NO310992B1 - Diagnostisk metode for detektering av ruptur av fotale membraner og testkit som anvender denne - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører en diagnostisk metode for detektering av ruptur av føtale membraner, idet nevnte metode er basert på bestemmelse av et protein tilstede i en vaginal sekresjonsprøve fra en gravid kvinne, og et testkit for diagnostikk av rupturen av føtale membraner.

Betegnelsen "premature rupture of fetal membranes" (PROM) refererer til den spontane rupturen av membranene minst 24 timer før begynnelsen av fødselen ved termin eller før terminen. Det oppstår i omtrent 5-10 # av tilfellene og er årsaken til omtrent 10 % av perinatale dødsfall. Omtrent 30-50 % av de premature rupturene av membranene oppstår når den gestatisjonale alderen er mindre enn 37 uker, og er dermed ikke fullgodt. Her er diagnostikken ekstremt viktig på grunn av at ruptur av membranene er assosiert med en betraktelig øket risiko for intrauterin infeksjon. Risikoen for en infeksjon er større desto lenger tid som har gått mellom rupturen av membranene og fødselen. Infeksjoner øker både den maternale og perinatale dødeligheten.

Til tross for at problemet har vært så vanlige og alvorige har det ikke vært kjent noen absolutt diagnostisk metode for å detektere rupturen av membranene i de tilfellene hvor rupturen ikke er klinisk tydelig.

I mangel av en definitiv metode er flere utilfredsstillende metoder blitt anvendt ved forsøk på å indikere tilstedeværelse av amniotisk fluid i vagina. Kjente metoder er blant annet beskrevet av Friedman ML og McElin TW, Diagnosis of ruptured fetal membranes. Am J Obstet Gynec 1969;104: 544-550. Amniotisk fluid krystalliseringstesten er basert på observering av en karakteristisk trestruktur eller bregne-mønster på et objektglass og mønstre er forskjellig fra det til normale vaginale sekresjoner.

I farvetestene ble et forsøk utført for å detektere forskjellen ved farving av sekresjonen på et objektglass med f.eks Nile Blue, acridin oransje eller bromtymolblå. En endret pH i vaginalsekresjonen kan bli detektert ved en nitrazintest. I ovennevnte artikkel er en metode også beskrevet hvori amnionfluidet blir farget med en fluorecens-forbindelse og lekkasjen blir visuelt observert i UV lys.

Disse metodene er ikke tilfredsstillene på grunn av falske positive eller falske negative resultater for ofte oppnås, eller de er følsomme overfor interfererende forbindelser eller er assosiert med en risiko for pasientens helse. Testresultatet kan være feilaktig dersom det er en vaginal infeksjon, eller dersom det har gått lang tid siden ruptur av memebranene.

Det er også blitt foreslått at for å detektere prematur ruptur av føtale membraner er det nyttig å bestemme en slik forbindelse i vaginalfluidet, idet konsentrasjonen er høy i amnionfluidet sammenlignet med konsentrasjonen til nevnte forbindelse i de andre sekresjonene som kan være tilstede i vagina. Følgende forbindelser er blitt beskrevet: alfa-føtoprotein (AFP) (Rochelson et al. Rapid assay - possible application in the diagnosis of premature rapture of the membranes. Obstet Gynecol 1983; 62: 414-418) og prolactin (PRL) (Koninckx et al. Prolactin concentration in vagninal fluid: a new method for diagnosin ruptured membranes: Br J Obstet Gynecol 1981; 88: 607-610). Konsentrasjonen av begge forbindelsene i amnionfluidet er klart høyere enn i blodet til en gravid person. I en situasjon hvor vaginalfluidprøven inneholder blod er det vanskelig å detektere tilstedeværelsen av en liten mengde amnionfluid ved å bestemme disse forbindelsene .

Det er derfor klart at det er et behov for utvikling av en enkel og pålitelig diagnostisk metode for å detektere ruptur av føtale membraner. I den situasjonen hvor testen blir utført er det ekstremt viktig å oppnå testresultatet hurtig. Den ideelle testen for dette er enkel og utføre og hurtig

(resultat oppnådd i løpet av minst 30 minutter) og kan fortrinnsvis bli utført som en test utført øyeblikkelig ved sengen på stedet.

Hensikten ifølge foreliggende oppfinnelse er derfor å tilveiebringe en ny og forbedret metode for detektering av ruptur av føtale membraner, idet metoden er spesifikk for forbindelsen som skal bli målt uavhengig av individuelle variasjoner i pasientene.

Hensikten ifølge oppfinnelsen er også å tilveiebringe en fremgangsmåte som er hurtig og enkel å utføre mens pasienten venter (en såkalt bed-side test).

