FI86777B - Foerfarande foer diagnosticering av bristningen av fosterhinnorna samt reagensfoerpackning foer anvaendning daervid. - Google Patents

Description

! 86777

Diagnostinen menetelmä sikiökalvojen puhkeamisen osoittamiseksi sekä siihen käytettävä reagenssipakkaus Förfarande för diagnosticering av bristningen av fosterhinnor-na samt reagensförpackning för användning därvid

Keksinnön kohteena on diagnostinen menetelmä sikiökalvojen puhkeamisen osoittamiseksi, joka menetelmä perustuu raskaana olevan naisen vaginasta otetussa eritenäytteessä olevan proteiinin määritykseen, sekä reagenssipakkaus sikiökalvojen puhkeamisen diagnoosia varten.

Sikiökalvojen ennenaikainen puhkeaminen, jolla ymmärretään kalvojen spontaania puhkeamista vähintään 24 tuntia ennen täy-saikaisen tai ennenaikaisen synnytyksen käynnistymistä, tapahtuu noin 5-10 %:ssa synnytyksistä ja on syynä noin 10 %: iin pe-rinataaleista kuolemista. Noin 30-50 % kalvojen ennenaikaisista puhkeamisista tapahtuu, kun raskaus on alle 37 viikkoa eli ei ole täysiaikainen (premature rupture of fetal membranes, PROM). Tällöin diagnoosi on äärimmäisen tärkeä, koska kalvojen puhkeamiseen liittyy merkittävästi lisääntynyt infektioriski kohdussa. Infektioriski on sitä suurempi, mitä pidempi aika kalvojen puhkeamisesta synnytykseen kuluu. Infektio lisää sekä äitien kuolleisuutta että perinataalikuolleisuutta.

Ongelman yleisyydestä ja vakavuudesta huolimatta ei tiedossa ole ollut ehdotonta diagnostista menetelmää, jolla kalvojen puhkeaminen osoitettaisiin silloin, kun se ei ole kliinisesti selvä.

Definitiivisen menetelmän puutteessa on käytetty useita epätyydyttäviä menetelmiä, joilla on pyritty osoittamaan lapsiveden läsnäoloa vaginassa. Tunnettuja menetelmiä ovat kuvanneet mm. Friedman M. L. ja McElin T. W. , Diagnosis of ruptured fetal membranes. Am J Obstet Gynec 1969;104:544-550. Lapsiveden kitey-tymistestissä nähdään normaalista vaginaeritteestä poikkeava kiteytymismalli objektilasilla. Värjäystesteillä ero pyritään 2 86777 havaitsemaan värjäämällä lasilla olevaa eritettä esim. Niilin-sinisellä, akridiinioranssilla tai bromitymolisinisellä. Nitratsiinitestillä voidaan osoittaa muuttunutta vaginaerit-teen pH: ta. Edellä mainitussa julkaisussa kuvataan myös menetelmä, jossa lapsivesi värjätään fluoresoivalla aineella ja sen vuotaminen havaitaan visuaalisesti UV-valossa.

Nämä menetelmät eivät ole tyydyttäviä liian usein sattuvien väärien positiivisten tai väärien negatiivisten tulosten vuoksi, taikka ovat herkkiä häiritseville aineille tai sisältävät riskin potilaan terveydelle. Testitulos voi olla virheellinen, jos emättimessä on tulehdus, tai jos lapsiveden menosta on kulunut jo kauan aikaa.

Sikiökalvojen ennenaikaisen puhkeamisen osoittamiseksi on myös esitetty määritettäväksi vaginaeritteestä jotakin sellaista yhdistettä, jonka pitoisuus lapsivedessä on suuri verrattuna kyseisen yhdisteen pitoisuuksiin niissä muissa eritteissä, joita vaginassa mahdollisesti voi olla. Tällaisina yhdisteinä on kuvattu alfa-fetoproteiinia (AFP) (Rochelson et ai. Rapid assay - possible application in the diagnosis of premature rupture of the membranes. Obstet gynecol 1983;62:414-418) ja prolaktiinia (PRL) (Koninckx et al. Prolactin concentration in vaginal fluid: a new method for diagnosing ruptured membranes. Br J Obstet Gynecol 1981;88:607-610). Molempien yhdisteiden konsentraatio lapsivedessä on selvästi korkeampi kuin raskaana olevan henkilön veressä. Kuitenkin tilanteessa, jossa vaginasta otettu näyte sisältää verta, on näitä yhdisteitä määrittämällä vaikea osoittaa pienen lapsivesimäärän läsnäoloa.

Näin ollen on ilmeistä, että on olemassa tarve yksinkertaisen ja luotettavan diagnoosimenetelmän kehittämiseksi sikiökal-vojen puhkeamisen toteamiseksi. Testaustilanteessa on tuloksen nopea saaminen erittäin tärkeätä ja tarkoitukseen ihanteellinen testi on suoritukseltaan yksinkertainen ja nopea (tulos vähintään 30 minuutin kuluessa) ja voidaan mieluiten tehdä bedside-testinä eli välittömästi paikan päällä.

3 86777

Keksinnön tarkoituksena on siten saada aikaan uusi ja parannettu menetelmä lapsiveden menon osoittamiseksi, joka menetelmä on mitattavalle aineelle spesifinen potilaan yksilöllisistä poikkeamista riippumatta.

Keksinnön tarkoituksena on myös saada aikaan menetelmä, joka on nopea ja helppo suorittaa potilaan odottaessa nk. bedside-testinä.

