FI94181C - Diagnostinen menetelmä synnytysajankohdan ennustamiseksi sekä siihen käytettävä reagenssipakkaus - Google Patents

Description

941 81

Diagnostinen menetelmä synnytysajankohdan ennustamiseksi sekä siihen käytettävä reagenssipakkaus FÖrfarande för diagnosticering av födseltiden samt reagens-förpackning för användning därvid

Keksinnön kohteena on diagnostinen menetelmä synnytysajankohdan ennustamiseksi, joka menetelmä perustuu raskaana olevan naisen vaginasta otetussa eritenäytteessä olevan proteiinin määritykseen, sekä reagenssipakkaus tätä määritystä varten. Synnytysajankohdan ennustaminen on tärkeätä erityisesti päätettäessä oikeaa synnytyksen käynnistämisen ajankohtaa silloin, kun raskaus on yliaikainen sekä epäiltäessä ennenaikaisen synnytyksen uhkaa.

Yliaikaiset raskaudet ovat synnytyksiin liittyvä yleinen ja vaikea ongelma. Yli 41-42 viikkoa jatkunutta raskautta pidetään yliaikaisena. Yliaikaiseksi raskaus menee noin 7-12 prosentissa raskauksista, silloin kun raskauden kesto lasketaan viimeisten kuukautisten alkamispäivästä. Noin 4 % raskauksista jatkuu yli 43 viikon. Diagnoosi on vaikea silloinkin, kun viimeisten kuukautisten alkamispäivä on tiedossa. Yliaikaisuuden myötä lisääntyvät sikiön ja vastasyntyneen sairastuvuus sekä kuolleisuus. Perinataalikuolleisuus nousee 42 raskausviikon jälkeen ollen kaksinkertainen kun raskaus on * jatkunut 43 viikkoa.

Sikiön hyvinvoinnin seuranta on ensisijaisen tärkeää yliaikaisessa raskaudessa ja synnytys käynnistetään luonnollisesti heti, jos on merkkejä sikiön voinnin huononemisesta. Jos kuitenkin sikiö voi hyvin, tulee keskeiseksi kysymys oikeasta käynnistyshetkestä. Yleisesti hyväksytty periaate on, että synnytys tulisi käynnistää heti, kun kohdunsuu on niinsanotusti kypsä (lyhentynyt, pehmentynyt ja mahdollisesti alkanut avautua). Käynnistysyritykset liian aikaisessa vaiheessa eli silloin, kun kohdunsuu ei vielä ole riittävän kypsä, johtavat lisääntyneeseen sektioiden määrään. Toisaalta, jos sikiön tila 2 94181 vaatii pikaista synnytystä ja varmasti tiedetään, ettei kohdunsuu ole kypsä, voidaan heti päättää sektiosta.

Kohdunsuun kypsyyden arvioinnissa käytetään laajasti ns.

Bishopin pisteytyssysteemiä. (Bishop E H., Obstet Gynecol 1964;24:266). Bishopin menetelmässä arvioidaan sormin tunnustelemalla kohdunsuun aukioloa, kohdunkaulakanavan pituutta, pehmeyttä ja suuntaa. Käytettävissä oleva menetelmä kohdunsuun kypsyyden mittaamiseksi ei kuitenkaan aina ole riittävä synnytyksen ajankohdan ennustamisessa tai käynnistämisen ajankohtaa ja käynnistyksen onnistumisen mahdollisuuksia arvioitaessa.

Käynnistysyrityksetkään eivät kaikissa tapauksissa saa aikaan kohdunsuun avautumista. Pitkittynyt synnytys lisää sekä sikiön että äidin infektioriskiä ja sikiön asfyksiavaaraa ja on lisäksi psyykkisesti epämiellyttävä kokemus synnyttäjälle. Menetelmiä, joilla kohdunsuun kypsyyttä voitaisiin arvioida entistä tarkemmin, kaivataan siis kipeästi.

Tässä keksinnössä käytetään täysin uutta lähestymistapaa oikean synnytysajankohdan ennustamiseen. Kohdunsuun kypsyyttä arvioidaan määrittämällä raskaana olevan naisen vaginasta otetusta eritenäytteestä desiduasolujen tuottamaa proteiinia, IGFBP-1: tä (Insulin-like growth factor binding protein 1 eli insuliininkaltaisen kasvutekijän sitojaproteiini-1).

Kohdunsuun kypsyessä ja kohdun kivuttoman supistustoiminnan lisääntyessä desidua eli äidin kohdun limakalvo ja siihen kiinnittynyt sikiökalvo (korion eli suonikalvo) alkavat irrota toisistaan kohdun alasegmentissä. Tällöin desiduasolujen tuottamaa proteiinia IGFBP-1 alkaa pieniä määriä "valua" kohdunsuun läpi vaginaan ja proteiini on todettavissa vaginaerit-teessä. Mikäli minkäänlaista kypsymistä ei kohdun alasegmentissä tapahdu, korionkalvo pysyy kiinni desiduassa ja desiduan tuotetta ei esiinny vaginaeritteessä.

Näinollen IGFBP-1 määrittäminen vaginaeritteestä voi toimia 94181 3 biokemiallisena testinä arvioitaessa kohdunsuun kypsyyttä ja synnytyksen tai käynnistyksen ajankohtaa. Määritystä käyttämällä voidaan tunnistaa ne naiset, joilla käynnistyskään ei tule johtamaan kohdunsuun avautumiseen ja näin vältytään pitkiltä sikiön ja äidin riskiä lisääviltä käynnistysyrityksiltä.