Hensikten ifølge oppfinnelsen er også å utvikle en testkit egnet for en slik diagnose, idet kittet inneholder midler for å utføre en enkel og hurtig diagnostisk metode.

De nøyaktige trekkene ifølge oppfinnelsen vil fremkomme fra følgende beskrivelse og krav som er vedlagt. Foreliggende oppfinnelse er derfor rettet mot en diagnostisk metode for detektering av ruptur av føtale membraner, idet metoden er basert på bestemmelsen av et protein tilstede i en vaginal sekresjonsprøve, kjennetegnet ved at proteinet som skal bli detektert er insulin-lignende vekstfaktorbindende protein 1, IGFBP-1, tilstedeværelsen av IGFBP-1 resulterer fra rupturen av føtale membraner som blir detektert i prøven ved hjelp av minst en spesifikk bindingsforbindelse av IGFBP-1 ved å justere testbetingelsene slik at et positivt resultat bare fremkommer når konsentrasjonen av IGFBP-1 i prøven er over terskelverdien til IGFBP-1 som kommer fra andre kilder enn tilstedeværelse av amnionfluid.

I metoden for oppfinnelsen er forholdet mellom mengden av spesifikk bindingsforbindelse og mengden av protein som skal bli bestemt justert slik at en lav konsentrasjon av IGFBP-1 ikke forårsaker en reaksjon som blir bestemt å være positiv. En positiv reaksjon vil ikke bli forårsaket av noe unntatt en konsentrasjon som er så høy at den er bare karateristisk for amnionfluid. Ifølge oppfinnelsen blir denne reduksjonen av sensitiviteten oppnådd f.eks ved fortynning av vaginalprøven før testent blir utført.

Oppfinnelsen angår videre testkit for diagnostikk av ruptur av føtale membraner, kjennetegnet ved at kittet inneholder minst et reagens inneholdende en spesifikk bindingsforbindelse av insulin-lignende vekstfaktorbindende protein 1, IGFBP-1, for detektering av tilstedeværelse av IGFBP-1, idet nevnte kit er tilpasset for å gi et positivt signal bare når konsentrasjonen av IGFBP-1 i en vaginal sekresjonsprøve er over terskelgrensen til IGFBP-1 som kommer fra andre kilder enn tilstedeværelse av amnionfluid.

Testkit ifølge foreliggende oppfinnelse inneholder også fortrinnsvis en markør for å indikere bindingsreaksjon mellom IGFBP-1 og den bindende forbindelsen, og fortrinnsvis, er den spesifikke IGFBP-1 bindende forbindelsen inkludert i reagenset et spesifikt antistoff til IGFBP-1, spesielt et monoklonalt antistoff.

Insulin-lignende vekstfaktorbindende protein 1 (IGFBP-1) er et protein som er tilstede i varierende konsentrasjoner i forskjellige hann- og hunnkropsfluider og f.eks i serumet til en gravid kvinne. Det er frem til nå blitt vist syntetisert bare av leveren, for utskilt og utskilt endometriet samt ovarier.

IGFBP-1 ble først renset fra placenta og føtale membraner i 1980 (Bohn et al. Isolierung ung Characterisierung eines Neuen Plazentaspezifischen Proteins (PP12), Arch gynecol 1980; 229: 279-291 ). Det var antatt å være et protein med placental opprinnelse og ble betegnet Placental Protein 12 (PP12). Senere ble det observert at PP12 og IGFBP-1 renset fra amnionvæske har samme N-terminale aminosyresekvens (Povoa et al Cross-reactlons of serum somatomedin-binding protein ln a radioimmunoassay developed for somatomedin-binding protein isolated from human amniotic fluid. Acta Endocrinologica 1984; 107: 563-570) og at PP12 binder IGF I (insulin-ligende vekst faktor I) (Koistinen et al. Placental protein 12 is a decidual protein that binds somatomedin and has a indentical N-terminal amino acid sequence with somatomedin-binding protein from human amniotic fluid. Endocrinology 1986; 118:1375). Syntese av IGFBP-1 i utrusslimhinnen ble først beskrevet i 1985 (Rutanen et al. Syntesis of pacental protein 12 by human decidua. Endocrinology 1985; 116:1304). Rensing av IGFBP-1 fra en human hepatomcellelinje ble publisert i 1988 (Lee et al. Insulin-like growth factor (IGF) binding protein complementary deoxyribonucleic acid from human HPE G2 hepatoma cells, Mol Endocrinol 1988; 2:494. Det var i denne sammehengen at hele aminosyresekvense til proteinet ble rapportert for første gang.

Konsentrasjon av IGFBP-1 i amnionvæsken er blitt observert å være vanligvis 100 til 1000 ganger høyere enn den i morserumet (Rutanen et al. Radioimmunoassay of pacental protein 12: levels in amniotic fluid, cord blood and serum of helathy adults, pregnant women and patients with trophoblastic disease. Am J Obstet Gynecol 1982; 144:460). Kliniske anvendelser før denne observasjonen er derimot enda ikke blitt beskrevet.