Keksinnön tarkoituksena on myös kehittää tällaiseen diagnoosiin soveltuva reagenssipakkaus, joka sisältää välineet yksinkertaisen ja nopean diagnoosimenetelmän suorittamiseksi.

Keksinnön tarkemmat piirteet ilmenevät seuraavasta selityksestä ja oheisista patenttivaatimuksista, joiden sisältö liitetään oheen tällä viittauksella. Siten keksinnön kohteena on diagnostinen menetelmä sikiökalvojen puhkeamisen osoittamiseksi, joka menetelmä perustuu raskaana olevan naisen vaginasta otetussa eritenäytteessä olevan proteiinin määritykseen, ja jolle menetelmälle on tunnusomaista, että tunnistettavana proteiinina on insuliininkaltaisen kasvutekijän sitojaproteiini 1, IGFBP-1, jonka lapsiveden menosta johtuva läsnäolo näytteessä osoitetaan IGFBP-1: n vähintään yhden spesifisen sitoja-aineen avulla.

Keksinnön mukaisessa menetelmässä spesifisen sitoja-aineen ja määritettävän proteiinin määrien suhde on säädetty sellaiseksi että matala IGFBP-1-pitoisuus ei aiheuta positiiviseksi tulkittavaa reaktiota, vaan sen aiheuttaa vasta niin korkea pitoisuus, kuin ainoastaan lapsivedessä on. Tämä epäherkistys aikaansaadaan keksinnön mukaan esimerkiksi siten, että vaginasta otettu näyte laimennetaan ennen testin suorittamista.

Keksinnön mukaiselle sikiökalvojen puhkeamisen diagnoosia varten kehitetylle reagenssipakkaukselle on tunnusomaista, että se sisältää vähintään yhtä reagenssia, jossa on insuliinin- 4 86777 kaltaisen kasvutekijän sitojaproteiini 1: n, eli IGFBP-1: n spesifistä sitoja-ainetta, sikiökalvojen puhkeamisesta johtuvan IGFBP-1: n läsnäolon osoittamiseksi vaginasta otetussa e rite näyt teessä.

Keksinnön mukaisessa reagenssipakkauksessa on lisäksi edullisesti IGFBP-1: n ja sitoja-aineen välisen sitomisreaktion osoittava leima, ja reagenssin sisältämä IGFBP-1:n spesifinen sitoja-aine on edullisesti IGFBP-1: n spesifinen vasta-aine, erityisesti monoklonaalinen vasta-aine.

I nsuliininkaltaisen kasvutekijän sitojaproteiini 1, IGFBP-1 (Insulin-like Growth Factor Binding Protein 1) on proteiini, jota esiintyy vaihtelevissa pitoisuuksissa sekä miesten että naisten eri ruumiinnesteissä ja mm. raskaana olevan naisen seerumissa. Sen synteesi on toistaiseksi osoitettu vain maksassa, kohdun limakalvossa ja munasarjassa.

IGFBP-1 puhdistettiin ensimmäisen kerran istukasta ja sikiö-kalvoista vuonna 1980 (Bohn et ai. Isolierung und Characte-risierung eines Neuen Plazentaspezifischen Proteins (PP12). Arch Gynecol 1980;229:279-291). Sitä pidettiin istukkaperäi-senä proteiinina ja nimitettiin istukkaproteiini 12: ksi (PP12). Myöhemmin todettiin, että PP12:11a ja lapsivedestä puhdistetulla IGFBP-1: llä on sama N-terminaalinen aminohappo-järjestys (Povoa et ai. Cross-reactions of serum somatomedinbinding protein in a radioimmunoassay developed for somatomedinbinding protein isolated from human amniotic fluid. Acta Endocrinologica 1984;107:563-570) ja että PP12 sitoo IGF I:tä (insuliininkaltäinen kasvutekijä I) (Koistinen et ai.

Placental protein 12 is a decidual protein that binds somatomedin and has an identical N-terminal amino acid sequence with somatomedin-binding protein from human amniotic fluid. Endocrinology 1986,-118:1375). IGFBP-1: n synteesi raskaana olevan kohdun limakalvossa (deciduassa) osoitettiin ensimmäisen kerran vuonna 1985 (Rutanen et ai. Synthesis of placental protein 12 by human decidua. Endocrinology 1985,-116:1304).

II

5 86777

Vuonna 1988 julkaistiin IGFBP-1: n puhdistus ihmisen maksa-syöpäsolulinjasta (Lee et ai. Insulin-like growth factor (IGF) binding protein complementary deoxyribonucleic acid from human HEP G2 hepatoma cells, Mol. Endocrinol., 2, 404). Tässä yhteydessä raportoitiin ensimmäisen kerran koko proteiinin täydellinen aminohappojärjestys.

IGFBP-1: n pitoisuuden on todettu olevan lapsivedessä yleensä 100-1000-kertainen äidin seerumiin verrattuna (Rutanen et ai. Radioimmunoassay of placental protein 12: levels in amniotic fluid, cord blood and serum of healthy adults, pregnant women and patients with trophoblastic disease. Am J Obstet Gynecol 1982,-144:460). Kliinisiä sovellutuksia ei tälle havainnolle kuitenkaan toistaiseksi ole kuvattu.

