CN105467131B - 可以同时检测尿液和血清样本中α1‑微球蛋白的试剂盒 - Google Patents

可以同时检测尿液和血清样本中α1‑微球蛋白的试剂盒 Download PDF

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Abstract

一种可以同时检测尿液和血清样本中α1‑微球蛋白的试剂盒，包括试剂1和试剂2，其特征在于：所述的试剂1为含有抗人类风湿因子抗体和促凝剂的缓冲液；所述的试剂2为含有包被有抗人α1‑微球蛋白单克隆抗体的大粒径聚苯乙烯纳米颗粒的缓冲液。具有高灵敏度、宽线性、特异性更好、抗干扰能力强，且可以检测人尿液和血清的优点。

Description

可以同时检测尿液和血清样本中α1-微球蛋白的试剂盒
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体地说涉及一种可以同时检测尿液和血清样本中α1-微球蛋白的试剂盒。
背景技术
α1-微球蛋白(alpha-1-microglobulin,α1-MG)是人体内的一种相对分子量较小的糖蛋白。主要由人体肝细胞和淋巴细胞产生，广泛分布于包括血液、尿液、唾液等在内的各种体液中，以游离性和高分子量结合型存在。在血液中α1-微球蛋白主要以游离型α1-微球蛋白、与免疫球蛋白IgA结合形式、与白蛋白结合形式存在。游离型α1-微球蛋白能自由通过肾小球滤过膜，在近曲小管几乎全部被重吸收并分解代谢，而高分子量的结合型α1-微球蛋白则不能通过肾小球滤过，故正常人尿液中仅存在游离型α1-微球蛋白，若肾小球滤过膜受损，结合型α1-微球蛋白亦可出现于尿液中，因此血清α1-微球蛋白能敏感地反应肾小球滤过功能的改变。而正常情况下，通过肾小球滤过膜的游离型α1-微球蛋白约99.9％被肾小管重吸收，仅有微量排除体外，当近端小管功能受损时，重吸收效率降低，使得尿中α1-微球蛋白排泄量急剧增加。因此，尿α1-微球蛋白被认为是近端小管功能轻微损伤的敏感指标。人血清中α 1-微球蛋白的正常参考值为18.7±4.3mg/L，人尿中α1-微球蛋白的正常参考值为2.14±1.2mg/L，当肾小球滤过功能受损时，血中α1-微球蛋白年度可升高数倍，最高可升高十余倍，当肾小管重吸收功能受损时，尿中α1-微球蛋白亦可升高数倍。α1-微球蛋白在肾功能检查中，作为早期肾病的敏感指标，在门诊、健康诊断等领域中被广泛使用。
目前临床上广泛使用的α1-微球蛋白检测方法是酶联免疫吸附法(ELISA)和免疫比浊法。酶联免疫吸附法检测耗时且操作繁琐，不能满足大型医院对大批量样本快速检测的要求；免疫比浊法因其适用于全自动生化分析仪，操作方便，适合大批量样本的快速检测而得到广泛应用。目前免疫比浊法多采用纳米颗粒增强法和胶体金增强法。
中国国家知识产权局网站上公开了一种α1-微球蛋白检测试剂盒及其制备，基于多克隆抗体胶体金增强免疫比浊法，具有灵敏度高等优点，但其检测线性范围仅为0-40.0mg/L(详见专利说明书中第3/10页[0023]段)，而存在线性范围窄的问题，无法满足对α1-微球蛋白 浓度为40mg/L以上的高值病理临床样本检测的要求。中国国家知识产权局网站上还公开了一种纳米微球免疫比浊法检测α1-微球蛋白的试剂盒，采用多克隆抗体纳米颗粒增强免疫比浊法，用于血清中α1-微球蛋白的检测(详见专利说明书[0001]段)，但是却不能用于人尿液中α1-微球蛋白的检测。
另外，多克隆抗体较单克隆抗体特异性差，而且类风湿因子异常的病人易造成检测样本的假阳性和假阴性，影响检测结果的准确度。
发明内容
本发明所要解决的问题是针对现有技术的不足而提出一种具有高灵敏度、宽线性、特异性更好、抗干扰能力强，且可以同时检测尿液和血清样本中α1-微球蛋白的检测试剂盒。
本发明所采用的技术方案为：一种可以同时检测尿液和血清样本中α1-微球蛋白检测试剂盒，包括试剂1(R1)和试剂2(R2)，所述的试剂1为含有抗人类风湿因子(RF)抗体和促凝剂的缓冲液；所述的试剂2为含有包被有抗人α1-微球蛋白单克隆抗体的大粒径聚苯乙烯纳米颗粒(胶乳颗粒)的缓冲液。
本发明所述抗人类风湿因子抗体是含有功能部位的完整抗体或抗体片段，为兔抗人多克隆抗体或羊抗人多克隆抗体，或，兔抗人单克隆抗体或羊抗人单克隆抗体；均为市售产品。
本发明所述促凝剂为聚乙二醇(PEG)，聚乙烯吡咯烷酮(PVP)中的一种或几种。
作为优选，本发明所述的试剂1组成为：50～200mmol/L Tris-HCl缓冲液，0～30g/L聚乙二醇(PEG)，5～30g/L氯化钠，0.5～1g/L叠氮化钠，0.1～1g/L抗人类风湿因子抗体。
