PT1535068E - DISPOSITIVOS E MéTODOS PARA DETECTAR FLUIDO AMNIËTICO EM SECREÎES VAGINAIS - Google Patents

Description

ΕΡ1535068

DESCRIÇÃO

DISPOSITIVOS E MÉTODOS PARA DETECTAR FLUIDO AMNIÓTICO EM

SECREÇÕES VAGINAIS

CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se a um método de diagnóstico para a detecção precisa de pequenas quantidades de fluido amniótico na vagina. Em particular, a invenção refere-se à utilização de anticorpos monoclonais especificamente seleccionados que se ligam especificamente a oq- microglobulina placentar. Mais especificamente, a presente invenção refere-se à selecção de um par de anticorpos anti-PAMG-1 ("par básico") que proporciona uma sensibilidade suficiente para a detecção da concentração PAMG-1 de fundo mínima na secreção vaginal da mulher grávida. Adicionalmente, a presente invenção refere-se a um sistema de imunoensaio em fase sólida que compreende anticorpos PAMG-1, em que uma combinação de dois ou mais anticorpos anti-PAMG-1 está imobilizada no suporte de fase sólida do dispositivo, para estabelecer com precisão um nível limiar de sensibilidade pré-definido.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO A ruptura prematura da membrana fetal (saco amniótico) ocorre em cerca de 10% das mulheres grávidas e quando não tratada prontamente é a causa de cerca de 10% de todas as mortes perinatais. O termo PROM (ruptura prematura das membranas fetais) refere-se à ruptura espontânea das membranas, 24 horas ou mais antes do início do trabalho de 1 ΕΡ1535068 parto, quer de termo, quer pré-termo. PPROM refere-se à ruptura prematura de membranas pré-termo. Aproximadamente cerca de 30-50% destas rupturas prematuras ocorrem antes da 37a semana de gravidez. Nestes casos, o diagnóstico definitivo da ruptura é extremamente importante, uma vez que a PROM está associada com um aumento significativo do risco de uma infecção intra-uterina e perturbação do desenvolvimento do sistema pulmonar fetal. A penetração intra-uterina destas infecções aumenta quer a morbilidade, quer a mortalidade materna e perinatal em cerca de 10 porcento. O diagnóstico imediato de uma ruptura às 38 a 40 semanas de gravidez é crucial, uma vez que sendo a PROM detectada, o parto deverá ser induzido o mais rápido possível. O diagnóstico de ruptura também é importante antes das 37 semanas de gravidez pois permite e prevenção de uma infecção intra-amnio e o estímulo do desenvolvimento pulmonar fetal. Não uma "regra de ouro" disponível para o diagnóstico de ruptura de membrana. A PROM é uma entidade dinâmica, pelo que o intervalo entre a ruptura de membrana e a implementação da modalidade de diagnóstico, a presença de perdas "elevadas", perdas intermitentes, variações na incidência de PROM em relação às populações e considerações sobre o material que tem a capacidade de interferir com os resultados de teste são factores que quando não tidos em consideração resultam num registo não preciso. Estas imprecisões podem levar a erros em estudos de interpretação que têm por objectivo revelar a melhor ferramenta para a identificação da PROM. O diagnóstico de PROM tem-se baseado tradicionalmente na descrição por parte da paciente da ocorrência de descarga de fluidos pela vagina. O exame físico tem a capacidade de fazer 2 ΕΡ1535068 o diagnóstico de forma inequívoca; no entanto, por vezes o que se encontra no exame é internamente inconsistente ou equívoco. Esta situação obriga à necessidade de testes de diagnóstico confirmativos (Lockwood C. J. et al., Am. J. Obstet. Gynecol., 1994, v. 171, No 1, pp. 146-150). Vários métodos, todos eles insuficientes, são actualmente utilizados para detectar fluido amniótico na vagina, tais como o teste de Fern (M. L. Friedman and T. W. McElin, "Diagnosis of Ruptured Fetal Membranes", American Journal of Obstetrics and Gynecology 1969, Vol. 100, pp. 544-550). Este método baseia-se na detecção do fluido amniótico por observação da referida arborização quando o fluido amniótico seca sobre uma lâmina. Este método, no entanto, não é suficientemente preciso, uma vez que se baseia nas propriedades altamente voláteis do fluido amniótico na vagina. Pode produzir resultados falsos em tanto quanto 30 porcento dos casos.

Foi também proposto detectar a ruptura da membrana fetal utilizando vários corantes: azul do Nilo, laranja de acridina, azul de bromotimol, nitrazina, etc. (M. L. Friedman and T. W. McElin, supra). Esta abordagem é inconveniente e tem desvantagens relacionadas com a volatilidade das propriedades químicas do fluido amniótico na vagina e algumas misturas possíveis com este. Por exemplo, uma infecção vaginal pode influenciar os resultados dos testes acima referidos. Um estudo anterior sobre os testes de Nitrazina e Ferning que actualmente são utilizados indicou que estes testes têm taxas de imprecisão elevadas que aumentam progressivamente quando já passou mais de uma hora desde a ruptura de membranas e são inconclusivos após 24 horas. O estudo conclui que nos casos de PROM prolongada estes testes não fornecem uma melhor informação de diagnóstico do que a que se obtém por simples 3 ΕΡ1535068 avaliação clínica (Gorodeski I. G, Haimovitz L., Bahari C. M., Journal Perinat. Med, 1982, v. 10, No 6, pp. 286-292). Dados mais recentes (Trovo S. et al., Minerva Girzecol. 1998, v. 50, No 12, pp. 519-512) sobre os testes são: O teste de Nitrazina apresenta uma sensibilidade de 70%, especificidade de 97%, precisão de 90%; O teste de Ferning apresenta uma sensibilidade de 70%, precisão de 93%.

Foi proposto recentemente detectar a ruptura de membranas fetais com base numa análise imunoquímica das proteínas no fluido amniótico. A análise imunoquímica com ligação utiliza as seguintes proteínas do fluido amniótico para detectar uma ruptura de membranas: alfa-fetoproteina, prolactina, fibronectina, e proteína 1 de ligação ao factor de crescimento do tipo insulina, ver B. L. Rochelson et al, "Rapid Assay-Possible Application in the Diagnosis of Premature Rupture of the Membranes", em Obstetrics and

Gynecology, 1983, v. 62, pp. 414-418; P. R. Koninckx et al., "Prolactin Concentration in Vaginal Fluid: a New Method for Diagnosing Ruptured Membranes", British J. Obstetr. Gynecol., 1981, v. 88, pp. 607-610; P. Hellemans, et al., "Preliminary Results with the Use of the ROM Check Immunoassay in the Early Detection of Rupture of the Amniotic Membranes", Eur. J. Obstet. Gynecol. Reprod. Biol., 1992, v. 43 (3), pp. 173-179 ; Rutanen, E. M., et al., "Measurement of Insulin-like Growth-Factor binding Protein-1 in Cervical/Vaginal Secretions: Comparison with the ROM Check Membrane Immunoassay in the Diagnosis of Ruptured Fetal Membranes", Clin. Chie. Acta., 1993, v. 214, pp. 73-81. 4 ΕΡ1535068

Rutanen, E. M. , et al. desenvolveram mais tarde um teste cromatográfico utilizando uma membrana cromatográfica posicionada ao contrário (FI-84863; Patente US 5554504).

Os métodos que se baseiam na detecção de alfa-fetoproteína (AFP) e prolactina (PRL) não são fiáveis, uma vez que a razão entre sangue/fluido amniótico das proteínas AFP e PRL tem predisposição para variações significativas. A AFP e PRL estão presentes no fluido amniótico em concentrações elevadas apenas durante o segundo trimestre de gravidez. A razão das concentrações de proteína amniótica/soro para ambas as proteínas é de apenas cerca de 3 a 4 no termo.

Outro método baseado na detecção de fibronectina fetal nas secreções vaginais também se revelou insatisfatório. Por exemplo, a presença de fibronectina fetal pode ocorrer mesmo na ausência de ruptura da membrana fetal (P. Hellemans, et al., "Preliminary Results with the Use of the ROM Check Immunoassay in the Early Detection of Rupture of the Amniotic Membranes", Eur. J Obstetr. Gynecol. Reprod. Biol. 1992, v. 43 (3), pp. 173-179; C. Lockwood, et al., "Fetal Fibronectin in Cervical and Vaginal Secretions as a Predictor of Preterm Delivery", New England Journal of Medicine, 1991, v. 325, pp. 669-674), produzindo desse modo resultados falso positivos.

Todos estes métodos para detectar a ruptura da membrana fetal, baseados na detecção de alfa-fetoproteína, prolactina, e fibronectina, são imprecisos devido a factores variáveis no controlo da concentração destas proteínas no fluido amniótico e da concentração relativa destas proteínas no fluido amniótico em relação à do sangue. 5 ΕΡ1535068

Tal como para a actualização do teste de IGFBP-1, há dados contraditórios em relação à sua especificidade e precisão. Um teste de tira rápido (teste de PROM da OY Medix Biochemica, Finlândia, também designado Amni-check, MAST Diagnostica, Alemanha), foi desenvolvido para detectar a presença de IGFBP-1 nas secreções vaginais (Rutanen EM, Karkkainen TH, Lehtovirta J., Uotila JT, Hinkula MK, Hartikainen AL. "Evaluation of a rapid strip test for insulin-like growth factor binding protein-1 in the diagnosis of ruptured fetal membranes", Clin Chim Acta 1996 Sep 30; v. 253 (1-2), pp. 91-101). E. Rutanen referiram que o limite de detecção do teste foi estabelecido de modo a que concentrações de IGFBP-1 inferiores a 400 ng/ml na secreção cervical (abaixo do 95° percentil dos níveis de IGFBP-1 no soro da mulher grávida) deverão permanecer negativas. No entanto, em casos com hemorragia, o resultado do teste deve ser interpretado com cuidado, dado que o sangue directamente do leito placentar pode conter quantidades mais elevadas de IGFBP-1 do que o sangue dos vasos sanguíneos cervicais.

Todas as amostras (n=55) em mulheres com PROM clinicamente confirmada apresentavam um resultado positivo e 71 das 75 amostras recolhidas de mulheres assintomáticas eram negativas, de acordo com o teste. De entre este conjunto de amostras, o teste tinha sensibilidade de 100% e especificidade de 94,7%. Este facto pode ser explicado por especificidade insuficiente (reactividade cruzada) do anticorpo monoclonal utilizado no primeiro passo do teste.

De entre os 181 pacientes avaliados por PROM suspeita, mas equívoca após exame inicial, o teste era positivo em 64 casos e negativo em 117 casos. Cinquenta de 64 pacientes 6 ΕΡ1535068 positivos (78,1%) deram à luz antes das 37 semanas de gestação, 42 (65,6%) no espaço de 2 semanas após a amostragem. Cinco de 117 pacientes com um resultado de teste negativo tiveram uma cesariana electiva por motivos não relacionados com a PROM. Entre os outros 112 pacientes, 102 (91,1%) deram à luz no termo e 10 (8,9%) deram à luz antes das 37 semanas, sete das quais (6,3%) no espaço de duas semanas após a amostragem (E. Rutanen et al. 1996). Infelizmente, não há dados referentes à sensibilidade e especificidade do teste de PROM em mulheres com diagnóstico inequívoco de PROM.

Num estudo de W. Woltmann, utilizou-se Amni-check para detectar IGFBP-1 em 150 espécimes de fluido amniótico e 50 amostras de secreção vaginal de mulheres com PROM clinicamente não confirmada. O teste tinha uma sensibilidade de 97% e uma especificidade de 100% (Woltmann W. et al., Z. Gebursh. Neonatal, 1995, v. 199, pp. 243-244). V. Ragosh avaliou a precisão de diagnóstico do teste

Amni-check nas 75 amostras de secreção vaginal. O teste mostrou uma sensibilidade de 100% e uma especificidade de 83%.

Alguns investigadores referiram que a taxa de falsos positivos era fortemente dependente da actividade de trabalho de parto. Em mulheres com contracções uterinas, o teste tinha uma especificidade de 59% (Ragosch, V. et al., Geburtsh. U.

Frauenheililk., 1996, Vol. 56, pp. 291-296).

Num estudo de E. Darj e S. Lyrenas (Acta Obstet. Gynecol. Scan. d., 1998, v. 77, pp. 295-297), o teste de PROM tinha uma sensibilidade de 95,7% e uma especificidade de 93,1% entre os pacientes com diagnóstico clinicamente confirmado 7 ΕΡ1535068 (mulheres com ruptura óbvia das membranas ou mulheres com membranas intactas). No entanto, a sensibilidade e especificidade do teste PROM eram de apenas 70,8% e 88,2%, respectivamente, nas pacientes com suspeita de PROM. Esta discrepância podia ser explicada pelo limite de exclusão do teste (400 ng/ml), que torna impossível detectar uma pequena quantidade de fluido amniótico em secreções vaginais de pacientes com diagnóstico equívoco (por exemplo, no caso de uma ruptura pequena).

Assim, um nível de fundo significativo de IGFBP-1 vaginal em mulheres com membranas intactas e um limiar de exclusão elevado do teste podem prejudicar a sua sensibilidade e especificidade e assim ter impacto na precisão do teste em pacientes com um diagnóstico equívoco. As misturas de soro sanguíneo e/ou exsudado inflamatório também poderão ter impacto na precisão do teste (ver dados de E. Darj et S. Lyrenas, acima) . O autor deste teste não estudou este assunto.

Na tentativa de evitar alguns dos reveses acima referidos, utilizaram-se dois anticorpos monoclonais contra dois sítios de ligação para factores de crescimento do tipo insulina, para detector a fracção não ligada de oíi-microglobulina de placenta (patentes US 5968758; 5597700; 5891722; 5877029).

Nestas patentes, a identidade das duas proteínas, PAMG-1 e IGFBP-1, foi assumida sem fundamento. De facto, esta assunção apenas se baseou na comparação da estrutura primária e genes destas proteínas. 8 ΕΡ1535068

Nas patentes acima referidos, não foi possível estabelecer o limiar de sensibilidade deste teste de modo a se obter o grau mais elevado de precisão possível (99% ou acima). 0 problema comum destes testes é o nível de fundo e a variabilidade da concentração de fundo da substância detectada. Por exemplo, o nível de fundo de outra proteína, a IGFBP-1, na secreção vaginal de mulheres grávidas, varia numa gama alargada de 0,5 a 90 ng/ml (ver estudos de Rutanen) . O segundo ponto importante é a possibilidade de misturas de exsudados de inflamação ou soro sanguíneo contendo substâncias detectadas na secreção vaginal. Isto pode originar resultados falso positivos. A proteína PAMG-1 foi primeiro descrita por D. Petrunin (Petrunin D. et al, Akusherstvo i Ginekologia, 1977, No. 1, p. 64, em Russian; ver também PMID: 65924 (PubMed-indexado para a MEDLINE: "Immunochemical Identification of organ specific human placental alpha-globulin and its concentration in amniotic fluid", Akusherstvo i Gynekologia (Moscovo) 1977 Jan, Vol. 1, p. 64)). Obtiveram-se anticorpos contra a proteína purificada e isolada e métodos imunoquímicos permitiram medir os teores da proteína no fluido amniótico (incluindo fluido amniótico recolhido da vagina) em diferentes fases da gravidez. Também se mediu a concentração da proteína no sangue e diferentes órgãos do feto e adulto.

Este grupo de pesquisa continuou a publicar novos resultados sobre a proteína durante os anos subsequentes, até 1990 (Petrunin, D. et al, "Comparative Study of Four Placental Protein During Gestation", Akusherstvo i Ginekologia, 1988, No. 1, pp. 50-52; Zaraisky, E. et al, Voprosy Med. Khemii, 1989, No 5, pp. 131-132; Tatarinov, Y. 9 ΕΡ1535068 et al, UspekAi Sovr. Biologii 1990, Vol. 109, pp. 369-373;

Boltovskaya, M. et al, Bulletin of Experimental Biology and Medicine, 1991, No. 7, pp. 397-400; Nasimova, S. V. et al, Bulletin of Experimental Biology and Medicine, 1993 Sep; Vol. 116, No. 9, pp. 302-304 (todos estes artigos estão em russo com resumos em inglês). D. Petrunin obteve o Certificado de Invenção no método de isolamento de PAMG-1 (# SU-1614184 Al, ano de prioridade 1988).

Em 1988-89 foram publicados alguns artigos que mostram em detalhe a sequência parcial e total de proteínas semelhantes, as proteínas de ligação ao factor de crescimento do tipo insulina (IGFBP), obtidas a partir de fluido amniótico, de placenta e de hepatoma humano (Bell S et al, 1988; Luthman H. et al, 1989; Julkunen et al, 1988; Lee, Y. et al, 1988) . O gene foi localizado na porção 7pl4-7pl2 do 7o cromossoma humano. Antes de 1991, os investigadores utilizaram diferentes nomes para esta proteína: oq-PEG, PP-12, IGFBP, BP-25, etc.

Em 1980-82, Bohn isolou uma proteína da placenta e designou-a por PP-12. Neste artigo, ele comparou PP-12 com a proteína PAMG-1, descoberta mais cedo e discutiu as semelhanças e diferenças entre elas.

Em contradição com outras publicações de investigação, o artigo de Bell et al (1988), revelam que encontraram um polimorfismo no péptido de terminal-N da proteína oíi-PEG, nomeadamente na 11a e 12a posições e concluíram que havia, na realidade, duas proteínas diferentes, em vez de uma. 10 ΕΡ1535068 S. Bell mais uma vez faz referência ao seu próprio artigo a respeito das duas proteínas diferentes cg-PEG no fluido amniótico. Este artigo aceita a decisão do comité de nomenclatura de 1990 das proteínas de ligação (Report on the Nomenclature of the IGF Binding Proteins, Journ. Clin. Endocr And Metabol. 1990,70, # 3, p. 817), que decidiu que as proteínas AFBP, PP- 12, αι-PEG, GH-Protein, proteínas de ligação 28, 26, 25, JB-1 são idênticas e deram a todas o nome geral hIGFBP-1.