Toinen tilanne, jossa synnytysajankohdan oikea arviointi tulee kriittisen tärkeäksi, on epäiltäessä ennenaikaisen synnytyksen alkamista. Ennenaikaisen synnytyksen ennustaminen on vaikeaa. Pelkkien riskitekijöiden tunnistamisella, voidaan ennenaikaisista synnytyksistä ennustaa vain hyvin pieni osa.

Ennenaikaisten supistusten diagnostisointi on usein vaikea. Ennenaikaiset supistelut voivat olla niin vähäisiä että jäävät huomaamatta sekä naiselta itseltään että tutkivalta hoitajalta tai lääkäriltä. Toisaalta ennenaikaiisita supistelijöistä arvioidaan vain noin 10-20 prosenttia olevan sellaisia, jotka tarvitsevat hoitoa mahdollisen uhkaavan ennenaikaisen synnytyksen estämiseksi. Keitä ovat nämä 10-20 prosenttia, on vaikea ennustaa. Kuitenkin ennenaikaisten synnytysten määrän vähentämisen kannalta olisi tärkeää pystyä identifioimaan tällaiset potilaat mahdollisimman varhain, silloin kun supistuksia alkaa esiintyä.

Sellaisia potilaita, joilla on olemassa ennenaikaisen synnytyksen riskitekijöitä, tulisi monitoroida erityisen tarkkaan. Ideaalisessa tapauksessa, jos ennenaikaisen synnytyksen ennustava testi olisi positiivinen, voisi elintapojen muutoksella ja lääkityksellä mahdollisesti pystyä paremmin estämään synnytystä. Ennenaikaista vedenmenoa pidetään aina uhkaavan ennenaikaisen synnytyksen merkkinä. Mutta, mikäli sikiökalvot ovat kliinisesti ehjät, vasta säännöllisiä supistuksia ja todettavia muutoksia kohdun kaulakanavassa (kaulakanavan lyheneminen ja kohdunsuun avautuminen vähintään 2 cm) pidetään yleensä uhkaavan ennenaikaisen synnytyksen diagnoosikriteerei-nä ja sairaalaan ottamisen indikaatioina. Tämä voi joissakin tapauksissa olla liian myöhään.

4 94181

Ennenaikaisen synnytyksen riskin ennustamiseksi on kehitetty erilaisia pisteytyssysteemejä. Pisteet lasketaan ensimmäisen raskaustutkimuksen yhteydessä ja tähän verrataan myöhemmin.

Näillä systeemeillä pystytään kartoittamaan kuitenkin vain noin puolet niistä raskauksista, jotka päättyvät ennenaikaiseen synnytykseen. Näiden pisteytyssysteemien perusteella toisaalta monet sellaiset naiset joutuvat riskiryhmään, jotka eivät synnytä ennenaikaisesti. Erilaisia biokemiallisia testejä on myös yritetty kehitellä (mm. veren estradioli ja progesteroni pitoisuuksien sekä prostaglandiinien mittaaminen) huonolla menestyksellä.

Tähänastisin menetelmin ei ole mahdollista luotettavasti ennustaa ennenaikaisia supistuksia ja ennenaikaista synnytystä, eikä näinollen ole mahdollista hoitaa profylaktisesti juuri oikeaa ryhmää raskaana olevia. Osalla naisista ennenaikaiset supistukset ovat niin heikkoja, että nainen itse ei niitä huomaa, kunnes synnytys on pitkällä ja kohdunsuu avautunut ja sikiökalvot puhkeavat. Ainoaksi mahdollisuudeksi jää hoitaa niitä naisia, joilla jo on kliinisesti todettavia supistuksia.

Kuitenkin vain osa ennenaikaisista supistuksista johtaa ennenaikaiseen synnytykseen, ja näinollen kliinisistä supisteli-jöistä vain tämä osa naisia kaipaisi profylaktista hoitoa (lepo + tokolyyttiset eli supistuksia estävät lääkkeet). On : toisaalta todettu, että supistusten estohoito ei auta ja ennenaikaista synnytystä ei pystytä estämään, jos kohdunsuussa on jo tapahtunut huomattavia muutoksia ennen lääkityksen alkamista.

Tämän keksinnön tarkoittamaa menetelmää, jossa vaginaerittees-tä määritetään IGFBP-l-määrä, voidaan käyttää hyödyksi ennustettaessa ennenaikaista synnytystä.

Kohdun supistusaktiviteetin lisääntyessä sikiön vesikalvon ulkopuolella oleva suonikalvo eli korion voi teoriassa alkaa kohdun alasegmentissä irrota kohdun seinämästä eli desiduasta.

94181 Näin tapahtuukin raskauden lopussa ja kalvojen irtoamista kohdun seinämästä pidetään yhtenä kriteerinä kohdunsuun " kyp-, syydestä" arvioitaessa synnytyksen ajankohtaa yliaikaisessa raskaudessa. Korionkalvon irrotessa desiduasta, voi vähäisiä määriä näiden kahden kudoksen tuotteita vuotaa kohdunkaula-kanavaan ja edelleen vaginaan.

IGFBP-1 on desiduasolujen tuote. Ei-raskaanaolevan vagina-eritteissä proteiinia on kuukautisten aikana, mutta ei muulloin. Virtsassa ja seminaaliplasmassa, joita voi olla raskaana olevan naisen vaginassa, IGFBP-l-pitoisuudet ovat hyvin matalia.

