CN114924085A - 一种抗缪勒氏管激素测定试剂盒 - Google Patents
一种抗缪勒氏管激素测定试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及生物分析技术领域，提供了一种抗缪勒氏管激素测定试剂盒，其特征在于，包括彼此独立的试剂1和试剂2，试剂1由稳定剂和防腐剂置于pH为6～7.5的缓冲液中组成，稳定剂的浓度为0.05～0.3mol/L，防腐剂的浓度为0.01～0.06wt％；试剂2由牛血清白蛋白、表面活性剂、防腐剂和包被有抗缪勒氏管激素抗体的胶乳颗粒置于pH为6～8的缓冲液中组成，牛血清白蛋白的浓度为0.5～2wt％，吐温20的浓度为0.5～2wt％，防腐剂的浓度为0.01～0.06wt％，包被有抗缪勒氏管激素抗体的胶乳颗粒的浓度为0.2～3wt％。本发明的试剂盒采用胶乳免疫比浊法为检测原理，与现有技术相比，本发明具有特异性强、灵敏度高、准确性高、操作方便、检测成本低、无放射性污染的优点，能在生化分析仪上使用，不需要昂贵的检测仪器，适合临床推广使用。
Description
技术领域
本发明涉及生物分析技术领域，尤其涉及一种抗缪勒氏管激素测定试剂盒。
背景技术
抗缪勒氏管激素(AMH)是一种转化生长因子β超家族多肽类物质，在女性体内由卵巢的初级卵泡、窦前卵泡和小窦卵泡颗粒细胞合成并分泌。血清AMH水平检测不仅能更早、更准确地反映卵巢储备功能，预测绝经年龄，且在卵巢相关疾病，如多囊卵巢综合症，卵巢早衰等的诊断，儿童性别发育异常的诊断及辅助生殖技术中有着重要意义。
对于AMH的检测，目前临床的方法包括：酶联免疫法、化学发光、电化学发光法等方法。目前最常用的是酶联免疫法利用酶联免疫法检测抗缪勒氏管激素含量，灵敏度高，特异性强，但检测时间长，不能自动化；化学发光法检测血清中AMH，能自动化检测，但需要昂贵化学发光检测系统。
发明内容
本发明旨在至少克服上述现有技术的缺点与不足其中之一，提供一种抗缪勒氏管激素测定试剂盒。本发明目的基于以下技术方案实现：
一种抗缪勒氏管激素测定试剂盒，包括彼此独立的试剂1和试剂2，其中：
所述试剂1由稳定剂和防腐剂置于pH为6～7.5的缓冲液中组成，所述稳定剂的浓度为0.05～0.3mol/L，所述防腐剂的浓度为0.01～0.06wt％；
所述试剂2由牛血清白蛋白、表面活性剂、防腐剂和包被有抗缪勒氏管激素抗体的胶乳颗粒置于pH为6～8的缓冲液中组成，所述牛血清白蛋白的浓度为0.5～2wt％，吐温20的浓度为0.5～2wt％，防腐剂的浓度为0.01～0.06wt％，包被有抗缪勒氏管激素抗体的胶乳颗粒的浓度为0.2～3wt％。
优选地，所述试剂1中缓冲液的浓度为50～150mmol/L，所述试剂2中缓冲液的浓度为50～150mmol/L。
优选地，所述缓冲液包括柠檬酸钠、2-吗啉乙磺酸、4-羟乙基哌嗪乙磺酸、三羟甲基氨基甲烷或PBS缓冲液。
优选地，所述表面活性剂包括吐温20、吐温40、吐温60、吐温80、曲拉通X-100中的一种或多种。
优选地，所述稳定剂包括氯化钠、和/或氯化钾。
优选地，所述防腐剂包括叠氮钠、Procline300、山梨酸钾、苯甲酸钠、亚硝酸钠中的一种或多种。
优选地，所述试剂1包括柠檬酸钠100mmol/L，氯化钠0.15mol/L，防腐剂0.03wt％；
所述试剂2包括柠檬酸钠100mmol/L，牛血清白蛋白1wt％，吐温20 1wt％，防腐剂0.03wt％，包被有抗缪勒氏管激素抗体的胶乳颗粒1wt％。
优选地，本发明提供的一种抗缪勒氏管激素测定试剂盒，还包括校准品，所述校准品包含50wt％人血清、25～100mmol/L缓冲剂、2～10wt％保护剂、0.05～0.3mol/L氯化钠、0.01～0.06wt％防腐剂、靶值浓度范围为(42，56)ng/mL的抗缪勒氏管激素抗原。
优选地，本发明提供的一种抗缪勒氏管激素测定试剂盒，还包括质控品，所述质控品包含50wt％人血清、25～100mmol/L缓冲剂、0.01～0.06wt％防腐剂、2～10wt％保护剂、0.05～0.3mol/L氯化钠、抗缪勒氏管激素抗原，所述抗缪勒氏管激素抗原的水平1目标浓度范围为(2，10)ng/mL，所述抗缪勒氏管激素抗原的水平2目标浓度范围为(16，24)ng/mL。