Utilizou-se uma designada PAMG-1 livre para detectar a ruptura da membrana fetal. No entanto, como referido acima, não foi criado nenhum teste com precisão elevada (> 99 %). Este objectivo foi conseguido mais tarde com o nosso novo método e dispositivo, descritos no presente pedido. A presente invenção utiliza um método de selecção de um par de anticorpos monoclonais para proporcionar sensibilidade suficiente para detectar uma concentração muito baixa de PAMG-1 na secreção vaginal e também envolve a selecção de alguns outros anticorpos anti-PAMG-1, que em combinação com os dois anticorpos mencionados acima, permitiram definir com precisão um limiar de sensibilidade pré-definido para o dispositivo de tiras. Isto, por sua vez, tornou possível minimizar a frequência de resultados falso positivos do teste A presente invenção teve início no estudo pioneiro de D. Petrunin, que separou e descreveu a alfa-microglobulina placentar e levou a cabo uma medição rigorosa da sua concentração no fluido amniótico, sangue e alguns tecidos, utilizando métodos imunoquímicos. Esta publicação é do domínio público e deve ser tida em conta por qualquer investigador. 0 método de separação de PAMG-1 foi protegido 11 ΕΡ1535068 por um certificado de autor oficial (#; SU-1614184 Al, ano de prioridade 1988), um equivalente de uma patente na antiga URSS.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se ao método para detectar uma pequena quantidade de fluido amniótico nas secreções vaginais durante a gravidez. A presente invenção refere-se a um método para detectar PAMG-l acima de uma concentração de fundo mínima da proteína amniótica PAMG-l na secreção vaginal de uma mulher grávida, que indica a presença de fluido amniótico.

Numa concretização específica, o método para detecção da proteína PAMG-l utiliza um par de anticorpos monoclonais especialmente seleccionado para detectar a concentração de fundo mínima da proteína PAMG-l na secreção vaginal a ser utilizado em combinação com pelo menos um anticorpo monoclonal anti-PAMG adicional, de modo a estabelecer com precisão um determinado limiar de sensibilidade do teste. A invenção também contempla a utilização de uma combinação de anticorpos de captura de PAMG-l num dispositivo de tira, para permitir um estabelecimento mais preciso do limiar de sensibilidade no método para detecção da proteína amniótica PAMG-l na secreção vaginal. Esta abordagem proporciona um maior controlo de sensibilidade e uma gama dinâmica do que a utilização de apenas um par de anticorpos seleccionado. 12 ΕΡ1535068

Verifica-se que o nível do limiar de sensibilidade do método mais adequado é próximo de 5 ng/ml, uma vez que o limite superior de PAMG-1 na secreção vaginal, que pode ser causado por inflamação, não excede 3 ng/ml e, por outro lado, o nível de fundo regular de PAMG-1 na secreção vaginal de mulheres grávidas saudáveis é de cerca de 0,2 ng/ml. A diferença significativa entre o nível de fundo e a concentração limiar da substância detectada minimiza os resultados falso negativos e falso positivos. Numa concretização, o primeiro passo para reconhecer a PAMG-1 amniótica ocorre na região de almofada do dispositivo de tira, onde está localizado o anticorpo especialmente seleccionado e marcado. O segundo passo da reacção ocorre na região de teste do dispositivo de tira de imersão, onde está imobilizado o segundo anticorpo do par seleccionado e de preferência pelo menos um anticorpo anti-PAMG-1 adicional.

Em resumo, descrevemos o método e dispositivo para detectar pequenas quantidade de fluido amniótico na vagina de uma mulher grávida. 0 método baseia-se de preferência, na selecção do par de anticorpos monoclonais contra oq-microglobulina placentar (PAMG-1). 0 objectivo de selecção foi, primeiro, medir uma concentração de fundo de PAMG-1 mínima na secreção vaginal. Tendo esta informação, qualquer técnica analítica capaz de detectar PAMG-1 acima do nível limiar pode ser utilizada para detectar fluido amniótico em secreções vaginais. Com base nesta informação, pode-se criar um dispositivo baseado na utilização do mesmo par e anticorpos adicionais, de modo a diminuir, e estabelecer com precisão, o limiar de sensibilidade do dispositivo e minimizar deste modo a probabilidade de resultados falso negativos e falso positivos. 13 ΕΡ1535068 São possíveis várias combinações de anticorpos de captura e seus fragmentos, ou combinações de quaisquer outras moléculas com as mesmas propriedades que as propriedades aqui especificadas.

Descreve-se um método que compreende o contacto de uma amostra que contém a proteína PAMG-1 e o anticorpo monoclonal, o primeiro do par seleccionado, que detecta selectivamente PAMG-1. Compreende também o anticorpo que forma o complexo anticorpo-PAMG-l e o passo de detecção do complexo anticorpo-PAMG-1 por outro anticorpo monoclonal do par. Por fim, compreende a medição quantitativa da concentração de fundo mínima de PAMG-1 na secreção vaginal da mulher grávida que não tenha ruptura da membrana amniótica. Este método é muitas vezes utilizado em testes da classe ELISA.

Ainda noutra concretização da presente invenção, o dispositivo implementa o contacto de uma amostra que contém a proteína PAMG-1 e um anticorpo monoclonal marcado, o primeiro do par seleccionado, que detecta selectivamente PAMG-1. Compreende ainda o anticorpo que forma um complexo anticorpo-PAMG-l, o fluxo lateral deste complexo e o passo de detecção do complexo anticorpo-PAMG-l por outro anticorpo monoclonal que reconhece PAMG-1, sendo o limiar de sensibilidade do dispositivo estabelecido na gama de 5-7 ng/ml, utilizando anticorpos adicionais com um maior rigor do que se consegue obter utilizando o par de anticorpos monoclonais que reconhecem PAMG-1. 14 ΕΡ1535068

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS A Figura 1 é uma vista seccional longitudinal, esquemática, de um dispositivo da invenção que pode ser utilizado para detector a presença de PAMG-1 de modo a diagnosticar a ruptura de uma membrana fetal; A Figura 2 é uma vista em plano do dispositivo da Figura 1.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO A presente invenção aborda os problemas acima referidos de detectar com precisão fluido amniótico em secreções vaginais, detectando concentrações muito baixas de oq-microglobulina placentar em secreções vaginais. Esta abordagem mostrou ser vantajosa devido a um nivel de fundo baixo (cerca de 0,2 ng/ml na secreção vaginal da mulher grávida) da concentração de PAMG-1. O ponto crucial da presente invenção era a selecção do anticorpo monoclonal para detectar a proteína a concentrações baixas, o que permite a quantificação destes valores e, por sua vez, permite a utilização de qualquer técnica analítica para detectar o nível de PAMG -1. Pode esperar-se a presença de PAMG-1 numa concentração baixa na secreção vaginal, uma vez que a permeabilidade da parede capilar para as proteínas do sangue depende de modificações pós-traducionais de proteínas e sua interacção com outras moléculas (Marinaro J. A. et al: 0-glycosylation delays the clearance of human IGF-binding protein-6 from the circulation; Eur J Endocrinol 2000, Maio; 142 (5): 512; Schneeberger E. E.: Proteins and vesicular transport in capillary endothelium; Fed Proc 1983 Maio 15; 42 15 ΕΡ1535068 (8): 2419-24; Minshall RD et al: Vesicle formation and trafficking in endothelial cells and regulation of endothelial barrier function; Histochem Cell Biol 2002 Feb; 117 (2): 105-12; Del Vecchio PJ et al: Endothelial monolayer permeability to macromolecules; Fed Proc 1987 Jun; 46 (8): 2511-5; Siflinger-Birnboim A et al: Selectivity of the endothelial monolayer: effects on increase permeability; Microvasc Res 1998 Nov; 36 (3): 216-27; Ghinea N, Milgrom EA new function for the LH/CG receptor: transcytosis of hormone across the endothelial barrier in target organs; Semin Reproduct Med 2001 ; 19 (1) : 97-101) . De entre as moléculas PAMG-1 que sofreram as modificações pós-traducionais ou estabeleceram uma ligação não covalente com outras moléculas, estão aquelas cuja penetração na secreção vaginal é mínima. A concentração destas moléculas na secreção vaginal deverá ser baixa, salvo se houver uma fuga no saco amniótico. A heterogeneidade das moléculas PAMG-1 também pode ser o resultado de corte e rearranjo alternativo. Bell et al. apresentaram dados referentes a duas proteínas oíi-PEG próximas, mas diferentes, no fluido amniótico. A cg-PEG é próxima de PAMG-1. A penetração baixa ou elevada de diferentes moléculas na secreção vaginal ocorre devido à permeabilidade selectiva das paredes capilares e processos secretores selectivos. Um imunoensaio bem sucedido requer detectar a concentração de fundo baixa de moléculas PAMG-1 na secreção vaginal.

Um par de anticorpos monoclonais capaz desta detecção foi seleccionado com sucesso. As características exactas das moléculas PAMG-1 detectadas parecem não ser importante para os fins da presente invenção, com uma excepção: a sua concentração baixa na secreção vaginal deve ser certa. Este 16 ΕΡ1535068 parâmetro é suficiente para ajustar o limiar de sensibilidade a um nível baixo, mantendo uma diferença significativa entre 0 limiar do teste e o nível de fundo da concentração de PAMG- 1 na secreção vaginal. Esta escolha do limiar óptimo permite filtrar guer os resultados falso negativos, quer os falso positivos, potenciais, do teste.

Em particular, estudaram-se anticorpos monoclonais (MAc) contra αΐ-microglobulina placentar com base na sua reacção no sistema MAc-PAMG-l-conjugado de outro MAc da presente invenção (Exemplo 4, Tabela 6) . O título mais elevado foi encontrado utilizando especificamente o par M271-M52. No entanto, utilizando o par MAb271-MAb52 e uma técnica ELISA de rotina os requerentes não conseguiram detectar qualquer concentração de PAMG-1 na secreção vaginal. Foi desenvolvida uma técnica ELISA de sensibilidade elevada para o par MAb271-MAb52 (Exemplo 5, Tabela 7) e utilizada para medir concentrações baixas de PAMG-1 (na gama dos picogramas) nas amostras vaginais (Exemplo 6, Tabela 8), e em seguida em ambas, secreções cervicais e vaginais da mulher grávida (Exemplo 7, Tabela 9). No teste ELISA, a primeira camada era formada pelo mAc M271 de especificidade elevada. 0 conjugado de peroxidase de rábano continha o MAc M52, diluído no tampão que não continha nenhum agente inibidor. A partir do exemplo 7, Tabela 9 pode ver-se que a concentração de PAMG-1 nas secreções cervicais e vaginais de mulheres grávidas sem complicações durante a gravidez variavam de 0,05 a 0,22 ng/ml. Pode ver-se a partir destes dados que 17 ΕΡ1535068 - a concentração normal de PAMG-1 (8 casos) se situa em torno de um nível estável. A estabilidade relativa de PAMG-1 quer na vagina, quer no cérvix pode servir de indicação da estabilidade dos parâmetros do método e do modo padrão de recolha de amostras; - os níveis médios da concentração normal de PAMG-1 na secreção cervical são de cerca de 151 pg/ml, na secreção vaginal de cerca de 110 pg/ml; - no caso de patologia gestacional, não relacionada com distúrbios dos vasos sanguíneos (anemia, atraso no desenvolvimento do feto), também se observou um nível quase normal de PAMG-1; - a mistura de sangue é acompanhada por um aumento na concentração de PAMG-1 no cérvix, que se observou ao nível de 290 pg/ml, em contraste com a concentração normal de 151 pg/ml; - o nível de PAMG-1 aumenta na presença de sintomas de trabalho de parto pré-termo e gestose, que poderá estar relacionado com a permeabilidade aumentada das membranas fetais às proteínas; - ocorrendo perda de fluido amniótico, o nível de PAMG-1 aumenta bruscamente (por um factor de 10-50).

Como se pode ver nos exemplos a seguir, seleccionou-se um par de anticorpos monoclonais M271 e M52 para posterior desenvolvimento do método, dispositivo e kit de teste. 18 ΕΡ1535068 A presente invenção refere-se assim em particular a um par seleccionado de anticorpos monoclonais com afinidade de ligação para PAMG-1, a ser utilizados em combinação com pelo menos um anticorpo monoclonal anti-PAMG-1 em dispositivos e métodos para detectar PAMG-1, bem como à ruptura da membrana fetal, com base na presença de fluido amniótico na vagina, tal como indicado pela presença de PAMG-1 na secreção vaginal

Tal como será descrito aqui em maior detalhe, a presente invenção surge em parte de um estudo com um par de anticorpos monoclonais que permitem a detecção da concentração de fundo mínima de PAMG-1 na secreção vaginal da mulher grávida. A concentração de fundo mínima de PAMG-1 na secreção vaginal e a sua concentração elevada no fluido amniótico permitem, em primeiro lugar, estabelecer o limiar de sensibilidade de um dispositivo a um nível baixo e detectar deste modo quantidades muito pequenas de fluido amniótico na secreção vaginal e, em segundo lugar, posicionar o limiar de sensibilidade do dispositivo de um modo óptimo, especificamente, entre o nível típico da concentração de fundo mínima baixa de PAMG-1 na secreção vaginal da mulher grávida sem ruptura de membranas fetais e um nível elevado de PAMG-1 típico no fluido amniótico. Um anticorpo monoclonal adicional ou anticorpos contra PAMG-1 permitem o estabelecimento mais rigoroso do limiar de sensibilidade do dispositivo para um nível pré-definido e.g., para análise semi-quantitativa. Adicionalmente, uma vez que a presença de fluido amniótico na secreção vaginal é indicativa de ruptura da membrana fetal, a detecção de PAMG-1 na secreção vaginal também pode ser utilizada para detectar ruptura da membrana fetal. Tudo isto em combinação permite minimizar os resultados falsos do teste para detectar PROM e PPROM. 19 ΕΡ1535068

De acordo com a presente invenção, os anticorpos específicos para PAMG-1 podem ser incorporados em dispositivos e métodos utilizados para a detecção de PAMG-1 e consequentemente da ocorrência de uma ruptura da membrana fetal baseada na presença de PAMG-1 na secreção vaginal.

Proteína PAMG-1 A PAMG-1 é uma proteína que está presente no soro, fluido amniótico e secreção vaginal da mulher grávida e no soro de todas as pessoas. A PAMG-1 está presente no soro de mulheres não grávidas (0-60 ng/ml) e grávidas (5-120 ng/ml) em que a concentração medida depende do par de anticorpos monoclonais que foi utilizado para a sua detecção (Exemplo 1, tabelas 1,2). É conhecido que a utilização de diferentes pares de anticorpos contra a mesma proteína pode originar uma concentração medida diferente dessa proteína. Deste modo, num estudo análogo de Diamandi A. et al (ver Diamandi A. et al "Immunoassay of the Insulin-Like Growth Factor-Binding

Protein-3"in Journal of Clinicai Endocrinology and Metabolism, 2000, Junho, Vol. 85, No 6, pp. 2327-2333), três variantes de ELISA mostraram três concentrações diferentes de IGFBP-3, que Diamandi A. et al atribuíram à capacidade de cada par de anticorpos detectar uma modificação pós-traducional específica das moléculas de proteína. A PAMG-1 é encontrada no fluido amniótico numa concentração mais elevada do que no soro (2000-75000 ng/ml). A PAMG-1 foi isolada em 1977 a partir de fluido amniótico por D. Petrunin e foi originalmente designada por alfa-l-globulina de placenta, específica (D. Petrunin, et al., "Immunological Identification of Organ Specific alpha-1 20 ΕΡ1535068

Globulin of Human Placenta and Its Content in the Amniotic Fluid", in Akusherstvo i Ginekologiya, 1977, N 1, pp. 64- 65, Moscovo, URSS (ver exemplo 2))

Uma proteína semelhante, mas não idêntica, identificada como PP12 (proteína placentar 12) , foi isolada mais tarde e purificada a partir de membranas placentares e fetais por Bohn, et al. ("Isolierung und Characterisierung eines Neuen Placentaspezifischen Proteins (PP12)", in Arch. Gynecol., 980, Vol. 229, pp. 279-291). S. Bell, et al. referiram a separação da proteína PEG-1 endometrial, diferente de PP12 em dois substituintes de aminoácidos (aminoácidos Null, 12) nos péptidos de terminal-N de 15 aminoácidos (S. Bell, et al., American Journal of Reproductive Immunology, 1989, Vol. 20, pp. 87-96).

Para caracterizar melhor as proteínas identificadas a partir do fluido amniótico, realizou-se uma série de medidas para determinar o peso molecular de PAMG-1. Utilizou-se o método de imunotransferência de modo a determinar o peso molecular de PAMG-1, que se verificou ser de 32 kD (quilodalton, kD é uma unidade de massa atómica) (Boltovskaya, Μ. N. et al., "Histochemical and Clinico-Diagnostic Study of the Placental Alpha-Microglobulin [PAMG-1] Using Monoclonal Antibodies", in Bulletin of Experimental. Biology and Medicine, 1991, No. 10, pp. 397-400). Os requerentes mais tarde assumiram que PAMG-1 se refere à família de proteínas IGFBP (ver patente US 5968758). A PAMG-1 pode estar presente em isoformas diferentes, i.e., que sofreram diferentes modificações pós-traducionais. Os anticorpos podem ter uma especificidade diferencial para 21 ΕΡ1535068 uma isoforma, relativamente a outra, e isto pode ser utilizado como vantagem nos testes da invenção.

Anticorpos contra PAMG-1

Originalmente, utilizaram-se anticorpos monoespecificos contra PAMG-1 (ver, por exemplo, Tatarinov, Y. et al, in Uspekhi Sovr. Biologii, 1990, Vol. 109, pp. 369-373). Mais tarde, obtiveram-se anticorpos capazes de reconhecer apenas as moléculas PAMG-1 que estavam livres de IGF-1 e IGF-2 (patente US 5891722).

