CN106093407A - 一种测定脂蛋白(a)的试剂盒及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种测定脂蛋白（a）的试剂盒及其制备方法，包括彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分组成试剂盒，包括的成分及相应含量为：试剂R1：缓冲液、稳定剂、加速剂、防腐剂、抗人类风湿因子抗体、其溶剂为纯化水，试剂R2：缓冲液、表面活性剂、稳定剂、助悬剂、防腐剂、胶乳包被抗人脂蛋白（a）抗体，其溶剂为纯化水，制备方法为：按照组分含量配制好试剂；将待测样本与试剂R1和试剂R2混合，使其充分反应；用全自动生化分析仪测定反应后的吸光度差值；根据吸光度变化值计算出样本中的脂蛋白（a）的浓度。本发明具有准确度高等优点。
Description
技术领域
本发明涉及医学及生物化学技术领域，具体来说是一种测定脂蛋白(a)的试剂盒及其制备方法。
背景技术
脂蛋白(a)是一种特殊独立的血浆脂蛋白，是1963年挪威遗传学家Berg在研究低密度脂蛋白的遗传变异时发现的。20世纪80年代末，人们发现脂蛋白(a)与动脉粥样硬化有关。
脂蛋白(a)是一种富含胆固醇的脂蛋白，核心部分为中性脂质和apoB-100分子，其外围包绕着亲水性的apo（a），二者以二硫键共价连接；其中apo（a）是脂蛋白(a)的特征性糖蛋白成分，主要由一种称为Kringle的特征性结构构成，Kringle由80～114个氨基酸残基组成，依靠三个内部二硫键稳定。
脂蛋白(a)主要在肝脏合成后分泌入血，血浆脂蛋白(a)浓度主要取决于脂蛋白(a)的合成速率，而与分解速率基本无关,人群中脂蛋白(a)浓度个体差异极大，浓度范围可在0～1000mg/L，这种差异最主要由apo（a）基因位点决定。
在糖尿病患者中发现脂蛋白(a)血清水平明显高于一般人群，脂蛋白(a)水平的升高是糖尿病并发微血管病变、冠心病的一个重要因素，其作用方式与脂蛋白(a)致动脉粥样硬化相似,也有报道，2型糖尿病患者血清脂蛋白(a)的升高可能通过激活血小板活化途径参与糖尿病血管病变的发生及发展，另外，在肝病患者如原发胆汁性肝硬化患者中未发现有脂蛋白(a)浓度的改变，在子宫内膜异位的女性患者中发现有脂蛋白(a)水平升高，研究表明性激素对脂蛋白(a)血清浓度有影响。
目前，检测脂蛋白(a)的检测方法有放射免疫法、酶联免疫吸附法、免疫比浊法，但是放射免疫法有放射性污染，酶联免疫吸附法操作复杂、耗时长，对操作者有一定的技能要求，免疫比浊法与纤溶酶原有交叉污染，易受类风湿因子干扰，因此测定的准确度也就比较低，需要进行改进。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是为了克服现有技术存在放射性污染、操作复杂以及测定准确度低的缺陷，而提供一种测定脂蛋白(a)的试剂盒及其制备方法。
本发明解决上述技术问题提供的技术方案是：本发明公开了一种测定脂蛋白(a)的试剂盒，包括彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分组成试剂盒，包括的成分及相应含量为：
试剂R1：
缓冲液 15~185 mmol/L
稳定剂 10~18 g/L
加速剂 20~50 g/L
防腐剂 0.5~1.3 g/L
抗人类风湿因子抗体 0.2~1.8 g/L
其溶剂为纯化水
试剂R2：
缓冲液 50~110 mmol/L
表面活性剂 0.5~2.5 mL/L
稳定剂 14~44 g/L
助悬剂 10~25 g/L
