CN115290584B - 一种稳定的不饱和铁结合力测定试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种稳定的不饱和铁结合力测定试剂盒由以下成分组成，试剂盒含有试剂R1和试剂R2；试剂R1包含以下组分：缓冲液、氯化铁、碳酸氢钠碳酸钠、曲拉通‑100、Fe³⁺稳定剂、叠氮钠；试剂R2包含以下组分：甘氨酸、抗坏血酸、呋喃三嗪二钠盐、稳定剂、Pc300。本发明制备的不饱和铁结合力测定试剂稳定性好、准确度高、重复性好、分析灵敏度高，37℃可保存两周，明显优于市售的同类型产品。

Description

一种稳定的不饱和铁结合力测定试剂盒

技术领域

本发明涉及生化检测技术领域，特别是涉及一种稳定的不饱和铁结合力测定试剂盒及其制备方法和应用。

背景技术

铁是人体最丰富的必须微量元素之一，是合成红细胞中血红蛋白的主要原料，广泛参与人体内的代谢过程。存在于正常成人体内的铁平均3-4.5g左右，全身所有的铁约70％存在于血红蛋白中，少量存在于肌红蛋白中，而各种酶和血浆中运输状态的铁，仅占全身铁的极小部分，缺铁或含铁过多都会引发各种疾病。转铁蛋白又名运铁蛋白(transferrin，TRF， siderophilin)是血浆中主要的含铁蛋白质，负责运载由消化管吸收的铁和由红细胞降解释放的铁，以TRF-Fe3+的复合物形式进入骨髓中，供成熟红细胞的生成。血清中只有三分之一的转铁蛋白与铁结合，其余三分之二未结合，转铁蛋白这种潜在的结合铁的能力称为不饱和铁结合力UIBC(Unsaturated Iron Binding Capacity)，能结合的最大铁量称为总铁结合力 TIBC(Total Iron Binding Capacity)，等于血清铁与不饱和铁结合力之和。

血清不饱和铁结合力的测定方法主要有原子吸收光谱法电化学法和直接比色法。原子吸收法与电化学法虽样品用量少，分析时间短，但因需要专门的测试仪器，且价格昂贵，应用范围有限，目前在临床实验室广泛使用的是比色法。目前血清铁和不饱和铁结合力检测试剂盒，都可以在自动生化仪上进行快速测定。不饱和铁结合力测定原理：向血清样本中加入含过量铁离子的碱性缓冲液，使未与铁结合的转铁蛋白全部与铁离子结合，剩余的铁离子在还原剂、显色剂作用下生成有色物质，在特定波长下测定吸光度，计算缓冲液中铁离子的减少量即为血清的不饱和铁结合力，而由不饱和铁结合力加上血清铁计算得到总铁结合力。但是由于铁离子在碱性条件下不容易稳定存在，Fe³⁺容易和OH^—结合，以及还原剂容易被氧化变质，不饱和铁结合力测定试剂存在重复性不好、稳定性差等缺点。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供一种稳定的不饱和铁结合力测定试剂盒，该试剂盒是稳定性强、准确度高、重复性好、灵敏度高的液体试剂盒。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种稳定的不饱和铁结合力测定试剂盒由以下成分组成，试剂盒含有试剂R1和试剂 R2；

试剂R1包含以下组分：

试剂R2包含以下组分：

其中，所述试剂R1中的的缓冲液为三(羟甲基)甲基甘氨酸(tricine)缓冲液。

所述试剂R1中的Fe³⁺稳定剂由L-酪氨酸、羟甲基磺酸钠和Pluronic F68组成，且质量比为1-2：2-3:3-5。

所述试剂R2中的稳定剂由三(2-羧乙基)膦盐酸盐和磺丁基-β-环糊精组成，且质量比为 1-3：3-4。

本发明有益效果：

1、本发明试剂R1采用三(羟甲基)甲基甘氨酸缓冲液，且提高了三(羟甲基)甲基甘氨酸的浓度，有利于试剂R1中Fe³⁺的稳定存在，在试剂1与血清样本混合后，Fe³⁺和转铁蛋白完全结合，加入R2后，剩余Fe³⁺和fenene结合，提高试剂准确度和分析灵敏度。

2、本发明试剂R1中添加铁离子稳定剂L-酪氨酸、羟甲基磺酸钠、Pluronic F68，使铁离子在碱性条件下稳定存在，避免因铁离子沉淀引起的试剂空白升高，提高试剂的稳定性和重复性，Pluronic F68表面活性剂降低溶液表面张力和增溶效果更好，从而获得均一的分散体系，进一步提高试剂的重复性。