Reaksjoner basert på spesifikke bindende forbindelser er generelt kjente. Antistoffene er forbindelsene som vanligvis blir anvendt som spesifikke bindende forbindelser. Disse såkalte immunologiske metodene er basert på evnen som et antistoff har til å binde spesifikt til et visst sete i dets antigen (epitope). De såkalte polyklonale antistoffene er en blanding av immunoglobuliner i serumet til et immunisert dyr. Blandingene er forskjellige i hvert individuelle dyr. De såkalte monoklonale antistoffene blir derimot produsert av en cellelinje som blir dyrket i laboratoriebetingelser og hvert antistoff er homogent og kan bli karakterisert ved hjelp av metoder anvendt innen proteinkjemien og som blir kontinuerlig produsert i identisk form.

En immunologisk metode kan bli utviklet slik at bare et antistoff blir anvendt. I dette tilfellet blir reaksjons-betingelsen valgt slik at antigenet i prøven konkurrerer med et tilsatt antigen som er merket, men som ellers er identisk med prøveantigenet for et begrenset antall bindingsseter i antistoffet. Konsentrasjonen til prøveantigenet blir bestemt ved analysering av fraksjonen av bundet markør. Flere merkingsforbindelser som produserer et signal som muliggjør måling av konsentrasjonen kan bli anvendt, f.eks radiaktiv isotoper, enzymer, kjemiluminescens eller fluorescens forbindelser. Metoden kan også anvende to forskjellige antistoffer (såkalt sandwich prinsipp). Her er antistoffene spesifikke for separate epitoper i samme antigen og kan bli bundet simultant til det samme antigenmolekylet. Et antistoff blir vanligvis immobilisert på en fast bærer og den andre blir merket. Begge antistoffene blir bundet til antigenet i prøven og komplekset kan bli separert fra ubundet markør ved hjelp av bæreren. Mengden av bundet merket antistoff er direkte proposjonalt med antigenkonsentrasjonen i prøven.

Oppfinneren ifølge oppfinnelsen har studert placentaproteiner og for forskningen har hun utviklet en radioimmunologisk analysemetode for å bestemme IGFBP-1 (PP12) konsentrasjonen. Videre er monoklonale antistoffer til IGFBP-1 blitt utviklet for studiene (Rutanen et al. Monocolonal antibodies to the 27-34 K insulin-like growth factor binding protein. Biochem Biophys Res Commun 1988; 152:208). Studiene har derimot ikke ført til noen kliniske anvendelser.

Det er ingen rapport som finnes i litteraturen og som viser en sammenligning mellom konsentrasjonen av IGFBP-1 i amnionfluidet og andre utskillelser tilstede i vagina. En forskningsgruppe ledet av oppfinneren til foreliggende oppfinnelse har nå studert konsentrasjonene av IGFBP-1 i amnionfluidet og blod, samt konsentrasjonene i sekresjoner som muligens er tilstede i vagina (tabell 1).

Tabell 1

Konsentrasjoner av IGFBP-1, prolaktin (PRL) og alfa-feto-protein (AFP) i prøver av morserum (S) og aminonfluid (AF) er vist i tabellen. Prøvene ble tatt ved gestasjon på 24-38 uker.

Det kan konkluderes fra de parrede blod og amnionfluidprøvene som er blitt studert at til tross for at det er betydelige og individuelt varierende mengder av IGFBP-1 blodet er konsentrasjonen av IGFBP-1 i amnionfluidet i alle tilfellene mer enn 100 ganger høyere enn i morserumet. De nevnte for-skjellene i konsentrasjoner er den største forskjellen mellom et protein i blodet og i amnionf luidet som er kjent for oppfinneren. På grunn av dette er IGFBP-1 godt egnet for detektering av tilstedeværelse av amnionfluid også i situasjoner hvor amnionfluidet er blandet med blod.

De tilsvarende forholdene mellom proteinene AFP og PRL varierer betraktelig og er i størrelsesorden 1-10. I noen tilfeller ble til og med høyere konsentrasjoner av forbindelsene som skal bli målt funnet i serum enn i amnionfluidet. Disse målingene viser også hvorfor tidligere tester basert på målinger av AFP og PRL ikke har vært fullstendig pålitelige.

Ifølge foreliggende oppfinnelse er det blitt observert at ved justering av deteksjonsgrensen til IGFBP-1 testen til slikt nivå at selv en høy blodkonsentrasjon av IGFBP-1 ikke gir et positivt resultat kan man være sikker på at et positivt resultat alltid kommer fra en tilstedeværelse av amnionfluid. På denne måten kan IGFBP-1 også fra amnionf luidet med en lav konsentrasjon bli detektert selv om det bare er en liten mengde av amnionfluid blandet i blodet.