优选地，所述缓冲剂的pH为6.0～8.0。
优选地，所述校准品和/或质控品的性状为冻干粉。
优选地，所述试剂1和2按照体积比1.5～5：1进行免疫凝集反应。
本发明可至少取得如下有益效果其中之一：
本发明的试剂盒采用胶乳免疫比浊法为检测原理测定血清抗缪勒氏管激素抗体，在反应体系中，标本中抗缪勒氏管激素抗原与包被有抗缪勒氏管激素抗体的胶乳颗粒试剂反应，形成免疫复合物，在600nm波长下测定浊度的变化，参照校准曲线可计算出标本中AMH的含量。与现有技术相比，本发明所提供试剂盒具有特异性强、灵敏度高、准确性高、检测时间短、操作方便、检测成本低、无放射性污染的优点，能在生化分析仪上使用，不需要昂贵的检测仪器，适合临床推广使用。
具体实施方式
下面将对本发明的实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1试剂盒的制备
一、试剂1和试剂2
1.试剂主要原料
抗缪勒氏管激素测定试剂盒(胶乳免疫比浊法)的主要原料是包被有抗缪勒氏管激素抗原的胶乳颗粒，经过对国内外厂家的调研和筛选，选择了两个厂家的产品，分别为北京百尚利德和北京华元山水生物科技有限公司。
缓冲液及pH值：
| 缓冲体系 | pH值 |
| Tris-HCl(三羟甲基氨基甲烷) | 7.5 |
| PBS(NaH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>·Na<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>·12H<sub>2</sub>O) | 7.5 |
| 柠檬酸钠 | 6.5 |
| HEPES(4-羟乙基哌嗪乙磺酸) | 7.5 |
| MES(2-吗啉乙磺酸) | 6.5 |
2.实验仪器及条件
全自动生化分析仪(型号Olympus AU400)
检验方法：终点法检验温度：37℃
检验波长：600nm比色杯光径：1cm
以水作为空白对照
3.实验方法
每种缓冲液各取60mL，作为试剂1使用，另外，每种缓冲液各取20mL，分别加入包被有抗缪勒氏管激素抗体胶乳颗粒0.2mL，充分混匀，作为试剂2使用。
试剂1：样品：试剂2＝120:2:40，按照比例加入试剂1和20ng/mL的抗缪勒氏管激素样品混匀，37℃反应5分钟，加入试剂2混匀，30秒后在600nm下读取吸光度值A1，5分钟后读取吸光度值△A2。计算A＝A2-A1，△A应≥0.01；用纯化水代替样本检测试剂空白，A≤2.0。
1)定标数据
| 缓冲体系 | MES | PBS | 柠檬酸钠 | HEPES | Tris-HCl |
| 0 | -0.0021 | -0.0013 | -0.0020 | -0.0011 | -0.0012 |
| 2.875 | 0.0197 | 0.0103 | 0.0204 | 0.0118 | 0.0113 |
| 5.75 | 0.0515 | 0.0247 | 0.0503 | 0.0227 | 0.0233 |
| 11.5 | 0.1361 | 0.0615 | 0.1440 | 0.0815 | 0.0818 |
| 23 | 0.3231 | 0.177 | 0.3173 | 0.1754 | 0.1512 |
| 46 | 0.5572 | 0.3222 | 0.5553 | 0.3253 | 0.2376 |
| ABS | 0.5636 | 0.5412 | 0.5372 | 0.5369 | 0.5622 |
2)试验数据
分析试验数据，5种缓冲体系中，缓冲液为MES、柠檬酸钠时，测值的CV比较接近，且均值小于其他种类缓冲液的CV值，说明缓冲液为MES、柠檬酸钠时，抗缪勒氏管激素样品的重复性最好，需做进一步研究确定试剂缓冲体系。
3)37℃加速试验：
