FI113567B - Menetelmä Downin syndrooman testaamiseksi - Google Patents

Description

113567

Menetelmä Downin syndrooman testaamiseksi Tämä keksintö koskee mahdollisten geneettisten epänormaa-5 lisuuksien ja erityisesti Downin syndroomaan liittyvien epänormaalisuuksien ilmaisua.

Ennen synnytystä toteutettu Downin syndrooman tutkimus on tullut syntymää edeltävän hoidon tärkeäksi ja käytetyksi 10 osaksi. Suurin osa tutkimusohjelmista on nykyisin riippuvaista äidin iästä yhdistettynä 16. raskausviikolla toteutettavaan äidin seerumin humaani koriongonadotropiinin (hCG) ja a-fetoproteiinin (AFP) mittaukseen konjugoimattoman estriolin (uE3) mittauksen kanssa tai ilman sitä. Tällainen lähestymis-15 tapa ilmaisee noin 65 prosenttia raskauksista, joita Downin syndrooma vaivaa, kun lapsivesipunktio tehdään viidessä prosentissa raskauksista. On toivottu kuitenkin kauan, että tutkimuksen parannukset lisäisivät tätä ilmaisumäärää, samalla kun ne vähentäisivät lapsivesipunktioiden määrää ja tekisivät 20 mahdolliseksi toteuttaa tutkimus aiemmin raskauden aikana.

Sitä paitsi raportoitiin äskettäin, että inhibiini, heterodi-meerinen glykoproteiini, jota erilaiset kudokset tuottavat, istukka mukaan lukien, lisääntyi normaaleihin raskauksiin • verrattuna, raskauden toisen kolmanneksen aikana äidin seeru-» · · * : 25 missä, joka oli otettu sellaisten raskauksien aikana, joihin • · ·

Downin syndrooma liittyi (van Lith et ai., 1992, Second-tri-, ,·. mester maternal serum immunoreactive inhibin as a marker for 1!!^ fetal Down's syndrome, Prenatal Diagnosis 12, 801 - 806; sekä ’ Spencer, K. et al, 1993, Elevated levels of maternal serum 30 inhibin immunoreactivity in second trimester pregnancies « * · affected by Down's syndrome, Annals of Clinical Biochemistry 30, 219 - 220) .

» · • » ·

• I I

Tämän lisäksi on alustavasti arvioitu joukko sikiön ja istu-35 kan proteiineja siinä suhteessa, ovatko ne käyttökelpoisia > » · : ·’ Downin syndrooman markkereina eli tunnuksina raskauden ensim mäisen, pikemmin kuin toisen, kolmanneksen aikana äidin see- 2 113567 rumissa (Macintosh M.C.M. ja Chard, T., 1993, Biochemical screening for Down's syndrome in the first trimester of pregnancy, Fetal and Maternal Medicine Reviews 5, 181 - 190 sekä siihen sisältyvät viitteet). Aiemmin raskauden aikana, ensim-5 mäisen kolmanneksen kuluessa toteutetulla tutkimisella olisi huomattavia etuja tutkimuksen nykyiseen ajoitukseen nähden, joka sattuu toiseen kolmannekseen. Useita äidin seerumin markkereita, joihin AFP, humaani koriongonadotropiinin b-ala-yksikkö (β-hCG), raskauteen liittyvä istukkaproteiini A 10 (PAPP-A) kuuluvat, on määrätty raskauden ensimmäisen kolmanneksen markkereiksi, joista β-hCG on kaikista lupaavin tähän mennessä. Äidin iän, β-hCGin ja AFP:n yhdistelmän on ennustettu antavan 54 prosentin ilmaisumäärän suhteessa lapsi-vesipunktion antaman viiden prosentin sijasta (eli väärien 15 positiivisten määrä - FPR) (Aitken et ai, 1993, Biochemical screening for chromosome abnormalities and neutral tube defects in the first trimester, Journal of Medical Genetics 30, 336). On vielä selvästi tarvetta saada luotettavampi koe, jonka herkkyys ja spesifisyys on parempi ja joka olisi mie-20 luummin sovellettavissa raskauden sekä ensimmäiseen että toiseen kolmannekseen mutta erityisesti ensiksi mainittuun.

: '·· On todettu nyt, että inhibiinihormonin tiettyjen lajien voi- : : : mistuneet tasot äidin kehonnesteissä ilmaisevat, että tämän- : : : 25 laatuisia sikiön epänormaalisuuksia on mahdollisesti läsnä.

; Inhibiinihormonin tiedetään liittyvän ihmisen ja eläimen t « · lisääntymiseen, vaikka sen roolia ei ole vielä vahvistettu.

»

Nyt tiedetään, että on olemassa ryhmä inhibiinejä, jotka 30 tunnetaan inhibiini A:na ja inhibiini B:nä. Nämä molekyylit • · · ovat dimeerejä, jotka koostuvat kahdesta alayksikkömonmeeris-·. tä. Inhibiini A koostuu kahdesta proteiinialayksiköstä, jotka O": ovat nimeltään a ja BA ja joita disulfidisidokset yhdistävät.

taa i : ‘ . 35 Eurooppalainen patentti 185034, joka on peräisin hakemuksista . . vuodelta 1984 ja 1985, edeltää inhibiinien ryhmän keksimistä, * ' ja siinä on esitetty inhibiinin yksi dimeerimuoto, joka pa- 3 113567 tentissä identifioidaan molekyylipainon, alayksikkörakenteen ja muiden ominaisuuksien perusteella. EP 185 034 ilmoittaa yhden alayksikön kooksi, molekyylipainona ilmaistuna, 14 000 + 2000 kilodaltonia (12 K tai 14 K) ja että suurempi alayk-5 sikkö on 44 K:n suuruinen molekyyli. Myöhempi tutkimus viittaa siihen, että inhibiini-A-dimeerin primaarinen aktiivinen muoto on kooltaan 32 K ja vastaa 12K:n 5A- ja 20K:n a-ala-yksikköä. 32K:n suuruinen inhibiini on kypsä muoto, joka tuotetaan molekyylipainoltaan 65K:n ja 56K:n suuruisten pre-10 kursorimuotojen translaation jälkeisen prosessoinnin avulla. Kehossa kiertää myös immunologisesti reaktiokykyinen a-mono-meeri, tekijä, joka monimutkaistaa inhibiinin määritystä. Puhutaan yleisesti "inhibiinimuodoista", kun tarkoitetaan kiertävien inhibiiniproteiinien kokonaisuutta.

15

Inhibiinin monimutkainen luonne ja se seikka, että sekä mono-meeri- että dimeerimuodot kiertävät kehossa, aiheuttavat suunnattomia vaikeuksia analytiikalle sekä tutkimustulosten biologiselle tulkinnalle. Aiemmin raportoidut inhibiinin 20 immunologiset mittausmenetelmät eivät ole mahdollistaneet selvien johtopäätösten tekemistä, koska immunologisen reaktiokyvyn mittaus ei tee eroa edellä kuvattujen erilaisten : ** molekyylilajien välillä eikä se ole siitä syystä funktionaa- i lisen biologisen aktiivisuuden luotettava ilmaus. Van Lith et 25 al.:n ja Spencer et al.:n edellä mainitut julkaisut ovat ainoat kaksi julkaisua, jotka kuvaavat immunologisesti reak- : tiokykyisen inhibiinin käyttöä Downin syndrooman havaitsemi- • · « ·’·*: sessa raskauden toisen kolmanneksen aikana. Nämä molemmat k tutkimukset käyttävät hyväksi kaupallista, entsymometristä 30 määritystä (Medgenix, High Wycombe), jossa käytetään kahta I · « ... anti-a-alayksikkövasta-ainetta. Molemmat tutkimukset ilmoit- • · · tavat, että ero on epäselvä, mikä johtuu sekä kontrolli- että Downin syndrooman näytteiden antamien tulosten laajasta ja-kaumasta.

35 • k ,·. ; Tämä keksintö sisältää Downin syndrooman indikaatiota varten • ♦ · testausmenetelmän, jossa mitataan inhibiini A:n taso äidin 4 113567 kehonnesteessä mieluummin sellaisella määritysmenetelmällä, joka on spesifinen inhibiini A:lle.

Keksinnön mukaan mitataan mieluummin dimeerisen inhibiini A:n 5 kaikkien molekyylimuotojen tasot molekyylikokoon katsomatta. Ei suljeta pois kuitenkaan mahdollisuutta, että tämän keksinnön tarkoituksiin voi riittää, että määritetään spesifisesti dimeerisen proteiinin kypsä 32K-muoto.

10 Tämän keksinnön mukaisiin diagnostisiin tarkoituksiin voidaan käyttää dimeerisen inhibiini-A:n mitä tahansa sopivaa ja täsmällistä määritysmenetelmää. Tunnetaan erilaisia analyysejä, mutta nykyisessä muodossaan, sellaisina kuin ne on kuvattu kirjallisuudessa, ne soveltuvat huonommin kuin edullinen 15 menetelmä, jota tullaan kuvaamaan yksityiskohtaisesti myöhemmin tässä yhteydessä. Baly et ai. esimerkiksi esittivät äskettäin selonteon kaksipuolisten määritysten kehittämisestä erilaisia inhibiinimuotoja varten, siten että käytetään mono-klonaalisia ja polyklonaalisia vasta-aineita, jotka on muo-20 dostettu yhdistelmäinhibiiniä vastaan. (Baly, D. L., Aldisim, D. F., Krummer, A., Woodruff, T. K., Soules, M. R., Chen, S. A., Fendly, B. M., Bald, L. N., Mather, J. P. & Lucas, C.

** (1993), Development of specific and sensitive two-site enzy- ,.· i me-linked immunosorbent assay for measurement of inhibin-A in v.: 25 serum. Endocrinology, 132, 2099 - 2103). Dimeerisen inhibii-ni-A:n ilmaisuraja määrityksessä, jonka he esittävät, oli ; kuitenkin 1000 pg/ml, ja esitettyjen tulosten mukaan inhi- ;‘j1: biiniä ei voitu ilmaista kaikista näytteistä, ei edes sellai sista näytteissä, jotka oli saatu naiselta, joka sai gonado-:·, 30 tropiinihoitoa.