Tämän keksinnön tekijä Eeva-Marja Rutanen on aikaisemmin osoittanut, että sikiökalvojen puhkeaminen voidaan todeta mittaamalla IGFBP-l-pitoisuus vaginaeritteestä. Tähän havaintoon perustuu kansainvälinen patenttihakemus W0 92/12426. Samalla osoitettiin, että pieniä määriä IGFBP-1 voi olla vaginaeritteessä vaikka sikiökalvot ovat ehjät. Tämä pieni IGFBP-1 määrä on todennäköisesti vuotoa desiduasoluista kohdun alasegmentissä, jota voi tapahtua kun desidua ja korionkalvo irtoavat toisistaan kohdun aktiviteetin lisääntyessä ja kohdunsuun alkaessa vähitellen kypsyä. Näinollen veripitoisuutta korkeampi IGFBP-l-pitoisuus vaginaeritteessä viittaa lapsi-veden läsnäoloon eli kalvojen puhkeamiseen, kun taas matalat : pitoisuudet viittaavat proteiinin erittymiseen desiduasoluista kohdunkaulaan ja korion-desiduarajan muutoksiin, joka puolestaan heijastaa jo subkliinistä muutosta kohdunsuussa.

EP-patenttihakemuksessa 316919 on kuvattu korionsolujen tuottaman proteiinin, fetaaliseen fibronektiinin käyttöä osoitta- • · maan sikiökalvojen puhkeamista ja ennenaikaisen synnytyksen lähestymistä (kts. myös Lockwood CJ, Senyei AE, Dische MR et ai., New Engl J Med 1991; 325: 669). Menetelmän haittana on kuitenkin se, että fetaalisen fibronektiinin pitoisuus seminaaliplasmassa on korkea, mikä muodostaa suuren virhelähteen.

6 941 81

Edelleen menetelmän käyttöarvoa heikentää se, että fetaalisen fibronektiinin seerumi- ja lapsivesipitoisuuksien suhde ei ole yhtä edullinen kuin IGFBP-1: llä, mikä pahentaa sitä mahdollisuutta, että huomaamattoman pieni verikontaminaatio häiritsee määritystä. Käytännön kokeissa todettiin esimerkiksi, että kun 20 naiselta, joiden sikiökalvot olivat ehjät ja joilla ei esiintynyt supistuksia, proteiinit mitattiin vaginaeritteestä, fibronektiinilla saatiin 4 positiivista tulosta, kun IGFBP-1: llä vastava tulos oli 0.

Synnytysajankohdan määritykseen liittyvissä testaustilanteissa on tuloksen nopea saaminen hyödyllistä ja tarkoitukseen ihanteellinen testi on suoritukseltaan yksinkertainen ja nopea (tulos jopa 30 minuutin kuluessa) ja voidaan mieluiten tehdä bedside-testinä eli välittömästi paikan päällä.

Keksinnön tarkoituksena on siten saada aikaan uusi ja parannettu menetelmä kohdunsuun kypsyyden arvioimiseksi ja ennenaikaisen synnytyksen uhkan toteamiseksi, joka menetelmä on mitattavalle aineelle spesifinen potilaan yksilöllisistä poikkeamista riippumatta.

Keksinnön tarkoituksena on myös saada aikaan menetelmä, joka on nopea ja helppo suorittaa potilaan odottaessa nk. bedside-testinä.

*

Keksinnön tarkoituksena on myös kehittää tällaiseen diagnoosiin soveltuva reagenssipakkaus, joka sisältää välineet yksinkertaisen ja nopean diagnoosimenetelmän suorittamiseksi.

: Keksinnön tarkemmat piirteet ilmenevät seuraavasta selitykses tä ja oheisista patenttivaatimuksista, joiden sisältö liitetään oheen tällä viittauksella. Siten keksinnön kohteena on diagnostinen menetelmä synnytysajankohdan ennustamiseksi, joka menetelmä perustuu raskaana olevan naisen vaginasta otetussa eritenäytteessä olevan proteiinin määritykseen. Tunnistettava proteiini on IGFBP-1 ja sen kohonnut pitoisuus näytteessä 94181 7 osoitetaan IGFBP-1: n vähintään yhden spesifisen sitoja-aineen avulla.

*

Keksinnön mukainen synnytysajankohdan diagnoosia varten kehi-* tetty reagenssipakkaus sisältää vähintään yhtä reagenssia, jossa on IGFBP-1: n spesifistä sitoja-ainetta, IGFBP-1: n kohonneen pitoisuuden osoittamiseksi vaginasta otetussa eritenäyt-teessä.

Keksinnön mukaisessa reagenssipakkauksessa on lisäksi edullisesti IGFBP-1: n ja sitoja-aineen välisen sitomisreaktion osoittava leima, ja reagenssin sisältämä IGFBP-1: n spesifinen sitoja-aine on edullisesti IGFBP-1: n spesifinen vasta-aine, erityisesti monoklonaalinen vasta-aine.

IGFBP-1 on proteiini, jota esiintyy vaihtelevissa pitoisuuksissa sekä miesten että naisten eri ruumiinnesteissä ja mm. raskaana olevan naisen seerumissa. Sen synteesi on toistaiseksi osoitettu vain maksassa, kohdun limakalvossa (desiduas-sa) ja munasarjassa.

IGFBP-1 puhdistettiin ensimmäisen kerran istukasta ja sikiö-kalvoista vuonna 1980 (Bohn et ai. , Arch Gynecol 1980; 229:279-291). Sitä pidettiin istukkaperäisenä proteiinina ja nimitettiin istukkaproteiini 12: ksi (PP12). Myöhemmin todet- • · - tiin, että PP12:11a ja lapsivedestä puhdistetulla IGFBP-1:llä on sama N-terminaalinen aminohappojärjestys ja että PP12 sitoo IGF I: tä (insuiiininkaltäinen kasvutekijä I) (Koistinen et ai., Endocrinology 1986,-118:1375). IGFBP-1: n synteesi raskaana olevan kohdun limakalvossa (deciduassa) osoitettiin ensimmäi-. . sen kerran vuonna 1985 (Rutanen et ai., Endocrinology 1985; 116: 1304).