3、本发明试剂R2中添加强还原剂TCEP保护抗坏血酸稳定性，TCEP本身具有更佳的稳定性和更强的还原性，避免使用DTT、巯基乙醇等挥发性、刺激性气味的还原剂。磺丁基-β-环糊精作为高水溶性大分子物质，提高色原呋喃三嗪二钠盐(ferene)的稳定性。

4、本发明制备的不饱和铁结合力测定试剂稳定性好、准确度高、重复性好、分析灵敏度高，37℃可保存两周，明显优于市售的同类型产品。

附图说明

图1为实施例1和对比例1试剂的相关性曲线；

图2为对比例2和对比例1试剂的相关性曲线；

图3为对比例3和对比例1试剂的相关性曲线；

图4为实施例1和对比例1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11提供的不饱和铁结合力测定试剂进行稳定性试验的浓度变化。

图5为实施例1和对比例1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11提供的不饱和铁结合力测定试剂进行稳定性试验的水空白变化。

具体实施方式

以下是本发明的具体实施例结合附图说明，对本发明的技术方案作进一步的描述，但本发明并不限于这些实施例。

本发明试剂盒测定血清中不饱和铁结合力的测试条件为：方法：终点法；主/副波长： 575nm/700nm；温度：37℃；校正类型：线性；校准方法：两点定标；反应方向：向上。具体操作如表1所示。

表1不饱和铁结合力测定试剂操作步骤

计算结果：

样本要求：

1.不溶血血清。

2.样本稳定性：标本2～8℃保存可稳定3天，-20℃保存可稳定2周。

下面结合具体实施例对本发明进行进一步说明：

实施例1

一种稳定的不饱和铁结合力测定试剂盒：

试剂R1：

试剂R2：

制备方法为：试剂R1先加入缓冲液、碳酸钠、碳酸氢钠、稳定剂、表面活性剂、防腐剂，用盐酸或氢氧化钠调节pH，pH值调节为8.6，再加入氯化铁，制成试剂R1。试剂R2先加入缓冲液、抗坏血酸、稳定剂、防腐剂，用盐酸或氢氧化钠调节pH，pH值调节为4.0，再加入呋喃三嗪二钠盐(ferene)，制成试剂R2。

实施例2

试剂R1：

试剂R2：

制备方法同实施例1。

实施例3

试剂R1；

试剂R2包含以下组分：

制备方法同实施例1。

对比例1

进口贝克曼不饱和铁结合力测定试剂盒。

对比例2

对比例3

与实施例1中不饱和铁结合力测定试剂盒的区别仅在于试剂R1中的缓冲液为Tris-HCl 缓冲液(pH8.6)，其它与实施例1相同。

试剂R2：

对比例4

与实施例1中不饱和铁结合力测定试剂盒的区别仅在于试剂R1中不含有L-酪氨酸，其它与实施例1相同。

对比例5

与实施例1中不饱和铁结合力测定试剂盒的区别仅在于试剂R1中不含有羟甲基磺酸钠，其它与实施例1相同。

对比例6

与实施例1中不饱和铁结合力测定试剂盒的区别仅在于试剂R1中不含有PluronicF68，其它与实施例1相同。

对比例7

与实施例1中不饱和铁结合力测定试剂盒的区别仅在于试剂R2中不含有三(2-羧乙基) 膦盐酸盐，其它与实施例1相同。

对比例8

与实施例1中不饱和铁结合力测定试剂盒的区别仅在于试剂R2中不含有磺丁基-β-环糊精，其它与实施例1相同。

对比例9

与实施例1中不饱和铁结合力测定试剂盒的区别仅在于试剂R1中不含有L-酪氨酸，而含有等量的甘氨酸，其它与实施例1相同。

对比例10

与实施例1中不饱和铁结合力测定试剂盒的区别仅在于试剂R1中不含有羟甲基磺酸钠，而含有等量的羟甲基纤维素钠，其它与实施例1相同。

对比例11

与实施例1中不饱和铁结合力测定试剂盒的区别仅在于试剂R1中不含有PluronicF68，而含有等量的Brij-35，其它与实施例1相同。

性能验证

1、相关性实验

进行相关性试验，试验方案为：实施例1、对比例1、对比例2和对比例3，同时检测了40个临床血清样本，对四组检测结果进行相关性分析，计算相关系数r；以对比例1 检测结果作为靶值，分别计算40对数据的相对偏差(Bias％)。要求r不小于0.990，相对偏差不超过±10％。