将MES、柠檬酸钠缓冲体系下配制的试剂，分别做37℃加速稳定性。分别在0天、4天、7天检测，重复测定对比厂家质控品3次，计算CV值及均值与0天的偏差，观察不同缓冲液体系下试剂稳定性。
通过3次试验数据可以看出，MES缓冲液配制的试剂测试样品，随着时间的变化，偏差逐渐增大，而柠檬酸钠缓冲液配制的试剂检测样品，随着时间的变化，偏差变化不大，对比可知，柠檬酸钠缓冲液配制的试剂稳定性最好，因此抗缪勒氏管激素试剂选择pH值为6.5的柠檬酸钠缓冲体系。
4.试剂1、试剂2的配制
(1)试剂试剂1按照以下方法进行配制：柠檬酸钠100mmol/L，氯化钠0.15mol/L，防腐剂0.03wt％；按以上配比称取好原料后加入纯水中，搅拌速度为100r/min，搅拌时间为30min，即得。
(2)试剂试剂2按照以下方法进行配制：柠檬酸钠100mmol/L，牛血清白蛋白1wt％，吐温-20 1wt％，防腐剂0.03wt％，包被有抗缪勒氏管激素抗体的胶乳颗粒0.5wt％；按以上配比称取好原料后加入纯水中，搅拌速度为100r/min，搅拌时间为30min，即得。
以上防腐剂选用叠氮钠。
二.校准品、质控品的配制
1.缓冲液及pH值的选择
试验方法：
每种缓冲液各取10mL，分别加入抗缪勒氏管激素16μL充分混匀。
1)试验数据：
4种缓冲体系中，缓冲液为Tris-Hcl时，在3个pH范围下，测值的CV比较接近，且均小于其他种类缓冲液的CV值，说明缓冲液为Tris-Hcl时，抗缪勒氏管激素样品的重复性最好，因此选择Tris-Hcl为抗缪勒氏管激素校准品质控品缓冲体系。
2)37℃加速试验：
将Tris-HCl缓冲体系下的3个pH梯度配制的样品，分别做37℃加速稳定性。分别在0天、4天、7天检测，重复测定Tris-HCl缓冲体系下的3个pH值下配制的样品3次，计算CV值及均值与0天的偏差，观察不同pH下样品稳定性。
通过3次试验数据可以看出，3个pH下样品变化呈现一致的趋势，即37℃放置随着时间的变化，偏差逐渐增大，对比可知，当pH值为7.5时，配制的抗缪勒氏管激素样品稳定性最好，因此抗缪勒氏管激素校准品、质控品选择pH值为7.5的Tris-Hcl缓冲体系。
2.校准品、质控品的配制
1)校准品包含50％人血清、50mmol/L缓冲剂、5％保护剂、0.15mol/L氯化钠、0.03％防腐剂、靶值浓度范围为(42，56)ng/mL的抗缪勒氏管激素抗原。按照以上配比称取原料后，加入纯水中，搅拌速度为100r/min，搅拌时间为30min，即得。
2)质控品包含50％人血清、50mmol/L缓冲剂、5％保护剂、0.15mol/L氯化钠、0.03％防腐剂、抗缪勒氏管激素抗原，所述抗缪勒氏管激素抗原的水平1目标浓度范围为(2，10)ng/mL，所述抗缪勒氏管激素抗原的水平2目标浓度范围为(16，24)ng/mL。按照以上配比称取原料后，加入纯水中，搅拌速度为100r/min，搅拌时间为30min，即得。
以上防腐剂选用叠氮钠。
3)校准品、质控品的冻干参数设置如下：
| 设定温度(℃) | 设定时间(min) | 持续时间(min) | |
| 预冻 | -45 | 300 | |
| 升华干燥第1阶段 | -30 | 30 | 180 |
| 升华干燥第2阶段 | -20 | 30 | 180 |
| 升华干燥第3阶段 | -10 | 30 | 300 |
| 升华干燥第4阶段 | -5 | 30 | 180 |
| 升华干燥第5阶段 | 0 | 30 | 180 |
| 解析干燥第1阶段 | 5 | 30 | 60 |
| 解析干燥第2阶段 | 15 | 30 | 60 |
| 解析干燥第3阶段 | 30 | 30 | 180 |
为了提高校准品、质控品冻干后外观，加入5％海藻糖作为保护剂及赋形剂。校准品、质控品冻干后为致密饼状，且满足产品技术要求。
三、试剂盒的组成
实施例2试剂盒的检测方法
一、检测方法
1.试剂准备
液体双试剂开瓶即用，试剂开瓶后在2℃～8℃条件下贮存可以稳定30天。校准品、质控品使用前需用1.00mL的纯化水复溶，置10℃～30℃30分钟，使冻干物完全溶解后，轻轻混合即可作为原校准品溶液和质控品溶液使用。用纯化水将原校准品溶液按下表稀释(体积比)，稀释成六个浓度梯度，稀释方法如下：