IGFBP-1: n pitoisuuden on todettu olevan lapsivedessä yleensä 100-1000-kertainen äidin seerumiin verrattuna (Rutanen et ai., Am J Obstet Gynecol 1982; 144: 460). Tämän havainnon kliiniseen sovellutukseen perustuu saman hakijan nimissä oleva 8 94181 patenttihakemus PCT/FI91/00413, jonka etuoikeuspa!vä on 30. 12. 1990. Ko. keksinnön mukaan sopivasti epäherkistetyllä testillä osoitetaan sikiöksivojen puhkeamisesta johtuva IGFBP-1: n läsnäolo vaginassa. Sikiöksivojen puhkeamisen toteamista IGFBP-1: n avulla esitetään myös julkaisussa Rutanen E-M, Pekonen F., Am J Obstet Gynecol 1991,-164 (Suppl):258.

Spesifisiin sitoja-aineisiin perustuvat reaktiot ovat yleisesti tunnettuja. Spesifisinä sitoja-aineina käytetään yleisimmin vasta-aineita. Tällaiset, nk. immunologiset määritysmenetelmät perustuvat vasta-aineen kykyyn sitoutua spesifisti tiettyyn antigeeninsa kohtaan (epitooppiin). Ns. polyklonaali-set vasta-aineet ovat seos immunisoidun eläimen seerumin immu-noglobuliineja. Seokset ovat eläinyksilökohtaisesti erilaisia. Monoklonaaliset vasta-aineet taas ovat yhden laboratoriossa kasvatettavan solulinjan tuottamia ja kukin vasta-aine on homogeeninen ja proteiinikemiallisesti karakterisoitavissa sekä jatkuvasti identtisenä tuotettavissa.

Immunologinen määritys voi olla sellainen, että siinä käytetään vain yhtä vasta-ainetta, jolloin tavallisesti järjestetään reaktio-olosuhteet sellaisiksi, että tutkittavan näytteen antigeeni kilpailee leimatun, mutta muutoin näytteen sisältämälle antigeenille identtisen, seokseen lisätyn antigeenin : kanssa rajoitetusta määrästä sitomispaikkoja vasta-aineessa.

Pitoisuus saadaan selville tutkimalla sitoutuneen leiman osuutta. Leima-aineena, jonka antaman signaalin voimakkuuteen pitoisuuden määrittäminen perustuu, voidaan käyttää esim. radioaktiivista isotooppia, entsyymiä, kerniluminesoivaa tai fluoresoivaa yhdistettä. Määritys voi myös olla kahta vasta-: ainetta käyttävä (ns. sandwich-periaate). Tällöin vasta-aineet kohdistuvat antigeenin eri epitooppeihin ja pystyvät sitoutumaan yhtä aikaa samaan antigeenimolekyyliin. Toinen vasta-aine on usein sidottu kiinteään kantajaan ja toinen on leimattu.

Molemmat sitoutuvat näytteen antigeeniin ja kompleksi voidaan kantajan avulla erottaa sitoutumattomasta leimasta. Sitoutuneen leimatun vasta-aineen määrä on suoraan verrannollinen m 94181 näytteessä olleeseen antigeenipitoisuuteen.

" Tämän keksinnön keksijä on tutkinut istukkaproteiineja ja kehittänyt tutkimustaan varten IGFBP-l:lle (PP12:lle) radioimmunologisen määritysmenetelmän. Tutkimuksia varten on myös kehitetty IGFBP-1: tä vastaan monoklonaalisia vasta-aineita (Rutanen et ai., Biochem Biophys Res Commun 1988,-152:208, ja Pekonen et ai., J Immunoassay 1989;10:325-337).

Kirjallisuudessa ei havaintojemme mukaan ole yhtään raporttia, joissa lapsiveden ja muiden vaginassa olevien eritteiden IGFBP-1-pitoisuuksia olisi verrattu. Tämän keksinnön keksijän johdolla on kuitenkin tutkittu paitsi lapsiveden ja veren IGFBP-l-pitoisuuksia (Taulukko 1), myös pitoisuuksia eritteissä, joita vaginassa mahdollisesti voi olla.

Taulukko 1

Taulukossa esitetään raskauden 24-38 viikoilla otettujen äidin seerumi(S)- ja lapsivesi(LV)-näytteiden IGFBP-l-pitoisuuksia potilas näyte IGFBP-1 suhde

(ug/D

1 S 170 LV 60000 353 2 S 130 LV 29000 223 . 3 S 140 * LV 48000 343 4 S 200 LV 65000 325 5 S 63 LV 22000 349 6 S 350 LV 350000 1000 7 S 240 - ; LV 115000 479 8 S 190 LV 40000 210 9 S 240 LV 50000 208 94181 10

Taulukko 1 (jatk. ) potilas näyte IGFBP-1 suhde (ug/D

10 S 250 LV 200000 800 11 S 130 LV 70000 538 12 S 65 LV 33000 508 13 S 600 LV 70000 117 14 S 260 LV 95000 365 15 S 340 LV 180000 529 16 S 500 LV 155000 310 17 S 155 LV 19000 122 18 S 340 LV 140000 412 19 S 160 LV 200000 1250 20 S 240 LV 160000 667 21 S 340 LV 145000 426 22 S 350 LV 53000 151 23 S 200 LV 125000 625 24 S 135 LV 55000 407 25 S 340 , LV 145000 426 i «

Tutkituissa veri-lapsivesi-pareissa IGFBP-l-pitoisuus lapsi-vedessä oli kaikissa tapauksissa yli 100 kertaa suurempi kuin sen pitoisuus äidin seerumissa.