• · 1 < · »

Edullinen määritys perustuu tekniikkaan, jossa käytetään :”· monoklonaalista vasta-ainetta. Määritysmenetelmä voi täten · a sisältää sellaisten vasta-aineiden käytön, jotka ovat spesi-35 fisiä ainakin osalle inhibiini-A:n a- ja BA-alayksiköitä.

5 113567 BA-vasta-aine on mieluummin peräisin hybridoomasta, joka valmistetaan siten, että immunogeeninä käytetään synteettistä peptidiä, joka vastaa βΑ-alayksikön osaa. α-alayksikön vasta-aine on mieluummin peräisin hybridoomasta, joka valmistetaan 5 siten, että immunogeeninä käytetään synteettistä peptidiä, joka vastaa α-alayksikön osaa. βΑ-vasta-ainetta käytetään edullisesti vangitsemaan inhibiini koenäytteestä ja «-alayksikön vasta-ainetta käytetään ilmaisuvasta-aineena ja se sidotaan ilmaistavaan markkeriin eli tunnukseen, esimerkiksi 10 entsyymiin. Voidaan käyttää myös näiden vasta-aineiden fragmentteja, joilla on samanlainen spesifisyys kuin kokonaisilla vasta-aineilla. Termiä 'vasta-aine' käytetään tässä yhteydessä sisältämään tällaiset fragmentit.

15 Määrityksessä käytetyt vasta-aineet ovat peräisin hybridoo-mista, joita valmistetaan kirjallisuudessa kuvatuilla menetelmillä (Groome et ai., 1990, Monoclonal and polyclonal antibodies reactive with the 1-32 aminoterminal peptide of 32K human inhibin. Hybridoma, 9, 31- 41; ja Groome et al., 20 1991, Preparation of monoclonal antibodies reacting with the beta-A subunit of human ovarian inhibin. Hybridoma, 10, 309 -316). Groome et al., 1993, ovat kuvanneet myös analyysiä, Immunoassays for inhibin and its subunits, Further applica-» ** tions of the synthetic peptide approach, J. Immunol Methods :,:: 25 165, 167. Nämä Groome et al.:n julkaisut sisällytetään tähän !,·,! yhteyteen viitteinä.

• I I

# » · » · : Edullinen määritysmenetelmä, jotta vältettäisiin heterofii- « 11 listen vasta-aineiden aiheuttama häiriö, on käyttää mono-30 klonaalisen vasta-aineen Fab-fragmenttia inhiboimaan entsyy-miin kiinnitetty alayksikkö mieluummin kuin koko vasta-aine-molekyyli. Määrityksen spesifisyyden säilyttämiseksi on myös • » T tärkeää sisällyttää määrityksen laimennusaineeseen viisi ‘\‘‘i prosenttia (tilav./tilav.) hiiren seerumia sekä viisi pro- 35 senttiä (paino/tilavuus) Triton x 100taa.

t 1 · 6 113567

Vasta-aineet sekä yksityiskohtainen ohje ovat saatavissa Serotec Ltd:Itä, 22 Bankside, Station Approach, Kidlington, Oxford, 0X5 IJE.

5 Sitovan vasta-aineen (sellaisen vasta-aineen, joka sitoutuu BA-alayksikköön) immobilisointi hydratsidilevyille (avidpla-te-HZ Biopropelta) mieluummin kuin passiivisen adsorption avulla tavanomaisille mikrolevyille on tärkeää säilytettäessä funktionaalisen vasta-aineen suuri tiheys, mikä on välttä-10 mätöntä, jotta inhibiini saadaan hyvin talteen seerumista ja plasmasta. Määrityksen aiemmassa muunnoksessa näytti siltä, että anti-BA-vasta-aineen immobilisoinnin muut menetelmät antoivat samanlaisia tuloksia standardeille, jotka oli laimennettu määrityspuskuriin. Kun näitä verrattiin hydratsidi-15 levymenetelmällä saatuihin tuloksiin, viimeksi mainitut antoivat paljon paremmin takaisin yhdistelmäinhibiinin, joka oli lisätty humaani seerumiin.

Määrityksen spesifisyys 20 Tähän mennessä ei ollut selvää, pystyisikö kuvattu menetelmä erottamaan inhibiini-A:n inhibiini B:stä. Sellaisella synteettisellä peptidisekvenssillä, joka oli peräisin humaani BA-alayksiköstä ja jota käytettiin immunogeeninä E4-vasta- 1 < i.i : aineen valmistamiseen, oli homologiaa vastaavan sekvenssin v.; 25 kanssa, joka oli peräisin beeta-B-alayksiköstä, molemmat kaksi peptidiä reagoivat hyvin vasta-aineen kanssa. Yhdistel-! mämateriaalin näytteiden avulla on äskettäin todistettu, että

» · I

inhibiini-B: llä, aktiviini-A: 11a ja aktiviini-B : llä on kai-kiila erittäin vähäistä ristireaktiokykyä esillä olevassa ;·, 30 määrityksessä, kuten myöhemmin osoitetaan.

t · · t i » i t *

Ristireaktioprosentti « *

Inhibiini-A 100 35 Inhibiini-B 0,012 B » < · Aktiviini A < 0,002

Aktiviini B > 0,001 7 113567 Täten tätä määritystä voidaan pitää käytännössä menetelmänä, joka mittaa spesifisesti humaani seerumin ja plasmanäytteiden inihibiini-A:n muotoja. Analyysi ei ilmaise a-alayksikön vapaita muotoja.

5 Tämän keksinnön mukaista menetelmää voidaan käyttää äidin sopiviin kehonnesteisiin, esimerkiksi seerumiin tai plasmaan. Menetelmä on tehokas, kun sitä käytetään raskauden ensimmäisellä ja toisella kolmanneksella saatuihin näytteisiin.

10 Menetelmää voidaan pitää seulontatestinä, jolla valitaan potilaat myöhempää diagnostista tutkimusta varten. Downin syndrooman vaivaamissa raskauksissa inhibiini-A:n medi-aanitason havaittiin olevan kaksi kertaa suuremman kuin vastaava taso normaaleissa raskauksissa. Tärkeä havainto oli, 15 että eron aste säilyi raskauden sekä ensimmäisessä että toisessa kolmanneksessa. Tämä on ensimmäinen tieto, joka koskee dimeerisen inhibiini-A:n määrityksen käyttöä raskauden aikana sekä määrityksen myöhempää, menestyksellistä käyttöä Downin syndrooman ilmaisuun raskauden ensimmäisen ja toisen kolman-20 neksen aikana. Tullaan osoittamaan, että käytettäessä inhibiini-A: n mittausta ensimmäisen kolmanneksen aikana yksinään, sellaiset ilmaisumäärät ovat mahdollisia, jotka ovat suotuisasti vertailukelpoisia nykyisin saatavien menetelmien yhdistelmien kanssa. Kun inhibiini-A:ta käytetään yksinään, 25 se tarjoaa myös toisen kolmanneksen aikana suuria ilmaisumää-; riä, ja kun se yhdistetään nykyiseen seulontaan, ilmaisumää- rät lisääntyvät merkittävästi. Ennen kuin näitä tuloksia , kuvataan yksityiskohtaisesti, kuvataan metodiikkaa, joka ^1! koskee monoklonaalisten vasta-aineiden tuottoa ja määritystä.

30

Kuten aiemmin esitettiin, kirjallisuudessa on kuvattu sei-

• ‘ I

···· laisten hybridoomasolulinjojen tuottoa, jotka erittävät vas- '...* ta-aineita. Seuraavassa kappaleessa kuvataan lisäohjeita tehokkaimpien solulinjojen valmistusta varten.

35

I » I

t » » > t » » I ·

Immunologisessa määrityksessä käyttökelpoisen, suuriaffini- teettisen vasta-aineen valmistuksen onnistumiselle tärkeitä tekijöitä 8 113567 5 Tarvitaan sitova vasta-aine, jolla on erittäin suuri affiniteetti inhibiiniä kohtaan, kuten käy ilmi sen tehosta dimee-risen inhibiinin kaksipuolisessa määrityksessä, jota kuvataan myöhemmin. Vasta-aineen affiniteettia lisätään vielä, kun standardien ja näytteiden inhibiini hapetetaan ennalta vety-10 peroksidilla. Tämä menettely hapettaa kaksi metioniinitähdet-tä, jotka sijaitsevat epitoopin alueella. (Knight, P. G. ja Muttukrishna, S. (1993), Measurement of dimeric inhibin using a modified two-site IRMA spesific for oxidised (met 0) inhibin, Poster at Serono symposium on Inhibin and Inhibin-rela-15 ted substances, Siena, kesäkuussa 1993).

Useimmat anti-peptidivasta-aineet, jotka on muodostettu sisäisiä peptidisekvenssejä kohtaan, reagoivat vähäisellä affiniteetilla vanhempien proteiinin kanssa. Tärkeät tekijät 20 ovat seuraavat: 1. Tällaisia hyviä vasta-aineita valmistavien kloonien frekvenssi on vähäinen.

• · * i 25 2. Suositellaan tuotettavan niin monta peptidireaktiivista ; kloonia kuin mahdollista ja valikoitavan ne huolellisesti na- tiivin molekyylin avulla sellaisten kloonien valitsemiseksi, t · I « . jotka reagoivat koko molekyylin kanssa.

I « · 30 3. Kunakin neljänä päivänä ennen pernan poistoa tulisi antaa , neljä laskimonsisäistä annosta tuberkuliini-peptidikonjugaat- ;;; tia. Tämän keksinnön tekijät ovat käyttäneet peptidiä injek- ·;* tiota kohti rutiininomaisesti aina 200 mikrogrammaan saakka ’ : ja täydentäneet tätä vatsaontelonsisäisesti tarpeen tullen, " : 35 kun epäiltiin laskimonsisäisen injektion onnistumista. Im munisoitujen hiirien perna on aina poikkeuksetta suuri, mikä ' h on merkkinä hyperimmunisaatiosta.