Spesifisiin sitoja-aineisiin perustuvat reaktiot ovat yleisesti tunnettuja. Spesifisinä sitoja-aineina käytetään yleisimmin vasta-aineita. Tällaiset, nk. immunologiset määritysmenetelmät perustuvat vasta-aineen kykyyn sitoutua spesifisti tiettyyn antigeeninsa kohtaan (epitooppiin). Ns. polyklonaali-set vasta-aineet ovat seos immunisoidun eläimen seerumin immu-noglobuliineja. Seokset ovat eläinyksilökohtaisesti erilaisia. Monoklonaaliset vasta-aineet taas ovat yhden laboratoriossa kasvatettavan solulinjan tuottamia ja kukin vasta-aine on homogeeninen ja proteiinikemiallisesti karakterisoitavissa sekä jatkuvasti identtisenä tuotettavissa.

Immunologinen määritys voi olla sellainen, että siinä käytetään vain yhtä vasta-ainetta, jolloin tavallisesti järjestetään reaktio-olosuhteet sellaisiksi, että tutkittavan näytteen antigeeni kilpailee leimatun, mutta muutoin näytteen sisältämälle antigeenille identtisen, seokseen lisätyn antigeenin kanssa rajoitetusta määrästä sitomispaikkoja vasta-aineessa. Pitoisuus saadaan selville tutkimalla sitoutuneen leiman osuutta. Leima-aineena, jonka antaman signaalin voimakkuuteen pitoisuuden määrittäminen perustuu, voidaan käyttää esim.

6 86777 radioaktiivista isotooppia, entsyymiä, kemiluminesoivaa tai fluoresoivaa yhdistettä. Määritys voi myös olla kahta vasta-ainetta käyttävä (ns. sandwich-periaate). Tällöin vasta-aineet kohdistuvat antigeenin eri epitooppeihin ja pystyvät sitoutumaan yhtä aikaa samaan antigeenimolekyyliin. Toinen vasta-aine on usein sidottu kiinteään kantajaan ja toinen on leimattu. Molemmat sitoutuvat näytteen antigeeniin ja kompleksi voidaan kantajan avulla erottaa sitoutumattomasta leimasta. Sitoutuneen leimatun vasta-aineen määrä on suoraan verrannollinen näytteessä olleeseen antigeenipitoisuuteen.

Tämän keksinnön keksijä on tutkinut istukkaproteiineja ja kehittänyt tutkimustaan varten IGFBP-l:lle (PP12: lie ) radioimmunologisen määritysmenetelmän. Tutkimuksia varten on myös kehitetty IGFBP-1: tä vastaan monoklonaalisia vasta-aineita (Rutanen et ai. Monoclonal antibodies to the 27-34 K insulinlike growth factor binding protein. Biochem Biophys Res Commun 1988;152: 208). Tutkimukset eivät kuitenkaan ole johtaneet kliinisiin sovellutuksiin.

Kirjallisuudessa ei myöskään ole yhtään raporttia, joissa lapsiveden ja muiden vaginassa olevien eritteiden IGFBP-1-pitoisuuksia olisi verrattu. Tämän keksinnön keksijän johdolla on nyt tutkittu paitsi lapsiveden ja veren IGFBP-l-pitoisuuk-sia, myös pitoisuuksia eritteissä, joita vaginassa mahdollisesti voi olla (Taulukko 1).

7 86777

Taulukko 1

Taulukossa esitetään raskauden 24-38 viikoilla otettujen äidin seerumi(S)- ja lapsivesi(LV)-näytteiden IGFBP-1-, prolaktiini (PRL)- ja alfa-fetoproteiini (AFP)-pitoisuuksia potilas näyte IGFBP-1 suhde PRL suhde AFP suhde ^g/D (ng/i) (u/mi) 1 S 170 140 LV 60000 353 1800 13 2 S 130 76 LV 29000 223 320 4 3 S 140 83 LV 48000 343 260 3 4 S 200 118 LV 65000 325 340 3 5 S 63 183 LV 22000 349 210 1 6 S 350 124 LV 350000 1000 300 2 7 S 240 78 LV 115000 479 420 5 8 S 190 150 LV 40000 210 350 2 9 S 240 183 75 LV 50000 208 390 2 240 3 10 S 250 62 150 LV 200000 800 583 9 333 2 11 S 130 100 162 LV 70000 538 728 7 367 2 12 S 65 60 98 LV 33000 508 400 7 139 1 13 S 600 190 98 LV 70000 117 447 2 372 4 14 S 260 69 242 LV 95000 365 433 6 178 1 15 S 340 130 137 LV 180000 529 443 3 196 1 8 , - f· n h >->

Taulukko 1 (jatk. ) potilas näyte IGFBP-1 suhde PRL suhde AFP suhde (ug/D (iig/D (u/mi) 16 S 500 94 97 LV 155000 310 1173 12 377 4 17 S 155 154 233 LV 19000 122 46 <1 214 1 18 S 340 129 47 LV 140000 412 573 4 229 5 19 S 160 40 153 LV 200000 1250 1301 33 1252 8 20 S 240 104 71 LV 160000 667 964 9 151 2 21 S 340 201 LV 145000 426 111 <1 22 S 350 116 181 LV 53000 151 194 2 246 1 23 S 200 92 55 LV 125000 625 191 2 121 2 24 S 135 131 LV 55000 407 790 6 25 S 340 35 LV 145000 426 248 7

Tutkittujen veri-lapsivesi-parien perusteella voidaan todeta, että vaikka veressä onkin huomattavia ja myös yksilöllisesti vaihtelevia määriä IGFBP-1: tä, IGFBP-1-pitoisuus lapsivedessä on kaikissa tapauksissa yli 100 kertaa suurempi kuin sen pitoisuus äidin seerumissa. Mainittu pitoisuusero on suurin keksijän tiedossa oleva proteiinin veri lapsivesi-ero. Tästä syystä IGFBP-1 sopii erinomaisesti osoittamaan lapsivettä myös tilanteissa, joissa lapsivesi on sekoittunut vereen.

