JPH06504841A - 胎児膜の破裂を検出する方法およびその方法を利用する試験キット - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 胎児膜の破裂を検出する診断法および その診断法を利用する試験キット 本発明は胎児膜の破裂を検出する診断法に関し、その診断法は、妊娠女性の膣分 泌物の試料中に存在するタンパク質の測定と、胎児膜の破裂を診断するのに用い る試験キットに基づいた方法である。

“胎児膜の早期破裂”　（ＦＲＯＭ）という用語は、出産予定日または出産予定 日以前の日の出産開始の少なくとも２４時間前に、胎児膜が自然に破裂すること を意味する。この現象は出産の約５〜１０％に起こり、周産期死亡の約１０％の 原因である。胎児膜の早期破裂の約３０〜５０％は、在胎齢が３７週間より短い ときつまり満期でないときに起こる。このとき、胎児膜の破裂は子宮内感染の危 険が著しく増大するので、それを診断することは極めて重要である、胎児膜破裂 から出産までの時間経過が長ければ長いほど感染する危険性が大きい。感染する と母親の死亡と周産期の死亡の両方が増大する。

このようによく起こりかつ危険な問題であるにもかかわらず。胎児膜破裂が臨床 上明確でない場合、被験者の胎児膜破裂を検出する確実な診断法は知られていな い。

最も確実な方法はないが、膣内に羊水が存在することを表示させようとする場合 に、いくっがの不満足な方法が用いられている。公知の方法は、と（にＦｒ１ｅ ｄ■ａｎ　肛およびＭｃＥｌｉｎ　ＴＷ　、”　Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ　ｏｆ　ｒ ｕｐｔｕｒｅｄ　ｆｅｔａ１ｍｅｍｂｒａｎｃｅｓ″、Ａｔｓ　Ｊ　０ｂｓｔｅ ｔ　Ｇｙｎｅｃ、　１０４巻、５４４〜５５０頁、１９６９年に記載されている 。この羊水結晶化試験法は、スライドガラス上の特徴的な分枝状態すなわち“シ ダ状パターンを観察することに基づいているが、そのパターンは正常な膣分泌物 のパターンとは異なっている。

スライドガラス上の分泌物を、例えばナイルブルー、アクリジンオレンジまたは ブロモチモールブルーで染色することによる染色試験法で、上記パターンの差を 検出する試みがなされている。膣分泌物のｐＨの変化はニトラジン（Ｎｉｔｒａ ｚｉｎ）試験法で検出することができる。上記の文献には、羊水を蛍光化合物で 染色して、その漏洩を紫外光で目視観察する方法も記載されている。

これらの方法は、偽陽性または偽陰性の結果が得られる場合が非常に多いか、妨 害物質に対して敏感であるか、または患者の健康に対する危険を伴うので不満足 なものである。子宮感染症が存在しているか、または胎児膜が破裂してから長時 間経過している場合、間違った試験結果が得られることがある。

また、胎児膜の早期破裂を検出するには、膣内に存在する場合がある他の分泌物 中の濃度に比べて、羊水中の濃度が高い膣液中の化合物を測定することが有効で あろうと提案されている。このような化合物としては、α−フェトプロティン（ ＡＦＰ　）　（Ｒｏｃｈｅｌｓｏｎら、“　Ｒａｐｉｄ　ａｓｓａｙ　−ｐｏｓ ｓｉｂｌｅ　ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｄｉａｇｎｏｓｉｓ　ｏ ｆｐｒｅｍａｔｕｒｅ　ｒｕｐｔｕｒｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｍｅｍｂｒａｎｃｅｓ 　”、　０ｂｓｔｅｔＧｙｎｅｃｏｌ　、６２巻、４１４〜４１８頁、１９８３ 年）およびプロラクチン（ＰＲＬ　）　（Ｋｏｎｉｎｃｋｘら、“Ｐｒｏｌａｃ ｔｉｎｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｉｎ　ｖａｇｉｎａｌ　ｆｌｕｉｄ　：　 ａ　ｎｅｗ　ｍｅｔｈｏｄｆｏｒ　ｄｉａｇｎｏｓｉｎｇ　ｒｕｐｔｕｒｅｄ　 ｍｅｍｂｒａｎｃｅａ　”　、Ｂｒ　ＪＯｂｓｔｅｔ　Ｇｙｎｅｃｏｌ　、８８ 巻、６０７〜６１Ｏ頁、１９８１年）が報告されている。上記の両方の化合物の 羊水中の濃度は、妊娠女性の血液中より明らかに高い、しかし、膣液試料が血液 を含有している場合には、これらの化合物を測定することによって、少量の羊水 が存在するのを検出することは困難である。

従って、胎児膜の破裂を検出する簡単で信頼できる診断方法を開発する必要があ ることは明らかである。このような状況において、試験を実施する際には、迅速 に試験結果を得ることが極めて重要である。この目的を達成する理想的な試験法 は、実施することが簡単でかつ試験結果が少なくとも３０分以内に得られる迅速 な試験法であり、臨床試験法として現場で直ちに実施できる方法が好ましい。

したがって本発明の目的は、胎児膜の破裂を検出する新しい改善された方法であ って、患者の個々の変動とは無関係に測定される物質に対して特異的な方法を提 供することである。