防腐剂 0.5~1.3 g/L
胶乳包被抗人脂蛋白(a)抗体 0.2~2 g/L
其溶剂为纯化水。
作为优选，本发明公开了一种测定脂蛋白(a)的试剂盒，包括彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分组成试剂盒，包括的成分及相应含量为：
试剂R1：
缓冲液 100mmol/L
稳定剂 13 g/L
加速剂 30g/L
防腐剂 0.9 g/L
抗人类风湿因子抗体 1.0 g/L
其溶剂为纯化水
试剂R2：
缓冲液 80mmol/L
表面活性剂 1.5 mL/L
稳定剂 20 g/L
助悬剂 17g/L
防腐剂 0.9 g/L
胶乳包被抗人脂蛋白(a)抗体 1g/L
其溶剂为纯化水。
作为优选，所述的试剂R1中，所述的缓冲液采用MES缓冲液、MOPS缓冲液、MOPSO缓冲液、HEPES缓冲液、磷酸盐缓冲液中的一种或多种的组合，所述的稳定剂采用牛血清白蛋白、甘露糖、山梨醇、乙二胺四乙酸二钠、果糖、海藻糖中的一种或多种的组合，所述的加速剂采用聚乙二醇-2000、聚乙二醇-6000、聚乙二醇-8000、聚乙烯吡咯烷酮中的一种或多种的组合，所述的防腐剂采用苯酚、苯甲酸钠、叠氮钠中的一种或多种的组合，所述的抗人类风湿因子抗体采用兔抗人多克隆抗体、羊抗人多克隆抗体、兔抗人单克隆抗体、羊抗人单克隆抗体中的一种。
作为优选，所述的试剂R2中，所述的缓冲液采用MES缓冲液、MOPS缓冲液、MOPSO缓冲液、HEPES缓冲液、磷酸盐缓冲液中的一种或多种的组合，所述的表面活性剂采用吐温-80，所述的稳定剂采用牛血清白蛋白、甘露糖、山梨醇、乙二胺四乙酸二钠、果糖、海藻糖中的一种或多种的组合，所述的助悬剂采用阿拉伯胶、海藻酸钠、胶体二氧化硅、甘油、蔗糖中的一种或多种的组合，所述的防腐剂采用苯酚、苯甲酸钠、叠氮钠中的一种或多种的组合。
作为优选，所述的胶乳包被抗人脂蛋白(a)抗体的制备方法为：用50 mmol/L的MES缓冲液将粒径为30-200nm的聚苯乙烯微球稀释成为所含的聚苯乙烯微球的质量浓度为1%-5%的溶液，然后每毫升溶液中加入0.5 mg 1-乙基-3-（3-二甲基胺丙基）碳化二亚胺盐酸盐，在20-37℃的条件下反应2小时，使用离心机，在15000 rpm/min的转速下离心30分钟，去上清，将沉淀悬浮于50 mmol/L的MES缓冲液中，使用超声分散仪进行超声分散，再使用离心机，在15000 rpm/min的转速下离心30分钟，去上清，将沉淀悬浮于50 mmol/L的MES缓冲液中，超声分散，然后边搅拌边加入等体积的含抗人脂蛋白(a)抗体的MES缓冲液，混合搅拌，在室温20-37℃的条件下反应2小时，使得聚苯乙烯微球的最终质量浓度为1%，再加入牛血清白蛋白，使得牛血清白蛋白的浓度为10g/L为止，在4℃的条件下封闭12-18小时，即可制备得到胶乳包被抗人脂蛋白(a)抗体。
作为优选，本发明还公开了上述测定脂蛋白(a)的试剂盒的制备方法和使用方法，包括以下步骤：
（a）按照下列组分含量配制好试剂：
试剂R1：
缓冲液 15~185 mmol/L
稳定剂 10~18 g/L
加速剂 20~50 g/L
防腐剂 0.5~1.3 g/L
抗人类风湿因子抗体 0.2~1.8 g/L
其溶剂为纯化水
试剂R2：
缓冲液 50~110 mmol/L
表面活性剂 0.5~2.5 mL/L
稳定剂 14~44 g/L
助悬剂 10~25 g/L
防腐剂 0.5~1.3 g/L
胶乳包被抗人脂蛋白(a)抗体 0.2~2g/L
其溶剂为纯化水；
（b）将待测样本与试剂R1和试剂R2混合，使其充分反应；