Deteksjonsgrensen kan bli justert til et egnet nivå, blant annet ved anvendelse av en markør som produserer et slikt svakt signal at en lav konsentrasjon av IGFBP-1 forårsaket bare av blod eller visse andre utskillelser i prøven ikke vil gi et resultat som blir tolket som positivt. Når det anvendes et sterkt signal kan deteksjonsgrensen bli redusert, f.eks ved fortynning av prøven. Dersom signalet som blir anvendt gir et kvantitativt resultat kan det bli tolket som negativt alltid når konsentrasjonen av IGFBP-1 i prøven er under den høyeste kjente konsentrasjonen forårsaket av morserumet.

Det har også blitt vist i studier at konsentrasjonen av IGFBP-1 i vaginale sekresjoner i ikke-gravide kvinner og gravide kvinner med intakte membraner, i seminalplasmaet eller urinen er ekstremt lavt sammenlignet med den i amnionfluidet. Testen kan derfor bli konstruert slik at andre kilder av IGFBP-1 enn amnionfluid ikke kan forårsake falske positive resultater i testbetingelsene som blir anvendt. Som presentert i tabell 1 var den høyeste konsentrasjonen av IGFBP-1 som er funnet i studiene i morserum 600 ug/l, mens den laveste konsentrasjonen i amnionfluidet var 22000 ug/l. Selv om amnionfluidinnholdet i prøven er så lite som 10 % er IGFBP-1 konsentrasjonen forårsaket av tilstedeværelse av aminonfluid fortsatt 2200 ug/l, som er over tre ganger mere enn den høyeste konsentrasjonen som blir målt i morserum. Som oftest er IGFBP-1 konsentrasjonen i amnionfluidet betraktelig høyere enn det som er nevnt ovenfor (22000 ug/l) og derfor en konsentrasjonen i morserumet betraktelig lavere enn det som er nevnt ovenfor (600 ug/l).

En liten mengde (100-200 ul) vaginalsekresjon er tilstrekkelig for å utføre testen. Prøven blir fortrinnsvis tatt i løpet av en spekulumundersøkelse ved anvendelse av f.eks en engangssprøyte eller et sterilt instrument spesielt konstruert for dette.

På grunn av at den molekylære størrelsen til IGFBP-1 er stor nok, idet dets molekylvekt er på omtrent 25000 D, har det vært mulig å danne antistoffer mot det og disse antistoffene kan bli anvendt i en immunologisk analysemetode.

Metoden ifølge foreliggende oppfinnelse er derfor basert på anvendelsen av antistoffer mot IGFBP-1 eller andre spesifikke bindende forbindelser til IGFBP-1. Den er hurtig og området som den dekker er et egnet konsentrasjonsområde, og den er derfor godt egnet for diagnostisk bruk som er hensikten til foreliggende oppfinnelse, dvs å detektere rupturen av føtale membraner med verifisering av tilstedeværelse av amnionfluid i vagina.

Det er nå mulig for første gang ved anvendelse av den foretrukne analysemetoden til IGFBP-1 ifølge foreliggende oppfinnelse å detektere amnionfluid i vagina med en tilstrekkelig spesifisitet på grunn av at konsentrasjonene som er så høye som de som er nødvendige for målingsområdet til analysen ikke eksisterer andre steder enn i amnionfluidet. Det vil derfor ikke eksistere noen falske positive resultater forårsaket av kontaminasjon fra en annen IGFBP-1 kilde.

I en foretrukket utførelsesform ifølge oppfinnelsen blir målingsområdet justert slik at IGFBP-1 avledet fra blod ikke kan forårsake et falskt positivt resultat. Testen er derfor så ufølsom at den normalt forekommende mindre lekkasjen av amnionfluidet gjennom intakte føtale membraner ikke kan forårsake en falsk tolkning. Som bindingsforbindelsen eller bindingsforbindelsen anvendt i testen bare binder IGFBP-1 spesifikt er muligheten av en positiv reaksjon forårsaket av en såkalt kryss-reaksjon, dvs binding av feilforbindelse også eliminert.

Konsentrasjonen av IGFBP-1 i amnionfluidet er derimot alltid så høy at fluidet som lekker i sammenheng med en ruptur av føtale membraner ikke kan forbli udetektert i en test ifølge oppfinnelsen. Testen anvender en spesifikk bindingsforbindelse som blir bundet til IGFBP-1 med en så høy affinitet at til tross for dets hurtige virketid vil testen begynne å bli positiv ved begynnelsen av en ønsket IGFBP-1 konsentrasjon i prøven.