また本発明の目的は、患者が待っている間に実施する迅速かつ簡単な方法（いわ ゆる臨床試験法）を提供することである。

また本発明の目的は、上記のような診断を行うのに適した試験キットであって、 簡単で迅速な診断法を実施するための手段が入っている試験キットを開発するこ とである。

本発明の正確な特徴は、以下の説明と、内容が本願に記載されている後記の請求 の範囲から明らかになるであろう、したがって、本発明は、妊娠女性の膣分泌物 試料中のタンパク質を測定することに基づいた、胎児膜破裂を検出する診断法に 関する。上記の方法は、検出されるタンパク質がインスリン様増殖因子結合タン パク室１　（ＩＧＦＢＰ　−１）であることを特徴とする方法であり、このタン パク質が存在することは胎児膜破裂が原因であるが、少なくとも一つの特異的な ＩＧＦＢＰ−１結合物質によって試料中に指示される。

本発明の方法では、特異的な結合物質の量：被測定タンパク質の量の比率は、低 濃度のＩＧＦＢＰ−１が陽性であると解される反応を起こさないように調節され る。陽性反応は、羊水についてのみ特徴的な程度はどに高い濃度でなければ起こ らない。本発明によれば、その感度の低下は例えば試験を行う前に膣試料を希釈 することによって達成される胎児膜破裂を診断するために開発された本発明の試 験キットは、胎児膜破裂が原因で膣分泌物試料中にインスリン様増殖因子結合タ ンパク質１　（ＩＧＦＢＰ−１）が存在するのを検出するために、　ＩＧＦＢＰ −１に対して特異的な結合活性を有する物質を含有する少なくとも一つの試薬を 備えていることを特徴とするものである。

また本発明の試験キットには、　ＩＧＦＢＰ−１とその結合物質との結合反応を 指示する標識が入っている方が好ましく、かつ、該試薬中に含有されている特異 的ＩＧＦＢＰ−１結合物質は、好ましくはＩＧＦＢＰ−１に対する特異的な抗体 である、特にモノクローナル抗体である。

インスリン様増殖因子結合タンパク質１　（ＩＧＦＢＰ−１）は、男性と女性の 各種の体液、例えば妊娠女性の血清中に種々の濃度で存在するタンパク質である 。このタンパク質は、今までのところ、肝臓、脱落前および脱落後の子宮内膜お よび卵巣でしか合成されないことが分かりでいる。

ＩＧＦＢＰ−１は、胎盤と胎児膜から、１９８０年に始めて精製された（　Ｂｏ ｈｎら、”Ｉｓｏｌｉｅｒｕｎｇ　ｕｎｄ　Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｉｅ−ｒｕ ｎｇ　ｅｉｎｅｓ　Ｎｅｕｅｎ　Ｐｌａｚｅｎｔａｓｐａｚｉｆｌｓｃｈｅｎ　 Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　（ＰＰＩ　２　）　、　Ａｒｃｈ　ｇｙｎｅｃｏｌ　、　２ ２９巻、２７９〜２９１頁、１９８０年）、このタンパク質は、胎盤起源のタン パ゛り質と考えられたので胎盤タンパク質１２（ＰＰ１２）と呼称された。その 後、ＰＰ１２および羊水から精製されたＩＧＦＢＰ−１は、同じＮ末端アミノ酸 配列を有しく　Ｐｏｖｏａら、”　Ｃｒｏｓｓｒｅａｃｔｉｏｎａ　ｏｆ　ｓｅ ｒｕｍ　ａｏｍａｔｏ鳳ｅｄｉｎ　−ｂｉｎｄｌｎｇｐｒｏｔｅｉｎ　ｉｎ　ａ 　ｒａｄｉｏｉｓｍｕｎｏａｓｓａｙ　ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ　ｆｏｒｓｏｍａｔ ｏｍｅｄｉｎ　−ｂｉｎｄｉｎｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ　１ｓｏｌａｔｅｄ　ｆｒｏ ｍ　ｈｕｍａｎａｍｎｉｏｔｉｃ　ｆｌｕｉｄ″、　Ａｃｔａ　Ｅｎｄｏｃｒｉ ｎｏｌｏｇｉｃａ　、　Ｉ　Ｏ７巻、５６３〜５７０頁、１９８４年）、かつＰ Ｐ１２がＩＧＦ　Ｉ（インスリン様増殖因子Ｉ）を捕捉する（　Ｋｏｉａｔｉｎ ｅｎら、”　ｐｌａｃｅｎｔａｌ　ｐｒｏｔｅｉｎ　１２　ｌｓ　ａ　ｄｅｃｉ ｄｕａｌ　Ｐｒｏｔｅｌｎｔｈａｔ　ｂｉｎｄｓ　ｓｏｍａｔｏｍｅｄｉｎ　ａ ｎｄ　ｈａｓ　ａｎ　１ｄｅｎｔｉｃａｌ　Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ　ａｍｉｎｏ 　ａｃｉｄ　５ｅｑｕｅｎｃｅ　ｗｉｔｈ　ｓｏｍａｔｏｍｅｄｉｎ−ｂｉｎｄ ｉｎｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｆｒｏｍ　ｈｕｍａｎ　ａｍｎｉｏｔｉｃ　ｆｌｕｉ ｄ”　。

Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ　、　１１８巻、１３７５頁、１９８６年）ことが 見出された。脱落膜中でのＩＧＦＢＰ−１の合成は１９８５年に始めて報告され た（　Ｒｕｔａｎｅｎら、”　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｏｆｐｌａｃｅｎｔａｌ　 ｐｒｏｔｅｉｎ　１　２　ｂｙ　ｈｕｍａｎ　ｄｅｃｉｄｕａ”。

Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ　１１６巻、１３０４頁、１９８５年）、ヒトへバ トーム細胞系由来のＩＧＦＢＰ−１の精製は１９８８年に報告された（　Ｌｅｅ ら、”　Ｉｎ５ｕｌｉｎ−１１ｋａ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ（ＩＧＦ　） 　ｂｉｎｄｉｎｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ　ｄｅｏｘｙ ｒｉｂｏ−ｎｕｃｌｅｉｃ　ａｃｉｄ　ｆｒｏｍ　ｈｕｍａｎ　ＨＥＰ　Ｇ２　 ｈｅｐａｔｏｍａ　′ｃｅｌｌｓ　”　、　Ｍｏｌ　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ　、 　２巻、４０４頁、１９８８年）、この報告に関連して、上記タンパク質の完全 なアミノ酸配列が始めて報告された。

羊水中のＩＧＦＢＰ−１の濃度は、通常、母親の血清中の濃度より１００〜１０ ００倍高いことが見出されている（　Ｒｕｔａｎｅｎ　ら、“　Ｒａｄｉｏｉｍ ｍｕｎｏａｓｓａｙ　ｏｆ　ｐｌａｃｅｎｔａｌｐｒｏｔｅｉｎ　１　２　：　 １ｅｖｅｌｓ　ｉｎ　ａｍｎｉｏｔｉｃ　ｆｌｕｉｄ　、　ｃｏｒｄｂｌｏｏｄ 　ａｎｄ　ｓｅｒｕｍ　ｏｆ　ｈｅａｌｔｈｙ　ａｄｕｌｔｓ　、ｐｒｅｇｎａ ｎｔｗｏｍｅｎ　ａｎｄ　ｐａｔｌｅｎｔｓ　ｗｉｔｈ　ｔｒｏｐｈｏｂｌａｓ ｔｉｃ　ｄｉｓｅａｓｅ″。

・Ａｍ　Ｊ　０ｂｓｔｅｔ　Ｇｙｎｅｃｏｌ、　１４４巻、４６０頁、１９８２ 年）。しかしこの観察結果の臨床への適用については現在まで報告されていない 。

特異的な結合物質に基づいた反応は公知である。抗体は特異的な結合物質として 最も普通に用いられる化合物である。このようないわゆる免疫学的方法は、抗体 がその抗原の所定の部位（エピトープ）に特異的に結合する性能に基づいている 。いわゆるポリクローナル抗体は、免疫化された動物の血清中に存在する免疫グ ロブリンの混合物である、その混合物は、個々の動物毎に異なる。ポリクローナ ル抗体と異なり、いわゆるモノクローナル抗体は実験室条件下で培養される一つ の細胞系で産生され、各抗体は均質であり、タンパク質化学で使用される方法で 特性を決定することができ、同一の形態で連続的に産生される。

免疫学的方法は、一つだけの抗体を使用するように開発することができる。この 場合、試料中の抗原を、標識を付けであるが標識をつけてなければ試料の抗原と 同じ抗原を添加してこの抗原と、抗体の限定された量の結合部位に対して競合さ せるように、反応条件を選択する。試料の抗原の濃度は、捕捉された標識の画分 な分析することによって測定される。濃度を測定できるようにするシグナルを生 成するいくつもの標識物質として例えば放射性同位元素、酵素、化学発光化合物 または蛍光化合物を用いることができる。またこの方法は二つの異なる抗体を利 用することもできる（いわゆるサンドイツチ法）、この場合、抗体は、同じ抗原 のエピトープを分離するのに特異的であり、同時に同じ抗原分子に結合すること ができる。一方の抗体は通常、固体の担体に固定化され、他方の抗体には標識が つけられる０両方の抗体は試料中の抗原に結合し、生成した複合体は、上記担体 によって未結合の標識から分離することができる。捕捉された標識付き抗体の量 は試料中の抗原の濃度に比例している。

本発明の発明者は胎盤のタンパク質を研究してきたが、その研究業績としてＩＧ ＦＢＰ−１（ＰＰＩ　２　）の濃度を測定する放射線免疫検定法を開発した。さ らに、　ＩＧＦＢＰ−１に対するモノクローナル抗体が、その研究の結果として 開発された（　Ｒｕｔａｎｅｎら、”　Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　ａｎｔｉｂｏｄ ｉｅｓ　ｔｏ　ｔｈｅ２７−３４　Ｋ　１ｎｓｕＨｎ−１ｉｋｅ　ｇｒｏｗｔｈ 　ｆａｃｔｏｒ　ｂｉｎｄｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎ″、　Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｂｉｏ ｐｈｙｓ　Ｒｅｓ　Ｃｏｍｍｕｎ　、　１５２巻、２０８頁、１９８８年）、シ かしその研究結果は臨床の用途に導入されていない。

羊水中と、膣内に存在する他の分泌物中とのＩＧＦＢＰ−１の濃度の比較を示す 報告は文献には全く見られない。本発明の発明者が率いる研究グループは、羊水 中と血液中および腟内に存在しつる分泌物中のＩＧＦＢＰ−１の濃度を調査した （表１）。

表　１ 母親の血清（Ｓ）と羊水（ＡＰ）の試料中のＩＧＦＢＰ−１、プロラクチン（Ｐ ＲＬ　）　Ｒよびα−フェトプロティン（ＡＦＰ　）の濃度をこの表に示す、試 料は２４〜３８週間の妊娠期間時に採取した。

ＡＦ　１１５０００　４７９　４２０　５血液中のＩＧＦＢＰ−１の量は個体毎 に著しく変動しているが、すべての場合に、羊水中のＩＧＦＢＰ−１の濃度が母 親の血清中の濃度の１００倍以上であるということは、対になった血液と羊水の 試料の試験結果から結論することができる。上記の濃度の差は、発明者が知って いる、血液中と羊水中のタンパク質問の最大の差である。この理由から、ＩＧＦ ＢＰ−１は、羊水が血液と混合している場合でも羊水の存在を検出するのに優れ て適している。