Aqui, o termo "anticorpo" refere-se a qualquer proteína com uma afinidade de ligação como especificado no presente pedido, independentemente do método utilizado para obter a proteína. Por exemplo, a proteína pode ser um anticorpo monoclonal ou seu fragmento, ou qualquer molécula com uma especificidade de ligação como especificado neste pedido.

De acordo com a invenção, o polipéptidos PAMG-1 separado dos fluidos corporais, produzido de forma recombinante ou por síntese química e seus fragmentos, ou outros derivados, ou análogos, incluindo proteínas de fusão, podem ser utilizados como imunogénio para produzir anticorpos que reconhecem o polipéptido PAMG-1. Estes anticorpos incluem, mas não se limitam a fragmentos Fab policlonais, monoespecificos, monoclonais, quiméricos, de cadeia simples e uma biblioteca de expressão de Fab. Os anticorpos anti-PAMG-1 da invenção podem ter reactividade cruzada, e. g., eles podem reconhecer a PAMG-1 de diferentes espécies. Os anticorpos policlonais têm uma maior probabilidade de ter reacção cruzada. Alternativamente, um anticorpo da invenção pode ser 22 ΕΡ1535068 específico para uma única forma de PAMG-1. De preferência, este anticorpo é específico para PAMG-1 humana.

Podem utilizar-se vários procedimentos conhecidos na arte para a produção de anticorpos policlonais contra o polipéptido PAMG-1, ou seus derivados, ou análogos. Para a produção do anticorpo, podem-se imunizar vários animais hospedeiros por injecção com o polipéptido PAMG-1, ou um seu derivado (e.g., fragmento ou proteína de fusão) incluindo, mas não se limitando a coelhos, ratinhos, ratos, ovelhas, cabras, etc. Numa concretização, o polipéptido PAMG-1 ou seu fragmento pode ser conjugado com um transportador imunogénico, e. g., albumina de soro bovino (BSA), ou hemocianina de lapa buraco de fechadura (KLH). Podem-se utilizar vários adjuvantes para aumentar a resposta imunológica, dependendo da espécie hospedeira, incluindo, mas não se limitando a adjuvante de Freund (completo e incompleto) , geles minerais, tais como hidróxido de alumínio, substâncias tensioactivas, tais como lisolecitina, polióis plurónicos, polianiões, péptidos, emulsões em óleo, hemocianinas de lapa buraco de fechadura, dinitrofenol, e adjuvantes humanos potencialmente úteis, tais como BCG (bacilo Calmette-Guerin) e

Corynebacterium parvum.

Para a preparação de anticorpos monoclonais contra o polipéptido PAMG-1 ou seu fragmento, análogo ou derivado, pode-se utilizar qualquer técnica que proporciona a produção de moléculas de anticorpo por linhas celulares continuas em cultura. Estas incluem, mas não se limitam à técnica de hibridoma originalmente desenvolvida por Kohler e Milstein (Nature 1975,256: 495-497), bem como a técnica de trioma, a técnica de hibridoma de células-B humanas (Kozbor et al., 23 ΕΡ1535068

Immunology Today 1983,4 : 72; Cote et al. , Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A. 1983,80 : 2026-2030), e a técnica de hibridoma-EBV para produzir anticorpos monoclonais humanos (Cole et al. , em Monoclonal Antibodies and Câncer Therapy, Alan R.

Liss, Inc., pp. 77-96,1985). Noutra concretização da invenção, podem-se produzir anticorpos monoclonais em animais isentos de germes (publicação de patente internacional No. WO 89/12690, publicada em 28 de Dezembro de 1989) . De facto, de acordo com a invenção, podem-se utilizar técnicas desenvolvidas para a produção de "anticorpos quiméricos" (Morrison et al. , J. Bacteriol. 1984,159 : 870; Neuberger et al., Nature 1984,312 : 604-608; Takeda et al. , 1985, Nature 314: 452-454) por corte e rearranjo de genes a partir de uma molécula de anticorpo de ratinho especifica para um polipéptido PAMG-1, juntamente com genes de uma molécula de anticorpo humano de actividade biológica adequada; estando estes anticorpos no âmbito da presente invenção. Estes anticorpos humanos ou anticorpos quiméricos humanizados são preferidos para utilização em terapia de doenças ou distúrbios humanos (descritos infra), uma vez que os anticorpos humanos ou humanizados têm, eles próprios, uma probabilidade muito menor do que os anticorpos xenogénicos de induzir uma resposta imunogénica, em particular uma resposta alérgica.

De acordo com a invenção, as técnicas descritas para a produção de anticorpos de cadeia simples (Patentes US Nos. 5476786 e 5132405 de Huston; patente US 4946778) podem ser adaptadas para produzir anticorpos de cadeia simples específicos do polipéptido PAMG-1. De facto, estes genes podem ser fornecidos para expressão in vivo. Uma outra concretização da invenção utiliza as técnicas descritas 24 ΕΡ1535068 para a construção de bibliotecas de expressão de Fab (Huse et al., Science 1989,246: 1275-1281) para permitir a identificação rápida e fácil de fragmentos Fab monoclonais com a especificidade desejada para um polipéptido PAMG-1, ou seus derivados, ou análogos.

Os fragmentos de anticorpo que contêm o idiotipo da molécula de anticorpo podem ser produzidos por técnicas conhecidas. Por exemplo, estes fragmentos incluem, mas não se limitam a: o fragmento F(ab)2 que pode ser produzido por digestão com pepsina da molécula de anticorpo; os fragmentos Fab que podem ser produzidos reduzindo as pontes dissulfureto do fragmento F(ab)2, e os fragmentos Fab que podem ser produzidos tratando a molécula de anticorpo com papaína e um agente redutor.

Na produção de anticorpos, a pesquisa quanto ao anticorpo desejado pode ser realizada por técnicas conhecidas na arte, e. g., radioimunoensaio, ELISA (ensaio imunoabsorvente ligado a enzimas), imunoensaios "sanduíche", ensaios imunorradiométricos, reacções de precipitina de difusão em gel, ensaios de imunodifusão, imunoensaios in situ (utilizando ouro coloidal, marcadores enzimáticos ou de radioisótopos, por exemplo), transferências western, reacções de precipitação, ensaios de aglutinação (e. g., ensaios de aglutinação em gel, ensaios de hemaglutinação) , ensaios de fixação de complemento, ensaios de imunofluorescência, ensaios de proteína A, e ensaios de imunoelectroforese, etc. Numa concretização, a ligação do anticorpo é detectada por detecção de um marcador no anticorpo primário. Noutra concretização, o anticorpo primário é detectado detectando a ligação de um anticorpo secundário ou reagente para o 25 ΕΡ1535068 anticorpo primário. Noutra concretização, o anticorpo secundário é marcado. São conhecidos muitos meios na arte para detectar a ligação num imunoensaio e estes estão no âmbito da presente invenção. Por exemplo, para seleccionar anticorpos que reconhecem um epítopo especifico de um polipéptido PAMG-1, podem-se testar hibridomas produzidos para um produto que se liga a um fragmento do polipéptido PAMG-1 que contém este epítopo. Para a selecção de um anticorpo específico para um polipéptidos PAMG-1 a partir de uma espécie particular de animal, pode-se fazer a selecção com base na ligação positiva com o polipéptido PAMG-1 expresso por, ou isolado a partir de células dessa espécie de animal.

Anticorpos específicos de acordo com a presente invenção

As linhas celulares de hibridoma de acordo com a presente invenção são produzidas pelo seguinte procedimento. Primeiro, os ratinhos com células-B do baço e nódulos linfáticos são imunizados com PAMG-1. Os hibridomas são então produzidos para imortalizar as células B. As células-B podem ser células-B de baço e/ou nódulos linfáticos. Os hibridomas que produzem um anticorpo monoclonal com uma afinidade de ligação para PAMG-1, são em seguida identificados num ELISA: primeira camada: PAMG-1; segunda camada: sobrenadante do hibridoma; e terceira camada: conjugado de anticorpos anti-ratinho de coelho marcados com peroxidase de rábano. Estes hibridomas identificados são em seguida cultivados in vitro ou em ascites e os anticorpos monoclonais que produzem são isolados. Numa concretização específica, os anticorpos são de hibridomas N52, N271, e N42, tal como depositado na Russian National Collection of Industrial Microorganisms Depository 26 ΕΡ1535068 com os nos. de acesso VKPM H-92, VKPM H-93 e VKPM H-94, respectivamente. Métodos e dispositivos para detectar PAMG—1 A presente invenção estabelece que a PAMG-1, em particular a PAMG-1 presente no fluido amniótico em quantidades muito maiores do que no fluido vaginal normal, é um analito útil para detectar uma ruptura da membrana fetal que resulta na perda de fluido amniótico para a vagina. Por outras palavras, permite o diagnóstico da ruptura prematura das membranas, i.e., do saco amniótico. A invenção estabelece ainda limites de exclusão para detectar PAMG-1 sob condições normais, vários sintomas de vaginite e ruptura verdadeira de membranas. Tendo identificado o analito e os níveis relativos que indicam ruptura de membranas, um perito na arte pode então utilizar, com toda a vantagem, qualquer técnica analítica conhecida para a detecção de proteínas para determinar se ocorreu num paciente uma condição de ruptura prematura de membrana.

Imunoensaios, em particular ensaios imunocromatográficos constituem uma técnica preferida de acordo com a invenção, e descrevem-se imunoensaios em mais detalhe, a seguir. Estes ensaios têm a vantagem de especificidade, precisão, rapidez e economia. Métodos imunológicos e dispositivos para detectar PAMG-1

Podem-se utilizar vários meios conhecidos na arte para detectar a ligação imunoespecífica de um anticorpo a um antigénio, para detectar a ligação de acordo com a presente 27 ΕΡ1535068 invenção. Um método anterior para detectar a interacção entre um antigénio e um anticorpo envolvido na análise do complexo é a precipitação em geles. Um outro método para detectar um par de ligação analito-anticorpo detector inclui a utilização de um anticorpo detector radio-iodado, ou uma proteína radio-iodada que é reactiva com IgG, tal como a Proteína A. Estes métodos iniciais são bem conhecidos dos peritos na arte, como revisto em Methods in Enzymology, 1980, v. 70, pp. 166-198. Seleccionando um anticorpo e condições que originam um resultado positivo acima dos valores limiares para PROM aqui descritos, pode-se utilizar esta tecnologia na prática da invenção. Métodos posteriores para determinar a presença de um analito numa amostra utilizando apenas um anticorpo incluíam ensaios de ligação competitivos. Nesta técnica, o anticorpo que muitas vezes seria imobilizado num suporte sólido, seria exposto a uma amostra suspeita de conter o analito, juntamente com uma quantidade conhecida do analito marcado. Os dois analitos, o analito marcado e o analito na amostra iriam então competir para sítios de ligação no anticorpo. Determina-se quer o analito marcado livre, quer o analito marcado ligado e a partir desta medição é conhecida a quantidade de analito competidor na amostra. Uma descrição mais completa deste método está descrita em "Basic Principies of Antigen-Antibody Reaction", Elvin A. Labat, (Methods in Enzymology, 70,3-70, 1980). Neste exemplo, o analito marcado pode ser marcado quer com um radioisótopo, quer com um marcador enzimático.

Imunoensaios mais correntes utilizam um método de anticorpo duplo para detectar a presença de um analito. Estas 28 ΕΡ1535068 técnicas também estão revistas no volume acima referido de Methods in Enzymology. Deste modo, de acordo com uma concretização da presente invenção, a presença dos marcadores individuais é determinada utilizando um par de anticorpos para cada um dos marcadores a ser detectados. Um dos referidos pares de anticorpos é aqui designado por "anticorpos detector" e o outro par de anticorpos referido é aqui designado por "anticorpo de captura". Uma concretização da presente invenção utiliza assim o método de sanduíche de anticorpo duplo para detectar PAMG-1 numa amostra de fluido vaginal. Neste método, o analito está ensanduichado entre o anticorpo detector e o anticorpo de captura, sendo o anticorpo de captura irreversivelmente imobilizado num suporte sólido. 0 anticorpo detector irá conter um marcador detectável de modo a identificar a presença da sanduíche anticorpo-analito e, deste modo, a presença do analito.

Formas precoces, comuns, de suportes sólidos incluem placas, tubos ou pérolas de poliestireno, sendo todas elas bem conhecidas no campo de radiomimunoensaios e imunoensaio enzimático. Mais recentemente, foram utilizados como suportes sólidos vários materiais porosos, tais como nylon, nitrocelulose, acetato de celulose, fibras de vidro e outros polímeros porosos.

Deste modo, numa concretização específica, o dispositivo da invenção compreende meios para realizar um ensaio imunocromatográfico ("dispositivo de ensaio imunocromatográfico"). Este dispositivo compreende um meio de fase sólido para conduzir um líquido. Tal como aqui utilizado, o termo "meio de fase sólida para conduzir um liquido" refere-se a um suporte sólido que permite a migração de um 29 ΕΡ1535068 líquido através dele, e.g., por acção capilar. Um produto típico desta natureza é uma membrana de nitrocelulose, que pode ser preparada por métodos bem conhecidos dos peritos na arte. São conhecidos na arte muitos meios e formatos de ensaio imunocromatográfico e estes podem ser utilizados na prática da presente invenção. Os ensaios imunocromatográficos que utilizam uma membrana como suporte sólido num dispositivo de tira de imersão ou de fluxo estão bem estabelecidos para utilização no laboratório clínico e para testes no local alternativos, i.e., não em laboratório. A apresentação usual para um dispositivo de ensaio imunocromatográfico é uma membrana (celulósica ou não-celulósica) embalada num invólucro de plástico. 0 invólucro de plástico mantém a membrana numa configuração adequada, de modo a assegurar o funcionamento correcto de todo o dispositivo. Há muitas variações da estrutura básica dos dispositivos de ensaio. Por exemplo, Litman et al. (Patentes US Nos. 5156952 e 5030558) descrevem um método de ensaio e dispositivo para determinar a presença de uma quantidade mínima de um analito, numa amostra. Ullman et al. (Patentes US Nos. 5137808 e 4857453) descrevem um dispositivo para albergar uma membrana de teste que inclui reagentes líquidos independentes, para ajudar a amostra a fluir. Dafforn et al. (Patente US No. 4981768) descrevem um dispositivo com portas para aplicar a amostra e liquido extra Corti et al. (Pedido de patente europeia No. 89118378.2), Greenquist et al. (Patente US No. 4806312) e Berger et al. (Patente US No. 5114673) também descrevem dispositivos de ensaio. 30 ΕΡ1535068

De preferência, os meios de ensaio imunocromatográfico incluem um controlo para indicar que o ensaio foi realizado correctamente. 0 controlo pode ser um reagente de ligação especifica num local mais distante do ponto de aplicação da amostra no suporte de fase sólida do que a zona de detecção, que se irá ligar ao reagente marcado na presença ou ausência do analito, indicando assim que o receptor mobilizável migrou uma distância suficiente com a amostra líquida para se obter um resultado com significado.

Os marcadores adequados para utilização em ensaios imunocromatográficos incluem enzimas, fluoróforos, cromóforos, radioisótopos, corantes, ouro coloidal, carbono coloidal, partículas de látex e agentes quimiluminescentes. Quando se utiliza um marcador de controlo, podem-se utilizar os mesmos ou marcadores diferentes para marcador receptor e de controlo.

Uma concretização da presente invenção utiliza um dispositivo de imunoensaio do tipo fluxo. Valkirs et al. (Patente US No. 4632901) descrevem um dispositivo compreendendo um anticorpo, específico para um analito de antigénio, ligado a uma membrana porosa ou filtro ao qual é adicionada uma amostra líquida. À medida que o líquido flui através da membrana, os analitos alvo ligam-se ao anticorpo. A adição da amostra é seguida pela adição de um anticorpo marcado. A detecção visual do anticorpo marcado dá uma indicação da presença do analito alvo na amostra.

Outro exemplo de um dispositivo de fluxo é descrito por Kromer et al. (EP-A 0 229 359), que descreve um sistema de fornecimento de reagente que compreende uma matriz saturada com um reagente ou seus componentes dispersos num polímero 31 ΕΡ1535068 solúvel em água para controlar a taxa de dissolução do reagente para fornecimento a uma matriz de reacção posicionada por baixo da matriz.

Em ensaios do tipo migração, o suporte de fase sólida, e.g., membrana, é impregnado com os reagentes necessários para realizar o ensaio. É proporcionada uma zona de detecção do analito à qual o analito marcado se liga e os resultados do ensaio são lidos. Por exemplo, ver Tom et al. (Patente US No. 4366241), e Zulc (EP-A 0 143 574). Os dispositivos de ensaio de migração normalmente incorporam reagentes que foram ligados a marcadores corados, tais como ouro ou carbono coloidal, permitindo desse modo a detecção visível dos resultados do ensaio, sem adição de outras substâncias. Ver, por exemplo, Bernstein (Patente US No. 4770853), May et al. (WO 88/08534), e Ching et al. (EP-A 0 299 428). Todos estes tipos conhecidos de dispositivos de fluxo podem ser utilizados de acordo com a presente invenção.