Ved utvikling av testen er det blitt forsøkt å eliminiere den såkalte Hook-effekten (effekten av prozonefenomenet). Denne effekten betyr at i en immunologisk reaksjon kan en antigen-konsentrasjon som er meget høy sammenlignet med antistoff-konsentrasjonen forårsake en falsk reduksjon av antigen-antistoffkompleksene som skal bli målt. I dette tilfellet kan en prøve med en høy konsentrasjon derimot gi et lavt resultat, som i en test av foreliggende type vil være ekstremt skadelig og forårsake et falskt negativt resultat. På grunn av dette er forholdet mellom mengdene av bindings-reagenser og IGFBP-1 som skal bli målt blitt justert slik at selv om den høyeste kjente konsentrasjonen i amnionfluidet ikke kan forårsake at signaler målt blir negativt og dermed føre til en feil tolkning ved utvikling av den foretrukne utførelsesformen av testmetoden ifølge oppfinnelsen. På denne måten er risikoen for et falskt negativt resultat vesentlig eliminiert i testen ifølge oppfinnelsen.

IGFBP-1 testen ifølge oppfinnelsen er blitt utviklet for å gi et resultat så hurtig som mulig som også er både medisinsk og økonomisk viktig for å etablere diagnostikken ment for foreliggende oppfinnelse. Den nødvendige prøven kan bli tatt blant annet i løpet av en gynekologisk speclumundersøkelse når rupturen av membranene er ventet. Prøven kan f.eks bli tatt i en sprøyte eller med et prøveinstrument som er dannet for denne hensikten.

Ifølge en foretrukket utførelsesform ifølge oppfinnelsen er forholdet mellom konsentrasjonene til de spesifikke bindings-forbindelsene og IGFBP-1 som kommer fra prøven blitt justert for å være egnede i metoden slik at signalet som fører til en positiv tolkning bare vil oppstå når IGFBP-1 konsentrasjoenen i prøven er høy. Det riktige forholdet blir oppnådd f.eks ved fortynning av sekresjonsprøven som er blitt tatt for diagnostikk før selve testen blir utført. Fortynningen blir utført med en oppløsning som er egnet for bindingsreaksjonen som foregår i testen, fortrinnsvis med en oppløsning som hører til tetsten. Oppløsningen er fortrinnsvis en buffer så som blant annet en fosfatbuffer som inneholder beskyttende proteiner og som har en pH nær opptil fysiologisk.

I testene utført i praksis er det blitt merket at fortynningen bør være minst 1:10 for å oppnå et pålitelig resultat og fortrinnsvis minst 1:20. Større fortynninger kan også bli anvendt selv opptil 1:500 eller enda høyere. For å oppnå et resultat ifølge oppfinnelsen er et kvalitativt resultat dvs. + eller - tilstrekkelig, idet fortynningsnivået ikke er kritisk dersom det er over terskelen hvor blant annet IGFBP-1 tilstede i morblodet vil gi et positivt resultat i måle-området til den valgte markøren.

Testen kan også bli utført med en ufortynnet prøve, blant annet ved anvendelse av meget store mengder av spesifikk bindingsforbindelse og en markør, idet signalet ikke er meget sterkt. Det er derfor bare den høye konsentrasjonen av IGFBP-1 avledet fra amnionfluidet som kan gi et positivt resultat.

Ifølge oppfinnelsen blir IGFBP-1 testen fortrinnsvis utført ved anvendelse av to spesifikke monoklonale antistoffer, blant annet slik at et antistoff er koblet til en liten plastkule og det andre antistoffet er koblet til en markør, som et enzym, blant annet pepperotperoksydase (HRP). Den hensiktsmessige fortynnede prøven, enzym-merket antistoff og den antistoffbelagte kulen i en griper blir plassert i et reagensrør. Når blandingen blir inkubert vil IGFBP-1 tilstede i prøven bli bundet på den ene siden til kulen og på den andre til merket antistoff. Etter inkubasjon blir kulen fjernet fra røret og vasket under rennende vann. Kulen blir plassert i et rør inneholdene substratet til enzymet anvendt som markør. Iløpet av inkubasjonen utvikles en visuelt detekterbar farve dersom prøven inneholdt en tilstrekkelig mengde IGFBP-1. Oppløsningen forblir farveløs dersom prøven ikke inneholder IGFBP-1 eller dersom konsentrasjonen derav er for lav.