Vaginaeritteen IGFBP-1-pitoisuus voi keksijän havaintojen mukaan olla kohonnut esim. suuruusluokkaan 100 ug/l, vaikka sikiökalvot ovat ehjät eikä IGFBP-1 siis ole peräisin lapsi-vedestä. Sikiökalvojen pysyessä ehjinä tämän vähäisen, mutta normaalin rajan ylittävän kohoamisen voidaan tulkita johtuvan proteiinin vuotamisesta suoraan desiduasoluista. Mikäli näytteessä on lapsivettä, ei keksinnön mukaisen testiä voida käyt- 94181 11 tää osoittamaan desiduäsolujen vuotamisesta peräisin olevaa kohonnutta IGFBP-1-pitoisuutta, koska lapsiveden läsnäolosta johtuva IGFBP-1-pitoisuus on niin suuri. Sikiökalvojen mahdollinen puhkeaminen voidaan todeta tutkimalla tai esimerkiksi hakijan edellä mainitun patenttihakemuksen PCT/FI91/00413 mukaisella diagnosteisella menetelmällä.

Taulukosta 1 ilmenee, että raskaana olevan naisen seerumin IGFBP- 1-pitoisuus voi olla jopa suuruusluokkaa 600 μg/l. On siis ilmeistä, että myöskään verellä kontaminoitunut vagina-eritenäyte ei sovellu hyvin keksinnön mukaiseen synnytyksen ajankohdan ennustamistilanteeseen. Rajatapauksissa, joissa verikontaminaatio on vähäinen tai jos halutaan sulkea pois huomaamattoman pienikin verimäärän vaikutus, voidaan diagnoosi kuitenkin usein tehdä, jos määritetään samanaikasesti otetun seeruminäytteen IGFBP-1-pitoisuus. Tällöin on määritysten oltava olennaisesti kvantitatiivisia. Jos vaginaeritenäytteen IGFBP-l-pitoisuus ylittää selvästi seerumin pitoisuuden, on tulosta pidettävä positiivisena. Jos taas veriarvo on vaginasta saadun selvästi verisen näytteen arvoa mainittavasti korkeampi, tiedetään, ettei tulosta voi tulkita, vaan on pyrittävä saamaan mahdollisuuksien mukaan uusi, veretön näyte.

Tutkimuksissa on lisäksi osoitettu, etteivät vaginaeritteet, siemenneste tai virtsa sisällä juuri lainkaan IGFBP-1: tä. Testi voidaan siis suunnitella sellaiseksi, etteivät nämä näytteessä ollessaan voi testioloissa aiheuttaa testiin vääriä positiivisia tuloksia.

Pieni määrä (100-200 μΐ) vaginassa olevaa eritettä riittää . testin suorittamiseen. Näyte otetaan parhaiten spekulatutki- muksen yhteydessä esim. tuberkuliiniruiskulla tai tätä tarkoitusta varten valmistetulla steriilillä ottimella.

Koska IGFBP-1 on riittävän suurikokoinen molekyyli, sen mole-kyylipaino on noin 25000 D, on sille voitu aikaansaada vasta-aineita, joita on mahdollista käyttää hyväksi immunologisessa 12 94181 määritys menetelmäs s ä.

Näin ollen keksinnön mukainen määritysmenetelmä perustuu IGFBP-1: n vasta-aineiden tai muiden spesifisten sitoja-ainei-den käyttöön. Se on nopea ja toimii sopivalla pitoisuusalueel-la. Täten se soveltuu käytettäväksi keksinnön kohteena olevaan diagnostiseen käyttöön eli osoittamaan kohdunsuun kypsyyttä yliaikaisessa raskaudessa sekä uhkaavaa ennenaikaista synnytystä.

Keksinnön edullisessa suoritusmuodossa mittausalue on sellainen, että jo lievästi kohonnut IGFBP-l-pitoisuus vaginaerit-teessä erottuu positiivisena negatiivisesta matalasta normaalialueena pidettävästä pohjatasosta.

Kun testissä käytetään sitoja-ainetta tai -aineita, jotka sitoutuvat spesifisesti vain IGFBP-1: een, on myös ns. risti-reaktion eli väärän yhdisteen sitoutumisen takia tapahtuva positiivinen reaktio poissuljettu.

Keksinnön mukainen IGFBP-l-testi on kehitetty antamaan tuloksen mahdollisimman nopeasti, mikä keksinnön tarkoittamassa diagnoosin tekotilanteessa on sekä lääketieteellisesti että taloudellisesti edullista. Tarvittava näyte voidaan ottaa • esim. gynekologisen spekulatutkimuksen yhteydessä. Näyte voidaan ottaa esimerkiksi ruiskuun tai tätä tarkoitusta varten tehdyllä näytteenottovälineellä.

Keksinnön edullisen suoritusmuodon mukaan on menetelmässä spesifisten sitoja-aineiden ja näytteestä tulevan IGFBP-1:n pitoisuuden suhde säädetty sopivaksi, jotta positiiviseen tulkintaan johtava signaali alkaa esiintyä vasta oikealla IGFBP-1-pitoisuusaiueella.