9 113567 4. On havaittu, että tuberkuliinilla on tietty arvo kantajana synteettisissä peptidi-immunisaatioissa hiirillä, joita oli esikäsitelty kolme viikkoa aiemmin yhdellä annoksella humaani BCG-rokotetta (Glaxo), joka annettiin ihonalaisesti. Etuna 5 on, että BCG-rokotus antaa suuren lukumäärän auttaja-T-solu-ja, jotka tunnistavat tuberkuliinin eivätkä tuota paljon asiaankuulumattomia B-soluja, jotka jatkavat ei-toivottujen hybridoomien tuottamista. Sen jälkeen kun on immunisoitu aggressiivisesti tavanomaisten kantajien kanssa, kuten esimer-10 kiksi kuvatun immunisaatiojärjestelyn jälkeen, useimpien fuusion jälkeen kasvavien kloonien olisi määrä sitoutua kantajaan, mikä tekee paljon vaikeammaksi identifioida kloonit, jotka valmistavat vasta-ainetta peptidi-immunogeeniä kohtaan.

15 On käytetty seuraavia materiaaleja ja menetelmiä BA -alayksikön (E4) vasta-aineen valmistus

Peptidien kytkentä kantajaproteiiniin 20

Immunisointiin käytettyjen seitsemän peptidin paikka humaani inhibiini BA-inhibiinialayksikössä esitetään kuviossa 1,

Groom et al.:n julkaisussa Hybridoma 10, 309 - 316, (1991).

!*·.. Peptidit valmistettiin käyttämällä Fmoc-kemiaa, ja ne sisäl- • 25 sivät yhden ainoan kysteiinitähteen, joka oli joko luonnonmu- . .·. kaisen sekvenssin osa tai joka oli lisätty vain helpottamaan kytkentää. Kukin peptidi kytkettiin tuberkuliiniin -SH-ryhmän kautta, siten että käytettiin heterobifunktionaalista esteriä sekä ohjeita, jotka saatiin pakkauksesta, joka on saatavissa ' 30 Cambridge Research Biochemicalsilta, Button End Industrial

Estate, Harston, Cambridge, Yhdistynyt kuningaskunta, tai : muilla hyvin tunnetuilla menetelmillä.

f » » 35 * ’ Hiirien immunisointi ja tutkiminen 10 113567

Koiraspuolisia Balb/c-hiiriä esikäsiteltiin aluksi yhdellä annoksella humaani BCG-rokotetta (Glaxo). Hiiret saivat sitten neljä kuukausittaista, ihonalaista, 50 mg:n suuruista tehostetta kutakin peptidiä tuberkuliinikonjugaattina Freun-5 din epätäydellisessä adjuvantissa. Kuusi hiirtä immunisoitiin kullakin peptidillä, joka oli tuberkuliinikonjugaattina. ELISAlla toteutetuissa tutkimuksissa, levyillä, jotka oli päällystetty härän 32 kDa:n suuruisilla inhibiinipeptideillä 1, 3, 4 ja 5, ei saatu mitään vasteita, jotka olisivat olleet 10 erotettavissa immunisoimattomista hiiristä. Peptidi 6 tuotti yhden keskimääräisen vasteen (A = 0,4), peptidi 2 tuotti kaksi keskimääräistä vastetta (A = 0,4 ja A = 0,8) sekä peptidi 9 tuotti kaksi voimakasta vastetta (absorbanssi on suurempi kuin 2) sekä neljä keskimääräistä vastetta (A = 0,9, 15 1,0, 1,4, 0,7). Sellainen hiiri, joka antoi suurimman vas teen, määritettiin ELISAn avulla, ja kunakin viimeisenä neljänä päivänä ennen fuusiota se sai laskimonsisäisesti keittosuolaliuoksessa 50 mikrogrammaa peptidiä, joka oli tuberkuliinikon j ugaattina .

20 ELISA-tutkimusohj eet (vasta-ainekoe) . ·.. Puhdistettu, 32 KDa:n suuruinen härän inhibiini hankittiin • Peninsula laboratoriesilta ja se sidottiin kovalenttisesti ; 25 Cobind-levyihin (Polyfiltronics) valmistajien ohjeiden mu- kaan. Päällysteen pitoisuus oli 0,1 mikrogrammaa millitrassa , .·. fosfaatilla puskuroitua keittosuolaliuosta (PBS) 5 tunnin !!.' ajan 37 °C:ssa. Näitä levyjä ei ole enää saatavilla, mutta * samanlaisia tuloksia on saatu maleiinihappoanhydridillä akti- 30 voiduilla levyillä (Pierce Chemicals). Ylimääräiset kohdat '· " muovilevyillä suljettiin, siten että käytettiin 1-prosenttis- v ‘ ta (paino/tilavuus) häränseerumin albumiinia 1 tunnin ajan :··: huoneenlämpötilassa. Sitten levyjä pestiin kymmenen kertaa 0,05-prosenttisella (paino/tilavuus) Tween 80:llä, joka oli • ,35 natriumkloridissa, jonka pitoisuus oli 0,15 moolia litrassa.

Iitti ’ ’ Samanlaisia tuloksia on saatu maleiinihapolla aktivoiduilla '· ”· levyillä (Pierce Chemicals) .

11 113567

Tutkittavat hiiren seerumit laimennettiin suhteessa yksi tuhanteen, laimennusaineessa, jossa oli 0,5 prosenttia (pai-no/tilavuus) Tween 80:ntä, 0,15 moolia litrassa natriumklori-dia, 0,05 moolia litrassa fosfaattipuskuria, pH 7, sekä 1 5 prosentti häränseerumin albumiinilaimennusainetta. Hybridoo-masupernatantit laimennettiin tutkimusta varten yksi kahteen tässä laimennusaineessa. Primaarisen vasta-aineen sitoutumisen annettiin tapahtua 18 tunnin ajan huoneenlämmössä. Sitten levyt pestiin ja niihin lisättiin peroksidaasilla leimattua 10 anti-hiiri IgG:n peroksidaasikonjugaattia (yksi tuhanteen) 30 minuutin ajaksi. Lopullisen pesun jälkeen lisättiin 0,1 mil-lilitraa peroksidaasi-TMB-substraattia (Dynatek). Absorbans-sit luettiin Dynatekin pienoislukijalla 405 nmrssä yhden tunnin mittaisen inkuboinnin jälkeen.

15

Solufuusio

Yhdelle kahdesta hiirestä, joilla vaste oli voimakas ja jotka immunisoitiin peptidi yhdeksällä, annettiin tehosterokote 20 laskimonsisäisesti ja perna käytettiin fuusion toteuttamiseen. Hiireen ruiskutettiin neljästi peptidi yhdeksää, joka oli tuberkuliinikonjugaattina, kunakin neljänä päivänä ennen fuusiota. Fuusiotuote siirrostettiin kahdenkymmenen mikrole-: vyn kammioihin (1920). Noin kymmenen päivän kuluttua kussakin j 25 kammiossa kasvoi yhdestä kolmeen kloonia. Sen jälkeen kun oli

♦ I t I

. tutkittu ELISAlla, jonka levyt päällystettiin 32 KDa:n suu- ruisella inhibiinillä, havaittiin vain kahdeksan positiivista kloonia. Lopulta saatiin kuusi stabiilia kloonia. Näistä C.·. viisi oli isotyyppiä IgM, ja jäljelle jäävä klooni nimitet- ’ 30 tiin E4:ksi, jota IgG2b valmisti. Klooni E4 voitiin kasvattaa vatsaonteloon kertyvässä nesteessä spesifisen vasta-aineen i < t »·: kanssa, jota käytettiin 1,5 - 2 mg millilitraa kohti. Vasta- aine voitiin puhdistaa proteiini A:lla ilman aktiivisuuden ’. · häviötä, mikäli se neutraloitiin viipymättä eluution jälkeen, 35 joka toteutettiin pH 3,5:ssä. Kasvatus ontelokuitubioreakto-rissa tuotti vasta-ainetta 2 mg millilitrassa, ja klooni oli stabiili.

12 113567

Immunologiset pitoisuudet

Inhibiinimuodot väkevöitiin 200 millilitrasta naudan follikke-linestettä, siten että käytettiin monoklonaalista vasta-ai-5 netta, joka oli saatu α-alayksikköä kohtaan (katso myöhemmin) . Vasta-aine oli kiinnitetty Affigeliin. Inhibiinimuodot eluoitiin kuusimolaarisella guanidiini-HCl:llä, ne dialysoi-tiin kuusimolaarista Tris-Cl:ää; pH 6,75, vastaan ja sitten niitä käsiteltiin yksiprosenttisella (paino/tilavuus)) nat-10 riumdodesyylisulfaatilla ja yksiprosenttisella (paino/tila vuus) merkaptoetanolilla, ennen kuin niitä kuumennettiin 100 asteessa viiden minuutin ajan. Follikkelinesteessä olevat muodot 200 ml l.lilitrasta follikkelinestettä olivat lopulta neljässä millilitrassa liuosta.

15

Elektroforeesi ja blottaus

Yhdelle mikrolitralle näytteitä, jotka saatiin pelkistetystä ja denaturoidusta valmisteesta, toteutettiin elektroforeesi 20 esivalmistetulla, 20-prosenttisella (paino/tilavuus), homogeenisellä natriumdodesyylisulfaattipolyakryyliamidigeeleil-lä, jotka saatiin Pharmacialta. Elektroforeesi toteutettiin Pharmacia Phastsystemillä. Inhibiinivalmisteiden rinnalla ; ” kussakin ajossa käytettiin biotinyloituja molekyylipainomark- · 25 kereita, jotka olivat Sigmalta. Elektroforeesin jälkeen käy- : : : tettiin Phastsystemiä siirtämään geelien blotti nitrosellu- ··· loosalle diffuusioblottauksella, lisätyssä lämpötilassa, •kuten kuvataan Phastsystemin käsikirjassa. Blotti kehitettiin tämän jälkeen peräkkäisten inkubaatioiden avulla, jotka to-30 teutettiin joko kloonin E4 (valmistettu keksinnön yhteydessä ja reaktiokykyinen β-alayksikön kanssa) tai kloonin Rl kanssa (valmistettu aiemmin ja reaktiokykyinen β-alayksikön kanssa. Tämän jälkeen lisättiin hiiren IgG:n biotinyloitua vasta- • ainetta (Serotec), streptavidiinia tai alkalista fosfataasia _ : 35 (Serotec) sekä histokemiallista väriä alkalisen fosfataasi- aktiivisuuden paikantamiseksi. Molekyylipainot laskettiin . blottien suurennetuista valokuvista. Monoklonaalinen vasta- 13 113567 aine, joka oli peräisin kloonista E4, antoi kaksi vyöhykettä, jotka vastasivat β-Α-alayksikön kahta eri molekyylipainomuo- toa.