Os marcadores directos são um exemplo de marcadores que podem ser utilizados em ensaios imunocromatográficos de acordo com a presente invenção. Um marcador directo foi definido como uma entidade que no seu estado natural é facilmente visível, quer a olho nu, quer com o auxílio de um filtro óptico e/ou estímulo aplicado, e. g. luz UV, para produzir fluorescência. Exemplos de marcadores corados que podem ser utilizados de acordo com a presente invenção incluem partículas sol metálicas, por exemplo, partículas sol de ouro, tais como as descritas por Leuvering (Patente US No. 4313734); partículas sol de corante, tais como as descritas por Gribnau et al. (Patente US No. 4373932) e May et al. (WO 88/08534); latex corado, tal como descrito por May, supra, 32 ΕΡ1535068

Snyder (EP-A 0 280 559 e 0 281 327); ou corantes encapsulados em lipossomas, como descrito por Campbell et al. (Patente US No. 4703017). Outros marcadores directos incluem um radionuclido, uma porção fluorescente ou uma porção luminescente. Além destes dispositivos de marcação directa, também se podem utilizar marcadores indirectos compreendendo enzimas de acordo com a presente invenção. Há vários tipos de imunoensaios ligados a enzimas bem conhecidos na arte, por exemplo, fosfatase alcalina e peroxidase de rábano, lisozima, glucose-6-fosfato desidrogenase, lactato desidrogenase, urease, e estes e outros foram discutidos em detalhe por Eva Engvall em Enzyme Immunoassay ELISA e EMIT em Methods in Enzymology, 70.419- 439,1980 e na patente US No. 4857453.

Numa concretização especifica, o dispositivo de diagnóstico da presente invenção compreende um dispositivo de membrana com uma secção de detecção próxima do ponto de introdução da amostra e uma secção de captura a jusante dessa posição. A secção detectora contém anticorpos (anticorpos detectores) que irão reagir com qualquer analito da presente invenção que esteja presente na amostra. Os anticorpos detectores estão reversivelmente imobilizados na membrana e irão migrar com a amostra, quando em uso. É preferido, embora não essencial, que os anticorpos detectores sejam marcados, por exemplo, com um radionuclido, uma enzima, uma porção fluorescente, porção luminescente, ou um marcador corado, tais como os descritos na arte anterior e discutidos acima. Especificamente, pode-se utilizar um marcador reactivo de modo a que, por exemplo, o anticorpo surja como ouro antes da captura do antigénio e mude para roxo após captura. 33 ΕΡ1535068 A secção de captura que, como referido, está a jusante da secção detectora, compreende anticorpos de captura que estão irreversivelmente imobilizados no suporte sólido, estando cada anticorpo imobilizado numa posição diferente na secção de captura. Os anticorpos e reagentes necessários estão imobilizados no suporte sólido utilizando técnicas convencionais reconhecidas na arte, como discutido nos dispositivos de imunoensaio do tipo fluxo, discutidos anteriormente. Em geral, os anticorpos são absorvidos nos suportes sólidos como resultado de interacções hidrófobas entre sub-estruturas de proteínas não polares e material de matriz de suporte não polar.

Uma vantagem particular da tecnologia de ensaio imunocromatográfico da presente invenção é que esta ultrapassa a incapacidade destes ensaios proporcionarem dados quantitativos. Deste modo, a secção de captura pode conter uma mistura de anticorpos imobilizados específicos para PAMG-1, de modo que se produz um sinal apenas quando a quantidade de PAMG-1 na amostra excede o limiar de detecção desejado.

Além disso, a presente invenção contempla a utilização de formatos de imunoensaios homogéneos. Um exemplo deste método homogéneo competitivo pode ser encontrado na patente US No. 3817837 de Rubenstein e Ullman, que descreve uma técnica em que o ligando e o ligando ligado a enzima competem para os sitios de ligação ao anticorpo. Uma vez que a ligação do anticorpo ao ligando ligado à enzima altera a sua actividade enzimática, a concentração de ligando presente pode ser estimada medindo a taxa a que esta mistura converte substrato em produto. Deste modo, num método homogéneo, a propriedade detectável do marcador é inerentemente diferente, 34 ΕΡ1535068 dependendo se está ligado ou não ligado. No seu estado ligado, o marcador terá uma intensidade de sinal maior ou menor. Normalmente, a ligação do anticorpo ao ligando marcado provoca uma diminuição na intensidade de sinal, e. g., quando o marcador é uma enzima. Os produtos típicos nesta categoria incluem a linha EMIT dos imunoensaios enzimáticos da Syva Company e a linha TDX de imunoensaios de polarização de fluorescência da Abbott Diagnostics. Pode-se preparar um ensaio homogéneo particular com a disposição de todos os analitos em pérolas, caso em que a amostra será introduzida e as pérolas em seguida centrifugadas e detectadas.

Outros exemplos de dispositivos de diagnóstico biológicos que podem ser utilizados de acordo com a presente invenção incluem os dispositivos descritos por G. Grenner, P. B. Diagnostics Systems, Inc., nas patentes US. Nos. 4906439 E 4918025. 0 dispositivo de Grenner'439 compreende um elemento de teste de diagnóstico e uma unidade de aplicação da amostra que compreende um elemento de fornecimento de fluido que se caracteriza por ter uma camada com várias ranhuras para o fornecimento da amostra ao elemento de teste. Grenner'025 refere-se a um dispositivo que inclui um meio de introdução da amostra, tal como adjacente à membrana, no qual está posicionado um capilar que contém um reagente fixado e um reservatório para desperdício de líquido. A libertação do reagente fixado a partir do capilar completa a reacção após a amostra ser depositada e o líquido em excesso é retido pelo reservatório de desperdícios, sendo o reservatório independente.

Apesar de a medição com uma membrana ser preferida, deve entender-se que outras técnicas e dispositivos sensores 35 ΕΡ1535068 correspondentes podem ser igualmente utilizados de um modo semelhante ao acima descrito. Actualmente, estão disponíveis vários tipos de aparelhos de ensaio automatizados que podem realizar um ensaio em várias amostras ao mesmo tempo. Estes aparelhos de ensaio automatizados incluem dispositivos de ensaio de acesso contínuo/aleatório. Exemplos destes sistemas incluem OPUS™ da PB Diagnostic System, Inc. e o analisador IMX™ introduzido pela Abbott Laboratories de Chicago do Norte, III em 1988. Em geral, é tipicamente fornecida uma amostra do fluido de teste num copo de amostra e todos os passos do processo, incluindo a pipetagem da amostra para o elemento de teste do ensaio, incubação e leitura do sinal obtido, são realizados automaticamente. Os sistemas de ensaio automatizados geralmente incluem uma série de estações de trabalho, em que cada uma realiza um dos passos no procedimento de teste. 0 elemento de ensaio pode ser transportado desde uma estação de trabalho para a próxima por vários meios, tais como um carrossel ou calha móvel, para permitir que os passos do teste sejam realizados sequencialmente. Os elementos de ensaio podem também incluir reservatórios para armazenar reagentes, misturar fluidos, diluir amostras, etc. Os elementos de ensaio também incluem uma abertura para permitir a administração de uma quantidade pré-determinada de um fluido amostra e, se necessário, qualquer outro reagente necessário, a uma membrana porosa. 0 elemento de amostra pode também incluir uma janela para permitir a leitura de um sinal obtido como resultado dos passos do processo, tipicamente uma alteração fluorescente ou colorimétrica nos reagentes presentes na membrana porosa, tal como por meio de espectroscopia ou f luorimetria, que são incluídos no sistema de ensaio. 36 ΕΡ1535068

Os instrumentos de ensaio automatizados da PB Diagnostic Systems, Inc. estão descritos nas patentes US Nos. 5051237; 5138868; 5141871 e 5147609.

Outras classes de sistemas de análise imunoquimicos que podem ser utilizados na prática da presente invenção são os sistemas biossensores ou imunossensores ópticos. Em geral, um biossensor óptico é um dispositivo que utiliza princípios ópticos quantitativamente para converter concentrações ou actividades químicas ou bioquímicas de interesse em sinais eléctricos. Estes sistemas podem ser agrupados em quatro categorias principais: técnicas de reflexão, ressonância de plasma de superfície; técnicas de fibra óptica e dispositivos ópticos integrados. As técnicas de reflexão incluem, elipsometria, espectroscopia de reflexão integral, múltipla e dispositivos de enchimento capilar fluorescente. As técnicas de fibra óptica incluem fluorescência de campo evanescente, tubo capilar de fibra óptica e sensores de fluorescência de fibra óptica. Os dispositivos ópticos integrados incluem fluorescência de campo evanescente planar, imunossensor de acoplamento por redes de difracção de entrada, interferómetro Mach-Zehnder, interferómetro Hartman e sensores interferómetro de diferenças. A detecção holográfica de reacções de ligação é realizada detectando a presença de uma imagem holográfica que é gerada numa localização de imagem pré-determinada quando um reagente de um par de ligação se liga a um segundo reagente do par de ligação imobilizado (ver patente US No. 5352582, emitida em 4 de Out. , 1994 de Lichtenwalter et al.) . Exemplos de imunossensores ópticos estão descritos em geral num artigo de revisão de G. A. Robins (Advances in Biosensors), Vol. 1, pp. 229-256,1991. Pode-se encontrar uma descrição mais específica destes 37 ΕΡ1535068 dispositivos, por exemplo, nas patentes US Nos. 4810658; 4978503; e 5186897; R. A. Brady et al. (Phil. Trans. R. Soc. Land. B 316,143-160, 1987) e G. A.Robinson et al. (em Sensors and Actuators, Elsevier, 1992).

Os métodos da presente invenção são capazes de ser incorporados e postos em prática numa variedade de sistemas de medição óptica. Especificamente, apesar dos materiais da presente invenção poderem ser praticados num formato de imunoensaio, este formato é ele próprio capaz de ser concretizado numa variedade de sistemas de detecção optoelectrónica. Mais em particular, já é conhecida uma variedade de tecnologias imunossensoras que poderão ser implementadas na prática da invenção. Deste modo, por exemplo, podem também adoptar-se dispositivos e técnicas, tais como técnicas de reflexão, ressonância de Plasma de superfície, técnicas de guia de onda de fibra óptica e dispositivos ópticos integrados, configurá-los especificamente para detectar e apresentar os resultados da análise de uma amostra biológica de um paciente de acordo com o presente método. Técnicas de reflexão particulares, tais como reflectometria e elipsometria e a utilização específica de fibras ópticas, guias de onda ópticas, dispositivos de enchimento capilar fluorescentes e biossensores ópticos integrados, representam apenas algumas das variantes de técnicas e equipamentos que podem ser utilizados. Uma revisão geral destes dispositivos pode ser encontrada em Robinson, G. A., Optical Immunosensors : An OverView, Advances in Biosensors, Vol. 1, pp. 229-256 (1991).

Mais em particular, a elipsometria baseia-se na direcção de um feixe de luz polarizada contra uma superfície de 38 ΕΡ1535068 referência (um padrão) e em seguida contra a superficie da amostra, após o que pode ser feita uma comparação da natureza e extensão das reflexões resultantes. Em particular, a ligação do analito a moléculas receptoras será medida como uma cadeia a espessura da superficie em relação à superficie de referência.

No caso de espectroscopia de reflexão interna múltipla, por exemplo, o ligando e o seu receptor podem ser imobilizados de forma covalente na superficie de uma guia de onda plana de quartzo fundido, após o que o feixe de luz pode ser reflectido internamente no seio da guia de onda e penetrar numa solução adjacente à guia de onda, de modo que se poderão medir as diferenças refractivas entre o padrão e a amostra. Neste formato particular, pode-se associar um marcador fluorescente e fazer medições da fluorescência resultante, para determinar a extensão actual de ligação.

Uma técnica adicional utiliza a tecnologia conhecida como dispositivo de enchimento capilar fluorescente. Nesta tecnologia particular, utilizam-se duas placas de vidro guia mantidas separadas por um intervalo com a dimensão capilar. As moléculas receptoras podem ser imobilizadas na placa base que também actua como guia de onda óptica. Os ensaios competitivos ou sanduíche que utilizam marcação com FITC podem ser realizados e a fluorescência induzida é acoplada na guia de onda com o sinal das fontes ligadas em oposição a fontes não ligadas. Este sinal é discriminado pela sua divergência angular após sair da guia de onda. Também foram preparados dispositivos de ressonância de Plasma de superfície (SPR) que operam em resposta ao acoplamento da luz incidente numa película de metal fina, em modos de superfície 39 ΕΡ1535068 associados com oscilações de electrões colectivas no seio da película de metal. A condição de ressonância depende das características ópticas da película de metal, da sua espessura, dos índices de refracção do dieléctrico de cada um dos seus lados e do ângulo de incidência da luz. As moléculas receptoras estão ligadas ao lado de topo da película de metal e a luz é dirigida para o lado de baixo da película, tal como através de um substracto de prisma. 0 analito alvo, quando se liga a estes receptores irá causar um desvio na condição de ressonância devido à alteração que produz no índice de refracção local. A ressonância é observada por monitorização da intensidade de luz reflectida à medida que o ângulo de incidência do feixe de luz na película de metal varia. A alteração no ângulo de ressonância irá correlacionar-se directamente com a quantidade de analito ligado.

As técnicas que envolvem sistemas de fibra óptica incluem fluorescência de campo evanescente. Neste caso, a cobertura de protecção é removida da extremidade de uma fibra óptica, produzindo assim um elemento sensor que interage de forma evanescente com o meio envolvente. As moléculas receptoras são ligadas à superfície de fibra exposta e podem-se realizar ensaios directos utilizando a fluorescência natural do receptor e proteínas conjugadas. Os ensaios competitivos ou sanduíche podem ser realizados utilizando marcação com FITC para se obter uma maior sensibilidade. Em operação, uma onda de luz é acoplada à fibra e uma porção da fluorescência produzida de forma evanescente é acoplada de novo na fibra e propagada de volta até um detector.

Outra técnica que utiliza tecnologia de fibra óptica envolve o tubo capilar de fibra óptica, no qual está incluída 40 ΕΡ1535068 uma fibra óptica nua, no seio de uma câmara de enchimento, produzindo um elemento sensor que interage de forma evanescente com a porção do volume de enchimento que envolve imediatamente a fibra. As moléculas receptoras podem ser ligadas à superfície de fibra exposta e podem realizar-se ensaios de sanduíche ou deslocamento competitivo. Uma onda de luz seria acoplada na fibra e uma porção da fluorescência induzida de forma evanescente seria acoplada de novo na fibra e propagada de volta até um detector. O sinal do analito alvo versus as fontes de ruído de fundo é discriminado pela sua divergência angular quando sai da fibra. Podem-se adaptar outras técnicas de fibra óptica, tais como fluorescência de fibra óptica, à presente invenção, utilizando alguns dos mesmos princípios enunciados acima.

Outras técnicas fotónicas, tais como interferometria, incluem a disposição de uma guia de onda de uma película fina tendo, por exemplo, duas vias, na primeira das quais as moléculas receptoras podem ser imobilizadas, enquanto que na segunda são protegidas para se obter um canal de referência., Pode-se, por exemplo, acoplar luz laser na guia de onda e dividi-la através das duas vias, de modo que as alterações no índice de refracção e espessura da cobertura podem ser detectadas pelo resultado de um desvio de fase no feixe o que, por sua vez, se correlaciona com a quantidade de analito ligado. Uma variação desta abordagem é identificada no interferómetro de Hartman, em que se prepara uma guia de onda planar de uma película fina, multimodo, de percurso único. As moléculas de receptor podem ser imobilizadas neste percurso e a luz de um laser pode ser acoplada na guia de onda de modo que dois modos são propagados ao longo do percurso. As ópticas de geometria multimodo são tais que o modo de ordem 41 ΕΡ1535068 superior tem um capo evanescente grande, proporcionando um mecanismo de sinal, e o modo de ordem inferior não tem praticamente nenhum campo evanescente, proporcionando um mecanismo de referência. A ligação com o analito alvo irá causar alterações relacionadas no índice de refracção e espessura da camada de cobertura ao longo do percurso, o que será detectado pelo campo evanescente do modo de ordem superior, provocando um desvio de fase nesse modo. Dado que o modo de ordem inferior ou referência é cego a estas alterações, não ocorrerá nenhum desvio de fase e a diferença medida entre o sinal e feixes de referência será capaz de determinar a quantidade de analito ligado.

Apesar da discussão anterior sido feita, tanto em termos gerais, como com algum detalhe, há várias técnicas disponíveis na tecnologia de sensores ópticos que podem ser adaptadas à prática da presente invenção. Deve entender-se que a descrição acima referida não é de modo algum limitante, dado que se pode adoptar uma variedade de tecnologias existentes, que irão medir com sucesso as diferenças de ligação e, consequentemente, a presença e quantidade dos marcadores ou analitos respectivos, de interesse. Obviamente, como sublinhado acima, independentemente da tecnologia utilizada, a prática da invenção compreende a detecção e medição simultânea de pelo menos três analitos. Métodos imunocromatográficos para detecção de PAMG-1 A seguir descrevem-se concretizações dos métodos para detectar PAMG-1 de acordo com a presente invenção. 42 ΕΡ1535068

Numa concretização do método, a PAMG-1 é detectada numa amostra por contacto de uma amostra que contém PAMG-1 com um sistema de imunoensaio de acordo com a presente invenção, para formar um complexo anticorpo-PAMG-1. 0 complexo anticorpo-PAMG-1 é então detectado. Numa variação desta concretização, o anticorpo inclui um marcador detectável, o passo para detectar o complexo anticorpo-PAMG-1 que inclui o marcador detectável.

Noutra concretização do método, a PAMG-1 é detectada numa amostra colocando a amostra em contacto com um anticorpo que tem uma afinidade de ligação específica para PAMG-1 (M271, exemplificado infra), formando deste modo o complexo anticorpo M271-PAMG-1. 0 complexo entra então em contacto com um segundo anticorpo imobilizado (M52, exemplificado infra). 0 segundo anticorpo é imunologicamente distinto de, e sem reacção cruzada com o primeiro anticorpo, de modo que estes anticorpos se podem ligar em simultâneo à molécula de PAMG-1. 0 anticorpo imobilizado liga-se ao complexo anticorpo móvel-PAMG-1 para formar o complexo anticorpo imobilizado- PAMG-1-anticorpo. A PAMG-1 é detectada, detectando este complexo heterotrimérico. Como referido acima, o anticorpo com especificidade elevada para PAMG-1 é de preferência utilizado para o reconhecimento inicial de PAMG-1. Utiliza-se pelo menos um anticorpo monoclonal anti-PAMG-1 adicional (M42, exemplificado infra), de modo a estabelecer com precisão um determinado limiar de sensibilidade do método.