Sen sijaan proteiinien AFP: n ja PRL: n vastaavat suhteet vaih-televat huomattavasti, ollen suuruusluokkaa 1-10. Eräissä tapauksissa mitattavia yhdisteitä oli jopa enemmän seerumissa kuin lapsivedessä. Nämä mittaukset osoittavat myös miksi aikaisemmat, AFP: n ja PRL: n mittauksiin perustuvat kokeet 9 86777 eivät ole olleet täysin luotettavia.

Keksinnön mukaan todettiin, että asettamalla IGFBP-1-testin herkkyysraja sellaiseksi, että korkeakaan IGFBP-1-pitoisuus veressä ei anna positiivista tulosta, voidaan varmistaa se että positiivinen tulos on aina lapsivedestä peräisin. Tällöin voidaan osoittaa matalapitoisestakin lapsivedestä peräisin oleva IGFBP-1, vaikka lapsivettä on veren joukossa erittäin vähäinenkin määrä.

Herkkyysraja voidaan asettaa halutulle tasolle esimerkiksi käyttämällä leimaa, jonka antama signaali on niin heikko, ettei pelkästään verestä tai näytteessä olevasta muusta eritteestä johtuva alhainen IGFBP-1-pitoisuus anna positiiviseksi luettavaa tulosta. Voimakkaan signaalin herkkyysrajaa voidaan alentaa esimerkiksi laimentamalla näytettä. Kvantitatiivisen tuloksen antava signaali voidaan taas tulkita negatiiviseksi aina, kun IGFBP-1-pitoisuus näytteessä on alle äidin seerumista johtuvan korkeimman tunnetun pitoisuuden.

Tutkimuksissa on lisäksi osoitettu, etteivät vaginaeritteet, siemenneste tai virtsa sisällä kuin murto-osan lapsiveden sisältämästä IGFBP-1-määrästä, joten testi voidaan suunnitella sellaiseksi, etteivät muut IGFBP-l-lähteet testioloissa voi aiheuttaa testiin vääriä positiivisia tuloksia. Kuten Taulukosta 1 ilmenee, korkein kokeissa todettu IGFBP-l-pitoisuus äidin seerumissa oli 600 μg/l, kun sen sijaan alin pitoisuus lapsivedessä oli 22000 μg/l. Näin ollen, vaikka näytteessä ei olisi kuin 10% lapsivettä niin kuitenkin lapsiveden läsnäolosta johtuva IGFBP-l-pitoisuus olisi 2200 μg/l eli yli kolme kertaa enemmän kuin korkein mitattu äidin seerumista johtuva pitoisuus. Useimmiten lapsiveden IGFBP-l-pitoisuus on huomattavasti yli edellä esityn 22000 μg/l ja äidin seerumin vastaavasti huomattavasti alle edellä esitetyn 600 ug/l.

Pieni määrä (100-200 μΐ) vaginassa olevaa eritettä riittää testin suorittamiseen. Näyte otetaan parhaiten spekulatutki- 10 86777 muksen yhteydessä esim. tuberkuliiniruiskulla tai tätä tarkoitusta varten valmistetulla steriilillä ottimella.

Koska IGFBP-1 on riittävän suurikokoinen molekyyli, sen mole-kyylipaino on noin 25000 D, on sille voitu aikaansaada vasta-aineita, joita on mahdollista käyttää hyväksi immunologisessa määritysmenetelmässä.

Näin ollen keksinnön mukainen määritysmenetelmä perustuu IGFBP-1: n vasta-aineiden tai muiden spesifisten sitoja-ainei-den käyttöön. Se on nopea ja toimii sopivalla pitoisuusalueel-la ja täten se soveltuu käytettäväksi keksinnön kohteena olevaan diagnostiseen käyttöön eli osoittamaan sikiökalvojen puhkeamista näyttämällä toteen lapsiveden läsnäolon vaginassa.

Käyttämällä keksinnön mukaista edullista IGFBP-1-määritystä voidaan nyt ensi kertaa osoittaa lapsivettä vaginasta riittävän spesifisesti, koska niin korkeita pitoisuuksia kuin määrityksen mittausalue vaatii, ei muualla kuin lapsivedessä esiinny. Vääriä positiivisia tuloksia ei siis muusta lähteestä johtuvan kontaminaation vuoksi tule.

Keksinnön edullisessa suoritusmuodossa mittausalue on säädetty sellaiseksi, ettei veren IGFBP-1 voi aiheuttaa väärää positiivista tulosta. Siten testi on myös niin epäherkkä, ettei normaalisti tapahtuva erittäin vähäinen lapsiveden tihkuminen ehjien sikiökalvojen läpi voi aiheuttaa väärää tulkintaa. Kun testissä käytetään sitoja-ainetta tai -aineita, jotka sitoutuvat spesifisesti vain IGFBP-1: een, on myös ns. ristireaktion eli väärän yhdisteen sitoutumisen takia tapahtuva positiivinen reaktio poissuljettu.

Toisaalta on lapsiveden IGFBP-l-pitoisuus aina niin korkea, ettei sikiökalvojen puhkeamisen yhteydessä tapahtuva vuoto voi jäädä keksinnön mukaisessa testissä osoittamatta. Testissä käytetään spesifistä sitoja-ainetta, joka sitoutuu IGFBP-1:een niin suurella affiniteetilla, että testi nopeasta suoritus- '1 86777 ajastaan huolimatta alkaa osoittaa positiivista tulosta halutusta näytteen IGFBP-1-pitoisuudesta lähtien.

