CN112014572A - 一种用于检测kl-6的乳胶颗粒制备方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开用于检测KL‑6乳胶颗粒的制备方法，涉及生物分析技术领域，包括(1)用反应缓冲液悬浮乳胶微球，得到乳胶微球溶液；(2)向步骤(1)的反应体系加入KL‑6抗体；(3)持续搅拌反应；(4)向步骤(3)的反应体系依次加入EDC.HCl溶液和NHS溶液；(5)向步骤(4)的反应体系加入封闭液，反应后离心；(6)向步骤(5)的反应体系加入储存液；(7)过夜保存，获得胶乳试剂。本发明的有益效果是其所制备的乳胶颗粒用于乳胶增强免疫比浊法测定KL‑6时，能够有效提高灵敏度和特异性，并且抗干扰性强，能够有效降低干扰物，例如，胆红素，血红蛋白，甘油三酯，抗坏血酸，脂肪乳剂，类风湿因子的干扰。

Description

一种用于检测KL-6的乳胶颗粒制备方法及其应用

技术领域

本发明涉及生物分析技术领域，具体涉及一种用于特异性检测KL-6的乳胶颗粒的制备方法及其应用。

背景技术

涎液化糖链抗原(Kerbs von den Lungen-6，KL-6)是分类于第9族肺细胞抗原，相对分子质量约200000的糖蛋白。主要表达在肺泡Ⅱ型上皮细胞，在正常肺组织和终末细支气管上皮细胞只有极少量表达，而在肺泡I型上皮细胞上不表达。KL-6在间质性肺疾病患者中此项指标较健康人和其他呼吸系统疾病患者显示出有意义的升高，其表达异常与肺间质疾病密切相关，是一类肺间质性疾病(interstitial lung disease，ILD)的生物标志物。

目前，临床上诊断ILD常用高分辨率计算机断层扫描、支气管镜检查和(或)肺活检来确诊ILD，用肺功能检测来监控疾病活动性和ILD患者预后。然而，这些检查需要特定的医疗设备，且会给患者带来较强的不适感。

目前KL-6的检测方法主要有酶联免疫吸附法(ELISA)、荧光层析法或者电化学发光法，ELISA法操作相对繁琐、检测时间长，电化学发光法需要特殊仪器且成本较高。而在生化分析仪上利用胶乳增强免疫比浊法(LEIA)测定KL-6，灵敏度更高，线性范围更广，操作也相对简单，且该测试方法可以在各种生化分析仪上使用，具有很强的适用性。但现有技术产品不同批次试剂之间检测结果差异较大，导致结果不稳定。

发明内容

本发明的目的在于至少解决现有技术中存在的技术问题之一，提供一种用于特异性检测KL-6的乳胶颗粒的制备方法，以解决现有技术产品不同批次时间之间检测结果差异大的问题。

本发明的技术解决方案如下：

一种用于检测KL-6乳胶颗粒的制备方法，包括如下步骤：

(1)用反应缓冲液悬浮乳胶微球，得到乳胶微球溶液；

(2)向步骤(1)的反应体系加入KL-6抗体；

(3)持续搅拌反应；

(4)向步骤(3)的反应体系依次加入所述EDC.HCl溶液和NHS溶液；

(5)向步骤(4)的反应体系加入封闭液，反应后离心；

(6)向步骤(5)的反应体系加入储存液；

(7)过夜保存，获得胶乳试剂。

本申请中通过在制备过程中，采用依次向乳胶微球溶液中加入EDC.HCl溶液和NHS溶液，使得反应更加充分，能够显著提高所制备复合物的灵敏度，敏感性，抗干扰性以及稳定性。

本申请对KL-6抗体没有特殊要求，其可以为商业化抗体，或通过骨髓瘤杂交细胞进行制备。优选为单克隆抗体。

在本发明的一个具体实施方式中，所述EDC.HCl的浓度为0.01-0.1g/L，和/或所述NHS的浓度为0.1-0.5g/L，和/或所述乳胶微球的浓度为1％-2％。优选地，所述所述EDC.HCl的浓度为0.01g/L，0.03g/L，0.04g/L，0.05g/L，0.06g/L，0.08g/L或0.1g/L；所述NHS的浓度为0.1g/L，0.2g/L，0.3g/L，0.4g/L或0.5g/L；所述乳胶微球的浓度为1％，1.5％或2％。