Quando o método acima descrito inclui a utilização de um anticorpo do par seleccionado, marcado com um marcador detectável, uma variação do método inclui colocar a amostra em contacto com o primeiro anticorpo marcado, antes do 43 ΕΡ1535068 contacto da amostra com o segundo anticorpo, imobilizado. Nesta variação, o anticorpo marcado serve para ligar a PAMG-1 na amostra. Ainda outra concretização do método inclui os seguintes passos: adicionar uma amostra fluida que contém PAMG-1 a uma região de anticorpo marcado, mobilizável, de um material poroso, que permite a migração do anticorpo e proteínas ao longo do mesmo, incluindo a região do anticorpo um anticorpo mobilizável que tem uma especificidade elevada para PAMG-1, resultando na ligação do anticorpo a PAMG-1 para formar um complexo anticorpo-PAMG-1; migração do complexo até à região de teste que contém um segundo anticorpo nele imobilizado, o qual tem uma afinidade de ligação para PAMG-1 que resulta na ligação do segundo anticorpo ao complexo anticorpo marcado-PAMG-1, para formar um complexo imobilizado; e detecção do complexo imobilizado na região de teste.

Ainda outra concretização do método é um ensaio sanduíche convencional, em que um anticorpo não marcado é imobilizado em qualquer superfície. A adição da amostra fluida contendo PAMG-1 resulta na ligação de PAMG-1 pelo anticorpo imobilizado para formar um complexo anticorpo-PAMG-1. A adição de anticorpo marcado resulta ana formação de um complexo imobilizado composto por anticorpo imobilizado-PAMG-l-anticorpo marcado e detecção deste complexo.

De acordo com os métodos acima descritos, os anticorpos podem incluir um marcador detectável, em que o passo de detecção do complexo anticorpo-PAMG-1 ou PAMG-l-anticorpo, inclui a detecção do marcador detectável. Exemplos de marcadores detectáveis que podem ser utilizados incluem partículas coradas, enzimas, corantes e isótopos radioactivos. Numa concretização específica, o marcador detectável é uma 44 ΕΡ1535068 partícula de ouro corada, e. g., com uma dimensão média entre cerca de 20 nm e 30 nm. Ainda noutra concretização, o marcador detectável é peroxidase de rábano.

Exemplos de dispositivos para detecção de PAMG-1 Há uma variedade de dispositivos que podem ser utilizados para detectar a proteína PAMG-1 numa amostra. Uma concretização específica do dispositivo da presente invenção para detectar PAMG-1 está descrita nas Figuras 1-2. Os dispositivos de acordo com a presente invenção podem detectar de preferência PAMG-1 numa amostra, em que a concentração de PAMG-1 é entre cerca de 5 ng/ml e 50 pg/ml. Também é preferido que os dispositivos tenham um limiar de detecção de cerca de 5-7 ng/ml. Quanto maior for o intervalo entre a concentração de fundo de PAMG-1 e o limiar de sensibilidade do dispositivo de detecção, menor é a probabilidade de haver resultados falso positivos. Nesta secção, são descritas diferentes concretizações possíveis de dispositivos de acordo com a invenção, no dispositivo ilustrado nas figuras 1,2. Deve referir-se que este dispositivo pode ser concebido para detectar simplesmente a presença de PAMG-1 numa amostra de secreção vaginal. 0 termo "cerca de" como aqui utilizado, significa dentro da gama de erro aceitável para o valor particular, tal como determinado por um perito na arte, que irá depender em parte do modo como o valor é medido ou determinado i.e., das limitações do sistema de medição. Por exemplo, "cerca de" significa no espaço de 1 ou mais que um desvio padrão, pela prática na arte. Alternativamente, "cerca de" pode significar uma gama de até cerca de 20%, de preferência até 10%, mais 45 ΕΡ1535068 preferencialmente 5%, e mais preferencialmente até 1% de um determinado valor. Alternativamente, em particular no que se refere a sistemas ou processos biológicos, o termo pode significar dentro de uma ordem de magnitude, de preferência dentro de 5 vezes, e mais preferencialmente dentro de 2 vezes um valor. Quando se descrevem valores particulares no pedido e reivindicações, salvo indicação em contrário o termo "cerca de" significa dentro de uma gama de erro aceitável para o valor particular.

Descrição de um dispositivo da presente invenção

Para fins de exemplificação, a presente descrição refere-se a anticorpos monoclonais exemplificados infra. No entanto, não é necessário que estes anticorpos monoclonais específicos sejam utilizados.

Como se pode ver nas figuras 1 e 2, o dispositivo compreende um corpo do tipo tira composto por vários elementos sequencialmente interligados. Mais especificamente, a parte 12 do dispositivo compreende uma almofada, que contém a região 10 do anticorpo M271, em que os anticorpos M271 estão marcados, e. g., por partículas SP coradas (não apresentado nas figuras). A almofada 12 pode ser feita de um tecido de fibra de vidro, ou qualquer outro material que seja poroso e permita a migração de várias partículas e substâncias de uma amostra. As partículas coradas podem compreender partículas de ouro com uma dimensão média na gama de 20 a 30 nm. A região do anticorpo M271 também contém imunoglobulina IgG de ratinho marcada pelas mesmas partículas coradas. Os anticorpos M271 marcados e imunoglobulina IgG de ratinho são introduzidos na parte da banda 10 da almofada 12 46 ΕΡ1535068 impregnando a almofada 12 com uma solução de anticorpos M271 marcados e IgG de ratinho marcado. A solução de anticorpos M271 e imunoglobulina IgG de ratinho pode ser introduzida numa membrana de nitrocelulose 22 utilizando uma caneta de desenhar, ou um dispositivo formador de microgotas. Ligado a uma extremidade da almofada 12, na sua direcção longitudinal, estão [a] uma membrana de nitrocelulose 22, que contém uma região de teste 14 e uma região de controlo 16. Tanto a região de teste 14, como a região de controlo 16 estão dispostas transversalmente em relação ao dispositivo em toda a sua largura. A região de teste 14 é uma porção de banda da membrana de nitrocelulose 22. A região de teste 14 contém anticorpos M52 ligados à membrana de nitrocelulose 22. A região de controlo 16 contém anticorpos anti-imunoglobulina anti-ratinho ligados à membrana de nitrocelulose 22. A região de controlo 16 atravessa toda a largura da tira 22. Uma membrana de papel de filtro 24 está ligada à extremidade da membrana de nitrocelulose 22, que está oposta à extremidade da membrana de nitrocelulose 22 ligada à almofada 12. Uma membrana de papel de filtro 24 está ligada à extremidade da tira de nitrocelulose 22 na sua direcção longitudinal. A superfície do dispositivo está revestida com películas protectoras especiais 28 e 30, e. g., fitas adesivas finas especialmente concebidas para dispositivos de tiras. São desenhadas setas 18 na superfície da película 28, de modo a mostrar o final da almofada 12 de aplicação de amostra. A almofada 12, membrana de nitrocelulose 22 e tira de papel de filtro 24 estão ligadas a uma base de plástico rígida, adesiva 26. 47 ΕΡ1535068

Legendas das Figuras 1,2 10-região do anticorpo M271; 12-almofada; 14-região de teste; 16-região de controlo; 18-setas; 22-membrana de nitrocelulose; 24-membrana de papel de filtro; 26-base de plástico rígida, adesiva; 28-película protectora parcialmente transparente, com setas; 30-película protectora não transparente.

Concretização preferida do dispositivo da presente invenção

Na concretização descrita nesta secção, o dispositivo inclui uma região de almofada 10 do anticorpo M271 formada por uma matriz de aplicação de amostra, porosa, que permite a migração do anticorpos e proteínas através da mesma. A região 10 do anticorpo M271 inclui o anticorpo M271, que é capaz de se ligar com especificidade elevada a PAMG-1. A introdução da amostra de fluido contendo PAMG-1 na região do anticorpo M271 resulta na ligação do anticorpo M271 a PAMG-1 para formar o complexo anticorpo M271-PAMG-1. O dispositivo também inclui uma região de teste 14 em ligação fluida com a região 10 do anticorpo M271, formada por um material poroso que permite a migração de anticorpos e proteínas através da mesma. A região de teste 14 inclui o anticorpo M52 imobilizado na região de teste 14 que também é capaz de se ligar a PAMG-1. 0 anticorpo M52 é imunologicamente distinto do anticorpo M271, de modo que os 48 ΕΡ1535068 anticorpos M271 e M52 podem ligar-se em simultâneo a PAMG-1. A introdução de uma amostra de fluido na região 10 do anticorpo M271 resulta na migração do complexo M271-PAMG-1 para a região de teste 14 onde o complexo anticorpo M271-PAMG-1 se liga ao anticorpo M52 e fica imobilizado na região de teste pelo anticorpo M52. 0 dispositivo detecta PAMG-1 numa amostra baseada na presença do anticorpo M52 imobilizado na região de teste 14. De acordo com esta concretização, ambos os anticorpos são anticorpos de acordo com a presente invenção. 0 procedimento de selecção do par de anticorpos descrito acima pode ser reproduzido por qualquer perito na arte. Como resultado, apenas a PAMG-1 forma um complexo anticorpo M271-PAMG-l-anticorpo M52 que está imobilizado na região de teste 14. Deste modo, a presença do anticorpo M52 imobilizado na região de teste 14 indica a presença de PAMG-1 na amostra.

Nesta concretização do dispositivo, o anticorpo M271 está ligado a um marcador detectável que é utilizado para detectar PAMG-1 imobilizada na região de teste 14. Exemplos de marcadores detectáveis que podem ser utilizados incluem, mas não se limitam a, partículas coradas, enzimas, corantes, corantes fluorescentes e isótopos radioactivos. Numa concretização, o marcador detectável é de partículas de ouro com uma dimensão média entre cerca de 20- 30 nm. Numa concretização, o anticorpo M271 está marcado num estado liofilizado.

Numa variação da concretização em que o anticorpo M271 na região de almofada do anticorpo M271 está marcado com um marcador detectável, o dispositivo inclui ainda uma região de 49 ΕΡ1535068 teste que contém o anticorpo M52. A região de almofada e região de teste estão em conexão fluida.

Ainda noutra concretização do dispositivo, também concretizada no dispositivo ilustrado nas Figuras 1-2, o dispositivo tem um corpo do tipo tira com extremidades proximais e distais. A região 10 do anticorpo M271 do corpo do tipo tira é feita de um material que permite a migração de anticorpos e proteínas através do mesmo. A região 10 do anticorpo M271 do corpo do tipo tira inclui o anticorpo M271 que tem uma afinidade de ligação de especificidade elevada para PAMG-1, introdução na região de almofada do anticorpo M271 de uma amostra fluida contendo PAMG-1, que resulta na ligação do anticorpo M271 a PAMG-1, para formar o complexo anticorpo M271-PAMG-1. 0 corpo do tipo tira inclui uma região de teste 14, que está próxima da região 10 do anticorpo M271 e está em conexão fluida com a região 10 do anticorpo M271. A região de teste 14 é formada por um material que permite a migração de anticorpos e proteínas através do mesmo. A região de teste 14 inclui o anticorpo M52 imobilizado na região de teste 14, que tem uma afinidade de ligação para PAMG-1, em que a introdução da amostra de fluido na região 10 do anticorpo M271 resulta na migração do complexo anticorpo M271-PAMG-1 para a região de teste 14, onde o complexo anticorpo M271-PAMG-1 se liga ao anticorpo M52 e fica imobilizado na região de teste 14 pelo anticorpo M52. A região de teste também inclui o anticorpo M42 e o anticorpo M52 imobilizado na região de teste 14. Os anticorpos M52 e M42 não marcados, em combinação, permitem um fino ajuste do limiar de sensibilidade do dispositivo de tira da presente invenção (Exemplo 11) . O dispositivo detecta 50 ΕΡ1535068 PAMG-1 numa amostra baseada na imobilização do complexo de anticorpo M271 marcado-PAMG-1 na região de teste 14.

Região de controlo. 0 dispositivo da invenção inclui uma região de controlo padrão 16 (Figuras 1-2) . Esta região de controlo serve para confirmar que o dispositivo funciona da forma adequada. Deve referir-se, no entanto, que também se pode utilizar qualquer concepção alternativa da região de controlo, com o dispositivo da presente invenção. O dispositivo com uma região de controlo inclui a região 10 do anticorpo M271 formada por um material que permite a migração de anticorpos e proteínas ao longo da mesma, em que a região 10 do anticorpo M271 inclui um anticorpo M271 marcado que não está imobilizado nele e tem uma especificidade elevada para PAMG-1, em que a introdução na região almofada 10 do anticorpo M271 de uma amostra de fluido contendo PAMG-1 resulta na ligação do anticorpo M271 a PAMG-1 para formar um complexo anticorpo M271-PAMG-1. O dispositivo também inclui uma região de teste 14 em conexão fluida com a região 10 do anticorpo M271, que é formada por um material que permite a migração de anticorpos e proteínas através da mesma. A região de teste 14 também inclui o anticorpo M52 imobilizado na região de teste 14 que tem uma afinidade de ligação para PAMG-1. 0 anticorpo M52 é imunologicamente distinto do anticorpo M271, de modo que os anticorpos M271 e M52 se podem ligar em simultâneo a PAMG-1. A introdução da amostra de fluido na região 10 do anticorpo M271 resulta na migração do complexo anticorpo M271-PAMG-1 para a região de teste 14, onde o complexo anticorpo M271-PAMG-1 se liga ao anticorpo M52 e está imobilizado na região de teste 14 pelo anticorpo M52. O dispositivo detecta PAMG-1 51 ΕΡ1535068 numa amostra baseado na imobilização do anticorpo M271 marcado na região de teste 14. Quando uma concentração baixa de PAMG-1 está presente na amostra, pelo menos alguns dos anticorpos M271 marcados migram da região 10 do anticorpo M271 através da região de teste 14 para a região de controlo 16. Anticorpos anti-imunoglobulina anti-ratinho estão imobilizados na região de controlo 16. Os anticorpos anti-imunoglobulina ligam-se a anticorpos M271 marcados que coram a região de controlo. Se está presente na amostra uma concentração elevada de PAMG-1, então apenas uma pequena quantidade de anticorpos M271 marcados se pode aproximar da região de controlo 16 e a coloração da região de controlo poderá ser demasiado fraca para ser visível ao olho nu humano. Para evitar esta possibilidade, adicionou-se imunoglobulina IgG de ratinho, marcada, na região 10 do anticorpo M271. Esta imunoglobulina não se liga a PAMG-1 e migra livremente através da região de teste 14 do anticorpo M52 para a região de controlo 16, onde é ligada por anticorpo anti-imunoglobulina anti-ratinho e cora a região de controlo 16. A região de controlo confirma o funcionamento adequado do dispositivo, independentemente da concentração de PAMG-1 na amostra.

Ainda outro componente do dispositivo da presente invenção é um material poroso que está em conexão porosa estreita com o material da região de teste. Esta parte do dispositivo da invenção funciona como uma bomba que ajuda a mover líquidos, proteínas e anticorpos através da mesma. Exemplos de marcadores detectáveis que podem ser utilizados para a marcação de anticorpos de ratinho e imunoglobulina IgG incluem, mas não se limitam a, partículas coradas, enzimas, corantes e isótopos radioactivos. Numa concretização, o 52 ΕΡ1535068 marcador detectável é um corante fluorescente. Ainda noutra concretização, os marcadores detectáveis são partículas coradas. Numa concretização, o anticorpo M271 que é um anticorpo marcado e a imunoglobulina IgG de ratinho marcada, estão num estado liofilizado.

Os materiais utilizados nas várias regiões do dispositivo acima descrito podem estar em qualquer combinação de materiais que permita a migração de anticorpos e proteínas ao longo da mesma. Exemplos de materiais adequados incluem, mas não se limitam a, fibra de vidro, plástico poroso, nitrocelulose e papel de filtro.

As partes do dispositivo podem ser posicionadas em qualquer combinação funcional, desde que em qualquer concretização do dispositivo da presente invenção haja um par seleccionado de anticorpos que detecta uma concentração de fundo mínima de PAMG-1 na secreção vaginal da mulher grávida. 0 dispositivo da presente patente pode incluir opcionalmente uma película protectora que cobre pelo menos uma porção do dispositivo. Pode ser transparente ou não transparente e pode ter marcas/sinais de marca registada, informação ou setas necessários, na sua superfície.

Detecção de rupturas da membrana fetal A PAMG-1 existe no fluido amniótico a uma concentração cerca de pelo menos 100 vezes maior do que no soro da mulher grávida e pelo menos cerca de 3000 vezes maior do que na secreção vaginal da mulher grávida na ausência de ruptura da membrana fetal. Como resultado, mesmo que uma pequena 53 ΕΡ1535068 quantidade de líquido amniótico (cerca de 1/100 de uma gota por 1 ml de secreção vaginal) esteja dissolvida numa amostra de secreção vaginal, está presente uma quantidade suficiente de PAMG-1 nesta amostra de secreção vaginal, para indicar que ocorreu a ruptura da membrana fetal. Além disso, devido à baixa concentração de PAMG-1 no soro sanguíneo, uma mistura insignificante de soro sanguíneo na amostra (10-15%) não afecta os resultados produzidos pelos dispositivos e métodos da presente invenção.