表2相关性对比实验结果

表3对比例1分别与实施例1、对比例2、对比例3的相关系数

	相关系数r
		实施例1和对比例1	0.9982
对比例2和对比例1	0.9851
		对比例3和对比例1	0.9369

由表2和图1的可以看出，实施例1和对比例1的试剂盒血清样本测试偏差最大值为-1.8％，两种试剂的相关系数为0.9982，实施例1和对比例1的检测结果非常接近，因此本发明提供的实施例1检测试剂准确度较高；由表3和图2可以看出，对比例2和对比例1 检验结果偏差稍大，相关系数为0.9851；由表3和图3可以看出对比例3和对比例1检验结果偏差较大，相关系数为0.9369，说明本发明使用三(羟甲基)甲基甘氨酸缓冲液，通过优化反应体系，准确度优于对比例2和对比例3。

试验二稳定性实验

对实施例1和对比例1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11提供的不饱和铁结合力测定试剂进行稳定性试验，试验方案为：对实施例1和对比例1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11提供的试剂，一起放入37℃水浴箱中，每天检测靶值为39.0±4.1μmol/L的质控品和水，并监测质控品测定值和水空白的变化。

表4试剂热稳定性验证结果(质控)

表5试剂热稳定性验证结果(水)

由表4和图4、图5可以看出，与对比例1相似，本发明提供的实施例1试剂在37℃水浴条件下14天内基本无变化，稳定性较好；而对比例2、3、4、5、6试剂在37℃水浴条件下14天内水空白降低，样本值降低，对比例7、8在37℃水浴条件下14天内水空白升高，样本值升高。对比例3用TRIS缓冲液影响Fe³⁺的稳定性，导致吸光度上升，水空白下降，样本结果降低；对比例4、5、6试剂R1相比实施例1缺少Fe³⁺稳定剂，导致吸光度上升，水空白下降，样本结果降低，对比例7、8试剂R2相比实施例1缺少抗坏血酸稳定剂和色原稳定剂，导致抗坏血酸还原能力降低，色原衰减，反应吸光度下降，水空白上升，样本结果上升；对比例9、10、11虽然加入的同类物质，但并未提高试剂R1的稳定性。因此实施例1的试剂盒稳定性优于对比例2、3、4、5、6、7、8、9、10、11试剂盒的稳定性，说明本发明L-酪氨酸，羟甲基磺酸钠，Pluronic F68的同时加入，可以协同提高不饱和铁结合力试剂R1的稳定性，三(2-羧乙基)膦盐酸盐和磺丁基-β-环糊精可以协同提高R2的稳定性。

试验三重复性实验

分别选取低值、中值、高值三个质控，分别用实施例1和对比例1、2、6进行对照检测，对每份质控进行20次检测，将共20次检测结果计算平均值、标准差和变异系数。

表6试剂重复性验证结果

由检测结果可知，实施例1检测数值接近靶值，标准偏差小，变异系数小，重复性较好，对比例6相比实施例1和对比例1变异系数大，重复性较差，这说明本发明添加表面活性剂 Pluronic F68有利于进一步提高试剂的重复性，本发明通过添加Fe³⁺保护剂优化了反应过程，避免Fe³⁺沉淀，极大的提高了试剂的重复性。

试验四灵敏度实验

分别用实施例1、对比例1、2、3的试剂测定已知浓度在41.2μmol/L的样本，记录吸光度变化(ΔA)。检测结果见表7。

表7分析灵敏度对比实验结果

通过检测数据可知，实施例1测定试剂盒的吸光度变化与对比例1试剂盒相似，均高于对比例2和对比例3，说明本发明试剂盒的分析灵敏度在用Tricine缓冲液后明显提高。

本文中所描述的具体实施例仅仅是对本发明精神作举例说明。本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种修改或补充或采用类似的方式替代，但并不会偏离本发明的精神或者超越所附权利要求书所定义的范围。

Claims (2)

1.一种稳定的不饱和铁结合力测定试剂盒，其特征在于，由以下成分组成，试剂盒含有试剂R1和试剂R2；

试剂R1包含以下组分：

三(羟甲基)甲基甘氨酸缓冲液 150-200mM

氯化铁 18mg/L

碳酸氢钠 8.4g/L

碳酸钠 10.5 g/L

曲拉通-100 5ml/L

Fe³⁺稳定剂 1-10g/L

叠氮钠 1g/L

pH 8.6；

试剂R2包含以下组分：

甘氨酸 7.5g/L

抗坏血酸 10g/L

呋喃三嗪二钠盐 5g/L

稳定剂 1-12g/L

Pc300 1ml/L

pH 4.0；

所述试剂R1中的Fe³⁺稳定剂由L-酪氨酸、羟甲基磺酸钠和Pluronic F68组成，质量比为1-2：2-3:3-5；

所述试剂R2中的稳定剂由三(2-羧乙基)膦盐酸盐与磺丁基-β-环糊精组成，质量比为1-3：3-4。

2.一种权利要求1所述的不饱和铁结合力测定试剂盒的应用，用于非疾病的诊断和治疗目的测定血清中不饱和铁结合力的浓度。

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