（c）用全自动生化分析仪测定反应后的吸光度差值；
（d）根据吸光度变化值计算出样本中的脂蛋白(a)的浓度。
作为优选，步骤（b）中，所述的试剂R1与试剂R2的体积比为4:1。
作为优选，步骤（b）中，所述的待测样本与试剂R1和试剂R2的体积比在1:5到1:80之间。
本发明的检测原理是：先将含有抗人类风湿因子抗体和加速剂的缓冲液即试剂R1与样本相混合，在37℃下孵育5分钟，使得样本中的类风湿因子抗原与试剂R1中的抗人类风湿因子抗体结合形成抗原抗体复合物，并凝集成大颗粒，以达到将类风湿因子抗原清除的目的，再将含有包被了高特异性的抗人脂蛋白(a)单克隆抗体的聚苯乙烯微球的缓冲液即试剂R2与上述中去除过类风湿因子的样品中脂蛋白(a)（Lp（a））与试剂中的抗-脂蛋白(a)抗体结合形成抗原-抗体复合物产生一定浊度，该浊度的高低与脂蛋白(a)抗原的含量成正比，在特定波长下测定浊度并通过多点定标曲线，进行脂蛋白(a)的定量测定。
样本中脂蛋白(a)的活性（mg/L）= CS ×（mg/L）
式中：ΔAT以空白管吸光度作对照的样品管吸光度值
ΔAS以空白管吸光度作对照的校准管吸光度值
CS校准液中Lp（a）的浓度
与现有技术相比，本发明具有以下有益优点：本发明在试剂R1中添加了新型稳定剂，稳定性佳，对蛋白和酶类具有很好的保护作用，同时R1中还添加了抗人类风湿因子抗体，在R1和样本孵育的时候特异性的去除了类风湿因子的干扰，使得结果更准确，另外本发明的操作比较方便，适宜于广泛推广使用。
具体实施方式
以下结合具体实施例进一步说明，但本发明并不仅限于这些实施例。
实施例1
本发明的试剂盒包括彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分，其中
试剂R1：
MES缓冲液 100mmol/L
牛血清白蛋白 13 g/L
聚乙二醇-8000 30g/L
苯甲酸钠 0.9 g/L
兔抗人单克隆抗体 1.0g/L
其溶剂为纯化水
试剂R2：
MES缓冲液 80mmol/L
吐温-80 1.5 mL/L
牛血清白蛋白 20 g/L
海藻酸钠 17g/L
苯甲酸钠 0.9 g/L
胶乳包被抗人脂蛋白(a)抗体 1g/L
其溶剂为纯化水。
实施例2
本发明的试剂盒包括彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分，其中
试剂R1：
HEPES缓冲液 185 mmol/L
海藻糖 18 g/L
聚乙二醇-6000 20 g/L
苯酚 0.5 g/L
羊抗人多克隆抗体 0.2g/L
其溶剂为纯化水
试剂R2：
HEPES缓冲液 50 mmol/L
吐温-80 0.5 mL/L
海藻糖 14 g/L
阿拉伯胶 25 g/L
苯酚 0.5g/L
胶乳包被抗人脂蛋白(a)抗体 2g/L
其溶剂为纯化水。
实施例3
试剂盒的制备和使用方法
1、胶乳包被抗人脂蛋白(a)抗体的制备：用50 mmol/L的MES缓冲液将粒径为120nm的聚苯乙烯微球稀释成为所含的聚苯乙烯微球的质量浓度为3%的溶液，然后每毫升溶液中加入0.5 mg 1-乙基-3-（3-二甲基胺丙基）碳化二亚胺盐酸盐，在26℃的条件下反应2小时，使用离心机，在15000 rpm/min的转速下离心30分钟，去上清，将沉淀悬浮于50 mmol/L的MES缓冲液中，使用超声分散仪进行超声分散，再使用离心机，在15000 rpm/min的转速下离心30分钟，去上清，将沉淀悬浮于50 mmol/L的MES缓冲液中，超声分散，然后边搅拌边加入等体积的含抗人脂蛋白(a)抗体的MES缓冲液，混合搅拌，在室温25℃的条件下反应2小时，使得聚苯乙烯微球的最终质量浓度为1%，再加入牛血清白蛋白，使得牛血清白蛋白的浓度为10g/L为止，在4℃的条件下封闭10小时，即可制备得到胶乳包被抗人脂蛋白(a)抗体；