Uma vez que a presença de fluido amniótico numa secreção vaginal é indicativa de ruptura da membrana fetal, a detecção de PAMG-1 na secreção vaginal também pode ser utilizada para detectar a ruptura da membrana fetal. O método de acordo com a presente invenção para detectar PAMG-1 no fluido amniótico é altamente sensível. Por exemplo, é possível detectar uma concentração de 0,05 ng/ml de PAMG-1 (Exemplos 6,7) . Uma vez que a concentração máxima de PAMG-1 no soro é de cerca de 25 ng/ml, em comparação com uma concentração mínima de cerca de 1680 ng/m no fluido amniótico e porque a concentração de fundo de PAMG-1 na secreção vaginal é muito baixa, cerca de 0,2 ng/ml, pode-se utilizar um nível limiar mais baixo para PAMG-1 no método da presente invenção para detectar a ocorrência de fluido amniótico na vagina. Utilizando um limiar de detecção mais baixo no caso da presente invenção, evita-se a maioria dos resultados falsos.

Os dispositivos e métodos da presente invenção são concebidos para evitar produzir resultados falsos, através da utilização de um par de anticorpos que é altamente sensível e 54 ΕΡ1535068 específico para PAMG-1. Além disso, o limiar de sensibilidade do dispositivo da presente invenção pode ser ajustado de forma adequada no nível pré-definido que é próximo de 5-7 nq/ml.

Como resultado, os dispositivos e métodos da presente invenção não são influenciados pela presença de vaqinite ou outras variáveis, que tinham um impacto negativo no rigor dos métodos anteriores para detectar rupturas da membrana fetal. A concentração máxima de PAMG-1 no exsudado de inflamação é de 3 ng/ml (Exemplo 8, Tabelas 10, 11) . A mesma concentração de PAMG-1 pode ocorrer se a mistura de soro sanguíneo na secreção vaginal não exceder 10-15%. Além disso, uma vasta razão de concentrações de PAMG-1 soro/liquido amniótico faz com que os dispositivos e métodos da presente invenção tenham uma probabilidade significativamente menor de produzir resultados falso positivos devido à presença de soro sanguíneo nas secreções vaginais, mesmo com um limiar de detecção de PAMG-1 baixo. Como aqui descrito, os dispositivos e métodos podem ser adaptados para ser utilizados com facilidade de um modo rápido e conveniente, tornando assim possível que os dispositivos e métodos sejam utilizados em pacientes externos. Por exemplo, o método pode ser incorporado num dispositivo de uso fácil que pode ser operado por um paciente, com pouca ou nenhuma experiência anterior com o dispositivo. Não é necessária nenhuma altura especial, diluição ou correspondência das concentrações de amostra antes da medição para se utilizar o dispositivo. Isto faz com que o método e dispositivo sejam altamente fiáveis e não muito susceptíveis a erro do operador. O método também pode ser concebido para permitir uma determinação simples do tipo sim/não da presença de fluido amniótico na vagina. 55 ΕΡ1535068 A presente invenção proporciona métodos e dispositivos para detectar uma ruptura em membranas fetais, baseada na presença de PAMG-1 na secreção vaginal de um mulher grávida. Consequentemente, o método da presente invenção para detectar rupturas da membrana fetal inclui simplesmente o passo de detectar a presença de PAMG-1 na secreção vaginal, sendo que a presença de PAMG-1 na secreção vaginal indica a ocorrência de uma ruptura da membrana fetal. A parte chave da presente invenção é a selecção passo-a-passo do par de anticorpos para detectar uma concentração de fundo muito baixa da proteina PAMG-1 na secreção vaginal da mulher grávida. A presença de PAMG-1 a baixas concentrações na secreção vaginal pode ser esperada, uma vez que a permeabilidade da parede capilar para proteínas do sangue depende das modificações pós-traducionais das proteínas e da sua interacção com outras moléculas (Marinaro J. A. et al, "O-glycosylation delays the clearance of human IGF-binding protein-6 from the circulation," in European Journal of Endocrinology, Maio 2000, Vol. 142 (5), p. 512; Schneeberger E. E., "Proteins and vesicular transport in capillary endothelium,"Fed. Proc., Maio 1983, Vol. 42 (8), pp. 2419-24; Minshall R. D. et al, "Vesicle formation and trafficking in endothelial cells and regulation of endothelial barrier function,"Histochem. Cell Biol. Fev 2002, Vol. 117 (2), pp. 105-12; Del Vecchio P. J. et al, "Endothelial monolayer permeability to macromolecules", in Fed Proc Jun 1987, Vol. 46 (8), pp. 2511-2515; Siflinger-

Bimboim A et al, "Selectivity of the endothelial monolayer: effects on increase permeability,"Microvascular Research Nov 1998, Vol. 36 (3), pp. 216-227; Ghinea N., Milgrom, E. A., "New function for the LH/CG receptor: transcytosis of hormone across the endothelial barrier in target organs", in Semin. Reproduct. Med., 2001, Vol. 19 (1), pp. 97-101). Entre as 56 ΕΡ1535068 moléculas de PAMG-1 que sofreram modificações pós-traducionais ou estabeleceram uma ligação não covalente com outras moléculas, deverá haver algumas cuja penetração na secreção vaginal é mínima. A concentração destas moléculas na secreção vaginal deverá ser baixa. A penetração baixa ou elevada de diferentes moléculas é devida à permeabilidade selectiva das paredes capilares e a processos secretores selectivos. Dado que é conhecido que a presença de fluido amniótico na secreção vaginal da mulher grávida é indicativa de uma ruptura da membrana fetal, a detecção de PAMG-1 na secreção vaginal também pode ser utilizada para detectar a presença de ruptura da membrana fetal. Exemplos de métodos e dispositivos para detectar PAMG-1 na secreção vaginal incluem os métodos e dispositivos aqui descritos em maior detalhe. Os métodos incluem também o passo de detectar uma ruptura da membrana fetal baseada na detecção de PAMG-1 na amostra de secreção vaginal também e são aqui descritos em maior detalhe.

Tal como discutido acima, os métodos e dispositivos de acordo com a presente invenção para detectar rupturas de membranas fetais são altamente específicos, sensíveis e rigorosos. A sensibilidade e rigor são obtidos por meio de uma grande diferença entre a concentração de fundo baixa de PAMG-1 na secreção vaginal de mulheres grávidas e um limiar de sensibilidade pré-estabelecido muito mais elevado, do dispositivo da presente invenção, sendo o limiar, por sua vez, mais baixo do que a concentração típica de PAMG-1 na secreção vaginal na altura de uma ruptura da membrana fetal, o que cria uma perda do fluido amniótico para a vagina. 0 estabelecimento rigoroso do limiar é por sua vez conseguido utilizando pelo menos um ou mais anticorpos na região de teste 14 contra PAMG-1, para estabelecer precisamente o 57 ΕΡ1535068 limiar de sensibilidade pré-definido do dispositivo da presente invenção (Exemplo 9). Consequentemente, os métodos e dispositivos da presente invenção são concebidos para evitar produzir resultados falso negativos e falso positivos, através da utilização de um par de anticorpos monoclonais M271 e M52 altamente específicos e pelo menos um anticorpo adicional M42. Como resultado, o rigor dos métodos e dispositivos não é afectado de forma adversa pela presença de infecções vaginais ou certas outras variáveis que reduziam o rigor dos métodos da arte anterior para detectar a ruptura da membrana fetal. 0 dispositivo e métodos preferidos da presente invenção para detectar PAMG-1 na secreção vaginal de mulheres grávidas também são concebidos para ser utilizados de forma fácil, conveniente e rápida, possibilitando desse modo a utilização do dispositivo da presente patente em pacientes externos. Por exemplo, os métodos podem ser incorporados num dispositivo de utilização fácil que pode ser operado por um paciente com pouca ou nenhuma experiência com o dispositivo. Não é requerida nenhuma altura, diluição ou correspondência especial da concentração de amostra antes da medição, de modo a utilizar o dispositivo. Isto torna os métodos e dispositivos da presente invenção para detectar rupturas de membranas fetais altamente fiáveis e não muito susceptíveis a erros do operador. Os resultados de ensaios clínicos do dispositivo da invenção são apresentados no Exemplo 10. A medição da concentração de PAMG-1 na secreção vaginal na vaginite é apresentada no Exemplo 8. Pode-se ver pelo Exemplo 8 que a concentração máxima de PAMG-1 observada no exsudado de inflamação é próxima de 3 ng/ml. 58 ΕΡ1535068

EXEMPLOS

Os exemplos seguintes descrevem em maior detalhe o isolamento de PAMG-1 a partir do fluido amniótico, a selecção de um par de anticorpos contra PAMG-1, o estudo da especificidade destes anticorpos e a concentração de PAMG-1 no exsudado de inflamação na vaginite.

Exemplo 1: Concentração de PAMG—1 no sangue e fluido amniótico A concentração de PAMG-1 foi medida no soro sanguíneo de mulheres não grávidas, mulheres grávidas (37-40 semanas de gestação), e no fluido amniótico (39-40 semanas de gestação) por ELISA, utilizando pares de anticorpos monoclonais produzidos como descrito no Exemplo 3.

Os anticorpos Ml, M271, M152 e M392, foram absorvidos em poliestireno em tampão de carbonato-bicarbonato 0,05M a pH 9,5, durante 18 horas, a 6°C (100 μΐ de solução de anticorpo em cada poço). A absorção não especifica do poliestireno foi removida com uma solução a 1% de albumina de soro bovino (BSA) em solução salina tamponada com fosfato (PBS) a pH 7,0, 200 μΐ em cada poço, incubado durante uma hora a 37°C.

Adicionaram-se 100 μΐ de antigénio de PAMG-1 a cada poço a concentrações de 50, 25, 12, 6, 3, 15, e 0,7 ng/ml. As amostras de soro sanguíneo ou fluido amniótico foram diluídas num tampão de BSA a 0,01% e Twin 20 a 0,05% em PBS. As amostras diluídas foram adicionadas aos poços e os poços foram incubados durante uma hora, a 37°C. A reacção foi desenvolvida pela solução de ortofenilenodiamina em tampão 59 ΕΡ1535068 citrato-fosfato 0,05M (pH 4,7), incubada durante 20 minutos a 37°C. A densidade óptica foi lida ao comprimento de onda de 492 nm.

Concebeu-se uma concentração de anticorpos na primeira camada e uma concentração de conjugado que resultaram na curva de densidade óptica padrão para PAMG-1 com um declive máximo de cerca de 45 graus (um aumento de uma unidade óptica corresponde a um aumento da concentração de PAMG-1 na amostra de 1 ng/ml), o limite superior (para a concentração de PAMG-1 de 50 ng/ml) de 1,5 unidades ópticas e o ponto de concentração zero sem exceder 0,1 unidades ópticas. As amostras para investigação (soros, fluido amniótico, secreção vaginal e cervical) foram congeladas a -40°C. Cada amostra foi testada três vezes. Os soros foram diluídos a 1/5 da concentração original. As amostras de fluido amniótico foram diluídas a 1/2000 da concentração original. Se a amostra tinha uma densidade óptica acima de 1,5 unidades, a amostra era novamente diluída e testada de novo.

Os dados obtidos estão resumidos a seguir nas tabelas 1-3.

Tabela 1

Concentração de PAMG-1 (ng/ml) no soro sanguíneo de mulheres não grávidas N M1-M91 M271-M52 M152-M91 M392-M371 1 20 0 15 12 2 20 0 15 13 3 60 5 50 4 6 4 50 7 48 50 5 40 4 30 34 6 64 15 50 56 7 20 7 15 14 8 48 8 35 30 60 ΕΡ1535068 9 15 0 10 14 10 40 5 20 35

Tabela 2

Concentração de PAMG-1 (ng/ml) no soro sanguíneo de mulheres grávidas (37-40 semanas de gestação) N M1-M91 M271-M52 M152-M91 M392-M371 1 90 8 70 50 2 100 15 90 75 3 105 16 95 75 4 120 22 100 94 5 100 12 98 90 6 98 14 95 80 7 104 20 90 80 8 98 25 75 60 9 64 5 55 40 10 70 10 60 40

Tabela 3

Concentração de PAMG-1 (ng/ml) no fluido amniótico (39— 40 semanas de gestação) N M1-M91 M271-M52 M152-M91 M392-M371 1 8.000 1 . 680 6.400 5.000 2 12.000 8 .000 6.000 5.000 3 10.000 6.000 7.000 6.000 4 6.000 2.000 5.000 4.500 5 8.000 12.000 5.800 5.000 6 7.000 20.000 5.000 5.000 7 6.000 2.000 4.000 3.000 8 75.000 8 .000 5.000 4.700 9 2.000 3.000 1.440 1.500 10 40.000 13.000 36.000 25.000

Exemplo 2: Isolamento de PAMG-1 D. Petrunin propôs o método modificado de isolamento de PAMG-1 em 1980 (Petrunin, D. D., Kozlyaeva, G. A. , Tatarinov, 61 ΕΡ1535068

Yu. S., Shevchenko, 0. P. , Bulletin of Experimental Biology and Medicine, No 5, p. 558,1980 (em russo)). Os passos do esquema estão delineados na tabela 4 a seguir.

Tabela 4

Passos de isolamento de PAMG-1

Passos de isolamento Q, "0 de pureza Q, "0 rendimento Fluido amniótico 16-25 semanas de gravidez 4 100 Precipitação por cloreto de lantânio a 0,5% 25 90 Precipitação por sulfato de amónio a 50% de saturação 35 70 Precipitação por sulfato de litio a 60% de saturação 60 60 Separação por cromatografia de fase inversa 90 30 A PAMG-1 foi separada do fluido amniótico às 16 a 25 semanas de gestação. 0 fluido foi obtido de mulheres cuja gravidez foi terminada devido a considerações médicas. Adicionámos uma solução a 10% de cloreto de lantânio à razão volumétrica de 20:1 (de modo que a sua concentração final era de 0,5%) ao fluido amniótico e manteve-se a 4°C durante 18 horas. Formou-se um precipitado e separou-se por centrifugação a 8.000 rpm durante 30 min. Dissolvemos o precipitado na solução saturada de Na2HP04 e separámos o precipitado de sais de lantânio insolúveis produzidos no processo, por centrifugação a 8.000 rpm durante 30 min. Fraccionámos a solução resultante com sulfato de amónio 62 ΕΡ1535068 saturado a 50%, incubando a 4°C durante 18 horas e dissolvemos o precipitado resultante na água destilada, de modo a recuperar em ambos os casos o volume das fracções de precipitação dissolvidos para o volume inicial do fluido amniótico. Em seguida precipitámos a solução com sulfato de litio saturado a 60% e dissolvemos o precipitado numa pequena quantidade de água destilada. Após a diálise, absorvemos as misturas com pirofosfato de cálcio adicionando um volume igual de absorvente húmido à solução de proteína, misturando e incubando durante 10-15 min, e separando o absorvente por centrifugação.

Exemplo 3: Produção de linhas híbridas estáveis da presente invenção

Experiência de hibridoma 1. Utilizaram-se linfócitos de nódulos linfáticos popliteais de 5 ratinhos BALB/c. Os ratinhos foram imunizados por cinco injecções de PAMG-1 nas almofadas das patas. Cada injecção consistia de 100 pg de PAMG-1 e adjuvante de Freund completo, numa razão de 1:1. Após a fusão celular, as células foram semeadas em 1152 poços Testou-se um total de 363 hibridomas primários, 38 dos quais eram PAMG-l-positivos. Em seguida testou-se a especificidade dos anticorpos monoclonais estudando a sua ligação de reacção cruzada de proteínas alfa-2-microglobulina de fertilidade, gonadotrofina coriónica humana, beta-l-glicoproteína trofoblástica, lactogénio de placenta humana, alfa-fetoproteína e albumina de soro humano. Seleccionaram-se catorze hibridomas primários cujos anticorpos monoclonais não tinham reacção cruzada com outras proteínas. Em seguida, utilizou-se um método de diluições limitantes para clonar duas vezes os hibridomas específicos de PAMG-1 primários. Por 63 ΕΡ1535068 fim, seleccionaram-se cinco clones que eram aparentemente os produtores mais estáveis e produtivos de anticorpos monoclonais Ml, M38, M42, M52, M91.

Experiência de hibridoma 2. Utilizaram-se linfócitos do baço de 5 ratinhos. Os ratinhos foram imunizados cinco vezes por injecção intraperitoneal de 100 pg de PAMG-1. Cada injecção consistia de PAMG-1 e adjuvante completo Freund numa razão de 1:1. Utilizaram-se 1344 poços e 562 hibridomas. De entre estes, 45 eram PAMG-l-positivos, e 19 não tinham reacção cruzada com as outras proteínas, e.g. específicos de PAMG-1. Os hibridomas sem reacção cruzada foram clonados duas vezes e verificou-se que 6 clones eram particularmente estáveis e seleccionaram-se produtores intensivos de anticorpos monoclonais M122, M152, M211, M271, M371 e M392 para uso posterior.

Deste modo, produziram-se 11 anticorpos monoclonais contra PAMG-1 e em seguida foi seleccionado o par destes anticorpos que detectou uma concentração de fundo mínima de PAMG-1 na secreção vaginal da mulher grávida, como descrito no Exemplo 4.

Linhas celulares especificas de acordo com a presente invenção

Os anticorpos M271 e M52 são produzidos pelas linhas celulares de hibridoma M271 e M52, respectivamente. As linhas celulares que produzem os anticorpos monoclonais aqui referidos como M271 e M52 e adicionalmente M42, produzem anticorpos monoclonais utilizados para estabelecer e ajustar 64 ΕΡ1535068 um limiar de sensibilidade do dispositivo, como descrito a seguir. A tabela 5 descreve os resultados para a produção de hibridomas de dois ensaios.