Keksinnön mukainen IGFBP-l-testi suoritetaan edullisesti kahta spesifistä monoklonaalista vasta-ainetta hyödyntäen esimerkiksi siten, että toinen vasta-aine on kiinnitetty pieneen muovi-

Il « f *1 <> * · · M

94181 13 palloon ja toiseen vasta-aineeseen on liitetty leima kuten entsyymi, esim. piparjuuriperoksidaasi (horseradish per- . oxidase, HRP). Näyte, entsyymillä leimattu vasta-aine ja pidikkeessä oleva vasta-aineella päällystetty pallo pannaan koeputkeen. Inkuboidaan, jona aikana näytteessä oleva IGFBP-1 kiinnittyy toisaalta palloon, toisaalta leimattuun vasta-aineeseen. Pallo poistetaan putkesta ja pestään juoksevassa vedessä. Pallo pannaan putkeen, jossa on käytetyn entsyymin substraattiliuosta. Inkuboinnin aikana muodostuu silmin havaittava väri, mikäli näyte sisälsi riittävän määrän IGFBP-1: tä. Liuos jää värittömäksi, jos IGFBP-1: tä ei näytteessä ole tai sen määrä on liian alhainen.

Keksinnön mukainen IGFBP-l-testi voidaan tehdä myös niin, että ensimmäinen vasta-aine kiinnitetään tällaisiin testitarkoituk-siin kehitetyn membraanin pintaan. Näytteen annetaan olla kosketuksissa membraaniin, jolloin näytteen IGFBP-1 tarttuu spesifisti tähän immobilisoituun vasta-aineeseen. Sen jälkeen lisätään vastaavasti entsyymiin liitetty vasta-aine, joka puolestaan tarttuu membraanissa nyt olevaan IGFBP-1: een. Tarttunut entsyymi osoitetaan lisäämällä pestylle membraanille entsyymin saostuvaa substraattia, joka muuttaa väriään entsyymin vaikutuksesta ja täten näytteen ollessa positiivinen syntyy membraaniin silmin havaittava väri. Tällainen vasta-aineella päällystetyn kalvon käyttöön perustuva testi voidaan toteuttaa esim. kiinnittämällä kyseinen membraani tarkoitukseen erityisesti kehitettyyn muovikuppiin, jossa kalvon alla oleva imukykyinen materiaali imee testin liuokset nopeasti kalvon läpi, kun ne sille pipetoidaan. Samoin voidaan kalvo kiinnittää muoviliuskaan, jota siirretään liuoksesta toiseen.

Positiivista tulosta osoittava väri voidaan saada aikaan myös muutoin kuin leimaamalla vasta-aine entsyymillä, joka puolestaan aiheuttaa substraattinsa värinmuutoksen. Vasta-aineeseen voidaan entsyymin sijasta kiinnittää väriaine, jonka värin intensiteetti on riittävän suuri, jotta positiivisessa tapauksessa immobilisoituneeseen IGFBP-1: een tarttuvan leiman väri t 14 94181 on silmin havaittavissa. Tällaisena väriaineena voidaan käyttää esim. kulta- tai seleenikolloideja taikka dispergoituvia väriaineita. Näiden väriaineiden etuna on, että testin suoritus on lyhyempi, kun erillistä substraattireaktiovaihetta ei tarvita. Vastaavasti voidaan vasta-aine liittää myös värillisiin latex-partikkeleihin. Kun käytetään tällaista värin suoraan näkymiseen perustuvaa detektiota kuten latex- tai värihiukkaset, voidaan käyttää myös immunokromatografista pikatestimenetelmää IGFBP-1: lie. Siinä käytetään tyypillisesti membraania, johon on pienelle alueelle kiinnitetty ensimmäistä vasta-ainetta. Toiseen kohtaan on kuivattu värilliseksi leimattua toista vasta-ainetta, joka liuoksena lisätyn näytteen ansiosta lähtee liikkumaan membraanilla. Mikäli näyte sisältää riittävän määrän IGFBP-1: tä, muodostuu värillinen vyöhyke siihen, missä leimattuun vasta-aineeseen sitoutunut antigeeni kiinnittyy myös membraaniin immobilisoituun vasta-aineeseen.

Jos näyte on negatiivinen, ei värivyöhykettä synny, vaan väriaine liikkuu yli membraanin.

IGFBP-l-testi voidaan myös suorittaa agglutinaatioperiaatteel-la. Tällöin silmin havaittava reaktio on esim. vasta-aineella päällystettyjen partikkelien, kuten latexin, agglutinoituminen näytteessä olleen antigeenin ansiosta syntyvien sidosten vuoksi. Käänteisesti voidaan havaita myös agglutinaation inhi-. hoitumista.

Keksinnön mukaisissa menetelmissä ja reagenssipakkauksissa voidaan hyödyntää, paitsi spesifejä vasta-aineita, myös muita IGFBP-1: n spesifisiä sitoja-aineita ja molempien yhdistelmiä.

Täten voidaan esimerkiksi käyttää hyväksi IGFBP-1: n luonnollista sitoutumisominaisuutta IGF: ään (Insulin-like growth factor).

Testin suorittamiseen voidaan myös käyttää niitä määritysmenetelmiä, joita on selitetty FI patenttijulkaisussa 84863, jonka sisältö liitetään oheen tällä viittauksella.

ia m i ii t i i m .

15 941 81 Tämän keksinnön mukaisilla IGFBP-1: n testimenetelmillä voidaan ratkaisevasti helpottaa synnytysajankohdan arviointiin liit-* tyviä ongelmia. Yliaikaisissa raskauksissa voidaan vähentää äidin ja sikiön sairastuvuutta arvioimalla optimaalinen synnytyksen käynnistysajankohta. Keisarinleikkauksien määrä vähenee tällöin. Toisaalta helpottuu nopea sektion valitseminen primääriksi synnytystavaksi silloin, kun kohdunsuu ei osoita minkäänlaista valmiutta avautumiseen. Ennenaikainen synnytys on tärkein vastasyntyneen sairastuvuuden ja kuolleisuuden syy, kun vastasyntyneen epämuodostumat on poissuljettu. Ongelmaa voidaan huomattavasti lieventää ehkäisevällä hoidolla, jos se osataan oikeille potilaille riittävän ajoissa antaa.