逆に、タンパク質のＡＦＰとＰＲＬの対応する比率はかなり変動するが、１−１ ０の大きさである。いくつかの場合には、これら被測定化合物の濃度が羊水中よ り血清中の方が高いことが見出された。またこのような測定値は、ＡＦＰとＰＲ Ｌの測定値に基づいた初期の試験法が完全には信頼できない理由を示している。

本発明によれば、　ＩＧＦＢＰ−１試験法の検出限界を、血液濃度が高い場合の ＩＧＦＢＰ−１でも陽性の試験結果を与えないようなレベルに調節することによ って、陽性の試験結果が常に、羊水が存在することによって確実に得られるよう にできることが分かった。このように、低濃度の羊水由来のＩＧＦＢＰ−１でも 、ごく少量の羊水しか血液中に混合されていな（でも検出することができる。

この検出限界は、例えば、試料中の血液だけまたはいくつかの他の分泌物によっ てもたらされる低濃度のＩＧＦＢＰ−１が陽性とみなされる試験結果を与えるこ とがないような弱いシグナルを生成する標識を用いることによって、適切なレベ ルに調節することができる０強いシグナルを用いる場合には、この検出限界は、 例えば試料を希釈することによって低下させることができる。用いるシグナルが 定量的な試験結果を与える場合は、試料中のＩＧＦＢＰ−１の濃度が、母親の血 清でもたらされる、最高の公知の濃度より低いときは常に陰性であるとみなすこ とができる。

非妊娠女性および無傷の胎児膜を有する妊娠女性の膣分泌物、精漿または尿中の ＩＧＦＢＰ−１の濃度は、羊水中のその濃度と比べて極めて低いということは、 試験中に判明した。それ故に、本発明の試験法は、羊水以外のＩＧＦＢＰ−１の 起源が、利用される試験条件下で偽陽性の試験結果をもたらすことがないように 設計することができる０表１に示すように、試験で判明した母親の血清中のＩＧ ＦＢＰ−１の最高濃度は６００μｓ／ｌであったが、一方、羊水中の最低濃度は ２２０００μｇ／ｌであった。したがって、試料の羊水含有量がたとえ１０％と いう少量であっても、その羊水の存在によって生じるＩＧＦＢＰ−１の濃度は依 然として２２００μｇ／ｌであり、この濃度は、母親血清について測定された最 高濃度の３倍以上である。羊水中のＩＧＦＢＰ−１の濃度は上記の濃度（２２０ ００μｇ／ｌ　）より著しく高く、これに対して母親の血清中の濃度は上記の濃 度（６００ｕ　ｇ／ｌ）よりかなり低い場合が非常に多い。

本発明の試験法を実施するのに、少量（１００〜２００μｌ）の膣分泌物で充分 である。試料は、検鏡試験中、例えば使い捨て注射器または試料採取用に特に設 計された滅菌用具を用いて採取するのが好ましい。

ＩＧＦＢＰ−１の分子の大きさは充分太き（その分子量は約２５０００Ｄなので 、ＩＧＦＢＰ−１はそれに対する抗体を生成することができたが、これらの抗体 は免疫学的検定法に利用できる。

したがって、本発明の方法は、　ＩＧＦＢＰ−１に対する抗体またはＩＧＦＢＰ −１の他の特異的結合物質を使用することに基づいている。本発明の方法は迅速 であり、その利用範囲は適切な濃度範囲を含んでいるので、本発明の目的である 診断の用途、すなわち膣内に羊水が存在することを証明することによって胎児膜 の破裂を検出するのに好適である。

本発明の検定法の測定範囲に対して必要な濃度と同等の高濃度のＩＧＦＢＰ−１ は羊水以外の他の場所には存在しないから、本発明による好ましいＩＧＦＢＰ− １の検定法を用いることによって、まず第一に、膣内の羊水を充分な特異性で検 出することができる。それ故に、他のＩＧＦＢＰ−１の起源由来の汚染によって 偽陽性の試験結果が生じることはない本発明の好ましい実施態様では、測定範囲 は、血液由来の　ＩＧＦＢＰ−１が偽陽性の試験結果をもたらさないように調節 される。したがって本発明の試験法は、無償の胎児膜を通じて通常起こる少量の 羊水の漏洩によって誤った解釈を起こすほど敏感ではない０本発明の試験法に用 いられる単一もしくは複数の結合物質はＩＧＦＢＰ−１としか特異的に結合しな いので、いわゆる交差反応すなわち誤った化合物の結合によって陽性反応が起こ る可能性がない。

一方、羊水中のＩＧＦＢＰ−１の濃度は常に高いので、胎児膜の破裂に伴い漏洩 する羊水は１本発明の試験法で検出されずに残留することはない０本発明の試験 法は、その試験時間が短いにもかかわらず、試料中の所望のＩＧＦＢＰ−１の濃 度から出発して陽性に変わり始めるような高い親和性でＩＧＦＢＰ−１と結合す る特異的な結合物質を利用する。

本発明の試験法を開発する際にはいわゆるフック作用（Ｈｏｏｋ　ｅｆｆｅｃｔ ）　（前地帯現象の作用）をな（すように注意した。この作用は、免疫反応にお いて、抗原の濃度が抗体の濃度に比較して非常に高いと、測定される抗原抗体複 合体が擬似的に減少する作用である。この場合、高濃度の試料は逆に低い試験結 果を与えることがあり、このような試験１結果は、この種の試験法では極め゛て 有害であり、偽陰性の試験結果をもたらす、このため、本発明の試験法の好まし い実施態様を開発する際に、結合試薬と　ＩＧＦＢＰ−１の量の比率は、羊水中 の公知の最高濃度でも、測定されるシグナルを陰性に変えて誤った解釈をさせる ことがないように調節した。このように、偽陰性の試験結果が起こる危険性は、 本発明による試験法では特に排除されている。