Tabela 5

Total 1° hibridoma 2o hibridoma Poços, total 2496 1152 1344 Número de hibridomas primários 925 363 562 Número de hibridomas que produzem anticorpos monoclonais PAMG-l-positivos 83 38 45 Número de hibridomas que produzem anticorpos monoclonais específicos de PAMG-1 33 14 19 Número de linhas de hibridoma estáveis que produzem anticorpos monoclonais, seleccionados para estudos posteriores 11 5 6

Exemplo 4: Selecção do par de anticorpos monoclonais que detecta uma concentração mínima de PAMG-1 na secreção vaginal da mulher grávida. A PAMG-1 a uma concentração de 1 pg/ml em tampão carbonato-bicarbonato 0,05M, pH 9,5, foi absorvida em placas 65 ΕΡ1535068 de poliestireno por incubação durante 18 horas, a 4°C. Os anticorpos listados na tabela 6 foram adicionados aos poços em diluições em série, começando em 3 mg/ml. As placas foram em seguida incubadas durante uma hora a 37°C. Adicionou-se aos poços um conjugado de anticorpos anti-IgG de coelho anti-ratinho marcados com peroxidase de rábano. A reacção foi desenvolvida pela solução de ortofenilenodiamina em tampão citrato-fosfato 0,05M (pH 4,7), incubada durante 20 minutos a 37°C. 0 titulo de anticorpo monoclonal foi guantifiçado.

Tabela 6

Afinidade de ligação de PAMG-1 na concentração de 1 pg/ml por anticorpos monoclonais da presente invenção MAC Título a 1 pg/ml de concentração de PAMG-1 Ml 1: 900.000 M42 1:1.000.000 M52 1:1.000.000 M91 1:1.000.000 M122 1:2.000.000 Ml 52 1:1.000.000 M392 1:1.000.000 M371 1:400.000 M271 1:3.000.000 M38 1:50.000 M211 1:50.000

As concentrações de anticorpos monoclonais apresentadas na tabela 6 são as concentrações mínimas a que os anticorpos se ligam a PAMG-1, desde que a concentração de PAMG-1 na solução seja de 1 pg/ml. Quanto menor é a concentração, maior é a capacidade do anticorpo detectar concentrações mínimas de PAMG-1. Os anticorpos monoclonais M271 e M52 foram escolhidos para desenvolver uma ELISA de sensibilidade elevada para PAMG-1. 66 ΕΡ1535068 O anticorpo monoclonal M271 não apresentava reacção cruzada em ELISA com as seguintes proteinas individuais do fluido amniótico: alfa-2-microglobulina de fertilidade; gonadotrofina coriónica humana; lactogénio de placenta humana; beta-l-glicoproteina trofoblástica; alfa-fetoproteina; albumina de soro humano.

Adicionalmente, nas experiências com colunas fixaram-se anticorpos M271 em sefarose e o fluido amniótico não diluído foi passado através da coluna. Um eluato obtido a partir das colunas após electroforese mostrou uma banda correspondente a uma massa molecular gue correspondia à massa molecular de PAMG-1 (28-30 kDa). 0 anticorpo monoclonal de especificidade elevada M271 foi colocado na almofada do dispositivo de tira de fluxo lateral da presente invenção.

Em contraste com o anticorpo M271, o anticorpo M52 tinha reacção cruzada em ELISA com a proteína IGFBP-3, que é abundante no soro e fluido amniótico. A concentração do IGFBP-3 não glicosilado medido na secreção vaginal era de cerca de 600 ng/ml (Exemplo 9) . Nas experiências com o dispositivo de tiras da presente invenção, o IGFBP-3 a esta concentração não inibiu o reconhecimento de PAMG-1 na concentração de 5 ng/ml.

Exemplo 5: Teste ELISA de sensibilidade elevada para otl-Microglobulina de placenta Não foi possível detectar PAMG-1 na secreção vaginal utilizando ELISA convencional e o par de anticorpos M271-M52. Para permitir a detecção, a sensibilidade do teste ELISA foi 67 ΕΡ1535068 aumentada, diminuindo a concentração de PAMG-1 necessária para a detecção de 0,05 ng/ml.

Desenvolveu-se um sistema de imunoensaio de sanduiche com anticorpos M271-M52, que demonstrou sensibilidade de 50 picogramas por mililitro (0,05 ng/ml):

Ia camada: anticorpos monoclonais M271, concentração de 6 pg/ml, no tampão carbonato-bicarbonato pH 9,5. 2a camada: PAMG-1, concentrações de 3200, 1600, 800, 400, 200, 100, 50 pg/ml, e secreções cervicais e vaginais diluidas a ^ concentração no tampão com pH=7,0. 3a camada: conjugado M52 no tampão, a uma diluição 1/1000 . O aumento na sensibilidade foi obtido variando a Ia e 3a camadas. Em contraste com o sistema de sensibilidade elevada, no sistema regular com sensibilidade de 1 ng/ml a Ia camada foi formada com concentração de M271 de 10 a 20 μg/ml, e a diluição do conjugado (M52 marcado com peroxidase de rábano) era de 1/40.000.

Obteve-se uma curva de calibração padrão. Esta é apresentada na tabela 7 a seguir, em que a concentração de PAMG-1 é dada em picogramas por mililitro (pg/ml) e a densidade óptica da coloração E observada ao comprimento de onda de 450 nm é em unidade não dimensionais, convencionais. 68 ΕΡ1535068

Tabela 7

Curva de calibração do teste ELISA de sensibilidade elevada PAMG- 3200 1600 800 400 200 100 50 0 1 pg/ml E450 nm 2,000 1, 725 1,432 1, 130 0, 851 0, 600 0,304 0,051

Exemplo 6: PAMG-1 nas secreções vaginais de mulheres grávidas

Tabela 8

Concentração de PAMG-1 (ng/ml) na secreção vaginal da mulher grávida. As medições são realizadas utilizando pares de anticorpos monoclonais diferentes contra PAMG-1 (29-41 semanas de gestaçao) N Semanas de gestação M1-M91 M271-M52 M152-M91 M392-M371 1 29 25 0,15 5 6 2 34 50 0,1 10 8 3 37-38 70 0,22 30 15 4 37-38 60 0,06 25 10 5 33-34 30 0,05 13 5 6 29-30 45 0,05 13 5 7 33 50 0,16 14 10 8 30 60 0,09 15 12 9 39-40 84 0,21 28 18 10 35-36 90 0,13 30 19 11 38-39 90 0, 13 30 20 12 38 65 0, 15 25 15 13 31 95 0,35 45 30 14 39 44 0, 05 10 5 15 29-30 80 0,2 28 12 16 40-41 58 0, 078 24 10 17 37 90 0, 15 40 30 18 29-30 70 0,4 15 12 19 29 65 0, 64 15 12 20 30 80 0,1 22 20 69 ΕΡ1535068

Após medição das concentrações mínimas, cada anticorpo foi marcado com peroxidase de rábano. No teste ELISA, introduziram-se anticorpos não marcados a uma concentração de 10 pg/ml nos poços das placas. Em seguida, introduziu-se PAMG-1 nas concentrações de 50, 100, 200, 400, 800, 1600, 3200 pg/ml para uma segunda camada no plástico. Por último, o conjugado de um dos outros anticorpos foi introduzido em cada poço da placa. Os anticorpos seguintes gue funcionam em pares foram seleccionados (apresentados agui como anticorpo-conjugado): M1-M91 ; M271-M52 ; M152-M91; M392-M371.

Estes pares de anticorpos foram utilizados para medir a concentração de PAMG-1 na secreção vaginal da mulher grávida. Por fim, escolheu-se o par de anticorpos M271-M52, para o qual a concentração de PAMG-1 medida na secreção vaginal era a mais baixa. A concentração de PAMG-1 para o par M271-M52 foi medida utilizando ELISA altamente sensível. 0 par M271-M52 seleccionado e alguns outros pares foram utilizados para medir a concentração de PAMG-1 no fluido amniótico e no soro sanguíneo de mulheres não grávidas e grávidas (Exemplo 1, supra).

Exemplo 7: PAMG-1 nas secreções Vaginal e Cervical de mulheres grávidas

Tabela 9

Concentração de PAMG-1, picograma por mililitro (pg/ml), na secreção cervical e vaginal de mulheres grávidas. Gestação normal na tabela a seguir indica a ausência de qualquer desvio do curso normal de gestação diagnosticado N° PAMG-1, PAMG-1 Semana Notas pg/ml na pg/ml na de secreção secreção gestação 70 ΕΡ1535068 cervical vaginal 1 230 150 29 Gestação normal 2 220 100 34 Gestação normal 3 340 150 38 Erosão, sangue na secreção cervical 4 110 220 37-38 Gestação normal 5 100 60 37-38 Gestação normal 6 350 78 40-41 Sangue na secreção cervical 7 60 400 29-30 Ameaça de aborto 8 50 50 33-34 Gestação normal 9 180 50 29-30 Gestação normal 10 470 150 37 Sangue na secreção cervical 11 600 640 29 Ameaça de aborto 12 150 160 33 Gestação normal 13 170 90 30 Gestação normal 14 122 210 39-40 Oligohidramnios, gestose 15 300 50 39 Gestose, vaginite 16 56 130 35-36 Distúrbio de sangue retroplacentar 17 120 130 38-39 Anemia 18 1000 5000 30-31 Perda de fluido amniótico 19 400 200 29-30 Ameaça de aborto 20 800 350 31 Gestose

Exemplo 8: PAMG-1 nas secreções vaginais de mulheres grávidas com vaginite

Tabela 10

Concentração de alfa-l-microglobulina placentar na secreção vaginal da mulher grávida com vaginite. As medições foram feitas utilizando um teste ELISA não-de sensibilidade elevada N° do paciente PAMG-1 (ng/ml) 1 1,2 2 2, 0 3 0 4 2,5 5 1,5 6 1,9 71 ΕΡ1535068 7 1,5 8 2,0 9 1,4 10 1,2 11 1,0 12 0 13 0 14 O 00 15 1,5

Tabela 11

Concentração de alfa-l-microglobulina placentar na secreção vaginal da mulher grávida com vaginite N Nome (segunda inicial, primeira inicial, inicial do meio) Diagnóstico Resultado do dispositi vo da presente invenção é negativo) ELIS A ng/m 1 1 Ch.. G. A 40 semanas gestação. Vaginite — 1,2 2 To., E. N. 38 semanas gestação. Hipotrof ia Fetal. Vaginite 2,0 3 Ne., N. N 33 semana gestação Pielonefrite. Vaginite 0 4 St. . A. G. 38 semanas gestação. Pélvis contraída. Vaginite 2,5 5 So., T. N 40 semanas gestação. Vaginite 1,5 6 O V o Ω 29-30 semanas gestação. Risco de trabalho de parto prematuro 1, 9 7 Ry . , V. V. 29 semanas gestação. Sinais de trabalho de parto. Vaginite 1,5 72 ΕΡ1535068 8 Ma ., K. S. 38 semanas gestação. Erosão Cervical. Vaginite 2,0 9 St. , L. E. 38-39 semanas gestação. Pélvis contraída. Erosão cervical. Vaginite 1,4 10 La. . V. S 36-37 semanas gestação. Risco de trabalho de parto prematuro. Vaginite 1,2 11 Si., Μ. A. 39 semanas gest ação. Nefropatia. Anemia. Vaginite 1,0 12 Sh.,S.V. 37-38 semanas gestação. Nefropatia. Vaginite 0 13 Ab . , R. V. 36- 37 semanas gest ação. Risco de trabalho de parto prematuro. Vaginite 0 14 Gu . , E . K . 36 semanas gestação. Risco de trabalho de parto prematuro. Vaginite 3, 0 15 Ro., N. V. 35 semanas gestação. Vaginite 1,5 16 De., S. V. 32 semanas gestação. Erosão cervical. Vaginite 0 17 Zd., I. V. 35 semanas gestação. Risco de trabalho de parto prematuro. Erosão cervical. Vaginite 1,0 18 Ko., T.V. 24 semanas gestação. Risco de trabalho de parto prematuro. Vaginite 0 19 Ma., I. V. 36 semanas gestação. Risco de trabalho de parto prematuro. Vaginite 0 20 IO.,I. V. 40 semanas gestação. Erosão 0 73 ΕΡ1535068 cervical. Vaginite 21 Ma., S. 39 semanas gest ação — 0 22 Ve., E. L. 38 semanas gestação. Erosão cervical. Vaginite 0 23 St., I. N. 36 semanas gestação. Nefropatia. Vaginite 0 24 Ro., V. A. 39-40 semanas gestação. Anemia. Vaginite 0 25 Pu.,T.A. 38-39 semanas gestação — 0 26 Tu., Y. A. 21 semanas gestação. Suspeita de PROM 0 27 No., G.V. 22 semanas gestação. Risco de terminação 0 28 Ma., E. V. 31-32 semanas gestação. Pielonefrite. Vaginite 0 29 St., I. V. 36 semanas gestação. Risco de terminação 0 30 Ka., K. P. 32 semanas gestação. Nefropatia — 0

Exemplo 9: Modificações das características do dispositivo de tiras

Na primeira experiência, prepararam-se soluções de MAc M52 nas concentrações 1, 1/2,1/4, 1/8,1/16 e 1/32 mg/ml. Cada solução foi colocada num dispositivo de tira. Uma mistura destes três MAc (M52, M271, M42) foi também diluída nas concentrações 1, 1/2,1/4, 1/8,1/16 e 1/32 do original e cada solução diluída foi introduzida num dispositivo de tira separado. Em seguida, a solução contendo PAMG-1 na 74 ΕΡ1535068 concentração de 50 ng/ml foi adicionada a cada um dos 12 dispositivos de tira. A solução de anticorpo M52 puro tornou a banda corada na região de teste visível, a uma concentração de 1/8, e na mistura de MAc, a banda corada ficou visível a uma concentração de 1/2. Deste modo, a mistura de MAc inibe a ligação de moléculas PAMG-1, ajustando desse modo a visibilidade da banda.

Anticorpos monoclonais nas concentrações: M52: 0,8 mg/ml, M271: 0,1 mg/ml, e M42: 0,1 mg/ml foram colocados na região de teste de muitos dispositivos de tira. Em seguida, a PAMG-1 numa de uma vasta gama de concentrações, de 12800 ng/ml a 7 ng/ml, e a 1 ng/ml foi adicionada à região de teste de cada um dos dispositivos de tira da presente invenção. Foi possível observar a banda de teste a olho nu humano, na gama de concentrações de PAMG-1, de 12800 ng/ml a 7 ng/ml, e não foi possível observar na concentração de 1 ng/ml. Ao mesmo tempo, quando se utilizou a solução pura de M52 na mesma concentração, foi possível observar a tira de teste em toda a gama de concentrações de PAMG-1, incluindo 1 ng/ml, embora a intensidade a 1 ng/ml fosse baixa. Isto aumentou grandemente a probabilidade de ocorrerem resultados falso positivos nos pacientes com determinadas condições clínicas, tais como inflamação. 1. Ajuste da sensibilidade do dispositivo de tira da presente invenção com uma combinação de dois anticorpos na região de teste.

Na primeira investigação, apenas os anticorpos M52 (numa concentração de 0,4 mg/ml) foram introduzidos na região de teste. Na segunda investigação, os anticorpos M52 (numa 75 ΕΡ1535068 concentração de 0,4 mg/ml) e os anticorpos M271 (numa concentração de 0,4 mg/ml) foram introduzidos na região de teste. 0 anticorpo M271 conjugado com partículas de ouro foi introduzido na região de almofada numa concentração escolhida de modo a gue a densidade óptica fosse de dez ao comprimento de onda de 510 nm. Este conjugado foi introduzido na almofada numa solução de sacarose a 10% e caseína a 2%. A PAMG-1 foi titulada às concentrações de 20, 10, 5, e 1 ng/ml.

Nas tabelas a seguir, os números são índices de densidade óptica relativa medidos pelo programa Sigma Scan num scanner. Os anticorpos M271 estão na almofada; uma combinação M271+M52 está na região de teste. "+"indica que a tira de teste é visível (suficientemente corada para se detectada pelo olho humano), indica que a banda de teste não pode ser detectada pelo olho humano.

Concentração de PAMG-1, ng/ml 20 10 5 1 MAc M52 62 58 39 2 visível + + + - MAc M52+M271 82 8 2 4 visível + - - - A sensibilidade do teste mudou de 5 ng/ml na primeira investigação, para 20 ng/ml na segunda investigação. Pode-se concluir que por adição do MAc M271 à região de teste se obteve uma inibição de quatro vezes da sensibilidade. 76 ΕΡ1535068 2. Ajuste da intensidade de cor de uma banda de teste no dispositivo de tira com uma combinação de dois anticorpos

Na primeira investigação, apenas os anticorpos M52 (a uma concentração de 0,8 mg/ml) foram introduzidos na região de teste. Na segunda investigação, introduziram-se anticorpos M52 (0,8 mg/ml), anticorpos M271 (0,7 mg/ml) e anticorpos M42 (0,8 mg/ml) na região de teste. A mistura de anticorpos para a região de teste foi preparada como se segue: 14 μΐ (microlitros) de solução de anticorpo M52, a uma concentração de 8,6 mg/ml, foram misturados com 7 μΐ de solução M42 a uma concentração de 13,9 mg/ml e com 3 μΐ de solução de M271, a uma concentração de 10,9 mg/ml. Em seguida, o tampão foi adicionado ao volume total de 150 μΐ e a solução foi introduzida no dispositivo de tira.

Na tabela a seguir, são apresentadas as densidades ópticas relativas.

Concentração de PAMG-1, ng/ml 50 25 12 6 3 1,5 MAc M52 17 13 9 5 2 0 visível + + + + - - MAc M271+ 25 18 13 3 0 0 M52+M42 + + + - - - visível 0 declive (gradiente) da curva de densidade óptica diferia entre a primeira e segunda investigações. A uma concentração de PAMG-1 de 12 ng/ml, a linha corada na tira na segunda investigação era mais clara do que na primeira investigação. A uma concentração de PAMG-1 de 6 ng/ml, a 77 ΕΡ1535068 linha corada na tira era visível na primeira investigação, mas invisível na segunda investigação.

Com uma combinação de anticorpos, observaram-se bandas visualmente mais brilhantes. Deste modo, apesar de quase a mesma sensibilidade, a intensidade de coloração observada pelo olho humano era diferente. 3. Ajuste da sensibilidade e declive da curva de intensidade de coloração do dispositivo da presente invenção utilizando uma combinação de quatro anticorpos.