| 序号 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
| 纯化水:原液 | 1:0 | 15:1 | 7:1 | 3:1 | 1:1 | 0:1 |
2.参数设置
检验方法：终点法检验温度：37℃
检验波长：600nm比色杯光径：1cm
以水作为空白对照
3.检验步骤
4.校准程序
采用多点定标校正。
5.质控程序
每天对样本进行检测之前，须进行质量控制，以保障测试系统的稳定性。质控品测定结果应在允许范围内。
6.计算
7.参考区间
血清、血浆：
20-29岁女性：1.5ng/mL-7.5ng/mL；
30-39岁女性：0.5ng/mL-6.5ng/mL；
40-50岁女性：0.06ng/mL-2.5ng/mL；
本参考区间通过本公司对200例临床样本验证，采取正态分布方法，在95％置信区间下获得，由于地理、人种、性别及年龄等差异，建议各实验室建立自己的参考区间。
二、产品性能指标
1.空白限：试剂盒的空白限≤0.5ng/mL。
2.准确度：
其回收率应在85％～115％范围内。
3.线性：
在[1，46]ng/mL区间内，线性相关系数r≥0.990；
在[1，15]ng/mL区间内，线性绝对偏差不超过±1.5ng/mL，在(15，46]ng/mL区间内，线性相对偏差不超过±10％。
4.精密度：
测试高、低两浓度样本，其结果的变异系数CV≤6％。
随机抽取三批试剂盒，测试同一份样本，批间相对极差(R)≤10％。
校准品、质控品瓶间变异系数CV≤10％。
5.质控品赋值有效性：
质控品检测结果应在其质控范围内。
6.干扰能力的评价
若标本中含有以下浓度的干扰物，对检测结果无显著影响：
胆红素≤20mg/dL、血红蛋白≤2g/L、甘油三酯≤270mg/dL、抗坏血酸≤20mg/dL、脂肪乳剂≤750mg/dL、类风湿因子≤200IU/mL。
本试剂盒线性范围为[1，46]ng/mL。超出试剂盒线性范围的测定结果是通过校准品曲线外延得出的计算结果，不作为准确定量数据。
实施例3对实施例1的试剂盒进行检测
按照实施例2的检测方法及产品性能指标对实施例1的试剂盒进行检测。
1.空白限
试剂盒的空白限符合≤0.5ng/mL的要求。
2.准确度
3.线性范围
配制标准样品，每个浓度的样本用实施例1中的试剂盒测定3次取平均值，对测定值进行相关分析。本实验验证的抗缪勒氏管激素分析测量范围为1～46ng/mL，R＝0.9999，结果见下表。
4.精密度
用实施例1中制备的试剂测定批内精密度。选择低值和高值两个水平的质控血清作为评价样本，批内精密度：在较短的时间内及稳定的条件下连续重复测定10次，记录每次的测定结果并计算均值、标准差(SD)、变异系数(CV)。
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 平均值 | SD | CV |
| 4.89 | 4.86 | 5.03 | 5.05 | 5.16 | 5.19 | 5.13 | 5.13 | 4.95 | 5.17 | 5.056 | 0.12 | 2.38％ |
| 18.85 | 19.11 | 19.25 | 19 | 19.32 | 19.26 | 19.55 | 19.16 | 19.33 | 19.07 | 19.19 | 0.197 | 1.02％ |
试剂盒的批内CV最高为2.38％，符合试剂≤6％的要求。
校准品、质控品瓶间变异系数的测定方法同上。
校准品、质控品瓶间变异系数符合试剂≤10％的要求。
5.质控品赋值有效性
| 1 | 2 | 3 | 靶值范围 | 结论 | |
| 水平1 | 4.89 | 4.86 | 5.03 | 5.00(4.00～6.00)ng/mL | 合格 |
| 水平2 | 18.85 | 19.11 | 19.25 | 20.00(16.00～24.00)ng/mL | 合格 |