Testiä kehitettäessä on myös otettu huomioon ns. Hook-efektin (prozone-ilmiö) vaikutuksen poistaminen. Tämä efekti tarkoittaa, että immunologisessa reaktiossa vasta-aineeseen nähden erittäin korkea antigeenipitoisuus saattaa aiheuttaa määritettävien vasta-aine-antigeenikompleksien virheellistä vähenemistä. Tällöin voidaan korkeapitoisesta näytteestä saada päinvastoin matala tulos, mikä kuvatunlaisessa testissä olisi erittäin haitallista ja aiheuttaisi väärän negatiivisen tuloksen. Tämän vuoksi on keksinnön tarkoittaman testimenetelmän edullista suoritusmuotoa kehitettäessä sitojareagenssien ja mitattavan IGFBP-l:n määrien suhde reaktio-olosuhteissa säädetty sellaisiksi, ettei korkeinkaan tunnettu lapsiveden pitoisuus voi aiheuttaa testissä mitattavan signaalin muuttumista negatiiviseksi ja sen seurauksena virheellistä tulkintaa. Täten väärän negatiivisen tuloksen saamisen riski on keksinnön mukaisessa testissä olennaisesti eliminoitu.

Keksinnön mukainen IGFBP-1-testi on kehitetty antamaan tuloksen mahdollisimman nopeasti, mikä keksinnön tarkoittamassa diagnoosin tekotilanteessa on sekä lääketieteellisesti että taloudellisesti tärkeätä. Tarvittava näyte voidaan ottaa esim. gynekologisen spekulatutkimuksen yhteydessä vedenmenoa epäiltäessä. Näyte voidaan ottaa esimerkiksi ruiskuun tai tätä tarkoitusta varten tehdyllä näytteenottovälineellä.

Keksinnön edullisen suoritusmuodon mukaan on menetelmässä spesifisten sitoja-aineiden ja näytteestä tulevan IGFBP-l:n pitoisuuden suhde säädetty sopivaksi, jotta positiiviseen tulkintaan johtava signaali esiintyy vasta näytteen korkeissa IGFBP-1-konsentraatioissa. Oikea suhde aikaansaadaan esimerkiksi laimentamalla diagnoosia varten otettu eritenäyte ennen itse testin suorittamista. Laimennus suoritetaan liuoksella, joka on suotuisa testissä tapahtuvan sitoutumisreaktion suhteen, edullisesti testiin kuuluvalla liuoksella. Liuos on 12 96777 mieluiten puskuria kuten esimerkiksi fosfaattipuskuria, joka sisältää suojaproteiineja ja jonka pH on lähellä fysiologista pH: ta.

Suoritetuissa käytännän kokeissa on todettu, että laimennuksen tulisi olla vähintään noin 1:10 luotettavan tuloksen antamiseksi ja edullisesti vähintään noin 1:20. Myös suurempia laimennuksia voidaan käyttää, jopa 1:500 saakka tai jopa suurempia. Keksinnön vaatiman testin tulokseksi riittää kvalitatiivinen tulos, eli joko + tai -, joten laimennuksen suuruus ei ole kriittinen, kunhan se ylittää sen rajan, jossa esimerkiksi äidin veressä oleva IGFBP-1 voisi antaa positiivisen tuloksen valitun leiman herkkyysalueella.

Testi voidaan suorittaa myös laimentamattomasta näytteestä esimerkiksi käyttämällä erittäin suuria spesifisten sitoja-aineiden määriä ja leima-ainetta, jonka antama signaali ei ole kovin voimakas. Tällöin vain lapsivedestä johtuva suuri IGFBP-1-pitoisuus pystyy antamaan positiivisen tuloksen.

Keksinnön mukainen IGFBP-l-testi suoritetaan edullisesti kahta spesifistä monoklonaalista vasta-ainetta hyödyntäen esimerkiksi siten, että toinen vasta-aine on kiinnitetty pieneen muovi-palloon ja toiseen vasta-aineeseen on liitetty leima kuten entsyymi, esim. piparjuuriperoksidaasi (horseradish peroxidase, HRP). Sopivasti laimennettu näyte, entsyymillä leimattu vasta-aine ja pidikkeessä oleva vasta-aineella päällystetty pallo pannaan koeputkeen. Inkuboidaan, jona aikana näytteessä oleva IGFBP-1 kiinnittyy toisaalta palloon, toisaalta leimattuun vasta-aineeseen. Pallo poistetaan putkesta ja pestään juoksevassa vedessä. Pallo pannaan putkeen, jossa on käytetyn entsyymin substraattiliuosta. Inkuboinnin aikana muodostuu silmin havaittava väri, mikäli näyte sisälsi riittävän määrän IGFBP-1: tä. Liuos jää värittömäksi, jos IGFBP-1: tä ei näytteessä ole tai sen määrä on liian alhainen.