本发明通过使用聚苯乙烯纳米颗粒标记的抗人α1-微球蛋白单克隆抗体来测定人α1-微球蛋白。
进一步地，所述的聚苯乙烯纳米颗粒为粒径在150～500nm之间的聚苯乙烯纳米颗粒。
进一步地，所述聚苯乙烯纳米颗粒为粒径在200～350nm之间的聚苯乙烯纳米颗粒。
作为优选，所述抗人α1-微球蛋白单克隆抗体为含有能与人α1-微球蛋白特异性结合的Fab功能部位的单克隆完整抗体或抗体片段。
作为优选，所述试剂2的组成为：包被有抗人α1-微球蛋白单克隆抗体(抗人α1-微球蛋白单克隆抗体为通过α1-微球蛋白免疫小鼠取得的脾细胞与骨髓细胞融合，筛选取得能永久产生α1-微球蛋白抗体的杂交瘤细胞，并将此杂交瘤细胞培养分离纯化获得目标鼠单克隆抗 体；为行业常规技术)的聚苯乙烯纳米颗粒0.5～5g/L，50～200mmol/L pH7.5的Tris-HCl缓冲液，2-20g/L BSA(牛血清白蛋白)、2-40g/L蔗糖、0.5-2g/L叠氮化钠。
本发明的单克隆抗体致敏的大粒径纳米颗粒增强免疫检测方法的反应原理是：先将含有抗人RF抗体和促凝剂的缓冲液的试剂1即R1与样本混合，使样本中的类风湿因子抗原与R1中的抗人RF抗体结合成抗原抗体复合物并凝集成大颗粒，将类风湿因子抗原清除。再将含有包被了高特异性的抗人α1-微球蛋白单克隆抗体的大粒径聚苯乙烯纳米颗粒的缓冲液即试剂2(R2)，与R1中相应的α1-微球蛋白抗原发生特异性结合，在促凝剂作用下形成不溶性的聚苯乙烯纳米颗粒-抗原-聚苯乙烯纳米颗粒复合物乳浊液，产生一定的浊度，其浊度高低与样本中的α1-微球蛋白抗原浓度成正比关系，在一定波长下进行浊度测定，即可测得样本中被检测α1-微球蛋白的含量。由于大粒径纳米颗粒比小粒径纳米颗粒浊度变化比大，相应具有高灵敏度特性；单克隆抗体由于具有和抗原表面单一位点亲和的特点，与具有和抗原表面多位点亲和的多克隆抗体相比，其线性范围更宽且特异性更高。
本发明中，选取的浊度测定的检测波长为340～800nm，优选500-600nm。
采用本发明所述的试剂盒测定血清、血浆或尿液中α1-微球蛋白时，先将样本与试剂1混匀后孵育5分钟，然后加入试剂2，立即读取第一点吸光度值(A1)，计时反应5分钟后，读取第二点吸光度值(A2)，计算两点吸光度差值，根据校准曲线得到样本中α1-微球蛋白的含量。
本发明采用6点定标法，以样条函数作为计算模式，绘制出校准曲线。
本发明所述的试剂盒与现有技术相比，具有以下优点和有益效果：采用了高特异性单克隆抗体致敏的纳米颗粒增强免疫检测方法，具有抗干扰能力强、特异性好、灵敏度高和线性范围宽、既可适用于人尿样本也可以适用于人血清样本中的检测，检测灵敏度为0.5mg/L，检测范围在0.5—140mg/L以上，可以同时满足临床对α1-微球蛋白低值和异常高值样本检测的要求。
附图说明
图1：本发明试剂盒检测α1-微球蛋白线性范围；
图2：本发明试剂盒测α1-微球蛋白与用于检测α1-微球蛋白的某进口试剂盒相关性。
具体实施方式
以下实施例用来详细的说明本发明，但本发明不限于此。
实施例1
试剂R1：100mmol/L Tris-HCl缓冲液，15g/L聚乙二醇(PEG)，20g/L氯化钠，1g/L叠氮化钠，0.8g/L抗人类风湿因子抗体。
试剂R2：标记有抗人α1-微球蛋白单克隆抗体的胶乳颗粒的制备：将粒径为198nm的胶乳颗粒(JSR公司产，code No.：P0113；聚苯乙烯纳米颗粒)，用50mmol/L MES，pH6.0缓冲液稀释胶乳颗粒到3g/L，每ml溶液中加入EDAC 0.5mg，室温反应1小时，20000rpm转速下离心30min，去上清(上清液)，将沉淀悬浮于50mmol/L、pH6.0的MES缓冲液中，超声分散；再次20000rpm转速下离心30min，去上清，将沉淀悬浮于50mmol/L、pH6.0的MES缓冲液中，使得胶乳颗粒终浓度为6g/L，超声分散，边搅拌边加入等体积的含8mg/ml抗人α1-微球蛋白抗体的MES稀释液，混合搅拌，室温反应2小时，胶乳颗粒终浓度为3g/L。20000rpm转速离心30min，去上清，沉淀悬浮于50mmol/L、pH6.0的MES缓冲液中，胶乳颗粒终浓度为0.3％，超声分散，加入BSA使得BSA最终浓度达到20g/L，4℃封闭过夜。离心去上清，用含25mmol/L、pH7.5的Tris缓冲液、15g/L BSA、15g/L蔗糖、0.9g/L叠氮化钠的分散液溶解胶乳颗粒，使胶乳颗粒终浓度为3g/L，超声分散。