在本发明的一个具体实施方式中，所述EDC.HCl的浓度为0.05g/L，和/或所述NHS的浓度为0.3g/L，和/或所述乳胶微球的浓度为1.5％。

在本发明的一个具体实施方式中，所述乳胶微球溶液与所述(EDC.HCl溶液和NHS溶液)的总体积比为1：1。

在本发明的一个具体实施方式中，所述乳胶微球溶液与所述反应缓冲液的体积比为1：(15-20)；优选地，所述胶微球溶液与所述反应缓冲液的体积比为1：20。

在本发明的一个具体实施方式中，所述步骤1中，反应缓冲液为HEPES缓冲液、MES缓冲液和硼酸盐缓冲液中的一种或多种。

在本发明的一个具体实施方式中，所述反应缓冲液为MES缓冲液和硼酸缓冲液。

在本发明的一个具体实施方式中，所述MES缓冲液与硼酸缓冲液的体积比为1:3～5。

在本发明的一个具体实施方式中，所述MES缓冲液与硼酸缓冲液的体积比为1：4。

在本发明的一个具体实施方式中，所述MES缓冲液的pH值为6.0-6.5。

在本发明的一个具体实施方式中，所述硼酸缓冲液的pH值为7.2-7.3。

在本发明的一个具体实施方式中，所述步骤(4)中，反应体系为在25-37℃下恒温反应，反应时间60-120min。

在本发明的一个具体实施方式中，反应体系为在28℃条件下恒温反应90min。

在本发明的一个具体实施方式中，所述封闭液包括2mL/L的吐温20和1g/L的BSA。

在本发明的一个具体实施方式中，所述封闭液pH为7.2-7.3。

在本发明的一个具体实施方式中，所述储存液包括2mL/L吐温20、1g/LBSA和0.5ml/L proclin300的混合液。

在本发明的一个具体实施方式中，所述储存液pH为7.2-7.3。

在本发明的一个具体实施方式中，所述乳胶微球为聚苯乙烯胶乳颗粒。

在本发明的一个具体实施方式中，所述乳胶微球的直径范围为200-250nm。

在本发明的一个具体实施方式中，所述乳胶微球的直径范围为240nm。

本发明的一个具体实施方式中，所述乳胶颗粒用于乳胶增强免疫比浊法的测定。

本发明还提供一种乳胶颗粒，其是由上述制备方法制备而成。

本发明另一方面提供一种试剂盒，其包括上述制备方法制备的乳胶颗粒。

本发明的一个具体实施方式中，所述试剂盒包括试剂1和试剂2；所述试剂1包括100mmol/L柠檬酸钠，0.15mol/L氯化钠和0.03％防腐剂；所述试剂2包括100mmol/L柠檬酸钠，1％牛血清白蛋白，1％吐温20，0.03％防腐剂和1.5％乳胶颗粒。

本发明的一个具体实施方式中，所述试剂盒还包括标准品和质控品。

本发明的一个具体实施方式中，所述标准品为冻干粉，包括50％人血清、50mmol/L三羟甲基氨基甲烷缓冲液、0.03％防腐剂、5％保护剂、0.15mol/L氯化钠和靶值范围为8500-11500U/mL的涎液化糖链抗原-6。

本发明的一个具体实施方式中，所述质控品为冻干粉，包括50％人血清、50mmol/L三羟甲基氨基甲烷缓冲液、0.03％防腐剂、5％保护剂、0.15mol/L氯化钠和涎液化糖链抗原-6；涎液化糖链抗原-6的水平1为(200，400)U/mL；涎液化糖链抗原-6的水平2为(800，1200)U/mL。

本发明至少具有以下有益效果之一：本发明提供一种用于检测KL-6乳胶颗粒的制备方法，其所制备的乳胶颗粒用于乳胶增强免疫比浊法测定时，能够有效提高灵敏度和特异性，并且抗干扰性强，能够有效降低干扰物，例如，胆红素，血红蛋白，甘油三酯，抗坏血酸，脂肪乳剂，类风湿因子的干扰。

附图说明

图1为实施例中乳胶颗粒的制备方法。

图2为实施例中试剂盒的定标曲线。

具体实施方式

实施例1乳胶颗粒的制备

如图1所示，乳胶颗粒的制备，包括如下步骤：

步骤1、用5ml反应缓冲液悬浮250μL乳胶微球，整个反应体系保持在28℃恒温条件下反应，得到乳胶微球溶液；

反应缓冲液可以选择HEPES缓冲液、MES缓冲液和硼酸盐缓冲液中的一种或多种。本实施例中选择MES缓冲液和硼酸缓冲液。MES缓冲液包括4.888g/L的MES·H₂O、0.39g/L的NaOH，pH值为6.0-6.5；硼酸缓冲液包括3.0915g/L的硼酸、0.8586g/L的四硼酸钠，pH值为7.2-7.3。MES缓冲液与硼酸缓冲液的体积比为1:3～5；优选地，MES缓冲液与硼酸缓冲液的体积比为1:4。乳胶微球的浓度为1.5％。