2、按照下列组分含量配制好试剂：
试剂R1：
MES缓冲液 100mmol/L
牛血清白蛋白 13 g/L
聚乙二醇-8000 30g/L
苯甲酸钠 0.9 g/L
兔抗人单克隆抗体 1.0 g/L
其溶剂为纯化水
试剂R2：
MES缓冲液 80mmol/L
吐温-80 1.5 mL/L
牛血清白蛋白 20 g/L
海藻酸钠 17g/L
苯甲酸钠 0.9 g/L
胶乳包被抗人脂蛋白(a)抗体 1g/L
其溶剂为纯化水；
3、全自动生化分析仪参数设置
（a）检测温度：37℃；
（b）检测波长：主波长600nm；
（c）反应时间 ：10min，其中，孵育时间 5min，加入试剂 R2 后立即测定读取吸光度A1，5min后读取吸光度 A2，计算吸光度变化 ΔA ＝ A2-A1 ；
(d)反应方向：正反应；
4、检测步骤
（a）取240ul试剂R1与4ul待测样本混匀；
（b）将混匀后的溶液在37℃的条件下孵育5min；
（c）加入60ul试剂R2，立即测定读取吸光度A1，5min后读取吸光度A2，计算吸光度变化ΔA＝A2-A1；
(d)根据样本中脂蛋白(a)的活性（mg/L）=CS×（mg/L）计算出样本中的脂蛋白(a)的浓度。
实施例4
试剂盒的制备和使用方法
1、胶乳包被抗人脂蛋白(a)抗体的制备：用50 mmol/L的MES缓冲液将粒径为120nm的聚苯乙烯微球稀释成为所含的聚苯乙烯微球的质量浓度为3%的溶液，然后每毫升溶液中加入0.5 mg 1-乙基-3-（3-二甲基胺丙基）碳化二亚胺盐酸盐，在26℃的条件下反应2小时，使用离心机，在15000 rpm/min的转速下离心30分钟，去上清，将沉淀悬浮于50 mmol/L的MES缓冲液中，使用超声分散仪进行超声分散，再使用离心机，在15000 rpm/min的转速下离心30分钟，去上清，将沉淀悬浮于50 mmol/L的MES缓冲液中，超声分散，然后边搅拌边加入等体积的含抗人脂蛋白(a)抗体的MES缓冲液，混合搅拌，在室温25℃的条件下反应2小时，使得聚苯乙烯微球的最终质量浓度为1%，再加入牛血清白蛋白，使得牛血清白蛋白的浓度为10g/L为止，在4℃的条件下封闭10小时，即可制备得到胶乳包被抗人脂蛋白(a)抗体；
2、按照下列组分含量配制好试剂：
试剂R1：
HEPES缓冲液 185 mmol/L
海藻糖 18 g/L
聚乙二醇-6000 20 g/L
苯酚 0.5 g/L
羊抗人多克隆抗体 0.2 g/L
其溶剂为纯化水
试剂R2：
HEPES缓冲液 50 mmol/L
吐温-80 0.5 mL/L
海藻糖 14 g/L
阿拉伯胶 25 g/L
苯酚 0.5g/L
胶乳包被抗人脂蛋白(a)抗体 2g/L
其溶剂为纯化水；
3、全自动生化分析仪参数设置
（a）检测温度：37℃；
（b）检测波长：主波长600nm；
（c）反应时间 ：10min，其中，孵育时间 5min，加入试剂 R2 后立即测定读取吸光度A1，5min后读取吸光度 A2，计算吸光度变化 ΔA ＝ A2-A1 ；
(d)反应方向：正反应；
4、检测步骤
（a）取240ul试剂R1与4ul待测样本混匀；
（b）将混匀后的溶液在37℃的条件下孵育5min；
（c）加入60ul试剂R2，立即测定读取吸光度A1，5min后读取吸光度A2，计算吸光度变化ΔA＝A2-A1；