实施例2
试剂R1：200mmol/L Tris-HCl缓冲液，20g/L聚乙二醇(PEG)，9g/L氯化钠，1g/L叠氮化钠，0.5g/L抗人类风湿因子抗体。
试剂R2：将粒径为240nm的胶乳颗粒(JSR公司产，code No.：P0220)，用50mmol/LMES，pH6.0缓冲液稀释胶乳颗粒到3g/L，每ml溶液中加入EDAC 0.5mg，室温反应1小时，20000rpm转速下离心30min，去上清，将沉淀悬浮于50mmol/L MES，pH6.0缓冲液中，超声分散；再次20000rpm转速下离心30min，去上清，将沉淀悬浮于50mmol/L MES，pH6.0缓冲液中，使得胶乳颗粒终浓度为6g/L，超声分散，边搅拌边加入等体积的含8mg/ml抗人α1-微球蛋白抗体的MES稀释液，混合搅拌，室温反应2小时，胶乳颗粒终浓度为3g/L。20000rpm转速离心30min，去上清，沉淀悬浮于50mmol/L MES，pH6.0缓冲液中，胶乳颗粒终浓度为0.3％，超声分散，加入BSA使得BSA最终浓度达到20g/L，4℃封闭过夜。离心去上清，用含50mmol/LTris，pH7.5缓冲液、10g/L BSA、20g/L蔗糖、1g/L叠氮化钠的分散液溶解胶乳颗粒，使胶 乳颗粒终浓度为3g/L，超声分散。
实施例3
α1-微球蛋白的测定：
测定仪器：日立7060全自动生化分析仪；
分析方法：两点终点法；
分析参数：试剂1:240ul，试剂2:60ul，样本：2ul；波长：546nm；
测定步骤：先加入试剂1和样本，于37℃孵育5分钟后，加入试剂2，立即读取第一点吸光度值，计时反应5分钟后，读取第二点吸光度值，计算两点吸光度差值。
定标曲线制作：以定标液浓度为横坐标，各浓度定标液对应的吸光度差值为纵坐标，做logit-log(4p)函数曲线。
样本浓度计算方法：根据样本的吸光度值差值，代入定标曲线，计算相对应的浓度值。
实施例4
试剂盒检测样本性能试验：
(1)灵敏度试验
以水为空白样本，选取一份低值样本进行倍比稀释，配制出不同浓度的样本，每个样本重复测定10次，计算均值和标准差，结果见表1，灵敏度为0.5mg/L。
表1
α1-微球蛋白(mg/L) 0.00 0.25 0.50 1.00 2.00
平均值 0.03 0.25 0.54 1.05 2.04
SD 0.02 0.04 0.05 0.06 0.06
CV 38.06％ 12.70％ 8.14％ 4.24％ 1.78％
(2)线性范围试验
用α1-微球蛋白纯品配制成浓度为150mg/L的高值样本用纯水按照1、0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2、0.1的稀释比例进行倍比稀释，每个浓度重复测定3次，计算其均值，将样品的测量值与稀释比例进行相关对比，求出回归方程，并通过回归方程计算样本的理论值，结果见图1。根据理论值与检测均值求出该浓度的线性偏差，结果表明本发明试剂盒对尿液样本α1-微球蛋白的检测上限可达到140mg/L以上。
(3)抗干扰性试验
在同一份人血清样品中分别加入不同含量的干扰物质后进行测定。加入干扰物质后的测定值与加入干扰物质前的测定值之间的差值除以加入干扰物前的测定值比值即为干扰率，试验结果表明类风湿因子的浓度分别在1250IU/mL以下时，它们对测定结果的干扰均在3％以下(见表2)。
表2
(4)稳定性试验
在2-8℃贮存条件下，分别在0月、4月、8月和12月对同一血清样本进行测定，每个样本测20次(结果见表3)。血清样本分装后，储存于-20℃。4月，8月，12月与0月相比，测得值差异小，说明本发明的检测试剂盒在2-8℃贮存条件下可稳定一年。
表3
项目 0月 4月 8月 12月
试剂空白吸光度A0 0.6745 0.6654 0.6753 0.6678
样本测得值 14.2 14.9 14.0 13.9
CV(％) 1.35 1.7 1.85 2.52
(5)相关性分析
分别采用实施例1配制的本发明试剂盒和日本某公司的用于检测α1-微球蛋白的乳胶增强免疫比浊法检测试剂盒做相关性实验，使用日立7020型自动生化分析仪对79份人尿液和血清(包含正常和异常样本)进行测定，按照各自测定方法进行测定，对测定值进行相关分析，结果见图2(X、Y轴均为测定值，单位mg/l)。由图2可知，本发明试剂和对照试剂的相关系数为R2＝0.998，回归方程为y＝0.979x+0.763)。该结果表明本发明试剂与对照试剂具有很好的相关性、特异性和准确性。