Keksinnön mukainen IGFBP-1-testi voidaan tehdä myös niin, että 13 86777 ensimmäinen vasta-aine kiinnitetään tällaisiin testitarkoituksiin kehitetyn membraanin pintaan. Näytteen annetaan olla kosketuksissa membraaniin, jolloin näytteen IGFBP-1 tarttuu spesifisti tähän immobilisoituun vasta-aineeseen. Sen jälkeen lisätään vastaavasti entsyymiin liitetty vasta-aine, joka puolestaan tarttuu membraanissa nyt olevaan IGFBP-1: een. Tarttunut entsyymi osoitetaan lisäämällä pestylle membraanille entsyymin saostuvaa substraattia, joka muuttaa väriään entsyymin vaikutuksesta ja täten näytteen ollessa positiivinen syntyy membraaniin silmin havaittava väri. Tällainen vasta-aineella päällystetyn kalvon käyttöön perustuva testi voidaan toteuttaa esim. kiinnittämällä kyseinen membraani tarkoitukseen erityisesti kehitettyyn muovikuppiin, jossa kalvon alla oleva imukykyinen materiaali imee testin liuokset nopeasti kalvon läpi, kun ne sille pipetoidaan. Samoin voidaan kalvo kiinnittää muoviliuskaan, jota siirretään liuoksesta toiseen.

Positiivista tulosta osoittava väri voidaan saada aikaan myös muutoin kuin leimaamalla vasta-aine entsyymillä, joka puolestaan aiheuttaa substraattinsa värinmuutoksen. Vasta-aineeseen voidaan entsyymin sijasta kiinnittää väriaine, jonka värin intensiteetti on riittävän suuri, jotta positiivisessa tapauksessa immobilisoituneeseen IGFBP-1: een tarttuvan leiman väri on silmin havaittavissa. Tällaisena väriaineena voidaan käyttää esim. kulta- tai seleenikolloideja taikka dispergoituvia väriaineita. Näiden väriaineiden etuna on, että testin suoritus on lyhyempi, kun erillistä substraattireaktiovaihetta ei tarvita. Vastaavasti voidaan vasta-aine liittää myös värillisiin latex-partikkeleihin. Kun käytetään tällaista värin suoraan näkymiseen perustuvaa detektiota kuten latex- tai värihiukkaset, voidaan käyttää myös immunokromatografista pikatestimenetelmää IGFBP-1: lie. Siinä käytetään tyypillisesti membraania, johon on pienelle alueelle kiinnitetty ensimmäistä vasta-ainetta. Toiseen kohtaan on kuivattu värilliseksi leimattua toista vasta-ainetta, joka liuoksena lisätyn näytteen ansiosta lähtee liikkumaan membraanilla. Mikäli näyte sisältää riittävän määrän IGFBP-1:tä, muodostuu värillinen vyöhyke 86777 14 siihen, missä leimattuun vasta-aineeseen sitoutunut antigeeni kiinnittyy myös membraaniin immobilisoituun vasta-aineeseen. Jos näyte on negatiivinen, ei värivyöhykettä synny, vaan väriaine liikkuu yli membraanin.

IGFBP-1-testi voidaan myös suorittaa agglutinaatioperiaatteel-la. Tällöin silmin havaittava reaktio on esim. vasta-aineella päällystettyjen partikkelien, kuten latexin, agglutinoituminen näytteessä olleen antigeenin ansiosta syntyvien sidosten vuoksi. Käänteisesti voidaan havaita myös agglutinaation inhi-boitumista.

Keksinnön mukaisissa menetelmissä ja reagenssipakkauksissa , voidaan hyödyntää, paitsi spesifejä vasta-aineita, myös muita IGFBP-1:n spesifisiä sitoja-aineita ja molempien yhdistelmiä. Täten voidaan esimerkiksi käyttää hyväksi IGFBP-1: n luonnollista sitoutumisominaisuutta IGF: ään (Insulin-like growth factor).

Testin suorittamiseen voidaan myös käyttää niitä määritysmenetelmiä, joita on selitetty FI patenttihakemuksessa 902541, jonka sisältö liitetään oheen tällä viittauksella.

Tämän keksinnön mukaisilla IGFBP-1: n testimenetelmillä voidaan ratkaisevasti helpottaa lapsiveden ennenaikaiseen menoon liittyviä ongelmia. Lapsiveden menon jälkeen potilas vaatii tulehdusvaaran vuoksi intensiivistä seurantaa synnytykseen saakka. Epäillyissä vedenmenotapauksissa on siis tutkimuksen perusteella ratkaistava, onko potilas otettava sairaalaan vai pääseekö hän kotiin. Tämä ratkaisu on merkittävä sekä taloudellisesti että lääketieteellisesti: taloudellisesti hoito päivien kustannuksina yhteiskunnalle ja lääketieteellisesti siten, että ratkaisulla vaikutetaan suoraan sekä sikiön että äidin kuolleisuuteen.

Keksinnön mukainen reagenssipakkaus sisältää reagenssin, joka perustuu IGFBP-1: n spesifiseen sitoja-aineeseen. Testimenetel- l! s 86777 mästä riippuen reagenssi voi olla sitojaliuos tai se voi olla spesifisellä sitoja-aineella päällystetty kiinteä pinta kuten pallo tai membraani, tai se voi muodostua latex- tai väri-hiukkasista. Esimerkiksi yhdessä vaiheessa suoritettavassa testissä voi pakkauksessa olla myös edellisten yhdistelmä. Spesifinen sitoja-aine on edullisesti IGFBP-1: n spesifinen monoklonaalinen vasta-aine.

Edellä mainitun reagenssin lisäksi pakkaus sisältää edullisesti leiman, joka kykenee osoittamaan IGFBP-1: n riittävän pitoisuuden näytteessä sitoutumisreaktion tapahduttua. Sitomis-reaktion osoittava leima on edullisesti IGFBP-1: n toiseen vasta-aineeseen liitetty signaalin antava leima. Leima on esimerkiksi IGFBP-1: n toiseen vasta-aineeseen liitetty entsyymi, radioaktiivinen isotooppi, tai värin perusteella tunnistettava yhdiste. Mikäli leimana on entsyymi, reagenssi-pakkaus sisältää edullisesti myös entsyymin substraatin.

