KR0162504B1 - 양막파열을 감지하는 진단방법과 이 방법을 이용한 테스트키트 - Google Patents

Abstract

본 발명은 양막파열을 감지할 수 있는 신속하고 신뢰성 있는 방법과 이 방법을 실행할 수 있는 테스트키트에 관계한다. 양막파열로 인한 IGFBP-1의 존재를 질분비물내에서 IGFBP-1에 특이적 결합물질을 이용하여 감지하는 것으로 구성된다.

Description

양막파열을 감지하는 진단방법과 이 방법을 이용한 테스트키트

본 발명은 양막파열을 감지할 수 있는 임신여성의 질분비물에 있는 단백질의 양에 기초하는 진단방법에 관계하며, 양막의 진단을 위한 테스트키트에 관계한다.

양막조기파열(PROM)은 출산이전 적어도 24시간내에 막이 자연파열되는 것을 말하다. 이는 분만의 약 5-10%에 해당되고, 이것이 신생아 죽음의 10%에 해당된다. 임신 37주이전에 PROM의 PROM이 30-35% 정도 발생한다. 여기에서 PROM의 진단은 막파열이 자궁감염의 위험성이 상당히 높은 것과 연관이 있기 때문에 매우 중요하다. 감염의 위험성은 막파열과 분만사이에 시간이 지체될수록 더 위험하다. 감염의 태아와 산모에 사망을 증가시키는 요인이 된다.

이 문제가 매우 빈번하고 심각한데에도 불구하고 파열이 임상적으로 증명되지 않을 경우에 양막파열을 감지하는 공지된 절대적인 진단방법은 없다.

결정적인 방법이 부족한 가운데, 몇몇 불확실한 방법이 질내에 양수의 존재를 나타내는 것으로 사용되었다. 공지된 방법은 Friedman ML and McElin TW, Diagnosis of ruptured fetal membranes. Am J Obstet Gynec 1969;104:544-550. 양수 결정화 방법은 정상적인 질분비물의 양상과는 상이한 분자형 또는 양치류 패턴을 관찰하는 것을 기초로 한다.

염색 테스트에서는 나일블루, 아르시딘 오렌지 또는 브롬티올블루로 분비물을 염색하여 그 차이를 감지하는 것이다. 니트라진 테스트에 의해 질분비물의 pH의 변화도 감지할 수 있다. 상기 방법에 의해 양수를 형광성물질로 착색시키고 이를 UV광으로 관찰할 수 있다.

그러나 이들 방법은 가양성과 가음성이 종종 얻어지고 방해물질에 민감하여 환자의 생명에 위험을 줄 수 있기 때문에 만족할만한 방법이 못된다. 시험결과는 질이 감염되었거나 양막파열후 시간이 많이 경과했을 경우에는 잘못 나올수도 있다.

양막의 조기파열을 감지하기 위해 질내에도 있는 다른 성분물의 양과 비교하여 양수에 특히 많이 있는 질내 분비물의 성분물을 감지하는 방법이 제시되어 왔다. 이와같은 성분물은 알파-페토프로테인(AFP)(Rochelson et al. Rapid Assay-possible application in the diagnosis of premature rupture of the membranes. Obstet Gynecol 1983;62:414-418)과 프로락틴(PRL)(Konnickx et al. Prolactin concentrat ion in vaginal fluid: a new method for diagnosing ruptured membranes. Br J Obs tec Gynecol 1981;88:607-619) 이들 두성분물은 임산부의 혈액에보다는 양수내에 현저하게 높은 농도로 존재한다. 그러나, 양수내에도 혈액이 포함되는 상황에서 이들 성분물을 감지하기 위한 양수에 소량있는 것을 감지하기는 매우 어렵다.

결과적으로, 양막의 조기파열을 감지할 수 있는 간단하고 신뢰성 있는 진단방법의 필요성이 명백해진다. 테스트를 하는데에 중요한 것은 테스트결과를 신속하게 얻는 것이다. 이 목적을 위한 간단하고 신속한 테스트가 필요하다.