IGFBP-1 testen ifølge oppfinnelsen kan også bli utført slik at det første antistoffet blir koblet til overflaten av en membran utviklet for slike hensikter ved testen. Prøven blir tillatt å være i kontakt med membranen og IGFBP-1 i prøven vil bli bundet spesifikt til nevnte immobiliserte antistoff. Deretter blir et tilsvarende enzymkoblet antistoff tilsatt som igjen blir bundet til IGFBP-1 som nå er tilstede på membranen. Det bundete enzymet blir detektert ved å tilsette til den vaskede membranen et presipiterende substrat av enzymet og der substratet vil forandre farve som et resultat av enzymvirkningen. Når prøven dermed er positiv utvikles en visuelt detekterbar farve på membranen. Denne testtypen basert på en membran belagt med antistoff kan bli utført ved å koble den gjeldende membranen til en plastbeholder som er spesielt konstruert for dette. Et absorberende materiale plassert under membranen vil hurtig absorbere testlikvidet gjennom membranen når nevnte likvider blir plppetert på membranen. Tilsvarende kan membranen bli koblet til en plaststrimmel som blir overført fra en oppløsning til en annen.

En farve som indikerer et positivt resultat kan bli oppnådd på annen måte enn ved merking av antistoffet med et enzym som igjen forårsaker forandring av farven til dets substrat. I steden for et enzym kan et farvestoff bli koblet til antistoffet. Intensiteten til farvestoffet bør være tilstrekkelig sterk slik at i positive tilfeller er farven til markøren bundet til immobilisert IGFBP-1 visuelt detekterbar. Gull- eller seleniumkolloider eller disperse farvestoffer kan bli anvendt som slike farvestoffer. Fordelen med et slikt farvestoff er at yteevnen til testen er kortere når en separat substrat reaksjonsfase ikke er nødvendig. Antistoffet kan bli koblet til farvede latexpartikler. Når en slik deteksjon basert på en direkte visuell farve blir anvendt kan en immunkromatografisk hurtig testmetode bli anvendt for IGFBP-1. Vanligvis blir en membran anvendt hvori et første antistoff er koblet til et lite område. Til et annet område blir et andre farvemerket antistoff tørket. Nevnte andre antistoff begynner å migrere på membranen når en væskeprøve blir tilsatt. I det tilfellet hvor prøven inneholder en tilstrekkelig mengde IGFBP-1, vil en farvet sone bli utviklet ved det punktet hvor antigenet bundet til det merkede antistoffet videre bli bundet til antistoffet immobilisert til membranen. Dersom prøven er negativ blir det ikke utviklet noen farvesone og farven migrerer over membranen.

IGFBP-1 testen kan også bli utført ved agglutinerings-prinsippet. Her omfatter den visuelt detekterbare reaksjonen agglutinering av blant annet antistoffbelagte partikler, som latex, idet antigenet i prøven forårsaker bindinger mellom dem. Inhibisjon av agglutinasjonen kan også bli detektert. Ikke bare antistoffer, men også andre spesifikke bindingsforbindelser til IGFBP-1 og kombinasjoner derav kan også bli anvendt i metoden og testkittene ifølge foreliggende oppfinnelse. På denne måten kan blant annet den naturlige bindingskarakteristikken til IGFBP-1 til IGF (insulin-lignende vekstfaktor) bli undersøkt.

Ved utførelse av testen kan man også anvende analysemetodene forklart i FI-patent 84863, og inneholdet er innbefattet heri som referanse.

Metodene for testing for IGFBP-1 ifølge foreliggende oppfinnelse kan lette problemene relatert til prematur ruptur av membranene på en avgjørende måte. Etter ruptur av membranene trenger pasienten en intensiv oppfølging frem til levering på grunn av risiko for infeksjon. Når en prematur ruptur av føtale membraner antas må man avgjøre på grunnlag av en undersøkelse om pasienten bør bli innlagt på sykehus eller være hjemme. Denne avgjørelsen er viktig både økonomisk og medisinsk: økonomisk på grunn av kostnader for samfunnet for sengeliggende dager og medisinsk på grunn av avgjørelsen som direkte influerer på dødeligheten til både fosteret og moren.

Testkit ifølge foreliggende oppfinnelse inneholder et reagens som er basert på en spesifikk bindingsforbindelse til IGFBP-1. Avhengig av testmetoden kan reagenset være en oppløsning av bindingsforbindelsen eller den kan være en fast fase som en kule eller en membran belagt med den spesifikke bindingsforbindelsen, eller den kan bli dannet fra latex eller farvepartikler. I en ettrinnsanalyse kan kittet også inneholde en kombinasjon av ovennevnte komponenter, den spesifikke bindingsforbindelsen omfatter fortrinnsvis et spesifikt monoklonalt antistoff til IGFBP-1.

I tillegg til reagenset nevnt ovenfor inneholdet kittet fortrinnsvis en markør som kan detektere en tilstrekkelig konsentrasjon av IGFBP-1 1 prøven etter bindingsreaksjon. Markøren som detekterer bindingsreaksjonen er fortrinnsvis en signalproduserende markør koblet til et annet antistoff til IGFBP-1. Markøren er f.eks et enzym koblet til et annet antistoff til IGFBP-1, en radioaktiv isotope eller en forbindelse gjenkjent ved dets farve. Dersom markøren er et enzym inneholder testkittet fortrinnsvis et substrat av enzymet.