Nämä ratkaisut ovat merkittäviä sekä taloudellisesti että lääketieteellisesti: taloudellisesti hoitopäivien kustannuksina yhteiskunnalle ja lääketieteellisesti siten, että ratkaisulla vaikutetaan suoraan sekä sikiön että äidin hyvinvointiin ja jopa kuolleisuuteen.

Keksinnön mukainen reagenssipakkaus sisältää reagenssin, joka perustuu IGFBP-1: n spesifiseen sitoja-aineeseen. Testimenetelmästä riippuen reagenssi voi olla sitojaliuos tai se voi olla spesifisellä sitoja-aineella päällystetty kiinteä pinta kuten pallo tai membraani, tai se voi muodostua latex- tai väri-hiukkasista. Esimerkiksi yhdessä vaiheessa suoritettavassa testissä voi pakkauksessa olla myös edellisten yhdistelmä. Spesifinen sitoja-aine on edullisesti IGFBP-1: n spesifinen monoklonaalinen vasta-aine.

Edellä mainitun reagenssin lisäksi pakkaus sisältää edullisesti leiman, joka kykenee osoittamaan IGFBP-1: n riittävän pitoisuuden näytteessä sitoutumisreaktion tapahduttua. Sitomis-reaktion osoittava leima on edullisesti IGFBP-1: n toiseen 4 vasta-aineeseen liitetty signaalin antava leima. Leima on esimerkiksi IGFBP-1: n toiseen vasta-aineeseen liitetty entsyymi, radioaktiivinen isotooppi, tai värin perusteella tunnistettava yhdiste. Mikäli leimana on entsyymi, reagenssipakkaus 16 94181 sisältää edullisesti myös entsyymin substraatin.

Varsinaisten reagenssien lisäksi on edullista, että reagenssi-pakkaukseen kuuluu näytteen käsittelemiseen (esim. uuttaminen näytteenottotikusta) tarvittavaa liuosta, joka edullisesti on uuttopuskuria kuten esimerkiksi suojaproteiinia sisältävää fosfaattipuskuria, j onka pH on lähellä fysiologista pH: ta.

Reagenssipakkaukseen voi myös sisältyä näytteenottoinstrument-ti, joka voi olla esimerkiksi steriili kertakäyttöinen ruisku tai erityisesti testiä varten kehitetty väline.

Reagenssipakkauksena voi myös olla yksinkertainen vaginaerit-teen näytteenottoväline, ja siihen liittyvä puskuriliuos testin suorittamista varten. Reagenssipakkauksena voi myös olla vasta-aineella päällystetty tikku, jonka potilas voi itse vaikka viedä vaginaan.

Tämän keksinnön mukainen reagenssipakkaus voi olla myös yhdistelmäpakkaus, jolla voidaan samasta näytteestä samanaikaisesti tehdä sekä kohdunsuun kypsyyden arvioimiseen tarkoitettu testi että patenttihakemuksen PCT/FI91/00413 mukainen sikiökalvojen puhkeamisen osoittamiseen tarkoitettu testi. Tällainen yhdis-telmäreagenssipakkaus voi olla esimerkiksi immunokromatografi-. seen periaatteeseen perustuva. Se sisältää silloin membraanin, johon on kiinnitetty IGFBP-1: n sitoja-ainetta kahtena viivana.

Nämä viivat ovat erivahvuisia, jolloin toisen viivan avulla osoitetaan kohdunsuun kypsyydestä johtuva matalan IGFBP-1:n läsnäolo näytteessä. Jos pitoisuus on niin korkea, että kyseessä on lapsiveden läsnäolo, muodostuu värireaktio molempiin viivoihin. Testissä voidaan myös hyödyntää leiman eri laimennuksia tai eri värejä siten, että testien positiivisuutta osoittaa erivärinen viiva.

Seuraavat esimerkit havainnollistavat keksinnön mukaisen testin suoritusta keksintöä mitenkään rajoittamatta.

17 94181

Esimerkki 1 Päällystetään muovipalloja IGFBP-l-vasta-aineella (6305, Medix Biochemica). Liitetään toiseen IGFBP-l-vasta-aineeseen (6303, Medix Biochemica) leimaentsyymiä (piparjuuriperoksidaasi, HRP). Testipuskurina käytetään fosfaattipuskuria, joka sisältää 0. 3 % naudan albumiinia (BSA). Puskuri sisältää lisäksi detergenttiä ja säilöntäaineita ja sen pH on 7. 4. Suoritetaan IGFBP-l-pikatesti seuraavaa ohjetta noudattaen.

IGFBP-1-pikatestin suoritus: 1. Näyteputkeen pipetoidan 200 μΐ 6303-HRP-leimaa (laimennettuna 1:50 t es ti puskuriin).

2. Putkeen lisätään 100 μΐ näytettä.

3. Putkeen pannan IGFBP-l-vasta-aineella päällystetty pallo pidäkkeessä. Inkuboidaan 5 min.

4. Pallo pidikkeineen poistetaan liuoksesta ja palloa pestään juoksevan veden alla 30 sekuntia.

5. Pesty pallo pidikkeineen upotetaan substraattiliuokseen (2, 2'-atsinodi-(3-etyylibentstiatsolinsulfonaatti(6)), ABTS) (pipetoitu 400 μΐ kirkkaaseen putkeen).

6. Annetaan seistä tummassa suojapullossa 5 minuuttia.

7. Joko katsotaan liuoksen väriä suoraan tai lopetetaan reaktio lisäämällä lopetusliuosta (200 μΐ) ja katsotaan sen jälkeen liuoksen väriä: väritön on negatiivinen, vihreä on positiivinen.