본 발명의 목적은 양막의 조기파열을 감지하는 신규하고 개선된 방법을 제공하며, 이 방법은 환자에서 개인적인 다양한 상황이나 여건에 관계없이 측정할 수 있는 특이물질과 관계한다.

본 발명의 목적은 환자가 대기하는 동안에 실행할 수 있는 간단하고 신속한 방법을 제공한다.

본 발명의 목적은 간단하고 신속한 진단방법을 실행하기 위한 장치가 포함된 진단에 적절한 테스트키트를 개발하는 것이다.

본 발명의 특징의 다음의 상세한 설명과 청구범위에서 명백해진다. 따라서, 본 발명은 임산부의 질분비물내에 단백질을 정량하는 것을 기초로 하는 양막파열을 감지하는 진단방법이고 이 방법에서 감지되는 단백질은 인슐린 유사성장인자 결합단백질1(IGFBP-1)이다. 양막파열로 인한 이 단백질의 존재는 질분비물내에 적어도 하나이상의 IGFBP-1 결합물질이 있음을 지시하는 것이 된다.

본 발명에 따르면 특이적 결합물질의 양과 정량될 단백질의 양의 비가 조절되어 IGFBP-1의 낮은 농도는 양성이로 해석될 반응의 원인이 되지 않는다. 양성반응은 양수에만 있는 특징인 고농도에서 일어나는 것은 아니다. 본 발명에 따르면 강도의 감소는 시험하기전에 질분비물을 희석함으로써 가능하다.

양막파열을 진단하기 위해 개발된 본 발명에 따른 테스트키트에는 질분비물내에 태아막 파열에 의한 IGFBP-1 존재를 감지할 수 있는 IGFBP-1에 특이적 결합활성이 있는 물질로 구성된 적어도 하나이상의 시약을 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 테스트키트에는 IGFBP-1과 결합물질사이에 결합반응을 나타내는 라벨이 포함되는데, 적절하게는 시약내에 포함된 특이적 IGFBP-1 결합물질은 IGFBP-1에 특이적 항체 특히, 단클론 항체이다.

IGFBP-1은 남여 신체액과 임산부의 혈청등에 다양한 농도로 존재하는 단백질이다. 또한 이는 간, 자궁내막, 난소에 의해서만 합성된다.

IGFBP-1은 1980년 태반과 양막에서 처음으로 분리되었다(Bohn et al. Isolierung und Characterisierung eines Neuen Plazentaspezifischen Proteins (PP12), Arch gynecol 1980; 229:279-291)이는 태반 단백질로 여겨져 태반 단백질12(PP12)로 명명되었다. 후에, PP12와 IGFBP-1은 양수에서 정제되어 동일한 N 단부 아미노 서열을 가진것을 알 수 있었다(Povoa et al. Cross-reactions of serum somatomedin-binding protein in a radioimmunoassay developed for somatomedin-binding protein isolated from human aminotic fluid. Acta Endocrinologica 1984; 107:563-570). 그리고 PP12는 IGFI에 결합하였다(Koistinen et al. Placental protein 12 is a decidual protein that binds somatomedin and has an identical N-terminal amino acid sequence with somatomedin-binding protein from human aminotic fluid. Endocrinology 1986; 118:1375). 탈락막에서의 IGFBP-1의 합성이 1985년에 처음으로 상술되었다(Rutanen et al. Synthesis of placental protein 12 by human decidua. Endocrinology 1985; 116:1304). 사람의 간 세포주에서 IGFBP-1의 정제가 1988년에 공개되었다(Lee et al. Insulin-like growth factor (IGF) binding protein complementary deoxyribonucleic acid from human HEP G2 hepatoma cells, Mol Endocrinol 1988; 2:404). 이 단백질의 완전한 아미노산 서열이 처음으로 보고된 것이다.