步骤2、将步骤1中的反应体系加入KL-6抗体；

KL-6抗体可以为市售抗体或者通过骨髓瘤细胞杂交获得。本实施例中采用骨髓瘤细胞杂交获得。

步骤3、在28℃条件下，搅拌90min。

步骤4、向步骤3的反应体系依次加入125μL0.05g/L EDC.HCl溶液和125μL0.3g/LNHS溶液。NHS溶液现用现配。

步骤5、向步骤4的反应体系加入吐温20和BSA进行封闭。吐温20的终浓度为2mL/L；BSA的终浓度为1g/L，pH为7.2-7.3，反应后离心；

步骤6、向步骤5的反应体系加入吐温20、BSA和proclin300的储存液；吐温20的终浓度为2mL/L、BSA的终浓度为1g/L、proclin300的终浓度为0.5mL/L。

步骤7、过夜保存，获得胶乳试剂即乳胶颗粒。

实施例2试剂盒的制备

试剂盒的制备参见表1。

表1试剂盒

1)R1、R2的配制

按照表1配制试剂1和试剂2。

2)校准品的制备

将KL-6抗原用校准品稀释液配制成一系列校准品，浓度分别为0U/mL，625U/mL，1250U/mL，2500U/mL，5000U/mL，10000U/mL。

3)质控品的制备

将高浓度的KL-6样品(10000U/mL)用校准品稀释液分别稀释2倍和20倍成5000U/mL和500U/mL，分别作为高值质控品和低值质控品。

4)定标曲线的建立

将6个KL-6校准品，浓度从0到10000U/mL，分别与配制的KL-6胶乳单试剂在反应杯中反应，用生化分析仪进行检测，记录反应度。检测波长为570nm，检测散射光强度，采用终点法检测。图1是按实施例1得到的胶乳试剂建立的定标曲线。

实施例3试剂盒的检测方法

1.试剂准备

液体R1、R2试剂开瓶即用。校准品、质控品使用前需用1.00mL的纯化水复溶，置10℃～30℃30分钟，使冻干物完全溶解后，轻轻混合即可作为原校准品溶液和质控品溶液使用。用纯化水将原校准品溶液按下表稀释(体积比)，稀释成六个浓度梯度，稀释方法如表2所示：

表2原校准品稀释配比

序号	1	2	3	4	5	6
							纯化水：	1:0	15:1	7:1	3:1	1:1	0:1

2.参数设置

检验方法：终点法 检测温度：37℃

检测波长：570nm 比色杯光径：1cm

以水作为空白对照

3.检测步骤

4.校准程序

采用多点定标校正。

5.程序

每天对样本进行检测之前，须进行质量控制，以保障测试系统的稳定性。

6.计算

对实施例2的试剂盒进行各项指标的检测

一.线性范围

配制标准样品，每个浓度的样本用实施例3中的试剂盒测定3次取平均值。对测定值进行相关分析，如图2所示，R²＝0.9984且P＜0.05。本实验验证的KL-6分析测量范围为56.3～10028.3U/mL，见表3。

表3检测结果

二.精密度

用实施例3中制备的试剂测定批内精密度和日间精密度。选择低值(500)和高值(5000)两个水平的质控血清作为评价样本，在较短的时间内及稳定的条件下连续重复测定20次，记录每次的测定结果并计算均值(Mean)、标准差(SD)、变异系数(CV)；日间精密度：每天测定1次评价样本，累积20次结果，计算均值(Mean)、标准差(SD)、变异系数(CV)。实验结果如表4-1和表4-2所示。

表4-1批间重复性检测结果

表4-2日间重复性检测结果

由表4-1和4-2可以得出，试剂盒的批内CV最高为1.97％，日间C最高为2.85％，符合试剂≤4％的技术要求。

三.试剂开瓶稳定性

将高、低值的两份无溶血、黄疸、脂血的新鲜血清标本分别分装30份，于-80℃冷冻保存备用，检测前从冰箱取出恢复至室温混匀。在全自动生化仪(东芝40)相应的试剂仓内装载R1与R2试剂，在仪器试剂仓允许温度范围内开盖放置，当天做完校准后不再更换试剂和校准，每天测定质控合格后测定高、低值血清标本各1份，分别重复3次，计算均值及相对偏差。以相对偏差＜±10％作为该试剂稳定性的判断限，其实验结果如表5所示。