(d)根据样本中脂蛋白(a)的活性（mg/L）=CS×（mg/L）计算出样本中的脂蛋白(a)的浓度。
表1为实施例1所制得的测定脂蛋白(a)的试剂盒以及实施例2所制得的测定脂蛋白(a)的试剂盒分别对质控品1进行测定的结果，其中质控品1中的脂蛋白(a)的浓度为 169mg/L，测定结果见表1：
表1
| 第1次（mg/L） | 第2次（mg/L） | 第3次（mg/L） | 均值（mg/L） | 偏差（%） | |
| 实施例1 | 167 | 164 | 164 | 165.0 | 2.37 |
| 实施例2 | 163 | 162 | 163 | 162.7 | 3.73 |
由表1可知，本发明所制得的测定脂蛋白(a)的试剂盒对质控品1的测定结果偏差较小，因此测定准确度高，而且实施例1为最优的选择。
表2为实施例1所制得的测定脂蛋白(a)的试剂盒以及实施例2所制得的测定脂蛋白(a)的试剂盒分别对质控品2进行测定的结果，其中质控品2中的脂蛋白(a)的浓度为 196 mg/L，测定结果见表2：
表2
| 第1次（mg/L） | 第2次（mg/L） | 第3次（mg/L） | 均值（mg/L） | 偏差（%） | |
| 实施例1 | 194 | 196 | 194 | 194.7 | 0.66 |
| 实施例2 | 190 | 192 | 191 | 191.0 | 2.55 |
由表2可知，本发明所制得的测定脂蛋白(a)的试剂盒对质控品2的测定结果偏差较小，因此测定准确度高，而且实施例1为最优的选择。
表3为实施例3所制得的测定脂蛋白(a)的试剂盒对同一待测样本进行的多次反复测定以及实施例4所制得的测定脂蛋白(a)的试剂盒对同一待测样本进行的多次反复测定，对所得的结果进行SD和CV的计算，结果如下：
表3
由表3可知本发明所制得的测定脂蛋白(a)的试剂盒的精密度比较好，而且由表3可知，实施例3为最优的选择。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。
Claims (8)
1.一种测定脂蛋白(a)的试剂盒，其特征在于：包括彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分组成试剂盒，包括的成分及相应含量为：
试剂R1：
缓冲液 15~185 mmol/L
稳定剂 10~18 g/L
加速剂 20~50 g/L
防腐剂 0.5~1.3 g/L
抗人类风湿因子抗体 0.2~1.8g/L
其溶剂为纯化水
试剂R2：
缓冲液 50~110 mmol/L
表面活性剂 0.5~2.5 mL/L
稳定剂 14~44 g/L
助悬剂 10~25 g/L
防腐剂 0.5~1.3 g/L
胶乳包被抗人脂蛋白(a)抗体 0.2~2g/L
其溶剂为纯化水。
2.根据权利要求1所述的一种测定脂蛋白(a)的试剂盒，其特征在于：包括彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分组成试剂盒，包括的成分及相应含量为：
试剂R1：
缓冲液 100mmol/L
稳定剂 13 g/L
加速剂 30g/L
防腐剂 0.9 g/L
抗人类风湿因子抗体 1.0 g/L
其溶剂为纯化水
试剂R2：
缓冲液 80mmol/L
表面活性剂 1.5 mL/L
稳定剂 20 g/L
助悬剂 17g/L
防腐剂 0.9 g/L
胶乳包被抗人脂蛋白(a)抗体 1g/L
其溶剂为纯化水。