양수에서의 IGFBP-1의 농도는 모체혈청에 존재하는 농도의 100 내지 1000배 정도 통상적으로 높은 것으로 관찰되었다.(Rutanen et al. Radioimmunoassay of placental protein 12:levels in amniotic fluid, cord blood and serum of healthy adults, pregnant women and patients with trophoblastio disease. Am J Obstet Gynecol 1982; 144:460). 그러나 이 관찰의 임상적 응용은 더이상 상술되지 않았다.

특이결합물질에 기초한 반응은 일반적으로 공지되어 있다. 특이결합물질에 사용되는 가장 통상적인 성분물이 항체가 된다. 또한 면역학적인 방법은 항원의 특정부위(에피토프)에 특이적으로 결합할 수 있는 항체의 능력에 기초하다. 소위 다클톤 항체는 면역화된 동물의 혈청에 있는 이뮤노글로블린의 혼합물이다. 이 혼합물은 각 동물에서 상이한데, 이와는 달리, 단클론 항체는 실험실에서 배양된 한 세포주에 의해 생성되고, 각 항체는 일정하여, 단백질 화학에 사용되며, 연속적으로 동일한 형으로 생산할 수 있다.

단 한종류의 항체를 이용하는 면역학적 방법이 개발되었다. 이 경우에, 반응조건은 시료내의 항원과 동일한, 그러나 라벨된 항원을 첨가하여 항체에서 한정된 결합부위와 경쟁할 수 있는 반응조건을 선택한다. 시료항원의 농도는 결합된 라벨량을 분석함으로써 결정한다. 농도를 측정할 수 있는 시그날을 가진 몇가지 라벨링 물질은 방사능 동위원소, 효소, 게이루미선트 또는 형광 성분불등이 있다. 두가지 상이한 항체를 이용하는 방법도 있다(소위 샌드위치 원리). 항체들은 동일한 항원의 에피토프를 특이적으로 구분하여 동시에 동일 항원에 결합할 수 있다. 한 항체는 고형 운반체에 통상적으로 고정되어 있고, 다른 항체는 라벨된다. 이들 두 항체는 시료에서 항원에 결합되고 복합체는 운반체에 도움으로 결합안된 라벨에서 분리된다. 결합된 라벨항체의 량은 시료내의 항원농도에 직접적으로 비례한다.

본 발명의 발명자는 태반 단백질을 연구하였고, IGFBP-1(PP12) 농도를 정량할 수 있는 방사면역검사법을 개발하였다. 두익, IGFBP-1에 대한 단클론 항체가 연구되었다(Rutanen et al. Monoclonal antibodies to the 27-34 K insulin-like growth factor binding protein. Biochem Biophys Res Commun 1988; 152:208). 그러나 이 연구는 임상적으로 이용되지 못했다. 양수에서의 IGFBP-1의 농도와 질내에 있는 다른 분비물사이에 비교를 한 문헌은 없다. 본 발명의 발명자에 의한 연구에서 양수와 혈액에서의 IGFBP-1의 농도와 질내에 있는 농도를 연구하였다.

혈액과 양수시료에서의 연구결과를 보면 형액과 양수에서의 IGFBP-1의 농도가 매우 다양한데 이는 모체혈청보다 100배 이상됨을 알 수 있다. 농도에서의 상이성은 혈액과 양수사이의 단백질 차이때문이다. 이러한 이유에서 IGFBP-1이 양수와 혈액이 혼합된 상황에서 양수에 있는 것을 감지하기에 매우 적합한 것이다.

반대로, 단백질 AFP와 PRL의 상대적인 비는 1-10배 정도로 상당히 다양하다. 어떤 경우에는 혈청에서의 측정된 성분물의 농도가 양수에서 보다 높음을 알 수 있다. 이러한 측정에서 AFP와 PRL의 농도 측정은 신뢰성이 부족함을 나타낸다.

본 발명에 따르면 IGFBP-1의 감지한계를 조절함으로써 IGFBP-1의 고농도는 양성반응을 나타내고 양성결과는 양수에 존재하는 것을 유도할 수 있다. 이와같은 방식으로 낮은 농도의 양수에서의 IGFBP-1는 양수가 혈액과 소량 혼합될 경우에라도 관측될 수 있다.

