CN114965990B

CN114965990B - 一种糖类抗原CA125表面Tn抗原检测用校准品缓冲液及其制备方法、检测试剂盒

Info

Publication number: CN114965990B
Application number: CN202210278423.4A
Authority: CN
Inventors: 徐丛剑; 王宜生; 张晓燕; 王岳飞; 胡春颖; 路晟; 霍萌萌
Original assignee: Beijing Huizhong Medical Equipment Co ltd; Obstetrics and Gynecology Hospital of Fudan University
Current assignee: Beijing Huizhong Medical Equipment Co ltd; Obstetrics and Gynecology Hospital of Fudan University
Priority date: 2022-03-21
Filing date: 2022-03-21
Publication date: 2023-05-16
Anticipated expiration: 2042-03-21
Also published as: CN114965990A

Abstract

本申请涉及Tn抗原检测的技术领域，具体公开了一种糖类抗原CA125表面的Tn抗原检测用校准品缓冲液及其制备方法、检测试剂盒。制备方法包括以下步骤：S1、将包括pH缓冲试剂、无机盐、蛋白稳定剂和防腐剂的组分加入水中，溶解后定容，得到校准品缓冲液原液；S2、将所述校准品缓冲液原液置于15~38℃的环境中至少保存12h后即得到所述校准品缓冲液；该制备方法制备得到校准品缓冲液；糖类抗原CA125表面的Tn抗原检测试剂盒内含有该校准品缓冲液。该校准品缓冲液用于糖类抗原CA125表面的Tn抗原检测时，具有使校准品曲线拟合低值血清样本时准确检测低浓度Tn抗原的优点，提高试剂盒的检测灵敏度。

Description

一种糖类抗原CA125表面Tn抗原检测用校准品缓冲液及其制备方法、检测试剂盒

技术领域

本申请涉及Tn抗原检测的技术领域，更具体地说，它涉及一种糖类抗原CA125表面的Tn抗原检测用校准品缓冲液及其制备方法、检测试剂盒。

背景技术

糖类抗原CA125(cancer antigen 125，CA125)是妇科最常用的血清肿瘤标志物，约80％的上皮性卵巢癌患者血清CA125水平升高。CA125是用于卵巢癌检测的最常用生物标志物，是一种高度糖基化的粘蛋白；其糖链部分约占整个分子质量的20％-70％，糖基化程度的差异也是造成CA125分子质量差异的原因之一。

常见的糖基化修饰改变包括N-糖链分支增加、平分型N-糖链增加以及O-糖基化障碍，其中O-糖基化障碍表现为T抗原、Tn抗原增加。利用这些差异，有可能做到对肿瘤血清标志物进行进一步分型。临床检测中，CA125水平高于100U/mL的患者需高度怀疑恶性疾病，良性疾病患者的血清CA125水平通常低于200U/mL；因此100-200U/mL是CA125用于诊断的灰色地带。如果一种糖链结构在恶性来源CA125中的表达水平高于良性来源CA125，则有助于增加两类疾病人群的差距，降低重叠程度，提高诊断特异度。而糖类抗原CA125的表面Tn抗原，就能够用于区分良恶性疾病引起的CA125升高。

采用磁微粒化学发光免疫分析法检测糖类抗原CA125表面Tn抗原含量时，往往需要用校准品缓冲液工艺配制校准品定标；然而由于校准品的零浓度点的发光值较高，存在非特异性反应，因此在测试临床低值血清样本时，部分血清样本的发光值会低于校准品零浓度点的发光值，从而导致通过校准品拟合的曲线无法计算出该部分样本结果(尤其指的是低浓度含量部分的样本结果)，进而造成检测结果不准确的问题。

发明内容

在检测糖类抗原CA125表面Tn抗原含量时，需要用校准品缓冲液工艺配制校准品定标；为了提高在低浓度样本的检测准确性，本申请提供一种糖类抗原CA125表面Tn抗原检测用校准品缓冲液及其制备方法、检测试剂盒。