« ,8 941 81

Esimerkki 2 Päällystetään kapea vyöhyke nitrosel1uioosamembraaniliuskaa IGFBP-l-vasta-aineella (6305, Medix Biochemica). Myös päällystetään värillisiä latex-hiukkasia toisella IGFBP-l-vasta-aineella (6303, Medix Biochemica). Kuivataan päällystetyt latex-hiukkaset toiseen päähän membraaniliuskaa, jossa on vasta-ainevyöhyke. Suoritetaan IGFBP-l-pikatesti membraanilla seu-raavan ohjeen mukaisesti.

IGFBP-1-membraanitestin suoritus: 1. Pipetoidaan muutama tippa näytettä siihen liuskan osaan, johon latex-hiukkaset on kuivattu.

2. Inkuboidaan muutama minuutti, jona aikana näyte liikkuu membraania pitkin ja latex-hiukkaset kulkeutuvat nesteen mukana yli vasta-aineella päällystetyn vyöhykkeen liuskan toiseen päähän asti.

3. Tarkastellaan liuskaa. Mikäli siihen on muodostunut värillinen vyöhyke, on tulos positiivinen.

Esimerkki 3 Päällystetään pieni alue nailonmembraania IGFBP-l-vasta-aineella (6305, Medix Biochemica). Kiinnitetään päällystetty membraani muovikuppimaiseen telineeseen siten, että heti sen alla siinä kiinni on imukykyistä materiaalia (käsiteltyä selluloosaa). Liitetään toiseen IGFBP-l-vasta-aineeseen (6303,

Medix Biochemica) leimaentsyymiä (piparjuuriperoksidaasi, HRP). Suoritetaan IGFBP-1 pikatesti seuraavaa ohjetta noudattaen.

1. Pipetoidaan muutama tippa näytettä membraanille ja odotetaan että lious imeytyy membraanin läpi.

19 94181 2. Pipetoidaan kupin rajoittama määrä (n. 1 ml) pesuliuosta ja odotetaan että lious imeytyy membraanin läpi.

3. Pipetoidaan muutama tippa leima-liuosta ja odotetaan että liuos imeytyy membraanin läpi.

4. Pipetoidaan n. 1 ml pesuliuosta ja odotetaan että lious imeytyy membraanin läpi.

5. Pipetoidaan muutama tippa entsyymin saostuvaa substraattia membraanille ja odotetaan että liuos imeytyy membraanin läpi.

6. Tarkastellaan membraania. Mikäli siihen on muodostunut värillinen alue on tulos positiivinen.

Edellä keksinnön mukaisen testin suoritus on havainnollistettu eräillä immunometrisillä menetelmillä. Alan ammattiiniehille on kuitenkin selvää, että menetelmiä voidaan vaihdella ja muunnella edellä esitetyn selityksen sekä oheisten patenttivaatimusten puitteissa poikkeamatta keksinnön piiristä.

m 4

Claims (8)

1. Diagnostinen menetelmä, jossa raskaana olevan naisen vaginasta otetusta eritenäytteestä määritetään insuliininkaltäisen kasvutekijän sitoj aproteiini-1: n eli IGFBP-1: n läsnäolo vähintään yhden IGFBP-1: n spesifiseen sitoja-aineeseen perustuvan testin avulla, tunnettu siitä, että menetelmällä osoitetaan synnytyksen lähestyvän toteamalla IGFBP-1-: n spesifisen sitoja-aineen avulla, että IGFBP-l-pitoisuus olennaisesti verettömässä eritenäytteessä on kohonnut yli normaalitason, . mutta alittaa sikiökalvojen puhkeamisesta johtuvan lapsiveden aiheuttaman suuren IGFBP-1-pitoisuuden.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että synnytyksen todetaan lähestyvän kun IGFBP-l-pitoisuus on kohonnut korkeintaan noin arvoon 100 v-q/1.

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, t u n - ·. n e t t u siitä, että spesifisenä sitoja-aineena käytetään IGFBP-1:n vasta-ainetta, edullisesti monoklonaalista vasta-ainetta.

4. Jonkin edellisen patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että määritys suoritetaan immunologisella menetelmällä käyttäen IGFBP-1: n sitoja-aineeseen perustuvaa reagenssia sekä leimattua toista sitoja-ainetta, jonka antama signaali voidaan havaita.

5. Jonkin edellisen patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että käytetään leimattua reagenssia, jonka signaali antaa positiivisen tuloksen, kun mitattava IGFBP-l-pitoisuus ylittää normaalitason. 21 94181

6. Reagenssipakkaus jonkin patenttivaatimuksen 1-5 mukaisen diagnostisen menetelmän toteuttamiseksi, joka pakkaus sisältää vähintään yhtä reagenssia, jossa on insuliininkaltaisen kasvutekijän sitojaproteiini 1: n eli IGFBP-1: n spesifistä sitoja-ainetta sekä sitomisreaktion osoittava leima, tunnettu siitä, että synnytys ajankohdan ennustamista varten sitomis-reaktion osoittava leima antaa positiivisen tuloksen kun IGFBP-1-pitoisuus on kohonnut normaalitasosta arvoon, joka on alle noin 100 ug/l.

7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen reagenssipakkaus, tunnettu siitä, että sitomisreaktion osoittava leima on IGFBP-1: n toiseen sitoja-aineeseen liitetty signaalin antava aine.

8. Patentivaatimuksen 6 tai 7 mukainen reagenssipakkaus, tunnettu siitä, että siinä on lisäksi toinen sitomis-reaktion osoittava leima, joka antaa positiivisen tuloksen vasta kun IGFBP-l-pitoisuus on noussut yli 100 ug/1. * 22 94181