Na tabela a seguir "+" designa banda de teste visível a banda de teste não pode ser detectada pelo olho humano.

Concentração de PAMG-1, ng/ml 0 1 2,5 5 10 25 50 MAc M52+M42+M172 + + + MAc M271+ M52+M42+M122 visível + + + +

Deste modo, combinando anticorpos, pode-se ajustar a sensibilidade do teste.

Exemplo 10: Resultados de ensaios clínicos

PROTOCOLO DE ESTUDO

Os pacientes foram avaliados por controlo de "avaliação clínica" e pelo dispositivo da presente invenção. 78 ΕΡ1535068

Critérios de inclusão: 1) Idade gestacional 20,0-41,0 semanas. 2) Paciente que refere sinais ou sintomas sugestivos de PROM ou PPROM. 3) Nenhum exame vaginal digital até se obterem espécimes para avaliar a PROM ou PPROM da paciente. 4) a paciente consente um exame com espéculo estéril para recolha de avaliação clinica convencional (recolha, nitrazina, Ferning) e esfregaços estéreis para o teste de PAMG-1.

Critérios de Exclusão: 1) Sangramento vaginal activo de qualquer origem 2) Placenta prévia

Análise estatística disponível de 192 pacientes desde 12/15/2000 do Sharp Memorial Mary Birch Hospital for women (San Diego) e do Summit Medicai Center (Oakland).

Em duas pacientes de um total de 192, o dispositivo da presente invenção originou uma resposta positiva, enquanto que a determinação clínica convencional não apresentou nenhuma evidência de PROM. Estes dois casos, portanto, foram originalmente contabilizados como um resultado falso positivo a partir do dispositivo da presente invenção (ver dados "não corrigidos" a seguir). No entanto, os sintomas de PROM rapidamente se desenvolveram em ambas as pacientes no espaço de horas após o teste. O diagnóstico de PROM foi confirmado numa segunda avaliação clínica e ambos os resultados do dispositivo da presente invenção eram positivos verdadeiros (A coluna "Corrigido" representa os dados do ensaio final). 79 ΕΡ1535068

Dados combinados Dados combinados (Não corrigido) (Corrigido) Dx PROM Dx PROM a=84, b=5, c=2, d=101 a=88, b=l, c=0, d= 103 Sensibilidade = a/ (a+c) 84/ Sensibilidade = 84/ (84+2) = 97,7% (84+0) = 100% especificidade d/ (b+d) = Especificidade = 103/ 101/ (5 + 101) = 95,3% (1+103) = 99% PPV = a/(a+b) = 84/(84+5) = 94,4% PPV = 88/(88+1) = 99% NPV = d/ (d+c) =101/ (101+2) = 98,1% NPV = 103/(103+0) 100% em que a é o número de casos positivos verdadeiros observados; b é o número de casos falso negativos observados; c é o número d casos falso positivos observados; d é o número de casos negativos verdadeiros observado; a d

Sensibilidade = _; Especificidade = _ ; a + c b + d

Valor preditivo positivo: a PPV = _ a + b

Valor preditivo negativo: 80 ΕΡ1535068 d NPV = _ d + c

Positivo verdadeiro é o número de respostas positivas pelo dispositivo da presente invenção, PROM é confirmado pela avaliação clinica subsequente,

Negativo verdadeiro é o número de respostas negativas confirmadas pela avaliação clinica subsequente.

Falso Positivo é o número de respostas positivas, mas PROM não é confirmada por avaliação clinica subsequente.

Falso Negativo é o número de respostas negativas, mas PROM é confirmada por avaliação clinica subsequente.

Tabela 12. Ensaios do dispositivo da presente invenção (Lot C 98-0007) na Third Maternity Hospital of Moscow, Russian

Federation, Obstetrics and Gynecology Department #2. N Nome (segunda inicial, primeira inicial, inicial do meio) Diagnóstico Resultados de Amnisure Notas 1 Ser., L. B. 17 semanas gestação. Ameaço de aborto. Vaginite Negativo Observação clinica: sem perdas 2 GcL · f L . A · 17 semanas gestação. Ameaço de aborto. Negativo Observação clinica: sem perdas 3 Kuz., Μ.B. 23 semanas gestação. pH-negativo. Negativo Sem perdas 81 ΕΡ1535068

Sangue 4 Bul., Μ.V. 39 semanas gestação. Suspeita de perdas. Vaginite Positivo Observação clinica: descarga vaginal aumentada. Observação posterior: teste positivo confirmado (mais descarga, inicio do trabalho de parto) 5 Kra., E.U. 40 semanas gestação. Gestose. Amniotomia Negativo Observação clinica: sem perdas 6 Mel., N.V. 39 semanas gestação. Gestose. Doença urolítica Negativo Observação clinica: sem perdas 7 Buh, S.N. 29 semanas gestação. Hipertensão Negativo Observação clinica: sem perdas 8 Niv., I.P. 27-28 semanas gestação. Ameaço de aborto Negativo Observação clinica: sem perdas 9 Aik., A. 35 semanas gestação. Ameaço de aborto. Vaginite Negativo Observação clinica: sem perdas 10 Yak., L.A. 40 semanas de gestação Negativo Observação clinica: sem perdas 11 Kis., G.V. 33 semanas gestação. Ameaço de aborto. Vaginite Negativo Observação clinica: sem perdas 12 Koch., L.A. 34 semanas gestação. Negativo Observação clinica: 82 ΕΡ1535068

Suspeita de perdas sem perdas 13 Bai., S.A. 32 semanas gestação. Ameaço de aborto. Gestose Negativo Observação clinica: sem perdas 14 Mor., I.S. 32 semanas gestação. Ameaço de aborto. Vaginite Negativo Observação clinica: sem perdas 15 Ugr., T.I. 32-33 semanas gestação. Gestose. Pouco fluido amniótico Negativo Observação clinica: sem perdas 16 Pav., N.A. 22-23 semanas gestação. Gestose. Vaginite Negativo Observação clinica: sem perdas 17 Bog., T.I. 29 semanas de gestação. Ameaço de aborto Negativo Observação clinica: sem perdas 18 Var., T.I. 32 semanas de gestação. Gestose Negativo Observação clinica: sem perdas 19 Dal., O.V. 35 semanas de gestação. Gestose. Vaginite Negativo Observação clinica: sem perdas 20 Koz., 0.A. 40 semanas de gestação Negativo Observação clinica: sem perdas 21 Sen, S.G. 12-13 semanas gestação. Ameaço de aborto Negativo Observação clinica: sem perdas 22 Pol., E.A. 21 semanas gestação. Ameaço de aborto Negativo Observação clinica: sem perdas 23 Ber., L.M. 24 semanas gestação. Ameaço de aborto Negativo Observação clinica: sem perdas 83 ΕΡ1535068 24 Ard., V.M. 39 semanas gestação. Gestose aguda. Insuficiência placentar Negativo Observação clínica: sem perdas 25 Aki, A. 8 semanas gestação. Gestose. Vaginite Negativo Observação clínica: sem perdas

Tabela 13. Ensaios do dispositivo da presente invenção (Lot C 98-0007) na Third Maternity Hospital of Moscow, Russian

Federation N Nome Diagnóstico Resultados de Amnisure Notas 1 Fan, E.A: 38 semanas gestação. Edema Negativo Observação clínica: confirmou os resultados do teste 2 Sem., Z.D. 36 semanas gestação. Gestose Negativo Observação clínica: confirmou os resultados do teste 3 Tab., N.V. 36-37 semanas gestação. Ameaço de aborto Negativo Observação clínica: confirmou os resultados do teste 4 Zah., O.P. 35 semanas gestação. Edema Negativo Observação clínica: confirmou os resultados do teste 5 Dem., 0.V. 38-39 semanas gestação. Edema Negativo Observação clínica: confirmou os 84 ΕΡ1535068 resultados do teste 6 Vul., D.V. 32 semanas gestação. Ameaço de aborto. Vaginite Negativo Observação clinica: confirmou os resultados do teste 7 Klo., V.V. 38-39 semanas gestação. Edema, Pielonefrite. Erosão cervical Negativo Observação clinica: confirmou os resultados do teste 8 Bor., E.A. 35-36 semanas gestação. Distúrbio da circulação placentar Negativo Observação clinica: confirmou os resultados do teste 9 Jer., E.A. 40-41 semanas gestação. Negativo Observação clinica: confirmou os resultados do teste 10 Vik., N.P. 41-42 semanas de gestação. Pielonefrite. Edema Negativo Observação clinica: confirmou os resultados do teste 11 Tul., O.S. 35-36 semanas gestação. Gestose.Obesidade Negativo Observação clinica: confirmou os resultados do teste 12 Med., T.E. 38-39 semanas gestação. Varicose Negativo Observação clinica: confirmou os resultados do teste 13 Kuz., T.A. 39-40 semanas gestação. Negativo Observação clinica: confirmou os 85 ΕΡ1535068 resultados do teste 14 Kab., E .M. 39-40 semanas gestação. Edema. Polihidramnios Negativo Observação clínica: confirmou os resultados do teste 15 Che., E . V. 39-40 semanas gestação. Edema. Anemia Negativo Observação clínica: confirmou os resultados do teste 16 Tih., T.Y. 40 semanas gestação. Pré-e c1amp s i a Negativo Observação clínica: confirmou os resultados do teste 17 Bah., N. I . 39-40 semanas gestação. Prognóstico de parto. Suspeita de perdas Negativo Observação clínica: confirmou os resultados do teste 18 Gol. , N. V. 38-39 semanas gestação. Hipoxia fetal Negativo Observação clínica: confirmou os resultados do teste 19 Gri . , O.V. 25 semanas de gestação. Ameaço de aborto Negativo Observação clínica: confirmou os resultados do teste

Tabela 14. Ensaios do dispositivos da presente invenção (Lote C 98-0007) na Third Maternity Hospital of Moscow, Russian Federation N Diagnóstico Resultados de Amnisure Notas 1 40 semanas gestação. Positivo Dores de pato, 86 ΕΡ1535068

Feto gigante. Suspeita de perdas actividade de trabalho de parto desenvolvidas em 4 horas. Perda evidente observada 2 34 semanas gestação. Ameaço de aborto. Negativo Observação clinica durante 6 horas: sem perdas 3 39 semanas gestação. Negativo Observação clinica: Sem perdas 4 40 semanas gestação. Positivo Observação clinica: sem perdas 5 39-40 semanas gestação. Negativo Observação clinica: sem perdas 6 39-40 semanas gestação Negativo Observação clinica: sem perdas 7 39-40 semanas gestação. Erosão cervical Negativo Observação clinica: sem perdas 8 40 semanas gestação. Sintomas de trabalho de parto. Perda de fluido amniótico Positivo Observação clínica: perda de fluido amniótico 9 39 semanas gestação. Negativo Observação clínica: sem perdas 10 39-40 semanas de gestação Negativo Observação clínica: sem perdas 11 39 semanas gestação. Negativo Observação clínica: sem perdas

Tabela 15. ensaios do dispositivo da presente invenção (Lote C 98-0007) na Third Maternity Hospital of Moscow, Russian Federation, Obstetrics and Gynecology Chair of the State Moscow University of Rússia N Diagnóstico Resultados de Amnisure Notas 1 39 semanas gestação. Negativo Dores de pato, 87 ΕΡ1535068

Nefropatia. Hidramnios actividade de trabalho de parto desenvolvidas em 4 horas. Perda evidente observada 2 41 semanas gestação. Ameaço de aborto. Negativo Observação clinica durante 6 horas: sem perdas 3 39-40 semanas gestação. Feto gigante. Sintomas de trabalho de parto. Nefropatia Negativo Observação clinica: Sem perdas 4 39-40 semanas gestação. Negativo Observação clinica: sem perdas 5 37-38 semanas gestação. Mistura de sangue. Hipertensão Negativo Observação clinica: sem perdas 6 36 semanas gestação. Nefropatia Negativo Observação clinica: sem perdas 7 40 semanas gestação. Suspeita de perdas Positivo Observação clinica: perda. Trabalho de parto desenvolvido em 30 minutos 8 39-40 semanas gestação. Negativo Observação clinica: sem perda de fluido amniótico 9 38-39 semanas gestação. Negativo Observação clinica: sem perdas 10 38 semanas de gestação Negativo Observação clinica: sem perdas 11 39 semanas gestação. Parturiente adolescente Negativo Observação clinica: sem perdas 12 32 semanas gestação. Hipotrofia fetal Negativo Observação clinica: sem perdas 13 39-40 semanas gestação. Gestose Negativo Observação clinica: sem perdas 88 ΕΡ1535068 ΕΡ1535068 14 24 semanas gestação. Ameaço de aborto Negativo Observação clínica: sem perdas 15 34-35 semanas gestação. Gestose Negativo Observação clínica: sem perdas 16 33 semanas gestação. Edema Negativo Observação clínica: sem perdas 17 34-35 semanas gestação. Gestose Negativo Observação clínica: sem perdas 18 35-36 semanas gestação. Hipotrofia fetal Negativo Observação clínica: sem perdas 19 32 semanas gestação. Ameaço de aborto Negativo Observação clínica: sem perdas 20 38-39 semanas gestação. Suspeita de perdas. Mistura de sangue na descarga vaginal Negativo Observação clínica: sem perdas. As águas rebentaram em 10 horas, o trabalho de parto iniciou 21 40-41 semanas gestação. Sintomas de trabalho de parto Negativo Observação clínica: sem perdas 22 25 semanas gestação. Ameaço de aborto Negativo Observação clínica: sem perdas 23 28 semanas gestação. Gestose Negativo Observação clínica: sem perdas

Notas: a perda de fluido amniótico nas Tabelas 13, 14, 15 foi avaliada clinicamente pela quantidade de descarga vaginal e por análise ultrassonográfica. resultados de pacientes concomitantes. teste foram A observação clinica alargada em negativos foi possível porque as hospitalizadas para tratamento de doenças 89 ΕΡ1535068 O âmbito da presente invenção não deve ser limitado pelas concretizações especificas aqui descritas. De facto, várias modificações da invenção além das aqui descritas deverão ser evidentes para os peritos na arte a partir da descrição anterior e figuras anexas. Estas modificações estão no âmbito das reivindicações anexas.

Deve também entender-se que todos os valores são aproximados e são proporcionados para efeitos de descrição.

Tabela 16. Microorganismos depositados na Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM) Depositary (1 Dorozhny proezd 1, Moscovo 117545, Rússia).

Nome Data de depósito N° de Acesso Linhas celulares de hibridoma N52 22 de Maio, 2003 VKPM H-92 Linhas celulares de hibridoma N271 22 de Maio, 2003 VKPM H-93 Linhas celulares de hibridoma N42 22 de Maio, 2003 VKPM H-94

Lisboa, 24 de Junho de 2010 90

Claims (9)

1. ΕΡ1535068 REIVINDICAÇÕES 1. Método para detectar a perda de fluido amniótico em secreções vaginais, o qual compreende detectar a ligação de um par de anticorpos monoclonais específicos para PAMG-1 numa secreção vaginal, em que os anticorpos monoclonais do referido par são M271, produzidos pelo hibridoma N271, depositado na Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM) Depository e com o número de acesso VKPM-93; e M52, produzido pelo hibridoma N52, depositado na VKPM e com o número de acesso VKPM-92; e utilizando pelo menos um anticorpo monoclonal anti-PAGM-1 adicional, de modo a estabelecer com precisão um determinado limiar de sensibilidade do método, em que o referido pelo menos um anticorpo monoclonal anti-PAMG-1 adicional é M442, produzido pelo hibridoma N42, depositado na VKPM e com o número de acesso VKPM-94.
2. 2. Método de acordo com a reivindicação 1, em que um dos pares de anticorpos está imobilizado num suporte sólido.
3. 3. Método de acordo com a reivindicação 2, em que o suporte sólido é uma membrana através da qual o líquido se pode mover por acção capilar.
4. 4. Método de acordo com a reivindicação 2, que compreende ainda um segundo anticorpo específico para PAMG-1 imobilizada no suporte sólido.
5. 5. Método de acordo com a reivindicação 4, em que a razão entre o anticorpos imobilizados no suporte sólido proporciona 1 ΕΡ1535068 um limiar de detecção de PAMG-1 de cerca de 5 nanogramas por mililitro.
6. 6. Dispositivo que compreende um anticorpo imobilizado especifico para PAMG-1 e um anticorpo mobilizável especifico para PAMG-1 e pelo menos um anticorpo monoclonal anti-PAMG-1 adicional, de modo a estabelecer um determinado limiar de sensibilidade, em que a mobilização do anticorpo mobilizável por uma amostra de fluido permite a ligação do anticorpo mobilizável a qualquer PAMG-1 na amostra e a ligação do complexo anticorpo-PAMG-1 mobilizável formado deste modo com o anticorpo imobilizado, em que o anticorpo mobilizável compreende um marcador, em que o anticorpo mobilizável é M271, produzido pelo hibridoma N271, depositado na Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM) Depository e com o número de acesso VKPM-93; o anticorpo imobilizado é M52, produzido pelo hibridoma N52, depositado na VKPM e com o número de acesso VKPM-92 e o anticorpo monoclonal anti-PAGM-1 adicional é M42, produzido pelo hibridoma N42, depositado na VKPM e com o número de acesso VKPM-94.
7. 7. Dispositivo de acordo com a reivindicação 6, em que o anticorpo imobilizado está imobilizado num suporte de membrana.
8. 8. Dispositivo de acordo com a reivindicação 6, em que 0 marcador é ouro coloidal.
9. 9. Dispositivo de acordo com a reivindicação 6, em que a razão dos anticorpos imobilizados no suporte sólido proporciona um limiar do nível de detecção de PAMG-1 de cerca de 5 nanogramas por mililitro. 2 ΕΡ1535068 ΕΡ1535068 Lisboa, 24 de Junho de 2010 3