5 Inhibitio-ELISA

E4-kloonin vasta-aineen pitoisuutta, joka oli riittävä tuottamaan ELISAssa 0,6:n suuruisen absorbanssin, esi-inkuboitiin yön ajan 4 °C:ssa naudan follikkelinesteen erilaisten laimen-10 nusten kanssa 4 °C:ssa ennen ELISAa, jotta määritettiin, voiko monoklonaalinen vasta-aine reagoida inhibiinin (tai aktiviinin) erilaisten muotojen kanssa, joita oli tässä nesteessä.

15 α-alayksikön (Rl) vasta-aineen valmistus

Humaani ja eläinnestenäytteet

Yhdistetty BFF saatiin ovarioista, jotka Midland Meat 20 Packers, Crick, Northhamptonshire toimitti. Ovariot kuljetettiin takaisin laboratorioon jäiden päällä ja neste imettiin neljän tunnin kuluessa teurastuksesta. Yhdistetty HFF, joka saatiin naisilta, joille oli toteutettu hyperovulaatio-: käsittely, saatiin Bourne Hall Clinicistä, Bourne Cambrid- . 25 geshirestä. Molemmat nesteet säilytettiin erinä -40 °C:ssa.

Postmenopausaalinen eli kuukautisten loppumisen jälkeinen ’ .·. seerumi 63-vuotiailta naisilta saatiin Blood Transfusion ))! Laboratoriesin, Oxford, kautta.

30 Synteettiset peptidit ja 32K:n suuruinen naudan inhibiini V ' Kuten kuvataan Groome et al.:n julkaisussa Hybridoma, 9, 31 - ·;··; 42, (1990), käytetyt synteettiset peptidit perustuivat jul- !*·*. kaistuihin sekvensseihin, jotka sijaitsevat 32K:n suuruisen • t 35 inhibiinin α-alayksikön humaani 1 - 32:n aminopäätteen lä hellä (immunisointeihin), ne syntetisoitiin, siten että käy-’· tettiin pentafluorifenyyliestereitä, kuten kuvataan artikke- 14 113567 lisarjassa, jonka Atherton ja Sheppard sekä avustajat, esimerkiksi Eberley et ai., ovat esittäneet julkaisussa J. Chem. Soc. Perkin Trans. (1986), 361 - 367). Reagenssit peptidisyn-teesiä varten saatiin Milligen U.K. Millipore Housesta, 11 -5 15 Peterborough Road, Harrow. Pennisula-peptidejä ei puhdis tettu enempää. Kaikki peptidit, jotka valmistettiin keksinnön yhteydessä, puhdistettiin HPLC:llä ja aminohappokoostumus tarkastettiin ennen käyttöä.

10 Puhdistettu 32K:n suuruinen naudan inhibiini ostettiin Pen-nisula Laboratoriesiltä.

Peptidien kytkentä kantajaproteiineihin 15 Humaani peptidi 1-32 kytkettiin tuberkuliiniin (PPD) kyste-iinin välityksellä, siten että käytettiin heterofunktionaa-lista agenssia. Nämä kytkennät toteutettiin aluksi sellaisten reagenssien avulla ja ohjeiden mukaan, jotka saatiin Cambridge Research Biochemicals LtDrltä, Button End, Harston Cam-20 bridge. Tuberkuliini voidaan saada Central Veterinary Labora-toryltä, Weybridge.

Hiirien immunisointi » * · * * · · ..*. 25 Aikuisia, intakteja, koiraspuolisia hiiriä (Harlan-Olac Ltd, • · .:. Station Road, Blackthorn, Bicester) esikäsiteltiin yhdellä ! annoksella humaani BCG-rokotetta (Glaxo) ihonalaisesti. Yhtä i · · ' ' * · · kuukautta myöhemmin ruiskutettiin 50 pgrammaa humaani pepti- * · · diä 1-32 tuberkuliinikonjugaattina ihonalaisesti Freundin 30 epätäydellisessä adjuvantissa. Sama määrä immunogeeniä, joka : " oli Freundin epätäydellisessä adjuvantissa, annettiin tehos- v : teenä ihonalaisesti neljä kertaa kuukauden välein. Sellaisten ·...: hiirien näytteet, joiden vaste oli suurin, määritettiin ELI- ,···. SAlla ja pantiin syrjään fuusioita varten. Tässä keksinnössä • _ 35 kuvattuun fuusioon käytettiin hiirtä, joka oli saanut viimei- * M · t simmän tehosteen kolme kuukautta aiemmin.

15 113567

Monoklonaalisten vasta-aineiden valmistus

Kunakin neljänä päivänä ennen fuusiota annettiin 100 ugrammaa immunogeeniä keittosuolaliuoksessa laskimosisäisenä ruiskeena 5 häntälaskimoon. Perna poistettiin ja se käytettiin lymfosyyttien fuusioimiseksi SP2/0-myeloomiin normaalien ohjeiden mukaan. Fuusio tutkittiin ELISAn avulla levyillä, jotka oli päällystetty sian 1-32 -peptidillä, kuten kuvataan myöhemmässä osassa. Isotyypitys toteutettiin, siten että käytettiin 10 kaupallista isotyypitysvälineistöä, joka perustuu punasoluag-glutinaatioon (Serotec Ltd). Vasta-aine puhdistettiin askite-sistä proteiini A -kromatografiällä. Klooni Rl tuotti hiiren IgG2a:ta, ja se voi kasvaa myös ontelokuitubioreaktorissa ja tuottaa vasta-aineita 2 mg/ml.

15

Inhibiinimääritykseen käytettyjen hybridoomakloonien kasvatus Klooni Rl 20 Klooni Rl tuottaa vasta-ainetta inhibiinin α-alayksikölle. Pernasolun kantasolu oli peräisin Balb/c-hiirestä. Myeloo-malinja oli SP2/0. Solut kasvatettiin rutiinimaisesti Iscoven muunnetussa Dulbeccon alustassa (IMDM), joka saatiin Gibcolta : " ja joka sisälsi 20 prosenttia (tilavuus/tilc ?uus) vasikansi- : 25 kiön seerumia (Gibco) sekä 50 ugrammaa millilitrassa gentamy- siiniä. Kaasufaasi on ilma, jossa on viisi prosenttia C02:-hta.

: ·’; Tämä klooni kasvaa hyvin hiiren askitesinä ja tuottaa noin 30 kaksi milligrammaa vasta-ainetta askitesin millilitraa kohti tai ontelokuitubioreaktorissa, jossa se tuottaa vasta-ainetta aina kahteen milligrammaan saakka millilitrassa. Vasta-aine » T on IgG2a.

a..· 35 Klooni E4 16 113567

Klooni E4 on beeta-A-alayksikkö. Pernasolun kantasolu oli peräisin Balb/c-hiirestä. Myeloomalinja oli SP2/0. Soluja kasvatettiin rutiinimaisesti Iscoven muunnetussa Dulbeccon alustassa, joka sisälsi 20 prosenttia vasikansikiön seerumia 5 (Gibco) sekä gentamysiiniä 50 milligrammaa miililitrassa. Kaasufaasi on ilma, jossa on viisi prosenttia C02:hta.

Tämä klooni tuottaa vasta-ainetta huonosti hiiren askitesissä (0,5 - 1 mg miililitrassa), mutta se kasvaa hyvin ontelokuitu-10 bioreaktoreissa ja tuottaa vasta-ainetta aina kahteen milligrammaan saakka miililitrassa. Vasta-aine on IgG2b.

Keksinnönmukaiset reagenssit ja menetelmät 15 Dimeerisen humaani inhibiinin kaksipuolinen entsyymi-im-munoanalyysi naisen seerumista tai plasmasta

Analyysin toteutus 20 Näihin analyyseihin tarvittavat vasta-aineet annetaan käyttöön muodossa, joka tekee käyttäjälle mahdolliseksi päällystää ja käyttää 20 mikrolevyä dimeerisen inhibiinin analysoimiseen ihmisen seerumista ja plasmasta. Tämä mahdollistaa I '·' sen, että tutkija pystyy analysoimaan ainakin 800 seerumi- :.· · 25 tai plasmanäytettä. Tämän lisäksi tutkijan saatavissa on nyt täydellisiä, kaupallisia analyysivälineistöjä (Serotec *:* Ltd.), jotka antavat käyttöön kaikki välttämättömät, ennalta ; valmistetut reagenssit yksityiskohtaisin ohjein.

s * » • t · 30 Analyysi voi ilmaista miililitrassa niin vähäisiä määriä kuin 2 pg yhdistelmäinhibiiniä, joka on lisätty humaani seerumiin.

Useimmilla naisilla on vaihdevuosien jälkeen inhibiiniä vä- hemmän kuin 5 pg miililitrassa, kun taas ovarioiden hypersti - \' · mulaation jälkeen inhibiinitasot voivat saavuttaa 1200 pg:n ' : 35 määrän miililitrassa Normaalin kierron tasot ovat kauttaaltaan ·,·, likimäärin alueella, joka on 3 - 120 pg miililitrassa. Optimi- i>>; olosuhteissa kaksoisnäytteiden variaatiokerroin levyn sisällä * · 17 113567 ja levyjen välillä on molemmissa tapauksissa pienempi kuin seitsemän prosenttia. Sellaisten näytteiden sarjalaimennus, jotka sisältävät suuria määriä immunoreaktiivisuutta, käyttäytyvät samalla tavalla kuin 32 k:n suuruinen yhdistelmäin-5 hibiini, joka on vaihevuosienjälkeisessä seerumissa. Havaitaan, että lisätty inhibiini saadaan takaisin kvantitatiivisesti normaalien kiertojen sekä munarakkula- että keltarau-hasvaiheessa.