本発明のＩＧＦＢＰ−１試験法はできるだけ迅速に試験結果が得られるように開 発されており、このことは本発明が目的とする診断を達成するのに医学上および 経済上重要である。必要な試料は、例えば、胎児膜が破裂した疑いがある場合、 婦人科検鏡試験を行うときに採取することができる、試料は、例えば注射器で採 取するかまたは採取用に製作されたサンプリング用具で採取することができる。

本発明の好ましい実施態様によれば、特異的な結合物質と試料由来のＩＧＦＢＰ −１の濃度の比率は、陽性の解釈をもたらすシグナルが、試料中のＩＧＦＢＰ− １の濃度が高いときにのみ生じるよう、本発明の方法において適切に調節される 。正しい比率は、例えば、診断を行うために採取した分泌物の試料を、試験を行 う前に希釈することによって達成できる。その希釈は、試験中に起こる結合反応 にとって好都合な溶液、好ましくは本発明の試験法に属する溶液で行うことが好 ましい、その溶液としては、例えば保護タンパク質を含有しかつｐＨが生理的ｐ Ｈに近いリン酸緩衝液のような緩衝液が好ましい。

試験を実際に行ったときに分かったことは、希釈比が、信頼できる試験結果を得 るために少な（とも１：１０でなければならず、少なくともｌ：２０が有利であ ることである。１：５００またはさらに大きな希釈比も利用できる。

本発明によって、定性的なすなわちプラスまたはマイナスの試験結果を得るには 、希釈のレベルは、例えば母親の血液中に存在するＩＧＦＢＰ−１が選択された 標識の測定範囲内で陽性の試験結果を与えるいき値以上である限り臨界的でない 。

また本発明の試験法は、例えば非常に多量の特異的結合物質、および標識（その シグナルはそれほど強（ない）を用いることによって未希釈の試料で実施するこ とができる、このようにして、羊水由来の高濃度のＩＧＦＢＰ−１だけが陽性の 試験結果を与えることができる。

本発明によって、　ＩＧＦＢＰ−１の試験は、次のような二つの特異的モノクロ ーナル抗体を用いて有利に実施される。

例えば、一方の抗体は小さなプラスチック製ビーズに結合され、他方の抗体には 、例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ　）のごとき酵素のような標識が 結合されている。

適正に希釈された試料、酵素の標識を付けた抗体、およびグリッパ−にはさまれ た抗体被覆ピースを試験管に入れる。この混合物をインキュベートすると、試料 中に存在するＩＧＦＢＰ−１は一方ではビーズに結合し、他方では標識をつけた 抗体に結合する。インキュベートした後、ビーズを試験管から取出して、流水で 洗浄する。そのビーズを、標識として用いた酵素の基質が入っている試験管内に 入れる。

試料が充分な量のＩＧＦＢＰ−１を含有していたならば、インキュベーシジン中 に、肉眼で検出可能な色が生成する。試料がＩＧＦＢＰ−１を含有していないか またはその濃度が低すぎる場合、溶液は無色のままである。

また本発明のＩＧＦＢＰ−１試験法は、第１の抗体を、その試験法用に開発され た膜の表面に結合させて実施することができる。試料を上記の膜に接触させると 、試料中のＩＧＦＢＰ−１は前記の固定化抗体に特異的に結合する０次いで、対 応する酵素を結合された抗体が添加され、次にその抗体は上記膜上に存在するＩ ＧＦＢＰ−１に結合する。結合されている酵素は、洗浄された膜に添加すること によって検出され、その酵素の沈澱する基質は酵素の作用によってその色が変化 する。このように試料が陽性の場合、肉眼で検出可能な色が膜上に生成する。抗 体でコートされた膜によるこの種の試験は、例えば、この試験用に特に設計され たプラスチック製容器に問題の膜を結合させることによって実施できる。膜の下 側に配置された吸収材は、試験液を膜の上にピペットでおとすと、試験液を膜を 通じて迅速に吸収する。対応して、上記の膜は、一つの溶液から他の溶液にまた がるプラスチック製の帯状体に連結してもよい。

また陽性の試験結果を示す色は、抗体に酵素で標識を付けて、その酵素がその基 質の色を変化させる方法以外の方法でも得ることができる。酵素の代わりに染料 を抗体に結合させてもよい。染料の強度は、陽性の場合に、固定化されたＩＧＦ ＢＰ−１に結合された標識の色が肉眼で検出できるように充分強くなければなら ない、金もしくはセレンのコロイドまたは分散染料がかような染料として使用で きる。

このような染料の利点は、別個の基質の反応相が必要でない場合、試験時間が短 いということである。対応して、抗体は着色したラテックス粒子に結合させても よい、直接肉眼で見える色に基づいたこのような検出法を用いる場合。

免疫クロマトグラフィ迅速測定法をＩＧＦＢＰ−１について使用することができ る。一般に第一抗体が小領域に結合されている膜が用いられる。他の領域に、色 素で標識を付けられた第二抗体が乾燥されている。液体の試料が添加されると、 前記の第二抗体が膜上に移行し始める。試料が充分な量のＩＧＦＢＰ−１を含有 している場合は、標識を付けた抗体に結合した抗原がさらに膜に固定化された抗 体に結合する点に着色した領域が生成する。試料が陰性の場合、着色領域は生成 せず染料が膜の上に移行する。