감지한계는 매우 약한 시그날을 내는 라벨을 사용함으로써 적절히 조절할 수 있는데, 시료내에 혈액 또는 다른 분비물에 의한 IGFBP-1의 저농도는 양성으로 해석되지는 않는다. 감지한계에 강한 시그날을 이용할 경우에는 시료를 희석하면 된다. 사용된 시그날은 새료내에 IGFBP-1 농도가 모체혈청에 있는 공지된 농도보다 낮을 경우에 항성 음성으로 해석될 수 있도록 된다.

또한, 임신하지 않은 여성과 임산부의 질분비물, 정액 또는 뇨에서의 IGFBP-1의 농도는 양수의 것에 비해 상당히 낮은 것으로 밝혀졌다. 그러므로, 이 테스트는 사용된 시험조건에서 양수이외의 다른 기원의 IGFBP-1은 가양성을 나타내지 않도록 계획될 수 있다. 표 1에서 볼 수 있는 것과 같이 모체혈청에서 관측된 IGFBP-1의 최고 농도는 600㎍/1이고 양수에서의 최저농도는 22000㎍/1이다. 결과적으로, 시료에서 양수농도가 통상적인 양수에 있는 IGFBP-1 농도의 약 10% 정도로 작은 2200㎍/1 일때, 이 농도는 모체혈청에서의 최고농도의 약 3배이상이 된다. 양수에서의 가장 빈번한 IGFBP-1 농도는 통상적으로 22000㎕/1 보다 높고 결과적으로 모체혈청의 농도는 600㎍/1 보다 상당히 낮다.

질분비물의 소량(100-200㎕)으로도 이 테스트를 실행하는데는 충분하다. 시료는 이 테스트의 목적에 적합하도록 고안된 1회용 주사기 또는 멸균기구를 이용하여 관경관찰을 하면서 취하는 것이 적절하다.

IGFBP-1의 분자크기는 약 2500 D 정도로 크기 때문에 면역학적 검사법에 이용하는 항체에 사용이 가능하다.

따라서, 본 발명의 방법은 IGFBP-1에 대한 항체 또는 IGFBP-1의 특이적 결합물질의 이용을 기초로 한다. 이 방법은 신속하고, 농도의 적정범위를 이용할 수 있어, 본 발명의 목적 즉, 질내에 양수의 존재를 중명함으로써 양막의 파열을 감지하는 진단에 이용할 수 있다.

본 발명에 따른 IGFBP-1의 적절한 검사방법을 이용하여 이 검사범위내에 충분히 높은 농도로 있는 경우 양수 이외에는 존재하지 않으므로 질에서의 양수를 감지하는 것이 가능하다. 그러므로, 다른 IGFBP-1에서의 오염으로 인한 가양성의 결과는 나타나지 않는다.

본 발명의 구체예에서 측정범위를 조절하여 혈액에서의 IGFBP-1가 가양성을 유도하지 않는다. 따라서 이 테스트는 양막을 통한 통상적인 소량의 양수 누출로 인한 가양성의 결과를 일으키지 않도록 하다. 테스트에 사용된 결합물질은 특이적으로 IGFBP-1에 소위 교차반응에 의해 특이적으로 결합한다.

한편, 양수에서의 IGFBP-1의 농도는 양막파열과 연관된 누수일 경우 상당히 높기 때문에 본 발명에 따라 감지할 수 있다. 테스트에는 고친화력으로 IGFBP-1에 결합하는 특이적 결합물질을 이용하여 시료내에 있는 소요의 IGFBP-1 농도에서 시작해도 양성판단을 할 수 있을 정도로 신속하게 진행된다.