10 Humaani seerumin ja plasman dimeerisen inhibiinin entsyymi-immunoanalyysin ohje

Keksinnössä aikaansaadut materiaalit 15 1. Puhdistettu IgG monoklonaalisesta vasta-aineesta (E4), joka reagoi inhibiinin beeta-A-alayksikön kanssa. Yksi milli-litra liuosta, jossa on yksi milligramma millilitrassa liuosta.

2. Monoklonaalisen vasta-aineen (Rl) Fab-alkalinen fosfataasi 20 -konjugaatti, joka reagoi inhibiinin alayksikön kanssa. Tämän konjugaatin optimipitoisuus vaihteli erien välillä, ja se määritettiin kokeilemalla.

i 3. Suositellut menetelmät ja vaiheittainen ohje.

Li’: 25

Muut materiaalit : 1. Avidplate-HZ, laakea pohja. Saatu Bioprobe Internationa- liitä, 14272, Franklin Avenue, Tustin, Kalifornia 92680, USA. 30 Yhdistyneessä kuningaskunnassa nämä levyt voidaan saada Quantum Biosystemsiltä, 12 Pembroke Avenue, Waterbeach, Cambrid-.ge, CB5 9PB.

2. AMPAK-välineistö alkalisen fosfataasianalyysin amplifikaa- h./ 35 tiota varten. Yksi reagenssipakkaus antaa käyttöön reagenssit neljää mikrolevyä varten. Saatu Dako Corporationilta, 6392 Via Real, Carpinteria, Kalifornia 93013. Yhdistyneessä ku- 18 113567 ningaskunnassa nämä reagenssipakkauk'set voidaan saada Dako UK Ltd:ltä, 16 Manor Court Yard, Hughenden Avenue, High Wycombe, Bucks, Yhdistynyt kuningaskunta.

5 3. Yhdistelmäinhibiinistandardi. WHO valmistaa nykyisin stan dardia, joka sisältää 32 K:n suuruista humaani yhdistelmäin-hibiiniä, ja monet inhibiinitutkijat ovat saaneet tällaista materiaalia aiempia töitänsä varten. Sellaista seerumipoolia, joka on saatu naisilta, joilla on tapahtumassa munasolun 10 irtoamisen induktio, voitaisiin valmistaa oman laboratorion käyttöön ja se tulisi yksinkertaisesti kalibroida yhdistelmä-standardia vastaan.

4. Vetyperoksidi, 30-prosenttinen (paino/tilavuus). Käytä 15 tuoretta reagenssia, joka on analyysilaatua.

5. Sellainen pooli seerumia tai plasmaa, joka on saatu naisilta näiden vaihdevuosien jälkeen ja jonka on osoitettu sisältävän dimeeristä inhibiiniä sellaisia määriä, jotka 20 eivät ole ilmaistavissa. Noin puolet kaikista vaihdevuosien jälkeen saaduista seerumeista olisivat sopivia. Koottujen näytteiden tulisi olla hemolyysittömiä. On osoitettu myös, että vasikan sikiön seerumissa ei ole dimeeristä inhibiiniä, j ja sitä on voitu käyttää laimennusaineena korvaamaan vaihde- » » > '.n : 25 vuosien jälkeinen seerumi.

I » I

E4-vasta-aineen kytkentä Avid-levyille Tämä menetelmä on suunniteltu E4-vasta-ainetappioiden vähen-30 tämiseksi kytkentämenettelyn aikana.

1. Annetaan käyttöön yksi millilitra Ξ4 vasta-ainetta pitoisuutena, joka on yksi milligramma millilitrassa.

n » 35 2. Liuos siirretään vähimmäismittaiseen bentsoyloituun dia- H- . lyysiputkeen (Sigman luettelo nro D2272, vetoisuus on 10 mil- lilitraa 0,305 metriä kohti). Dialyysiputkea ei keitetä ennen 19 113567 käyttöä. Se vain pestään vedellä. Kun käytetään tällaista putkea, vasta-ainehäviöt havaitaan pienemmiksi kuin tavanomaista dialyysiputkea käytettäessä.

5 3. Vasta-aine dialysoidaan kolme kertaa 50-millimolaarista asetaattipuskuria, pH 5,0, vastaan kylmähuoneessa, siten että puskuri vaihdetaan dialysointien välillä.

4. Valmistetaan 100-millimolaarinen natriumperjodaattiliuos 10 (21 mg millilitrassa).

5. Otetaan selvää, millainen tilavuus vasta-aineliuosta on jäljellä dialyysin jälkeen, siten että punnitaan neste, joka on poistunut pussista.

15 6. Lisätään 0,1 tilavuutta perjodaattireagenssia, jotta saadaan 10-millimolaarinen lopullinen pitoisuus.

7. Liuosta inkuboidaan pimeässä 30 minuutin ajan huoneenläm-20 pötilassa, jotta aldehydiryhmiä voidaan saada aikaan vasta- aineen Fc:n hiilihydraattitähteissä.

8. Reaktio pysäytetään, siten että lisätään 0,01 tilavuutta : ” etyleeniglykolia.

: : : 25 • :.· 9. Suola poistetaan liuoksesta palauttamalla suolapitoisuus takaisin 50-millimolaarisen asetaattipuskurin, pH 5,0, pitoi-: suuteen, siten että käytetään lyhyttä Sephadex G25 -pylvästä (pakatun kolonnin tilavuus 15 ml) . Vasta-aine havaitaan en-30 simmäisenä huippuna jakeista, jotka luetaan 280 nm:ssä. Vaih-toehtoisesti dialysoidaan kylmähuoneessa 24 tunnin ajan ase-,·>, taattipuskuria vastaan (1 litra) ja puskuri vaihdetaan kaksi kertaa.

» » 35 10. Lopullinen absorbanssi luetaan 1 cm:n kyvetissä. Vasta- /·’; aineen pitoisuus milligrammoina millilitrassa tulee olemaan absorbanssi jaettuna l,4:llä.

113567 20 11. Lasketaan, paljonko vasta-ainetta kaikkiaan on, ja määrä ilmaistaan mikrogrammoina. Tämän menetelmän lopussa vasta-ainetta on luultavasti noin 600 mikrogrammaa. Tämän keksinnön tekijät käyttävät hydratsidilevyjen päällystämiseen pitoi- 5 suutta, joka on 5 mikrogrammaa milli.' it: assa. Vasta-ainetta on täten riittävästi, jotta voidaan valmistaa päällystysliuosta 600 jaettuna viidellä eli 120 millilitraa.

12. Kaikki vasta-aine lisätään 120 millilitraan 50- 10 millimolaarista asetaattipuskuria, pH 5,0, ja sekoitetaan perusteellisesti.

13. Aviplate-HZ:ien kammiot päällystetään 50 mikrolitralla yön ajaksi huoneenlämpötilassa. Levyt asetetaan laatikkoon, 15 jossa on kostea paperipyyhe, jotta estetään kosteuden haihtuminen tämän menetelmän aikana. Reagenssia tulee olemaan vähintään 20 - 24 mikrolevyn päällystämiseen. Jotta inhibiini saadaan takaisin täydellisesti seerumimatriksista, tarvitaan funktionaalisen E4-vasta-aineen suurta tiheyttä eikä suosi-20 telia käytettäväksi pienempiä pitoisuuksia kuin tässä yhteydessä on ilmoitettu.

14. Valmistetaan liuos, joka sisältää 0,1-molaarista Tris-HCl-puskuria, pH 7,5, jossa on yksi prosentti BSA:ta (Sigma, 25 proteaasiton, A3294), sekä 0,1 prosenttia natriumatsidia.

15. Yksi levy kerrallaan läimäytetään kuivumaan paperipyyh- * · keelle ja lisätään 1450 mikrolitraa edellä mainittua liuosta.

* · 30 16. Levyt voidaan nyt säilyttää kylmässä huoneessa ainakin 1 . - 6 kuukauden ajan ja vielä saadaan hyviä tuloksia. Haihtu- minen täytyy estää.

17. Levy pestään välittömästi ennen käyttöä vesiliuoksella, 35 joka koostuu 0,05 prosentista (paino/tilavuus) Tween 20:ntä ja 0,15 moolista litraa kohti NaCl:a 0,05-molaarisessa Tri- . » ‘ sissä, pH 7,5 (pesuliuos) .

21 113567

Analyysimenetelmä humaani seerumille Standardien valmistusohje 5 1. Tarvittavat standardit ja tuntemattomat näytteet laimenne taan jollain seerumilla, joka on saatu naiselta tämän vaihdevuosien jälkeen (PMS), tai vasikansikiön seerumilla, joissa kummassakaan ei ole dimeeristä inhibiini-A:ta.

10 On huomattava, että likimäärin puolessa kaikista PMS-seeru-meista ei ole inhibiiniä, joka on ilmaistavissa kuvatussa analyysissä. Muut seerumit antavat vähäisen mutta merkittävän signaalin (< 5 pg/ml). Tämän keksinnön tekijät työskentelevät tällä hetkellä sen määrittämiseksi, onko tämä pieni signaali 15 epäspesifinen vai johtuuko se todellisesta inhibiinistä.

Tällöin menetellään, siten että tutkitaan, voidaanko signaali estää esi-inkuboimalla Fab Rl:htä, alkalista fosfataasikonju-gaattia, synteettisen peptidi-immunogeenin kanssa, jota käytetään Rl:n valmistukseen, ennen kuin se lisätään kammioon.

20 Jos signaali voidaan estää, se johtuu luultavasti inhibiinistä. Jos sitä ei voida estää, se voi johtua näytteen hetero-fiilisistä vasta-aineista. Tätä aihetta koskevaa lisäinformaatiota annetaan käyttöön, kun sitä on saatavissa.

: 25 Otetaan itse selville arvioitavissa oleva seerumin tilavuus, *.1·1 joka antaa niin pienen signaalin kuin mahdollista. Tämän seerumin täytyy olla hemolyysitöntä.

♦ i t · ! : : 30

• I

t Inhibiini standardeja varten • · « 35 Yhdistelmäinhibiinistandardit valmistetaan valikoidussa, 4 ·:··· vaihdevuosien jälkeisen seerumin muodostamassa poolissa ja ne säilytetään -80 °C:ssa.