またＩＧＦＢＰ−１の試験は凝集の原理によって実施することができる。この場 合、肉眼で見て検出可能な反応は、例えば抗体でコートされたラテックスのよう な粒子と試料中の抗原とを凝集させて両者を結合させる反応で構成されている。

逆に凝集反応の阻害も検出できる。

ＩＧＦＢＰ−１の、抗体のみならず他の特異的な結合物質、およびそれらの組合 わせも本発明の方法と試験キットに用いることができる。この場合には、例えば 、ＩＧＦＢＰ−１がＩＧＦ　（インスリン様増殖因子）に自然に結合する特性を 利用することができる。

本発明の試験法を実施する際に、フィンランド特許第８４８６３号に説明されて いる検定法を用いてもよい、その内容は本願に援用するものとする。

本発明によるＩＧＦＢＰ−１の試験法は、決定的な方式で、胎児膜の早すぎる破 裂に関する問題を除くことができる。

胎児膜が破裂した後は、感染する危険があるので、患者は出産まで集中的な追跡 検査を行う必要がある。胎児膜が早期に破裂した疑いがある場合、検査に基づい て、患者は入院させなければならないかまたは帰宅させるべきかを決定しなけれ ばならない、この決定は経済上および医学上の両方について重要である。つまり 経済上は退院までの入院日時の経費として、および医学上は上記の決定が胎児と 母親の両者の死亡率に直接影響するので重要である。

本発明の試験キットにはＩＧＦＢＰ−１の特異的結合物質に基づいた試薬が入っ ている。試験法によって、試薬は結合物質の溶液でもよく、または特異的な結合 物質でコートされたビーズもしくは膜のような固体相でもよく、またはうテック スもしくは染料の粒子で製造されていてもよい０例えば、一段積定法では、キッ トには、上記要素の組合わせが入っている。その特異的な結合物質としては、　 ＩＧＦＢＰ−１に対して特異的なモノクローナル抗体で構成されたものが有利で ある。

上記の試薬に加えて、キットには、結合反応の後、試料中の充分の濃度のＩＧＦ ＢＰ−１を検出することができる標識が入っている方が有利である。結合反応を 有利に検出する標識は、　ＩＧＦＢＰ−１に対する他の抗体に結合されたシグナ ル生成標識である。その標識は例えば、　ＩＧＦＢＰ−１に対する他の抗体に結 合された酵素、放射性同位元素、またはその色で認識される化合物である。その 標識が酵素の場合、試験キットは、酵素の基質を含有している方が有利である上 記の必須の試薬に加えて、試験キットには、試料を希釈するのに用いる希釈溶液 が入っている方が有利である。

前記溶液としては、例えば保護タンパク質を含有しｐＨが生理的ｐＨに近いリン 酸緩衝液のような検定緩衝液を含有しているものが有利である。希釈緩衝液の量 は、所定量の試料が希釈溶液に添加されるとき、例えば１：２０のような最終希 釈率を達成できるように調節することができる。

また試験キットには、使い捨て滅菌注射器またはこの試験法用に特に開発された 用具のようなサンプリング用具が入っている。

また本発明の試験キットは、膣分泌物の試料と、試験を実施するのに用いる関連 希釈溶液とを採取するための簡単な用具を備えている。また試験キットは、患者 自身が腟内に挿入することができる、抗体でコートされた試験用帯状体を備えて いる。このような試験キットは家庭試験に好適であり、女性が、胎児膜が破裂し ているのではないかと思い病院に行くべきか否かと考えているときに、自分で家 庭にて使用できる。

下記の実施例は本発明の試験法の実例を示すが本発明を限定するものではない。

実施例　１ プラスチック製ビーズを抗ＩＧＦＢＰ−１抗体（６３０５゜Ｍｅｄｉｘ　Ｂｉｏ ｃｈｅｍｉｃａ　）でコートした。他のＩＧＦＢＰ−１抗体（６３０３、Ｍｅｄ ｉｘ　Ｂｉｏｃｈｅ＋５ｉｃａ　）に標識の酵素（西洋ワサビペルオキシダーゼ 、ＨＲＰ　）を結合させた。０．３％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ　）を含有 するリン酸緩衝液を検定緩衝液として使用した。この緩衝液は界面活性剤と安定 剤も含有し、そのｐＨは７，４であった。　ＩＧＦＢＰ−１の迅速試験を、下記 の指示にしたがって実施した。

ＩＧＦＢＰ−１の迅速試験の実施： １．２００μｍの６３０３−　）ＩＲＰ−標識を、試料の試験管（検定緩衝液で １：５０の希釈率で希釈）にピペットで添加した。

２．１００μｌの試料（検定緩衝液で１＝２０の希釈率で希釈）を上記試験管に 添加した。

３、ＩＧＦＢＰ−１抗体でコートされ、グリッパ−ではさまれたビーズを上記試 験管に入れ、５分間インキュベートした。

４、　グリッパ−にはさまれたビーズを溶液から取出し、流水で３０秒間洗浄し た。

５、上記の洗浄したビーズを基質溶液（２，２′−アジノージ−〔３−エチル− ベンズチアゾリンスルホナート（６）　］　、ＡＢＴＳ）　（透明試験管にピペ ットで採取した４００μｍ）に移した。

６、上記の試験管を琥珀色の遮蔽バイアルびん中で光に対して保護して５分間静 置させた。

７、　溶液の色を、直ちに検査するか、または反応停止溶液（２００μｌ）を加 えて反応を停止させてから検査した。溶液が無色の場合は陰性で、緑色の場合は 陽性であった１　比較を行いかつ適切な希釈率を確認するために、実施例１で先 に記載した手順にしたがって試験を実施した。この場合、試料は羊水でそのＩＧ ＦＢＰ−１の濃度は約２０００００μｇ／ｌであり、試験を行う前に１　：　２ ０，１　：　１００゜１　：　５００および１　：　２５００の希釈率で希釈し 、対応して、血清の試料はＩＧＦＢＰ−１の濃度が〉１００μｇ／ｌであり、試 験を行う前に１＝２０の希釈率で希釈した。