表5试剂盒开瓶稳定性检测结果

由表5可以得出，本申请所制备试剂的稳定性标准远低于10％，甚至都不到1.7％，说明本申请所制备的试剂稳定良好。

四.干扰能力的评价

依据CLSI EP7-A2指南的建议，采用添加外源性干扰物的方式来进行KL-6抗干扰性能评估。选择KL-6浓度分别为高低值的两份无溶血、黄疸、脂血的新鲜血清标本，取干扰物(胆红素、血红蛋白、甘油三酯、抗坏血酸、类风湿因子和脂肪乳)和生理盐水分别与高值血清标本按1：9比例混合为标本A、标本B，A与B按3：0、2：1、1：2、0：3比例混合为4份待测标本，每份标本重复测三次。用同样方法做低值血清的干扰实验。将每份标本各组的均值减去未加干扰物相应组的均值即可得出干扰值，并计数出干扰率，以相对偏差＜10％作为该检测方法对干扰物的判断限，在范围内判断为无明显干扰，否则为有明显干扰，其实验结果如表6-11所示。干扰率(％)＝干扰值/基础值×100％。

表6胆红素干扰试验结果

表7血红蛋白干扰试验结果

表8甘油三酯干扰试验结果

表9抗坏血酸干扰试验结果

表10类风湿因子干扰试验结果

表11脂肪乳干扰试验结果

由表6-11可以得出，实施例2所制备的试剂盒在检测含有以下浓度干扰物的样本时，对检测结果无影响：胆红素≤20mg/dL、血红蛋白≤5g/L、甘油三酯≤270mg/dL、抗坏血酸≤20mg/dL、脂肪乳剂≤750mg/dL、类风湿因子≤500IU/mL。

实施例4

与市场上其他试剂的性能参数对比

本发明试剂与市场上其他KL-6试剂盒性能参数对比情况如表12所示。

表12与市场上其他试剂的性能参数对比

从表12中可以看出，本发明的试剂主要在试剂检测用量、试剂的抗干扰项、线性范围等方面显著优于市场上的对比试剂。

以上仅是本发明的特征实施范例，对本发明保护范围不构成任何限制。凡采用同等交换或者等效替换而形成的技术方案，均落在本发明权利保护范围之内。

Claims (10)

1.一种用于检测KL-6的乳胶颗粒制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)用反应缓冲液悬浮乳胶微球，得到乳胶微球溶液；

(2)向步骤(1)的反应体系加入KL-6抗体；

(3)持续搅拌反应；

(4)向步骤(3)的反应体系依次加入EDC.HCl溶液和NHS溶液；

(5)向步骤(4)的反应体系加入封闭液，反应后离心；

(6)向步骤(5)的反应体系加入储存液；

(7)过夜保存，获得胶乳试剂。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述EDC.HCl的浓度为0.01-0.1g/L，和/或所述NHS的浓度为0.1-0.5g/L，和/或所述乳胶微球的浓度为1％-2％。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述胶乳微球的体积与所述EDC.HCl溶液和NHS溶液的总体积比为1:1。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述步骤1中，反应缓冲液为HEPES缓冲液、MES缓冲液和硼酸盐缓冲液中的一种或多种。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述反应缓冲液为MES缓冲液和硼酸缓冲液；优选地，所述MES缓冲液与所述硼酸缓冲液的体积比为1:3～5；更优选地，所述MES缓冲液与所述硼酸缓冲液的体积比为1：4。

6.根据权利要求4或5所述的制备方法，其特征在于：所述MES缓冲液的pH值为6.0-6.5，和/或所述硼酸缓冲液的pH值为7.2-7.3。

7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(4)中，反应体系为在25-37℃下恒温反应，反应时间60-120min；优选地，反应体系为在28℃条件下恒温反应90min。

8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述乳胶颗粒用于胶乳增强免疫比浊法。

9.试剂盒，其特征在于，包括权利要求1-8中任一项所述的制备方法制备的乳胶颗粒。

10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，包括试剂1和试剂2；所述试剂1包括100mmol/L柠檬酸钠，0.15mol/L氯化钠和0.03％防腐剂；所述试剂2包括100mmol/L柠檬酸钠，1％牛血清白蛋白，1％吐温20，0.03％防腐剂和1.5％乳胶颗粒。

Images