22 113 5 6 7

Analyysin laimennusaine 5 prosenttia (paino/tilavuus) Triton X 100:aa (Sigma X 100) 5 10 prosenttia (paino/tilavuus) härän seerumin albumiinia (proteaasiton, Sigma A3294) 5 prosenttia (tilavuus/tilavuus) normaalin hiiren seerumia (Serotec Product, koodi C115B) 10

Kaikki valmistetaan 0,1-molaarisessa Tris-HCl:ssä, pH 7,5, joka on 0,15-molaarinen natriumkloridin suhteen.

Liuoksen annetaan sekoittua sekoittimessa muutaman tunnin 15 ajan, kunnes se on kirkasta.

Tämä liuos suodatetaan sellaisen suodattimen läpi, jonka huokoskoko on 0,2 mikronia. Auttaa suodattamista, jos kokkareet poistetaan suodattamalla tai käytetään esisuodatusta 20 (Millex Milliporelta).

Sitten lisätään natriumatsidia 0,1 prosenttiin saakka (se on turvallisempaa kuin atsidin suodattaminen) ja liuos säilyte-j ’* tään kylmiössä. Pitempiaikaista säilytystä varten suodattama- * 25 ton liuos säilytetään pakastimessa ja tarvittaessa se suoda- ; tetaan 100 millilitran erinä ja siihen lisätään atsidia.

* * » 30

Analyysimenetelmä | 1. Yhdistelmäinhibiinistä valmistetaan standardipitoisuudet : 35 (500 - noin 2 pg millilitrassa) vaihdevuosienjälkeisessä see rumissa (PMS).

23 113567 2. Kutakin standardia tai tuntematonta näytettä otetaan 0,1 millilitraa pieneen putkeen sekä kaksi 0,1 millilitran erää ainoastaan PMS:ää kahteen muuhun putkeen.

5 On tärkeää, että seerumi- ja plasmanäytteet, jotka ovat peräisin raskaina olevilta naisilta, ovat hemolyysittömiä ja että ne saadaan varovaisilla keräysmenetelmillä. Liiallinen hemolyysi heikentää vetyperoksidin toimintaa, ja se antaa tulokseksi liian pieniä inhibiinidimeerin määriä. Hemolyy- 10 sitöntä tulee olla samoin myös vaihevuosienjälkeisen seerumin, jota käytetään matriisina standardeihin sekä tuntemattomien näytteiden laimennusaineena. Raskauden aikana otetut seerumi- tai plasmanäytteet on laimennettava noin 10-kertai-sesti, jotta ne saadaan standardikäyrän tarkalle alueelle. Ne 15 laimennetaan vaihdevuosienjälkeiseen seerumiin ennen vetype-roksidikäsittelyä ja sitten niitä käsitellään kuten standardeja.

3. Valmistetaan tuore viisiprosenttinen (paino/tilavuus} 20 vetyperoksidin vesiliuos ja sitä lisätään kuhunkin putkeen 25 mikrolitraa. Sekoitetaan varovaisesti. Hapen kupliminen näkyy putkessa, joissakin enemmän kuin toisissa. Tämä käsittely on suunniteltu hapettamaan E4-vasta-aineen epitoopin metioniini-tähteet. Se perustuu havaintoon, jonka mukaan tämä menetelmä ; : 25 lisää inhibiinin vuorovaikutuksen affiniteettia tämän vasta- aineen kanssa. Se parantaa määrityksen herkkyyttä 0 - 8 -[' kertaisesti sen mukaan, mikä on inhibiinin hapettumisaste, kun käsittely aloitetaan. On huomattava, että näytteitä ja ; t |’; standardeja käsitellään analyysissä molempia samalla tavalla.

30 4. 30 minuutin mittaisen reaktiojakson jälkeen, kuhunkin putkeen lisätään 0,2 millilitraa analyysin laimennusainetta. Sekoitetaan.

» 35 5. Otetaan E4:llä päällystetty hydratsidilevy (valmistettu, kuten edellä esitetään) ja se pestään kymmenen kertaa 0,05-prosenttisella (paino/tilavuus) Tween 20:llä, joka on 0,15- 24 113567 molaarinen NaCl:n suhteen ja joka on 0,05-molaarisessa Tris-HClrssa, pH 7,5. Levy läimäytetään kuivumaan kankaalle.

6. Lisätään viivyttelemättä 0,08 millilitraa kutakin näytettä 5 tai standardia mikrolevylle sen kaksoiskammioihin. Kullakin levyllä täytyy olla standardikäyrä, ja on noudatettava varovaisuutta, jotta varmistetaan, ettei haihtumista tai lämpöti-lagradientteja esiinny analyysin aikana. Varaudutaan kaikkiin merkkeihin siitä, että reunakammiot antavat epänormaaleja 10 lukemia.

7. Levyä inkuboidaan yön ajan kylmiössä. Tämän keksinnön tekijät ovat ravistelleet levyä, mutta se ei voi olla välttämätöntä.

15 8. Levyä pestään neljä kertaa pesuliuoksella. Lisätään välittömästi 50 mikrolitraa Fab Rl:n konjugaattia, joka on muodostettu alkalisen fosfataasin kanssa ja joka on laimennettu suhteessa 1:400.

20 9. Ravistellaan huoneenlämpötilassa 1-2 tunnin ajan. Varmistutaan siitä, että levy on peitetty.

Vahvistettu ELISA 25 .* Ilmaisussa käytetään alkalisen fosfataasireaktion vahvista mista. Yhtä suuria tuloksia voidaan saada kuitenkin, siten että käytetään yksikertaista alkalisen fosftaasin substraat-tia, kuten p-nitrofenyylifosfaattia.

30

Menetelmä AMPAK-välineistöllä : Huomaa ! Perusteelliset pesumenettelyt ovat menetelmälle ,· 35 kriittisen tarkkoja.

25 113567 1. Sen jälkeen kun on inkuboitu edellä esitetyn vasta-aineen kanssa, joka on konjugoitu alkaliseen fosfataasiin, levy pestään kymmenen kertaa levyn pesimessä. Läimäytetään kuivaksi .

5 2. Valmistetaan AMPAKrn pesuliuoksesta, joka tulee välineistön mukana, laimennus veteen suhteessa 1:12. Tämä liuos formuloidaan erityisesti vähentämään epäspesifistä sitoutumista. Levy pestään vielä kahdesti käsin tällä liuoksella ja levyn 10 annetaan olla ravistelussa kaksi 15 minuutin jaksoa kummallakin kerralla. Varmistutaan siitä, että pesuliuoksen varasto-liuos ei pääse kosketuksiin alkalisen fosfataasin konjugaatin kanssa.

15 3. Levyä ravistellaan ja lisätään substraatti, joka sisältyy välineistöön (50 μΐ kammiota kohti).

Reagenssipakkauksen koko substraattierä valmistetaan yhdellä kerralla. Jotta substraattireaktio kestäisi pitempään, lisä-20 tään substraattiin vielä macnesiumia (1 plitra 1-molaarista MgCl2:hta millilitraa kohti) . Nox.datetaan valmistajan (Dako) ohjeita. Substraattiliuos jaetaan kuuden millilitran suuruisiin eriin, joista kukin riittää yhdelle mikrolevylle, ja nämä säilytetään pakastettuina.

i 25 4. Levy peitetään parafilmillä ja sitä ravistellaan 37 °C:ssa *' kahden tunnin ajan. Parafilmi suojataan kannella, joka asete- taan levyn päälle. On tärkeää, että levy ei ole tässä vai-; heessa alttiina lämpötilagradienteille eivätkä ulommat kam- 30 miot ole alttiina haihtumiselle.

• - I

5. Levy poistetaan inkubaattorista ja sen lämpötilan annetaan palautua huoneenlämpötilaan kymmenen minuutin ajan.

< · 35 6. Lisätään 50 mikrolitraa voimistajaa, joka sisältyy vä- ' . lineistöön. Se valmistetaan myös etukäteen ja säilytetään ,, : kuuden millilitran erinä. Koska värin kehittyminen on niin 26 113567 nopeaa, voimistaja täytyy lisätä kammioihin jaksoittaisina ajankohtina (esimerkiksi ensimmäiseen riviin joka viides sekunti). Kun kaikkiin kammioihin on lisätty voimistaja, levyä kopautetaan varovaisesti, jotta se sekoittuu, ja levyn 5 annetaan seisoa 3-10 minuutin ajan, kunnes vaihdevuosien-jälkeistä näytettä sisältävät kammiot alkavat kehittää näkyvää väriä.

7. Reaktio pysäytetään, siten että lisätään 50 mikrolitraa 10 pysäytysliuosta, joka sisältyy välineistöön, ja käytetään samaa aikajaksoitusta kuin voimistajaa lisättäessä.

8. Levy luetaan 490 nm:ssä, siten että vertailuaallonpituutena on 620 nm. Useimmat ELISA-lukijat laativat standardikäyrän.

15 9. Sellaisissa seeruminäytteissä, jotka on saatu hyperovu-loiduilta tai raskaina olevilta naisilta, analysoitavaa ainetta voi olla enemmän kuin 1000 pg millilitrassa, ja ne on laimennettava PMStllä standardikäyrän tarkalle alueelle.

20 10. On helppo valokuvata levyt ja ne voidaan säilyttää pakastettuina, jos niitä ei voida lukea tai valokuvata suoraan.

Analyysin toteutuksen arviointi f: 25 1. 32 K:n suuruinen yhdistelmäinhibiini, joka on lisätty humaani seerumiin ja plasmaan tai vieläpä vereen, saadaan erinomaisesti takaisin.

t 1 t 30 2. Menetelmä soveltuu sekä seerumille että heparinisoidulle plasmalle, ja tasoissa on merkityksetön ero.

» 27 113567 4. Analyysin on osoitettu soveltuvan naisten näytteille.

5. Aktiviinilla ja vapailla α-alayksiköillä on ristireak-tiokykyä vähemmän kuin 0,1 prosenttia analyysissä, joka nou- 5 dattaa kuvattuja menettelytapoja.

6. Myöhemmin taulukossa 1 esitetään tyypillisen näytesarjan tulokset sellaisten yhdistelmästandardien analyysille, jotka on laimennettu vaihdevuosienjälkeiseen seerumiin.