測定された代表的な吸光度を以下に示す。

試　料　希釈率　Ａ４１４　目視性の評価羊　水　１７２０　０．９３１　＋ 羊　水　１：１００　１．０２１　＋ 羊　水　１：５００　０．６７９　＋ 羊　水　１：２ＳＯ００，２１２± 血清１　１：２０　０．０４４　− 血清２　１：２Ｇ　０．０４９　− 検定緩衝液　０　０．０３６　一 実施例　２ ニトロセルローズ帯状体の狭い領域なＩＧＰＢＰ−１抗体（６３０５、Ｍｅｄｉ ｘ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ　）でコートする０着色したラテックス粒子も他のＩ ＧＦＢＰ−１抗体（６３０３，ＭｅｄｉｘＢｉｏｃｈｅｍｉｃａ　）でコートす る。上記のコートされたラテックス粒子を、抗体の領域を含有する膜の帯状体の 他方の末端上で乾燥させる。　ＩＧＦＢＰ−１迅速試験を下記の指示にしたがっ て上記の膜上で実施する。

ＩＧＦＢＰ−１膜試験の実施： ゛１．緩衝液で希釈した試料の数滴を、ラテックス粒子が乾燥されている上記帯 状体の一部に、ピペットでおとす。

２、数分間のインキエベーシ式ン中に、試料は膜上を移行し、ラテックス粒子は 液体によって抗体でコートされた領域を越えて帯状体の他方の末端に移動する。

３、帯状体を検査する０着色領域が生成すれば試験結果は陽性である。

実施例　３ 小面積のナイロン膜をＩＧＦＢＰ−１抗体（６３０５゜Ｍｅｄｉｘ　Ｂｉｏｃｈ ｅｍｉｃａ　）でコートする。そのコートされた膜をプラスチック製カップ状容 器の上に配置し、真下の方に吸収材（処理されたセルロース）を結合させる。他 のＩＧＦＢＰ　−１抗体（６３０３、Ｍｅｄｉｘ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ　）を 標識酵素（西洋ワサビペルオキシダーゼ、ＨＲＰ　）に結合させる、ＩＧＦＢＰ −１迅速試験を下記の指示にしたがって実施する１、検定緩衝液で希釈した試料 の数滴をピペットで膜におとして、その溶液を膜を通じて吸収させる。

２、上記のカップが保有しているのと同等量の洗浄溶液（約１ｍ１）をとベット でおとし、その溶液を上記の膜をを通じて吸収させる。

３、・標識溶液の数滴をピペットでおとし、その溶液を上記の膜を通じて吸収さ せる。

４、約１　ｍ　ｌの洗浄溶液を、ピペットでおとし、その溶液を上記の膜を通じ て吸収させる。

５、酵素の沈降基質の数滴をピペットで膜の上におとし、その溶液を上記の膜を 通じて吸収させる。

６、膜を検査する。着色した領域が生成した場合、試験結果は陽性である。

本発明の試験法の実施例は、いくつかの免疫測定法で例示されている。しかし、 本発明の方法は、本発明の適用範囲から逸脱することなく、上記の説明と後記の 請求の範囲内で変更させることができることは、当業者にとって明らかなことで ある。

１、特許出願番号 ＰＣＴ／ＦＩ　９１１００４１３ ２、発明の名称 胎児膜の破裂を検出する診断法およびその診断法を利用する試験キット ３、特許出願人 住　所　大阪市西区土佐堀１丁目６番２０号　新栄ビル６階請　求　の　範　囲 １、膣分泌物の試料中に存在するタンパク質を測定することに基づいた、胎児膜 の破裂を検出する診断方法であって、 検出されるタンパク質がインスリン様増殖因子結合タンパク質１すなわちＩＧＦ ＢＰ−１であり、試料中のＩＧＦＢＰ−１の濃度が羊水の存在以外の起源由来の ＩＧＦＢＰ−１のいき値以上の場合にのみ陽性の試験結果が出現するように、試 験条件を調節することによって、胎児膜の破裂によってもたらされる　ＩＧＦＢ Ｐ−１の存在がＩＧＦＢＰ−１の少なくとも一つの特異的結合物質で試料中に検 出されることを特徴とする診断方法。

２、　使用される特異的結合物質がＩＧＦＢＰ−１に対する抗体であることを特 徴とする請求の範囲ｌ記載の方法。

３、抗体がモノクローナル抗体であることを特徴とする請求の範囲２記載の方法 。

４、測定が、ＩＧＦＢＰ−１結合物質および標識をつけた別の結合物質でそのシ グナルが検出可能な結合物質に基づいた試薬を用いて行われることを特徴とする 請求の範囲１〜３のいずれか一つに記載の方法。

５、　膣から採取された試料が、試料中のＩＧＦＢＰ−１の濃度を低下させるた めに、試験を行う前に希釈されることを特徴とする請求の範囲１〜４のいずれか 一つに記載の方法６、　希釈率が少なくとも１：１０で、好ましくはｌ：２０で あることを特徴とする請求の範囲５記載の方法。

７、標識を付けた試薬を用い、そのシグナルは、測定される　ＩＧＦＢＰ−１の 濃度が充分高い場合にのみ陽性の試験結果を与えることを特徴とする請求の範囲 １．２または３に記載の方法。