이 테스트를 개발할때, 후크효과를 제거되었다. 이 효과는 면역학적 반응에서 항원농도가 항체농도와 비교하여 높은 경우에 측정된 항원-항체 복합물은 허위적으로 감소되는 경우가 있다. 이 경우 시료에서의 고농도는 상대적으로 낮게되어 검사는 가음성의 결과로 나타나 위험하게 된다. 이 이유로, 본 발명에 따른 테스트 방법의 개발시에 IGFBP-1과 결합물질의 비를 조절하여 양수에서의 공지된 최고농도가 음성으로 나타나 허위해석이 일어나지 않도록 하였다. 이와 같은 허위음성결과의 위험성은 본 발명의 방법에는 근본적으로 제거되었다.

본 발명에 따른 IGFBP-1 테스트는 가능한한 본 발명의 진단을 실행하는데 의학적으로나 경제적으로 중요한 신속성을 제공할 수 있도록 개발되었다. 요구되는 시료는 본 발명의 목적에 맞게 제조된 샘플형 기구 또는 주사위로 양막의 파열이 의심스러울 경우 내관경 검사를 하면서 채취한다.

본 발명의 구체예에 따르면, 시료에서의 IGFBP-1과 특이결합물질의 농도비는 본 발명에 맞게 적절히 조절하여 IGFBP-1 농도가 시료에서 높을 경우에만 나타나는 양성 시그날이 생성되도록 한다. 이 테스트를 실행하기 전에 진단을 위한 분비시료를 희석함으로서 정확한 농도비를 얻을 수 있다. 시료의 희석은 테스트에 이용되는 용액으로 실행한다. 용액은 생리적 pH에 근접하고 보호 단백질이 포함된 인산 완충액과 같은 완충액이 적절하다.

실행된 테스트에서 희석은 적어도 1:20배, 적절하게는 1:20일 경우 신뢰성있는 결과를 나타내었다. 1:500 또는 이 이상의 희석도 가능함. 본 발명에 따른 결과를 얻기 위해서 희석배수는 중요하지 않으며, 모체혈액에 있는 IGFBP-1이 선택된 범위내에서 양성결과를 줄 수 있다.

본 발명에 따르면, IGFBP-1 테스트는 두가지 특이적 단클론 항체, 예로서, 한항체는 작은 플라스틱 비드에 결합되어 있고 다른 항체는 HRP와 같은 효소로 라벨된 것을 이용한다. 적절히 희석된 시료, 효소-라벨된 항체 그리고 항체-피복된 비드를 시험관에 넣는다. 혼합물을 배양하면, 시료내에 있는 IGFBP-1은 비드에 결합되고, 다른 한쪽은 라벨된 항체에 결합된다. 배양후, 비드를 튜브에서 제거하고, 흐르는 물로 세척한다. 비드는 라벨로 사용되는 효소를 포함하는 튜브에 위치한다. 시료내에 충분한 량의 IGFBP-1이 포함되어 있는 경우에는 배양동안에 눈으로 감지할 수 있는 발색반응이 일어나고, 시료내에 IGFBP-1이 없거나 농도가 너무 낮은 경우에는 무색으로 남아있게 된다.

본 발명에 따른 IGFBP-1 테스트는 본 발명의 목적에 맞게 개발된 막표면에 제1항체가 결합되도록 실행한다. 시료는 막과 접촉하게 되고, 시료내에 IGFBP-1은 고정된 항체에 특이적으로 결합하게 된다. 결합된 항체에 상응하는 효소를 첨가하고, 다시 막에 있는 IGFBP-1에 결합하게 된다. 결합된 효소는 세척된 막에 첨가함으로써 감지되고 기질과 효소의 침전이 효소반응의 결과로 색을 변하게 한다. 시료가 양성일 경우, 막에는 발색반응이 나타난다. 항체피복된 막을 기초로 하는 이와같은 테스트는 이 목적에 맞게 만들어진 플라스틱 용기에 막을 부착함으로써 실행할 수 있다. 막에 액체를 주입하면 막아래 있는 흡수물질이 막을 통한 테스트액을 신속히 흡수하게 된다. 결과적으로 막은 플라스틱 스트립에 부착되어 있다.