3.根据权利要求1或2所述的一种测定脂蛋白(a)的试剂盒，其特征在于：所述的试剂R1中，所述的缓冲液采用MES缓冲液、MOPS缓冲液、MOPSO缓冲液、HEPES缓冲液、磷酸盐缓冲液中的一种或多种的组合，所述的稳定剂采用牛血清白蛋白、甘露糖、山梨醇、乙二胺四乙酸二钠、果糖、海藻糖中的一种或多种的组合，所述的加速剂采用聚乙二醇-2000、聚乙二醇-6000、聚乙二醇-8000、聚乙烯吡咯烷酮中的一种或多种的组合，所述的防腐剂采用苯酚、苯甲酸钠、叠氮钠中的一种或多种的组合，所述的抗人类风湿因子抗体采用兔抗人多克隆抗体、羊抗人多克隆抗体、兔抗人单克隆抗体、羊抗人单克隆抗体中的一种。
4.根据权利要求1或2所述的一种测定脂蛋白(a)的试剂盒，其特征在于：所述的试剂R2中，所述的缓冲液采用MES缓冲液、MOPS缓冲液、MOPSO缓冲液、HEPES缓冲液、磷酸盐缓冲液中的一种或多种的组合，所述的表面活性剂采用吐温-80，所述的稳定剂采用牛血清白蛋白、甘露糖、山梨醇、乙二胺四乙酸二钠、果糖、海藻糖中的一种或多种的组合，所述的助悬剂采用阿拉伯胶、海藻酸钠、胶体二氧化硅、甘油、蔗糖中的一种或多种的组合，所述的防腐剂采用苯酚、苯甲酸钠、叠氮钠中的一种或多种的组合。
5.根据权利要求1或2所述的一种测定脂蛋白(a)的试剂盒，其特征在于：所述的胶乳包被抗人脂蛋白(a)抗体的制备方法为：用50 mmol/L的MES缓冲液将粒径为30-200nm的聚苯乙烯微球稀释成为所含的聚苯乙烯微球的质量浓度为1%-5%的溶液，然后每毫升溶液中加入0.5 mg 1-乙基-3-（3-二甲基胺丙基）碳化二亚胺盐酸盐，在20-37℃的条件下反应2小时，使用离心机，在15000 rpm/min的转速下离心30分钟，去上清，将沉淀悬浮于50 mmol/L的MES缓冲液中，使用超声分散仪进行超声分散，再使用离心机，在15000 rpm/min的转速下离心30分钟，去上清，将沉淀悬浮于50 mmol/L的MES缓冲液中，超声分散，然后边搅拌边加入等体积的含抗人脂蛋白(a)抗体的MES缓冲液，混合搅拌，在室温20-37℃的条件下反应2小时，使得聚苯乙烯微球的最终质量浓度为1%，再加入牛血清白蛋白，使得牛血清白蛋白的浓度为10g/L为止，在4℃的条件下封闭12-18小时，即可制备得到胶乳包被抗人脂蛋白(a)抗体。
6.根据权利要求1或2所述的一种测定脂蛋白(a)的试剂盒的制备方法和使用方法，其特征在于：包括以下步骤：
（a）按照下列组分含量配制好试剂：
试剂R1：
缓冲液 15~185 mmol/L
稳定剂 10~18 g/L
加速剂 20~50 g/L
防腐剂 0.5~1.3 g/L
抗人类风湿因子抗体 0.2~1.8 g/L
其溶剂为纯化水
试剂R2：
缓冲液 50~110 mmol/L
表面活性剂 0.5~2.5 mL/L
稳定剂 14~44 g/L
助悬剂 10~25 g/L
防腐剂 0.5~1.3 g/L
胶乳包被抗人脂蛋白(a)抗体 0.2~2g/L
其溶剂为纯化水；
（b）将待测样本与试剂R1和试剂R2混合，使其充分反应；
（c）用全自动生化分析仪测定反应后的吸光度差值；
（d）根据吸光度变化值计算出样本中的脂蛋白(a)的浓度。
7.根据权利要求6所述的一种测定脂蛋白(a)的试剂盒的制备方法和使用方法，其特征在于：步骤（b）中，所述的试剂R1与试剂R2的体积比为4:1。
8.根据权利要求6所述的一种测定脂蛋白(a)的试剂盒的制备方法和使用方法，其特征在于：步骤（b）中，所述的待测样本与试剂R1和试剂R2的体积比在1:5到1:80之间。
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