８、　請求の範囲１の方法にしたがって胎児膜の破裂を診断するのに用いる試験 キットであって、該キットが、インスリン様増殖因子結合タンパク質ｌすなわち ＩＧＦＢＰ−１の存在を検出するために、　ＩＧＦＢＰ−１の特異的結合物質を 含有する少なくとも一つの試薬を備え、前記キットは、膣分泌物の試料中のＩＧ ＦＢＰ−１の濃度が羊水の存在以外の起源由来のＩＧＦＢＰ−１のいき値以上の 場合にのみ陽性のシグナルを与えるよう構成されていることを特徴とする試験キ ット。

９、　さらに、結合反応を検出する標識を備えていることを特徴とする請求の範 囲８記載の試験キット。

１０、標識が生成するシグナルの感度の範囲は、羊水の存在で高濃度のＩＧＦＢ Ｐ−１がもたらされる場合にのみ陽性の試験結果が生じるような方式で調節され ることを特徴とする請求の範囲９記載の試験キット。

１１、試薬が、ＩＧＦＢＰ−１の特異的結合物質として、特異的ＩＧＦＢＰ−１ 抗体を、好ましくはモノクローナル抗体を含有していることを特徴とする請求の 範囲８．９または１゜に記載の試験キット。

１２、結合反応を検出する標識が、他のＩＧＦＢＰ−１結合物質に結合されたシ グナル生成装置であることを特徴とする請求の範囲９または１０に記載の試験キ ット。

１３、特異的結合物質に基づいた試薬が、固相もしくは不溶性粒子に結合した結 合物質、または結合物質の溶液からなることを特徴とする請求の範囲８に記載の 試験キット。

国際調査報告 ■、い、嘲−１中＾、−一１番−Ｎ−ＰＣＴ／Ｆ１９１１００４１３国際調査報 告 フロントページの続き （８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、　ＳＥ）、　ＡＴ、 　ＡＵ、　ＢＧ、　ＢＲ，ＣＡ、　ＣＨ，Ｃ３，ＤＥ、ＤＫ、ＥＳ、ＧＢ、ＨＵ 、ＪＰ、ＫＰ、ＫＲ、ＬＫ、ＬＵ、ＮＬ、Ｎｏ、　ＰＬ、　ＲＯ，ＲＵ、　ＳＥ 。

Ｓ

Claims (14)

【特許請求の範囲】
1. １．膣分泌物の試料中に存在するタンパク質を測定することに基づいた、胎児膜 の破裂を検出する診断方法であって、 検出されるタンパク質がインスリン様増殖因子結合タンパク質すなわちＩＧＦＢ Ｐ−１であり、胎児膜の破裂によってもたらされる　ＩＧＦＢＰ−１の存在が、 ＩＧＦＢＰ−１の少なくとも一つの特異的結合物質によって試料中に検出される ことを特徴とする診断方法。
2. ２．試験に用いられる結合物質：試料中のＩＧＦＢＰ−１の濃度の比率が、試料 中のＩＧＦＢＰ−１の濃度が羊水の存在以外の起源由来のいき値以上である場合 のみ、陽性の試験結果が出現するように調節されることを特徴とする請求の範囲 １記載の方法。
3. ３．使用される特異的結合物質がＩＧＦＢＰ−１に対する抗体であることを特徴 とする請求の範囲１または２に記載の方法。
4. ４．抗体がモノクローナル抗体であることを特徴とする請求の範囲３記載の方法 。
5. ５．測定が、ＩＧＦＢＰ−１結合物質および標識をつけた別の結合物質でそのシ グナルが検出可能な結合物質に基づいた試薬を用いて行われることを特徴とする 請求の範囲１〜４のいずれか一つに記載の方法。
6. ６．膣から採取した試料は、試料中の　ＩＧＦＢＰ−１の濃度を低下させるため に、試験を行う前に希釈することを特徴とする請求の範囲２，３，４また５に記 載の方法。
7. ７．希釈率が少なくとも１：１０で、好ましくは１：２０であることを特徴とす る請求の範囲３記載の方法。
8. ８．標識を付けた試薬を用い、そのシグナルは、測定されるＩＧＦＢＰ−１の濃 度が充分高い場合にのみ陽性の試験結果を与えることを特徴とする請求の範囲２ ，３，４または５に記載の方法。
9. ９．胎児膜の破裂によって膣分泌物試料中にもたらされる、インスリン様増殖因 子結合タンパク質１すなわちＩＧＦＢＰ−１の存在を検出するため、ＩＧＦＢＰ −１の特異的結合物質を含有する少なくとも一つの試薬を備えていることを特徴 とする胎児膜の破裂を診断するのに用いる試験キット。
10. １０．さらに、結合反応を検出する標識を備えていることを特徴とする請求の範 囲９記載の試験キット。
11. １１．標識が生成するシグナルの感度の範囲は、羊水の存在で高濃度のＩＧＦＢ Ｐ−１がもたらされる場合にのみ陽性の試験結果が起こるような方式で調節され ることを特徴とする請求の範囲１０記載の試験キット。
12. １２．試薬が、ＩＧＦＢＰ−１の特異的結合物質として、特異的１ＧＦＢＰ−１ 抗体を、好ましくはモノクローナル抗体を含有していることを特徴とする請求の 範囲９，１０または１１に記載の試験キット。
13. １３．結合反応を検出する標識が、他のＩＧＦＢＰ−１結合物質に結合されたシ グナル生成物質であることを特徴とする請求の範囲１０または１１に記載の試験 キット。
14. １４．特異的結合物質に基づいた試薬が、固相もしくは不溶性粒子に結合した結 合物質、または結合物質の溶液からなることを特徴とする請求の範囲９に記載の 試験キット。