양성을 나타내는 색은 효소와 항체의 라벨링보다는 기질의 색의 변화로 생성된 것이다. 효소대신에 염료가 항체에 결합하게 된다. 염료의 강도는 충분히 강하여 양성인 경우에는 고정된 IGFBP-1에 결합된 라벨의 색을 감지할 수 있다. 이와 같은 염료는 금 또는 셀레니움 클로이드 분산염료등이 이용될 수 있다. 이 테스트를 실행하는데 있어서, 이와 같은 염료의 장점은 별도의 기질반응이 필요하지 않다는 것이다. 결과적으로, 항체는 발색 라텍스 입자와 결합하게 된다. 직접적인 발색으로 감지하는 방법이 이용되는 경우 면역 크로마토그래피성 신속 검사법이 IGFBP-1에 이용될 수 있다. 일반적으로 막이 이용되는 경우 제1항체가 작은 구역에 부착되게 되고, 다른 지역에는 제2발색-라벨된 항체가 건조되어 있다. 제2항체는 액체 시료를 첨가했을 때 막으로 이동하기 시작한다. 시료에 충분한 양의 IGFBP-1이 포함되는 경우에 발색부위는 항원이 라벨된 항체에 결합되고 다시 막에 고정된 항체에 결합되는 점에서 나타난다. 시료가 음성인 경우, 발색부위가 나타나지 않고 염료는 막으로 이동한다.

IGFBP-1 테스트는 응집원리에 의해 실행될 수도 있다. 눈으로 감지할 수 있는 반응은 시료내에 있는 항체피복된 라텍스와 같은 입자와 항원사이의 결합으로 인한 응집으로 구성된다. 또한 응집의 저해도 감지할 수 있다.

본 발명에 따른 방법과 테스트키트에는 항체 뿐만 아니라 IGFBP-1에 특이적으로 결합하는 물질과 이들의 복합물이 사용될 수도 있다. 이와같이, IGF에 대한 IGFBP-1의 자연적 결합특징이 개발될 수도 있다.

이 테스트를 실행하는데 있어서, FI-특허 84863에 설명된 검사방법이 이용될 수도 있다.

본 발명에 따른IGFBP-1 테스트 방법은 결정적인 방법으로 양막의 파열과 연관된 문제를 용이하게 한다. 양막의 파열후, 감염의 위험때문에, 환자는 분만까지 진찰이 요구된다. 양막이 조기 파열되었음이 염려되는 경우, 환자는 병원에 입원하거나 또는 집에서 요양해야 한다. 이는 경제적으로는 비용문제와 의학적으로는 태아와 산모의 생명에 직접적인 영향을 주게된다.

본 발명에 따르는 테스트키트에는 IGFBP-1에 특이적으로 결합하는 시약이 포함되어 있다. 이 방법에 따라 시약은 결합용액이 될 수 있고 비드 또는 특이결합물질이 피복된 막과 같은 고형물이 될 수 있다. 예로써 1단계 검사에서 키트에는 전술한 성분물의 복합물이 포함될 수도 있다. 특이결합물질은 IGFBP-1에 특이적인 단클론 항체로 구성된다.

상기 언급한 시약에 추가하여 키트에는 결합반응후 시료에 있는 IGFBP-1의 농도를 감지할 수 있는 라벨이 포함된다. 라벨 감지 결합반응은 IGFBP-1에 또다른 항체가 결합된 시그날 발생라벨이다. 라벨은 예로써, IGFBP-1에 결합되는 또다른 항체와 연결된 효소, 방사능 동위원소 또는 색에 인지되는 성분물등이 된다. 라벨이 효소인 경우 테스트키트에는 효소기질이 포함된다.

기본적인 시약에 추가하여 테스트키트에는 시료를 희석하는 희석용액이 포함된다. 이 용액은 생리적 pH에 근접한 pH를 가지고 보호성 단백질이 포함된 인산 완충액과 같은 테스트 완충액으로 구성된다. 희석 완충액의 양을 조절하여 일정량의 시료에 첨가할 경우 최종 희석비 1:20을 얻을 수 있다.

테스트키트에는 본 테스트에 맞게 개발된 기구 또는 1회용 멸균 주사기와 같은 샘플링 기구가 포함된다.