10

Yhdistelmästandardin pitoisuus seerumissa, joka on saatu naiselta tämän vaihdevuosien jälkeen

Pikogrammoja/ml Absorbanssit Valmistetusta standardikäyrästä arvioitu pitoisuus 15 0 0,057, 0,53, 0,051, 0,057 2 0, 091, 0, 089 3,9 0,117, 0,122 4,3 *\ 7,8 0,170, 0,169 8,3 t * 15,6 0,281, 0,294 16,4 t ___ _____ - _ .. - ---- -- ---- - v;: 20 31,21 0,496, 0,510 30,2 · t * • I - — ....... ...... ——Ml. ' 62,5 0,925, 0,935 62,5 * i · ’T; 125 1,387, 1,434 125 j Keksintöä kuvataan vielä, siten että tämän keksinnönmukaiseen Γ:’: 25 menetelmään verrataan aiempia määritysmenetelmiä, joita käytetään raskauden sekä ensimmäisen että toisen kolmanneksen MM· ... aikana.

i * » » k I * » » ‘:"1 Ensimmäinen kolmannes » » 30 28 113567 Tämän keksinnön tekijät ovat aiemmin tutkineet kahta immuno-reaktiivista inhibiinianalyysiä Downin syndrooman toteamiseksi raskauden ensimmäisen kolmanneksen aikana. Käytettiin vasta-ainetta, joka oli muodostettu 31 kD:n suuruista härän 5 inhibiiniä kohtaan, sekä toista kaupallista, kaksipuolista analyysiä, jossa käytettiin kahta vasta-ainetta, jotka oli kohdistettu kahta erillistä α-alayksikköepitooppia vastaan. Ensimmäinen analyysi oli heterologinen radioimmunoanalyysi, jossa käytettiin vasta-ainetta (1989), joka oli saatu aikaan 10 31 kD:n suuruista härän inhibiiniä vastaan, sekä markkerina jodeerattua, 31 kDa:n suuruista inhibiiniä. Humaani yhdis-telmäinhibiini-A:ta (rhINH-R-90/1) käytettiin standardeihin ja tulokset ilmaistiin pg:ina millilitrassa. Määrityksen nerkkyys oli 780 pg m:' l.lilitrass^, ja analyysien sisäiset ja 15 analyysien väliset variaatiokertoxmet olivat vastaavasti 6,6 ja 11,5 prosenttia. Tämä analyysi on nykyisin saatavissa käyttöön the National Institute of Child Helth and Human Developmentilta (NICHD).

20 Toista analyysiä, kaupallista, kiinteään faasiin sidottua, kaksipuolista immunoentsymaattista analyysiä (Medgenix, High Wycombe, Yhdistynyt kuningaskunta) käytettiin samojen näytteiden analysointiin. Tässä määrityksessä käytettiin kahta vasta-ainetta, jotka oli suunnattu humaani inhibiinin a-ala-25 yksikön erillisiä epitooppeja vastaan. Humaani inhibiiniä / käytettiin standardeina ja tulokset ilmaistiin U;na millilit- ? * · rassa. Analyysin herkkyys oli 0,1 U:ta millilitrassa, ja ana- > * · "·; lyysin sisäiset ja analyysienväliset variaatiokertoimet oli- vat vastaavasti 1,9 ja 8,9 prosenttia.

: 30 Nämä tulokset laskettiin, siten että käytettiin äidin seerumi* mia, joka saatiin 11 naiselta, joilla oli raskaus, jossa esiintyi identifioitu Downin syndrooma, sekä 44 kontrollia 2 . (neljä vastasi kutakin raskauteen liittyvän Downin syndrooman 35 näytettä sekä varastoinnin kestoa) . Downin syndrooman näyt-teistä viisi oli koottu raskauden yhdennellätoista viikolla ja kuusi kahdennellatoista viikolla.

29 113567

Downin syndroomanäytteissä, jotka otettiin raskauden 11. ja 12. viikolla, äidin seerumin immunoreaktiivisen inhibiinin keskiarvo (+ SEM) oli vastaavasti 3186 + 195 sekä 2517 + 441 pg millilitrassa, ja kontrollien keskiarvot olivat 5 vastaavasti 2020 + 172 sekä 2561 + 198 pg millilitrassa, kun käytettiin NICHD-analyysiä. Kahden raskauden keskimääräiset immunoreaktiivisen inhibiinin tasot eivät eronneet merkittävästi kummankaan ryhmän suhteen, eikä esiintynyt, mitään merkittäviä eroja Downin syndrooman ja normaalien 10 raskauksien välillä (vastaavasti 2821 + 267 ja 2317 + 138 pg millilitrassa, ei riittävä).

Medgenixin analyysiä käyttämällä saatiin keskiarvoksi (+ SEM) 11. ja 12. raskausviikolla otetuissa Downin syndrooman näyt-15 teissä vastaavasti 2,46 + 0,56 ja 2,35 + 0,62 U millilitrassa ja kontrolleille vastaavasti 1,84 + 0,17 Π millilitrassa ja 2,20 + 0,33 U millilitrassa. Immunoreaktiivisen inhibiinin keskimääräiset tasot kahden raskauden kohdalla eivät eronneet merkittävästi kummallakaan ryhmällä, eikä ollut mitään mer-20 kittäviä eroja Downin syndrooman ja normaalien raskauksien välillä (vastaavasti 2,4 + 0,4 ja 2,04 + 0,19 U millilitrassa, ei riittävä).

Tämän lisäksi vallitsi huono korrelaatio niiden inhibiini-25 tasojen välillä, jotka saatiin kahdesta analyysistä.

'·:·* Johtopäätöksenä voidaan sanoa, että tulosten statistinen analyysi toi ilmi, että kumpikaan analyysi ei ilmaissut ras-·,*,· kauden merkittävää vaikutusta seerumin inhibiinitasoihin. Sen v ·* 30 jälkeen kun oli yhdistetty tulokset, jotka saatiin molemmista raskauksista, ei havaittu mitään merkittävää eroa Downin ;· syndrooman näytteiden ja kontrollien välillä. Nämä tulokset . viittaavat siihen, että nämä kaksi analyysiä ilmaisevat eri- .* , laisia inhibiinilajeja raskaudenaikaisessa seerumissa, mutta ' 35 että kumpikaan ei tule olemaan käyttökelpoinen Downin synd roomaa ilmaistaessa raskauden ensimmäisen kolmanneksen lopul-; ; la. Sitä vastoin on todettu, että inhibiini-A on erittäin 30 113567 hyvä Downin syndrooman markkeri raskauden ensimmäisen kolmanneksen aikana.

Sellaisten muistiinpanojen perusteella, jotka koskivat ras-5 kauksia, joissa esiintyi Downin syndrooma, identifioitiin 23 naista. Näistä naisista kahdeksalta seerumit oli koottu yh-dennellätoista täydellisellä raskausviikolla, kahdeksalta oli koottu kahdennellatoista täydellisellä viikolla ja seitsemän oli koottu kolmannellatoista täydellisellä raskausviikolla.

10 Nämä raskaudet on laskettu ultraäänitutkimuksista, jotka toteutettiin näytteenottopäivänä. Samalla tavalla identifioitiin kutakin Downin syndroomaa vastaavalle näytteelle neljä kontrollinaista, jotka olivat tasaveroisia raskauden (määritetty ultraäänellä) ja varastoinnin keston suhteen, ja heidän 15 näytteensä otettiin esille. Kolmea sellaista kontrollinäytet-tä ei voitu käyttää, joista kukin vastasi kolmea erilaista, yhdennellätoista viikolla otettua Downin syndrooman näytettä, sen tähden että näytteen tilavuus ei ollut riittävä, joten analyysiin oli saatavissa 89 kontrollinäytettä.

20

Niissä näytteissä, jotka olivat raskauden ensimmäiseltä kolmannekselta, äidin seerumin dimeerisen inhibiini A:n keskiarvo (95 % CI) kontrollinäytteissä oli 389,5 (341,3 - 437,7) pg/ml, 341,3 (279,9 - 402,7) pg/ml sekä 263,6 (218,7 - 308,4) 25 pg/ml vastaavasti yhdennentoista, kahdennentoista ja kolman- nentoista raskausviikon kohdalla. Downin syndrooman näytteis- sä MoM:n mediaani oli 2,46 (95 % CI 2,11 - 3,26), ja 65 (15/ — 23) prosenttia Downin syndroomanäytteistä ilmaistiin FPRtn ollessa 5 %. Kuvio 1 esittää 10., 50. ja 90. sadasosapisteet I · * : : : 30 MoM:eina merkityille Downin syndrooman 23 tapaukselle.

··. Esitetyt uudet tulokset ilmaisevat, että äidin seerumin di- meerinen inhibiini-A on Downin syndrooman käyttökelpoinen * _ seerumitunnus raskauden ensimmäisen kolmanneksen aikana.

: 35

Raskauden toinen kolmannes 31 113567

Raskauden toisella kolmanneksen näytteet on arvioitu ainoastaan Medgenix-analyysillä. Näihin tuloksiin on viitattu aiemmin. Ensimmäisessä tiedonannossa (van Lith et ai 1992) osoitettiin, että immunologisesti reaktiokykyinen inhibiini li-5 sääntyi Downin syndrooman yhteydessä. Tämän on varmistanut myöhemmin eräs toinen tiedonanto. Kuitenkin esitettiin, että inhibiinitason laaja jakaantuma sekä kontrollissa että sellaisissa raskauksissa, joissa Downin syndrooma ilmeni, teki epätodennäköiseksi sen, että inhibiini, kuten saatiin selvil-10 le, olisi arvokas tunnus.

Tämä keksintö esittää yksityiskohtaisesti tulokset, jotka ilmaisevat ensimmäistä kertaa, että, kuten raskauden ensimmäisessä kolmanneksessa, toisessa kolmanneksessa inhibiini-A 15 on merkittävästi lisääntynyt siinä määrin, että tämä tarjoaisi suuret ilmaisuasteet Downin syndroomalle. 21 raskaudessa, joissa esiintyi Downin syndrooma, inhibiini-A:n mediaani MoM 15 - 17 viikolla oli 2,6, 150 normaalista raskaudesta laskettuna (kuvio 2). Laskettiin, että annetulla 5,3 prosentin 20 FPR:llä olisi mahdollista 62 prosentin ilmaisuaste.