6.效期稳定性评价
对2℃-8℃留样产品第14个月进行实验监测，其各项指标均符合要求。
具体数据如下：
批号：SA01710101生产日期：2017.12.22有效期至：2018.12.21检测时间：2019.02.22
7.复溶稳定性评价
对2℃-8℃留样校准品、质控品在近效期做复溶稳定性检测，其各项指标均符合要求。具体数据如下：
1)一批产品的校准品、质控品第9天复溶测定数据(对照组)：
批号：SA01710101生产日期：2017.12.22有效期至：2018.12.21复溶日期：2018.12.28检测时间：2018.12.28
2)一批产品的校准品、质控品起始时间复溶，2℃～8℃条件下密闭贮存9天测定数据：
批号：SA01710101生产日期：2017.12.22有效期至：2018.12.21复溶日期：2018.12.19检测时间：2018.12.28
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种抗缪勒氏管激素测定试剂盒，其特征在于，包括彼此独立的试剂1和试剂2，其中：
所述试剂1由稳定剂和防腐剂置于pH为6～7.5的缓冲液中组成，所述稳定剂的浓度为0.05～0.3mol/L，所述防腐剂的浓度为0.01～0.06wt％；
所述试剂2由牛血清白蛋白、表面活性剂、防腐剂和包被有抗缪勒氏管激素抗体的胶乳颗粒置于pH为6～8的缓冲液中组成，所述牛血清白蛋白的浓度为0.5～2wt％，吐温20的浓度为0.5～2wt％，防腐剂的浓度为0.01～0.06wt％，包被有抗缪勒氏管激素抗体的胶乳颗粒的浓度为0.2～3wt％。
2.根据权利要求1所述的一种抗缪勒氏管激素测定试剂盒，其特征在于，所述试剂1中缓冲液的浓度为50～150mmol/L，所述试剂2中缓冲液的浓度为50～150mmol/L。
3.根据权利要求1所述的一种抗缪勒氏管激素测定试剂盒，其特征在于，所述缓冲液包括柠檬酸钠、2-吗啉乙磺酸、4-羟乙基哌嗪乙磺酸、三羟甲基氨基甲烷或PBS缓冲液；
所述表面活性剂包括吐温20、吐温40、吐温60、吐温80、曲拉通X-100中的一种或多种。
4.根据权利要求1所述的一种抗缪勒氏管激素测定试剂盒，其特征在于，所述稳定剂包括氯化钠、和/或氯化钾；
所述防腐剂包括叠氮钠、Procline300、山梨酸钾、苯甲酸钠、亚硝酸钠中的一种或多种。
5.根据权利要求3所述的一种抗缪勒氏管激素测定试剂盒，其特征在于，所述试剂1包括柠檬酸钠100mmol/L，氯化钠0.15mol/L，防腐剂0.03wt％；
所述试剂2包括柠檬酸钠100mmol/L，牛血清白蛋白1wt％，吐温20 1wt％，防腐剂0.03wt％，包被有抗缪勒氏管激素抗体的胶乳颗粒1wt％。
6.根据权利要求1所述的一种抗缪勒氏管激素测定试剂盒，其特征在于，还包括校准品，所述校准品包含50wt％人血清、25～100mmol/L缓冲剂、2～10wt％保护剂、0.05～0.3mol/L氯化钠、0.01～0.06wt％防腐剂、靶值浓度范围为42<c1<56ng/mL的抗缪勒氏管激素抗原。
7.根据权利要求1所述的一种抗缪勒氏管激素测定试剂盒，其特征在于，还包括质控品，所述质控品包含50wt％人血清、25～100mmol/L缓冲剂、0.01～0.06wt％防腐剂、2～10wt％保护剂、0.05～0.3mol/L氯化钠、抗缪勒氏管激素抗原，所述抗缪勒氏管激素抗原的水平1目标浓度范围为2<c2<10ng/mL，所述抗缪勒氏管激素抗原的水平2目标浓度范围为16<c3<24ng/mL。
8.根据权利要求6或7所述的一种抗缪勒氏管激素测定试剂盒，其特征在于，所述缓冲剂的pH为6.0～8.0。
9.根据权利要求6或7所述的一种抗缪勒氏管激素测定试剂盒，其特征在于，所述校准品和/或质控品的性状为冻干粉。
10.根据权利要求1所述的一种抗缪勒氏管激素测定试剂盒，其特征在于，所述试剂1和2按照体积比1.5～5：1进行免疫凝集反应。
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