I tillegg til de vesentlige reagensene er det fordelaktig at testkittet inneholder en fortynningsoppløsning for fortynning av prøven. Nevnte oppløsning omfatter fortrinnsvis en analysebuffer, blant annet fosfatbuffer inneholdende beskyttende proteiner og har en pH som er nær opptil fysologisk pH. Mengden av fortynningsbuffer kan bli justert for å oppnå en sluttfortynning, blant annet 1:20, når en viss mengde prøve blir tilsatt.

Testkittet kan også inneholde et prøvetakningsinstrument så som en engangs steril sprøyte eller et instrument spesielt utviklet for testen.

Testkittet kan også bestå av et enkelt instrument for å ta en vaginal sekresjonsprøve og en tilhørende fortynningsoppløs-ning for å utføre testen. Testkittet kan også omfatte en antistoffbelagt teststrimmel som pasienten selv kan føre inn i vagina. Slike testkit er velegnede for tester utført hjemme slik at en kvinne selv kan anvende den hjemme når hun antar ruptur av føtale membraner og lurer på om hun skal gå til sykehuset eller ikke.

Eksemplene nedenfor illustrerer utførelse av testen ifølge oppfinnelsen uten å begrense denne.

Eksempel 1

Plastkuler ble belagt med anti-IGFBP-1 antistoff (6305, Medix Biochemica). Et annet IGFBP-1 antistoff (6303, Medix Biochemica) ble koblet til et markørenzym (pepperrotperoksy-dase, HRP). Fosfatbuffer inneholdene 0,3 % bovint serumal-bumin (BSA) ble anvendt som analysebuffer. Bufferen inneholdt også en detergent og stabiliserende stoffer og pH var 7,4. En hurtig IGFBP-1 test ble utført ifølge følgende instruksjoner.

Utførelse av hurtig IGFBP-1 test:

1. 200 pl 6303-HRP-markør ble pippetert til prøverøret (fortynnet 1:50 i analysebuffer). 2. 100 ul prøve (fortynnet 1:20 i analysebuffer) ble tilsatt til røret. 3. IGFBP-1 antistoff belagt kule i en griper ble plassert i røret. Det ble inkubert i 5 min. 4. Kulen i griperen ble fjernet fra oppløsningen og vasket under rennende vann i 30 sekunder. 5. Den vaskede kulen ble overført til substrat oppløsningen (2,2'-azino-di-[3-etyl-benzotiazolinsulfonat(6)], ABTS (400 ul pippetert i et klart rør). 6. Røret ble latt stå beskyttet fra lys i en gul beskyttende beholder i 5 min. 7. Farven til oppløsningen ble enten undersøkt øyeblikkelig eller reaksjonen ble stoppet ved tilstening av oppløsning for stopping (200 ul) og undersøkt. Den farveløse oppløsning var negativ, grønn var positiv.

For å utføre en sammenligning og verifisere hensiktsmessig fortynning ble testene utført ifølge fremgangsmåten skrevet ovenfor i eksempel 1, hvor prøven var amnionfluid, der IGFBP-1 konsentrasjonen var på omtrent 200000 ug/l og som var fortynnet 1:20, 1:100, 1:500 og 1:2500 før testen og tilsvarende ble en serumprøve der IGFBP-1 konsentrasjonen var høyere enn 100 ug/l og som ble fortynnet 1:20 før testen.

Vanlige absorbanser målt som presentert nedenfor:

Eksempel 2

En snever sone av en nitrocellulosestrimmel blir belagt med et IGFBP-1 antistoff (6305, Medix Biochemica). Farvede latexpartikler blir også belagt med et annet IGFBP-1 antistoff (6303, Medix Bichemica). De belagte latexpartiklene blir tørket i andre enden av membranstrimmelen inneholdene antistoffsonen. Den hurtige IGFBP-1 testen blir utført på membranen ifølge følgende instruksjon:

Utførelse av IGFBP-1 membrantesten:

1. Noen få dråper av en prøve fortynnet med buffer blir pippetert på den delen av strimmelen hvor latexpartiklene er tørket. 2. I løpet av noen få minutters inkubasjon migrerer prøven på membranen og latexpartiklene blir overført med væsken over den antistoff-belagte sonen til den andre enden av strimmelen. 3. Strimmelen blir inspisert. Dersom en farvet sone blir dannet er resultatet positivt.