테스트키트에는 질분비물 시료를 취하는 간단한 기구와 테스트를 실행할 수 있는 희석 용액이 포함된다. 테스트키트에는 환자가 직접 질내로 삽입할 수 있는 항체 피복된 테스트 스트립이 포함될 수도 있다. 이와같은 테스트키트는 집에서 양막파열이 의심가는 경우, 병원에 가는 것을 결정할 수 있는 홈테스트용으로 적합하다.

다음의 실시예는 본 발명을 설명하기 위함이며, 본 발명을 이에 한정시키는 것은 아니다.

플라스틱 비드에 항-IGFBP-1 항체(6305, Medix Biochemica)로 피복시킨다. 또다른 항체 IGFBP-1(6303, Medix Biochemica) was coupled with a label enzyme (horseradish peroxidase, HRP)은 라벨 효소(HRP)와 결합시킨다. 0.3% BSA를 포함하는 인산 완충액을 검사용 완충액으로 이용하였다. 완충액에는 계면활성제와 안정제를 포함하며, pH 값은 7.4이다. 신속한 IGFBP-1 검사는 다음과 같이 실행한다.

1. 6303-HRP-라벨된 200㎕을 시료튜브에 넣는다(diluted 1:50 in assay buffer).

2. 시료(diluted 1:20 in assay buffe) 100㎕를 튜브에 첨가한다.

3. IGFBP-1 항체 피복된 비드를 튜브에 넣고, 5분간 배양시킨다.

4. 용액에서 비드를 제거하고, 30초간 흐르는 물에 세척한다.

5. 세척된 비드는 기질용액(2,2'-아지노-디-[3-에틸-벤즈티아졸린설포네이트(6)], ABTS) (400㎕)에 옮긴다.

6. 튜브는 빛을 차단하고, 5분간 방치한다.

7. 용액의 색을 즉시 검사하거나 또는 반응을 멈춤용액(200㎕)을 첨가하여 정지시키고 검사하다. 무색용액은 음성, 녹색용액은 양성.

비교와 적절한 희석을 위해, 테스트는 실시예 1의 과정에 따라 시행하고 시료는 양수가 되며 IGFBP-1 농도는 200000㎍/1이며, 1:20, 1:100, 1:500 그리고 1:2500 으로 희석하고 혈청시료는 IGFBP-1 농도는 100㎍/1 이상이고, 테스트전에 1:20으로 희석한다.

일반적인 흡수도는 다음과 같다.

[실시예 2]

니트로세룰로스 스트립에 소폭으로 IGFBP-1항체(6305, Medix Biochemica)로 피복된다. 발색된 라텍스 입자도 또다른 항체 IGFBP-1(6303, Medix Biochemica)으로 피복한다. 피복된 라텍스 입자는 항체가 포함된 스트립의 단부에서 건조된다. 신속한 IGFBP-1 테스트는 다음과 같다.

IGFBP-1의 테스트 실행은

1. 완충액으로 희석된 시료 몇방울을 스트립에 피펫링하다. 이때 라텍스 입자는 건조되어 있다.

2. 수분간 배양동안에 시료는 막으로 이동되고, 라텍스 입자는 스트립 단부에 있는 항체 피복부위로 이동된다.

3. 스트립을 검사한다. 발색부위가 형성된 경우 양성이 된다.

[실시예 3]

나일론막의 일부를 IGFBP-1 항체(6305, Medix Biochemica)로 피복한다. 피복된 막은 플라스틱 컵용기에 두고 그바로 아래에 흡수물질을 부착시킨다. 또다른 항체 IGFBP-1(6303, Medix Biochemica)은 라벨된 효소와 결합시킨다. 신속한 IGFBP-1 테스트는 다음과 같이 실행한다.

1. 완충액으로 희석된 시료 몇방울을 막에 피펫팅하고, 막을 통해 용액이 흡수되도록 한다.

2. 컵에 세척액(1ml)을 피펫팅하고, 용액이 막을 통해 흡수되도록 한다.