Varsinaisten reagenssien lisäksi on edullista, että reagenssi-pakkaukseen kuuluu näytteen laimentamiseksi tarvittavaa lai-mennusliuosta, joka edullisesti on testipuskuria kuten esimerkiksi suojaproteiinia sisältävää fosfaattipuskuria, jonka pH on lähellä fysiologista pH:ta. Laimennusliuoksen määrä voi olla sovitettu siten, että tietyn näytemäärän lisääminen siihen aikaansaa halutun, esimerkiksi 1: 20 suuruisen laimennuksen.

Reagenssipakkaukseen voi myös sisältyä näytteenotto!nstrument-ti, joka voi olla esimerkiksi steriili kertakäyttöinen ruisku tai erityisesti testiä varten kehitetty väline.

Reagenssipakkauksena voi myös olla yksinkertainen vaginaerit-teen näytteenottoväline, ja siihen liittyvä laimennusliuos testin suorittamista varten. Reagenssipakkauksena voi myös olla vasta-aineella päällystetty testitikku, jonka potilas voi itse vaikka viedä vaginaan. Tällaiset reagenssipakkaukset soveltuvat hyvin kotitestiksi, jota nainen voi itse kotona 16 86777 käyttää epäillessään vedenmenoa ja empiessään, pitääkö hänen lähteä sairaalaan vai ei.

Seuraavat esimerkit havainnollistavat keksinnön mukaisen testin suoritusta keksintöä mitenkään rajoittamatta.

Esimerkki 1 Päällystettiin muovipalloja IGFBP-l-vasta-aineella (6305, Medix Biochemica). Liitettiin toiseen IGFBP-l-vasta-aineeseen (6303, Medix Biochemica) leimaentsyymiä (piparjuuriperoksi-daasi, HRP). Testipuskurina käytettiin fosfaattipuskuria, joka sisälsi 0. 3 % naudan albumiinia (BSA). Puskuri sisälsi lisäksi detergenttiä ja säilöntäaineita ja sen pH oli 7.4. Suoritettiin IGFBP-l-pikatesti seuraavaa ohjetta noudattaen.

IGFBP-l-pikatestin suoritus: 1. Näyteputkeen pipetoitiin 200 μΐ 6303-HRP-leimaa (laimennettuna 1:50 testipuskuriin).

2. Putkeen lisättiin 100 μΐ näytettä (laimennettu 1: 20 testi-puskuriin) .

3. Putkeen pantiin IGFBP-l-vasta-aineella päällystetty pallo pidikkeessä. Inkuboitiin 5 min.

4. Pallo pidikkeineen poistettiin liuoksesta ja palloa pestiin juoksevan veden alla 30 sekuntia.

5. Pesty pallo pidikkeineen upotettiin substraattiliuokseen (2,2' -atsinodi-[3-etyylibentstiatsolinsulfonaatti(6)], ABTS) (pipetoitu 400 μΐ kirkkaaseen putkeen).

6. Annettiin seistä tummassa suojapullossa 5 minuuttia.

7. Joko katsottiin liuoksen väriä suoraan tai lopetettiin 17 86777 reaktio lisäämällä lopetusliuosta (200 μΐ) ja katsottiin sen jälkeen liuoksen väriä: väritön oli negatiivinen, vihreä oli positiivinen.

Vertailun suorittamiseksi ja sopivan laimennuksen toteamiseksi suoritettiin edellä esimerkissä 1 esitetyn mukaiset kokeet, kun näytteenä oli lapsivesi, jonka IGFBP-1-pitoisuus oli noin 200 000 ng/1 ja joka laimennettiin 1: 20, 1: 100, 1: 500 ja 1: 2500 ennen testiä ja vastaavasti seeruminäyte, jonka IGFBP-1-pitoisuus oli >100 ug/1 ja joka laimennettiin 1: 20 ennen testiä.

Tyypilliset mitatut absorbanssit on esitetty alla: Näyte: Laimennus A4m visuaalinen arvio

Lapsivesi 1: 20 0. 931 +

Lapsivesi 1: 100 1. 021 +

Lapsivesi 1: 500 0. 679 +

Lapsivesi 1: 2500 0. 212 ±

Seerumi 1. 1: 20 0. 044

Seerumi 2. 1: 20 0. 049 testipuskuri 0 0. 036

Esimerkki 2 Päällystetään kapea vyöhyke nitroselluloosamembraaniliuskaa lGFBP-1-vasta-aineella (6305, Medix Biochemica). Myös päällystetään värillisiä latex-hiukkasia toisella IGFBP-l-vasta-aineella (6303, Medix Biochemica). Kuivataan päällystetyt latex-hiukkaset toiseen päähän membraaniliuskaa, jossa on vasta-ainevyöhyke. Suoritetaan IGFBP-1-pikatesti membraanilla seuraavan ohjeen mukaisesti.

IGFBP-1-membraanitestin suoritus: 1. Pipetoidaan muutama tippa puskurilla laimennettua näytettä siihen liuskan osaan, johon latex-hiukkaset on kuivattu.

ie 86777 2. Inkuboidaan muutama minuutti, jona aikana näyte liikkuu membraania pitkin ja latex-hiukkaset kulkeutuvat nesteen mukana yli vasta-aineella päällystetyn vyöhykkeen liuskan toiseen päähän asti.