Eksempel 3

Et lite område av nylonmembranen blir belagt med IGFBP-antistoff (6305, Medix Biochemica). Den belagte membranen blir plassert på en plastkopp-lignende beholder slik at like under er det koblet et absorberende materiale (behandlet cellulose). Et annet IGFBP-1 antistoff (6303, Medix Biochemica) blir koblet til et markørenzym (pepperrotperoksy-dase, HRP). En hurtig IGFBP-1 test blir utført ifølge følgende instruksjoner. 1. Noen få dråper prøve fortynnet med analysebuffer blir pippetert til membranen og oppløsningen blir absorbert gjennom membranen. 2. Som mye vaskeoppløsning som koppen holder (omtrent 1 ml) blir pippetert og oppløsningen blir absorbert gjennom membranen. 3. Noen få dråper av den merkede oppløsningen blir pippetert og oppløsningen blir absorbert gjennom membranen. 4. Omtrent 1 ml av vaskeoppløsningen blir pippetert og oppløsningen blir absorbert gjennom membranen. 5. Noen få dråper av et prespiterende substrat av enzymet blir pippetert på membranen og oppløsningen blir absorbert gjennom membranen. 6. Membranen blir inspisert. Dersom en farvet sone blir dannet er resultate positivt.

Claims (13)

1. Diagnostisk metode for detektering av ruptur av føtale membraner, idet metoden er basert på bestemmelsen av et protein tilstede i en vaginal sekresjonsprøve, karakterisert ved at proteinet som skal bli detektert er insulin-lignende vekstfaktorbindende protein 1, IGFBP-1, tilstedeværelsen av IGFBP-1 resulterer fra rupturen av føtale membraner som blir detektert i prøven ved hjelp av minst en spesifikk bindingsforbindelse av IGFBP-1 ved å justere testbetingelsene slik at et positivt resultat bare fremkommer når konsentrasjonen av IGFBP-1 i prøven er over terskelverdien til IGFBP-1 som kommer fra andre kilder enn tilstedeværelse av amnionfluid.

2. Metode ifølge krav 1,karakterisert ved at den spesifikke bindingsforbindelsen som blir anvendt er et antistoff mot IGFBP-1.

3. Metode ifølge krav 2,karakterisert ved at antistoffet er et monoklonalt antistoff.

4. Metode ifølge et hvilket som helst av de foreågende krav, karakterisert ved at bestemmelsen blir utført ved anvendelse av et reagens basert på en IGFBP-1 bindende forbindelse og en annen, merket bindingsforbindelse hvor signalet derav kan bli detektert.

5 . Metode ifølge et hvilket som helst av de foregående krav, karakterisert ved at prøven som blir tatt fra vagina blir fortynnet før testen utføres for å redusere konsentrasjonen av IGFBP-1 i prøven.

6. Metode ifølge krav 5,karakterisert ved at fortynningen er minst 1:10, fortrinnsvis 1:20.

7. Metode ifølge krav 1, 2 eller 3, karakterisert ved at et merket reagens blir anvendt og signalet derav gir et positivt resultat bare når IGFBP-1 konsentrasjonen som skal bli målt er tilstrekkelig høy.

8. Testkit for diagnostikk av ruptur av føtale membraner i henhold til fremgangsmåten i krav 1, karakterisert ved at kittet inneholder minst et reagens inneholdene en spesifikk bindingsforbindelse av insulin-lignende vekstfaktorbindende protein 1, IGFBP-1, for detektering av tilstedeværelse av IGFBP-1, idet nevnte kit er tilpasset for å gi et positivt signal bare når konsentrasjonen av IGFBP-1 i en vaginal sekresjonsprøve er over terskelgrensen til IGFBP-1 som kommer fra andre kilder enn tilstedeværelse av amnionfluid.

9. Testkit ifølge krav 8, karakterisert ved at det videre inneholder en markør som detekterer bindingsreaksjonen.

10. Testkit ifølge krav 9,karakterisert ved at følsomhetsområdet til signalet produsert av markøren blir justert på en slik måte at et positivt resultat bare oppstår ved en høy konsentrasjon av IGFBP-1 som resulterer fra tilstedeværelse av amnionfliud.

11. Testkit ifølge krav 8, 9 eller 10, karakterisert ved at reagenset inneholder, som spesifikk bindingsforbindelse til IGFBP-1, et spesifikt IGFBP-1 antistoff, fortrinnsvis et monoklonalt antistoff.

12. Testkit ifølge krav 9 eller 10, karakterisert ved at markøren som detekterer bindingsreaksjonen er en signalproduserende forbindelse koblet til en annen IGFBP-1 bindende forbindelse.

13. Testkit ifølge krav 8,karakterisert ved at reagenset basert på den spesifikke bindingsforbindelsen omfatter bindingsforbindelser bundet til en fast fase eller til uoppløselige partikler, eller oppløsninger av bindings-forbindelsene.