Claims (7)

1.一种可以同时检测尿液和血清样本中α1-微球蛋白的试剂盒，包括试剂1和试剂2，其特征在于：所述的试剂1为含有抗人类风湿因子抗体和促凝剂的缓冲液；所述的试剂2为含有包被有抗人α1-微球蛋白单克隆抗体的大粒径聚苯乙烯纳米颗粒的缓冲液; 所述的聚苯乙烯纳米颗粒为粒径在150~500nm之间的聚苯乙烯纳米颗粒; 所述抗人类风湿因子抗体为兔抗人多克隆抗体或羊抗人多克隆抗体或兔抗人单克隆抗体或羊抗人单克隆抗体。
2.根据权利要求1所述的可以同时检测尿液和血清样本中α1-微球蛋白的试剂盒，其特征在于：所述抗人类风湿因子抗体是含有功能部位的完整抗体或抗体片段。
3.根据权利要求2所述的可以同时检测尿液和血清样本中α1-微球蛋白的试剂盒，其特征在于：所述促凝剂为聚乙二醇，聚乙烯吡咯烷酮中的一种或几种。
4.根据权利要求3所述的可以同时检测尿液和血清样本中α1-微球蛋白的试剂盒，其特征在于：所述试剂1的组成为：50～200mmol/L Tris-HCl缓冲液，0～30g/L聚乙二醇，5～30g/L氯化钠，0.5～1g/L叠氮化钠，0.1～1g/L抗人类风湿因子抗体。
5.根据权利要求1所述的可以同时检测尿液和血清样本中α1-微球蛋白的试剂盒，其特征在于：所述的聚苯乙烯纳米颗粒为粒径在200~350nm之间的聚苯乙烯纳米颗粒。
6.根据权利要求1所述的可以同时检测尿液和血清样本中α1-微球蛋白的试剂盒，其特征在于：所述的抗人α1-微球蛋白单克隆抗体为含有能与人α1-微球蛋白特异性结合的Fab功能部位的单克隆完整抗体或抗体片段。
7.根据权利要求1所述的可以同时检测尿液和血清样本中α1-微球蛋白的试剂盒，其特征在于：所述试剂2的组成为：0.5～5g/L包被有抗人α1-微球蛋白单克隆抗体的大粒径聚苯乙烯纳米颗粒，50～200mmol/L pH7.5的Tris-HCl缓冲液，2-20g/L BSA、2-40g/L蔗糖、0.5-2g/L叠氮化钠。
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