3. Tarkastellaan liuskaa. Mikäli siihen on muodostunut värillinen vyöhyke, on tulos positiivinen.

Esimerkki 3 Päällystetään pieni alue nailonmembraania IGFBP-l-vasta-aineella (6305, Medix Biochemica). Kiinnitetään päällystetty membraani muovikuppimaiseen telineeseen siten, että heti sen alla siinä kiinni on imukykyistä materiaalia (käsiteltyä selluloosaa). Liitetään toiseen IGFBP-l-vasta-aineeseen (6303, Medix Biochemica) leimaentsyymiä (piparjuuriperoksidaasi, HRP). Suoritetaan IGFBP-1 pikatesti seuraavaa ohjetta noudattaen.

1. Pipetoidaan muutama tippa testipuskurilla laimennettua näytettä membraanille ja odotetaan että lious imeytyy membraani n läpi.

2. Pipetoidaan kupin rajoittama määrä (n. 1 ml) pesuliuosta ja odotetaan että lious imeytyy membraanin läpi.

3. Pipetoidaan muutama tippa leima-liuosta ja odotetaan että liuos imeytyy membraanin läpi.

4. Pipetoidaan n. 1 ml pesuliuosta ja odotetaan että lious imeytyy membraanin läpi.

5. Pipetoidaan muutama tippa entsyymin saostuvaa substraattia membraanille ja odotetaan että liuos imeytyy membraanin läpi.

19 86777 6. Tarkastellaan membraania. Mikäli siihen on muodostunut värillinen alue on tulos positiivinen.

Edellä keksinnön mukaisen testin suoritus on havainnollistettu er®illä immunometrisillä menetelmillä. Alan ammattimiehille on kuitenkin selvää, että menetelmiä voidaan vaihdella ja muunnella edellä esitetyn selityksen sekä oheisten patenttivaatimusten puitteissa poikkeamatta keksinnön piiristä.

Claims (13)

2o 86777

1. Diagnostinen menetelmä sikiökalvojen puhkeamisen osoittamiseksi, joka menetelmä perustuu vaginasta otetussa eritenäyt-teessä olevan proteiinin määritykseen, tunnettu siitä, että tunnistettava proteiini on insuiiininkaltäisen kasvutekijän sitojaproteiini 1, IGFBP-1, jonka sikiökal voj en puhkeamisesta johtuva läsnäolo näytteessä osoitetaan IGFBP-1:n vähintään yhden spesifisen sitoja-aineen avulla säätämällä testiolosuhteet sellaisiksi, että positiivinen tulos ilmenee vain, kun IGFBP-1-pitois uus näytteessä on yli muusta kuin lapsiveden läsnäolosta johtuvan raja-arvon.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että spesifisenä sitoja-aineena käytetään IGFBP-1:n vasta-ainetta.

3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vasta-aine on monoklonaalinen vasta-aine.

4. Jonkin edellisen patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että määritys suoritetaan käyttäen IGFBP-1: n sitoja-aineeseen perustuvaa reagenssia sekä leimattua toista sitoja-ainetta, jonka antama signaali voidaan havaita.

5. Jonkin edellisen patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vaginasta otettu näyte laimennetaan ennen testin suorittamista näytteen IGFBP-l-pitoisuuden alentamiseksi.

6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että laimennus on vähintään 1: 10, edullisesti 1: 20. 2i 86777

7. Patenttivaatimuksen 1, 2 tai 3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että käytetään leimattua reagenssia, jonka signaali antaa positiivisen tuloksen vasta, kun mitattava IGFBP-l-pitoisuus on riittävän suuri.

8. Reagenssipakkaus patenttivaatimuksen 1 mukaisen diagnostisen menetelmän toteuttamiseksi sikiökalvojen puhkeamisen osoittamista varten, tunnettu siitä, että pakkaus sisältää vähintään yhtä reagenssia, jossa on insuliininkaltaisen kasvutekijän sitojaproteiini 1: n, eli IGFBP-1: n spesifistä sitoja-ainetta, sikiökalvojen puhkeamisesta johtuvan IGFBP-1: n läsnäolon osoittamiseksi vaginasta otetussa eritenäytteessä.

9. Patenttivaatimuksen 8 mukainen reagenssipakkaus, tunnettu siitä, että se sisältää lisäksi sitomisreaktion osoittavan leiman.

10. Patenttivaatimuksen 9 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että leiman antaman signaalin herkkyysalue on säädetty sellaiseksi, että positiivinen tulos ilmenee vasta lapsiveden läsnäolosta johtuvassa suuressa IGFBP-l-pitoisuudessa.

11. Patenttivaatimuksen 8, 9 tai 10 mukainen reagenssipakkaus, tunnettu siitä, että reagenssin käsittämä IGFBP-1: n spesifinen sitoja-aine on IGFBP-1: n spesifinen vasta-aine, edullisesti monoklonaalinen vasta-aine.

12. Patenttivaatimuksen 9 tai 10 mukainen reagenssipakkaus, tunnettu siitä, että sitomisreaktion osoittava leima on IGFBP-1: n toiseen sitoja-aineeseen liitetty signaalin antava aine.

13. Patenttivaatimuksen 8 mukainen reagenssipakkaus, tunnettu siitä, että spesifiseen sitoja-aineeseen perustuva reagenssi käsittää kiinteään pintaan tai liukenemattomiin hiukkasiin sidottuja sitoja-aineita tai sitoja-aineen liuoksia. 22 86777