3. 라벨된 용액 몇방울을 피펫팅하고, 용액이 막을 통해 흡수되도록 한다.

4. 세척용액 1ml 정도를 피펫팅하고, 용액이 막을 통해 흡수되도록 한다.

5. 효소의 침전물질을 막에 피펫팅하고, 용액이 막을 통해 흡수되도록 한다.

6. 막을 검사한다. 발색부위가 형성된 경우 양성이 된다.

본 발명에 따른 테스트는 하나의 예일 뿐이며, 본 기술분야에 숙지된 자는 본 명세서와 청구범위 영역내에 다양한 변화와 수정이 가능함을 인지할 것이다.

Claims (13)

1. 질분비물에 있는 특정 단백질을 정량함으로써 양막파얼을 감지하는 진단방법에 있어서, 감지된 단백질은 인슐린 유사성장인자 결합단백질-1, (IGFBP-1)이고 질분비물내에 있는 IGFBP-1에 특이적인 적어도 하나이상의 IGFBP-1 결합물질을 이용하여 시료내에 있는 IGFBP-1의 농도가 양수가 아닌 다른 지역에서 유도된 IGFBP-1의 최소치 이상일 경우 양성 결과를 나타내는 것으로 구성된 양막파열시 IGFBP-1을 정량하는 것을 특징으로 하는 양막파열 감지 진단방법.
2. 제1항에 있어서, 사용된 특이 결합물질이 IGFBP-1에 대한 항체인 것을 특징으로 하는 진단방법.
3. 제2항에 있어서, 항체가 단클론 항체인 것을 특징으로 하는 진단방법.
4. 전술한 어느 한 항에 있어서, IGFBP-1 결합물질과 라벨된 결합물질에 기초한 시약을 이용하여, 시그날을 감지하는 것을 특징으로 하는 진단방법.
5. 전술한 어느 한 항에 있어서, 테스트를 실행하기 전에 시료내에 IGFBP-1 농도를 감소시키기 위해 질분비물 시료를 희석시키는 것을 특징으로 하는 진단방법.
6. 제5항에 있어서, 희석은 1:10, 적절하게는 1:20인 것을 특징으로 하는 진단방법.
7. 제1,2 또는 3항에 있어서, 라벨된 시약을 사용하고, 측정된 IGFBP-1의 농도가 충분히 높은 경우에만 양성 시그날이 나타나는 것을 특징으로 하는 진단방법.
8. 양막파열을 진단하기 위한 테스트키트에 있어서, IGFBP-1에 특이적으로 결합하는 물질이 포함된 한가지 이상의 기질을 포함하고 질분비물에서 양막파열로 인한 IGFBP-1의존재를 감지하며 테스트키트는 시료내에 있는 IGFBP-1의 농도가 양수가 아닌 다른 지역에서 유도된 IGFBP-1의 최소 농도 이상인 경우 양성결과가 나오도록 조절된 것으로 구성된 것을 특징으로 하는 테스트키트.
9. 제8항에 있어서, 결합반응을 감지하는 라벨이 추가 포함되는 것을 특징으로 하는 테스트키트.
10. 제9항에 있어서, 라벨에 의해 발생되는 시그날의 강도가 양수에 있는 IGFBP-1이 고농도일 경우에만 양성 반응이 나타나도록 조정된 것을 특징으로 하는 테스트키트.
11. 제8,9 또는 10항에 있어서, 시약에는 IGFBP-1에 특이적인 결합물질로써, 특이 IGFBP-1 항체, 적절하게는 단클론 항체가 포함된 것을 특징으로 하는 테스트키트.
12. 제9항 또는 10항에 있어서, 결합반응을 감지하는 라벨이 다른 IGFBP-1 결합물질과 복합된 시그날 발생물질인 것을 특징으로 하는 테스트키트.
13. 제8항에 있어서, 특이 결합물질에 기초한 시약은 고형상 또는 불용성 입자에 결합된 결합물질 또는 결합물질 용액으로 구성된 것을 특징으로 하는 테스트키트.