On osoitettu, että dimeerisen inhibiini-A:n lisääntyneet määrät raskauden sekä ensimmäisessä että toisessa kolmannek- * * : “ sessa, ilmaisevat Downin syndrooman hoidonaiheen. Positiivis- : 25 ten tulosten ilmaisuun tarvittavia tasoja voidaan vielä pa-:.v rantaa, siten että kehitetään koemenettelyjä. Lisäys on huo- mättävä esimerkiksi normaalien raskauksien aina kaksinkertai-

MM

: siin tasoihin saakka. Nämä tulokset eroavat huomattavasti :'i'; tuloksista, joita on raportoitu muille epäspesifisille inhi- 30 biinianalyyseille, jotka on toteutettu raskauden ensimmäisen ;·. ja toisen kolmanneksen aikana.

* * · :05 32 1 13 5 6 7 :05 -

:m S

£ o P S , ^ ' P P 2

Ή -P O

+3 J2 P CD ^ CD 4-) - -h 'H ω m o z p —i 2 05 -H -3 ......___.....__ __.............. ......

3I r* m Γ-Γ-ΟΓ-ι-Ηι—IOOO

£ O ^ ----- U U1 03 Λ

- _Z M ^CNODeD,—IrHOOO

S M - 00 ^ ^ HO * CD -ro 2

>> -H

f, CD :05 s Λ > p Z> 03 M :tT3 2 CD :rd «3 5 e- e -ι-i ^ ----------

-H

P -Η £ v > φ ‘2 -h £ 00 cn Γ0 1—I v fO 3 !> 1 m 1—1 · v1 03 *—I 03 ζ/3 > Ή! Ή ra

. "" 1—1 H

P CD

n3 fö ·—i __ __^ ^ , _ , _ „ ^ ^

£ ' 10 m oeonLnnocsir-PO

ΟΉΡ -h oocoeo^roocM.—1.—1 O CD O. g • · M n :ιί S — —- • * · · Ό ,—I rö o\° ccu>i >—' ro cn σ', ι,η o σι in ^ ro

» · . P -H C\] C\] .—I .—I .—I

;.: ; w p c ra :ra ca cd > s_, : : : p £ -n :n3 . . -h "H o p :ca p o w -he 3 * m χ> § *··* O -P 3 ^

, . *. Q :CC ra P

* · · 1 I P E-H r—I

·” C H (1) CD CD 4-J---------- ·.· · -p ca ca

CΠ -H -H

-H :fO O

03 g ^ * · —I c &) • * t e r-H *rH 4—^

* (D C/3 O S lO O lO O lO O LO O lO

... en p p o : : : cd -h s o.—i.—icMCNroro^M*

, .—I CD

. P PC

.;... O <D

λ a e ··· p o i : p 03 ··· 1—1 Λί ca * a ca Λί ....: ca 03 o

‘ * H H -ro — --— I I I I I

33 113567 i

D

λ; rH ^ μ c c ω g CL) I—I ~ Ή - ° co — 3 S _ „ v: ^ H3 ·ι—I O t—I 0Ί [ ΓΟ \—I o o o ω -h ^ «c ii g ,_ tocDuocDoorH'^,—looo M > S Mgoor-cs)^

c r- o CM

S ^ S ^ a V ro .g v ' ^ gj :2 Μ rH CD in '2 CD ' " -M £ :2 -M CO tH ti CO .(__(

fO i—I O

i—i i—I Md g O) CL) φ C CO -P -h CD PC O to

H CU C

E C -H P

CO C Cl) m CO CO PC ks > £ CO —

•H r—I C (0 -H

CO O Cl) M 4_) > PC -P +j

McO-h (DCDooor-oorocriO^cri

21-1)13 -HCOOOOCOLnPOCMCMr-I

grHnH e o '—11-1^-1 —- -—- -— —' — -—- O CD -H (OM·— — — o CO M ro Cu M -H CD >— rHrHr-l'-rrHr-'CDCP^r

· ΌΟ -H C\1 C\) CM ,—! ,—I

. C -M C CO :c0

' >i O > M

; W C :c0 S c ;to • C T3 PC -Mg *.*· *H D O ΌΡ • · · C Π3 '1 i ^ v : s * cc

.;. O CO - EH

...: q co s . M O---------- ! : : c s ··. CD — ··· -M -H c co -m -m

• -M -M -M

to G CD

HDD ,. rH CO -H

* · CD O O

;·· coMg S LnomoLnoLnoLn ... Qj I—I o -

;;; — -H S Or-IrHCMCMOOPO-f^T

‘ ' CM

’ :C0 C

O M O

' * PC ICO

... PC :t0 CO

1 : 3 g rH

··· I—I 13 ,—I

• O P H

....: CO 3 O

• · EH rH -I—I -- —1" H-L -- 34 113567

Kuvien selitykset

Kuvio 1 Kromosomaalisesti normaalien 89 raskauden aikana äideistä otettujen seerumien inhibiini-A:n MoM:ien 10., 50. 5 ja 90. prosenttipisteet sekä tasot, jotka ovat peräisin 23 yksilöltä, jotka on saatu yksittäisistä Downin syndrooman vaivaamista raskauksista.

Kuvio 2 Kromosomaalisesti normaalien 150 raskauden aikana 10 äideistä otettujen seerumien inhibiini-A:n MoMrien 10., 50. ja 90. prosenttipisteet sekä tasot, jotka ovat peräisin yksittäisistä Downin syndrooman vaivaamista raskauksista.

15 20 < · · : 25 • » · « * · » 35

Claims (23)

1. Menetelmä Downin syndrooman testaamiseksi, tunnettu siitä, että mitataan dimeerisen inhibiini-

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että määritys on spesifinen inhibiini-A:lie.

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tun nettu siitä, että määritysmenetelmässä käytetään sellaista vasta-ainetta, joka on spesifinen ainakin inhibiini-A:n β-alayksikön (βΑ) osalle.

4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että βΑ-vasta-aine on monoklonaalinen vasta-aine, joka on peräisin hybridoomasta, joka on valmistettu käyttämällä immunogeeninä peptidiä, joka vastaa βΑ-alayksikön osaa.

5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että peptidi on synteettinen peptidi, joka vastaa βΑ-alayksikön C-terminaalisen alueen osaa.

5 A:n taso äidin kehonnesteessä.

6. Jonkin patenttivaatimuksista 3-5 mukainen menetelmä, 25 tunnettu siitä, että βΑ-vasta-ainetta käytetään vangitsemaan inhibiini-A koenäytteestä. » I ·

7. Jonkin patenttivaatimuksista 1-6 mukainen menetelmä, M.’ tunnettu siitä, että määritysmenetelmä käsittää sel- V ’ 30 laisen vasta-aineen käytön, joka on spesifinen ainakin inhi- biini-A:n α-alayksikön osalle. | I I ;"ö

8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että α-alayksikön vasta-aine on monoklonaalinen vasta- • i ’·*·’ 35 aine, joka on peräisin hybridoomasta, joka on valmistettu siten, että immunogeeninä on käytetty peptidiä, joka vastaa α-alayksikön osaa. • · 113567

9. Patenttivaatimuksen 8 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että peptidi on synteettinen peptidi, joka vastaa a-alayksikön N-terminaalisen alueen osaa.

10. Patenttivaatimuksen 8 tai 9 mukainen menetelmä, tun nettu siitä, että käytetään vasta-aineen Fab-fragment-tia.

11. Jonkin patenttivaatimuksista 7-10 mukainen menetelmä, 10 tunnettu siitä, että käytetään α-alayksikön vasta- ainetta ilmaisuvasta-aineena ja se on kytketty ilmaistavaan tunnukseen.

12. Patenttivaatimuksen 11 mukainen menetelmä, tunnet-15 t u siitä, että ilmaisuvasta-aine on kytketty entsyymiin.

13. Minkä tahansa edellä esitetyn patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että äidin kehonneste on seerumi tai plasma. 20

14. Minkä tahansa edellä esitetyn patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että se toteutetaan raskauden ensimmäisen kolmanneksen aikana. ;J 25

15. Patenttivaatimuksen 14 mukainen menetelmä, tunnet- ; t u siitä, että se toteutetaan raskauden yhdennentoista - ··· kolmannentoista viikon aikana. 1 < M !

16. Jonkin patenttivaatimuksista 1-13 mukainen menetelmä, 30 tunnettu siitä, että se toteutetaan raskauden toisen .. kolmanneksen aikana. i · · t · I

*' * 17. Minkä tahansa edellä esitetyn patenttivaatimuksen mukai- •:··; nen menetelmä, tunnettu siitä, että se toteutetaan f":35 seulontakokeena potilaiden valikoimiseksi myöhempää diagnos- i«» ’ . tista tutkimusta varten. * »» 113567

18. Patenttivaatimuksen 17 mukainen menetelmä, tunnet-t u siitä, että se toteutetaan muiden tunnistimien määrittämisen apuneuvona.

19. Dimeerisen inhibiini-A:n tasojen käyttö Downin syndrooman spesifisenä tunnistimena raskauden ensimmäisen tai toisen kolmanneksen aikana.

20. Dimeeriselle inhibiini-A:lie spesifisen vasta-ainejärjes-10 telmän käyttö Downin syndrooman testaamisessa raskauden ensimmäisen tai toisen kolmanneksen aikana.

21. Testipakkaus Downin syndrooman seulontaan, tunnettu siitä, että se käsittää inhibiini A:n β-alayksi- 15 kölle spesifisen ensimmäisen vasta-aineen ja inhibiini-A:n a- alayksikölle spesifisen toisen vasta-aineen.

22. Patenttivaatimuksen 21 mukainen testipakkaus, tunnettu siitä, että ensimmäinen vasta-aine on kiin- 20 nitetty kannatinmateriaaliin.

23. Patenttivaatimuksen 21 tai 22 mukainen testipakkaus, tunnettu siitä, että toinen vasta-aine on kytketty **·.. ilmaistavaan tunnistimeen. : .'.25 * · · * · · · # * · # I · « • · · »III • * * »· · lit * · * I · · » • · · t · « * · * » » * I · » · I ♦ · • MOI l · » I * · 113567