.0g、曲拉通X100 0.1-5mL，余量为水，pH值7.5-9.0；
所述的荧光微球标记抗体偶联物的缓冲液为每1L中含硼酸0.2-1.0 g、氢氧化钠0.1-2g、牛血清白蛋白3.0-20g、蔗糖50-300g、海藻糖10-100g、叠氮钠0.1-1g，余量为纯化水，pH值9.0-11.0。
2.根据权利要求1所述的GFAP定量检测试剂盒，其特征在于，所述的样品垫缓冲液的成分为：每1L中含三羟甲基氨基甲烷12.0 g、S9 10 g、胆酸1.0 g、酪蛋白1g、PVP-40 10g，余量为水，pH值8.5。
3.根据权利要求1所述的GFAP定量检测试剂盒，其特征在于，所述的聚酯垫缓冲液的成分为：每1L中含NaH2PO4·2H2O 7.8g、PVA 5g、曲拉通X100 1mL，余量为水，pH值8.5。
4.根据权利要求1所述的GFAP定量检测试剂盒，其特征在于，所述的荧光微球标记抗体偶联物为混合物，包括荧光微球标记的GFAP抗体1和荧光微球标记的抗人IgG多克隆抗体。
5.根据权利要求4所述的GFAP定量检测试剂盒，其特征在于，所述的荧光微球标记的GFAP抗体1和荧光微球标记的抗人IgG多克隆抗体的混合比例为质量比1：1。
6.根据权利要求1所述的GFAP定量检测试剂盒，其特征在于，所述的荧光微球标记抗体偶联物的封闭缓冲液为每1L中含碳酸氢钠0.05-0.5 g、无水碳酸钠0.02-0.4 g、牛血清白蛋白5-100g、甘氨酸10-50g、酪蛋白1-10g，余量为纯化水，pH值9.0-11.0。
7.一种用于GFAP血清检测的缓冲液组合，其特征在于，包括权利要求1-6中任意一项或多项所述的GFAP定量检测试剂盒中的缓冲液。
8.权利要求1-6任一项所述的GFAP定量检测试剂盒的制备方法，其特征在于，包括将样品垫经过样品垫缓冲液浸泡，所述的样品垫缓冲液的成分为：每1L中含三羟甲基氨基甲烷12.0-15.0 g、S9 3.0-12 g、胆酸0.2-2.0 g、酪蛋白0.2-5g、PVP-40 5-30g，余量为水，pH值7.8-9.0。
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