第一方面，本申请提供一种糖类抗原CA125表面Tn抗原检测用校准品缓冲液的制备方法，采用如下的技术方案：

一种糖类抗原CA125表面Tn抗原检测用校准品缓冲液的制备方法，包括以下步骤：

S1、将包括pH缓冲试剂、无机盐、蛋白稳定剂和防腐剂的组分加入水中，溶解后定容，得到校准品缓冲液原液；

S2、将所述校准品缓冲液原液置于15～38℃的环境中至少保存12h后即得到所述校准品缓冲液。

通过采用上述技术方案，在相关样品检测的过程中发现，在制备得到校准品缓冲液原液后，不立即低温保存或者直接使用，而是在15～38℃的环境中至少保存12h后，再进行低温保存或者使用。得到的校准品缓冲液用于糖类抗原CA125表面Tn抗原检测试剂盒的标准曲线拟合时，能够克服使用常规校准品缓冲液存在的零浓度点发光值较高、从而导致通过标准曲线计算的部分低值样本的浓度值为负值的问题。选用本申请的校准品缓冲液，由于校准品零度点发光值更低，检测低浓度糖类抗原CA125表面Tn抗原样本时结果出现负值的几率大大减少，在该处的检测结果更加准确，从而提高整体检测的准确性。

在该方案中，所述校准品缓冲液原液保存时的环境温度可以是15～38℃，也可以是置于15～25℃的环境中保存，也可以是25～30℃的环境中保存，还可以是30～38℃的环境中保存；例如可以是17℃、22℃、27℃、32℃或35℃。

本申请得到的校准品缓冲液在2～8℃环境中密闭保存或备用。

可选的，步骤S2中，所述保存时间为24～72h。

在本申请中，校准品缓冲液原液的保存时间至少为12h，可以是12～24h，可以是24～36h，还可以36～72h；为了减少产品生产周期考虑，保存时间可以适当缩短，例如，可以是15h、18h、21h、26h、30h或33h。

通过采用上述技术方案，在该保存时间下，得到的低值样本(包括零浓度点)发光值低，检测准确性高。

可选的，所述校准品缓冲液原液中各组分的含量为：

无机盐150～160mM，蛋白稳定剂10～35g/L，防腐剂0.5～1.5g/L，添加pH缓冲试剂后，使得校准品缓冲液原液的pH为7.5±0.1。

通过采用上述技术方案，选用上述的缓冲液组分及含量，能够显著降低校准品零浓度点的发光值，减少试剂盒校准曲线生成过程中的非特异性反应，改善校准品稳定性，保证校准品的赋值稳定可靠。

可选的，所述无机盐选自氯化钠、氯化钾、氯化镁和氯化钙中的至少一种。其中，无机盐的添加主要是为了调节离子强度，以保证相关蛋白的活性。

可选的，蛋白稳定剂选自牛血清蛋白、甘油、海藻糖、蔗糖中的至少一种。

可选的，pH缓冲试剂为Tris、HEPES或者磷酸盐。

可选的，pH缓冲试剂为磷酸二氢钾和磷酸氢二钾。

可选的，步骤S1中，在定容后还包括对定溶液除杂的步骤，所述除杂步骤选自过微滤膜、高速离心中的任意一种。

通过采用上述技术方案，进一步去除在前序制备过程中存在的固体杂质、微生物等，进而避免此类杂质或微生物对检测结果或产品质量造成影响，从而保证了检测结果的准确性。

第二方面，本申请提供一种糖类抗原CA125表面Tn抗原检测用校准品缓冲液，采用如下的技术方案：

一种糖类抗原CA125表面Tn抗原检测用校准品缓冲液，采用上述的制备方法制备得到。

可选的，所述校准品缓冲液用于糖类抗原CA125表面Tn抗原检测试剂盒中质控品和校准品的制备，检测Tn抗原的最低浓度在2U/mL以下。

通过采用上述技术方案，首先该校准品缓冲液用于糖类抗原CA125表面Tn抗原检测时，使零浓度点的检测发光值更低，使得该试剂盒检测灵敏度显著提高，即，选用该校准品缓冲液，能够使得低浓度Tn抗原的检测结果更加准确，且能够检测的最低浓度更低。

第三方面，本申请提供一种糖类抗原CA125表面Tn抗原检测用试剂盒，采用如下的技术方案：

一种糖类抗原CA125表面Tn抗原检测用试剂盒，包括上述的校准品缓冲液制备的质控品和校准品。

可选的，所述试剂盒还包括磁分离试剂和抗试剂。

综上所述，本申请具有以下有益效果：

1、由于本申请首先制备得到校准品缓冲液原液，随后通过额外增加“15～38℃的环境中至少保存12h”的处理步骤，最终获得的校准品缓冲液，用于试剂盒中质控品和校准品的制备。该试剂盒在全自动发光免疫分析仪定标时，校准曲线零浓度点发光值更低，通过校准曲线能够更准确计算低浓度Tn抗原样本，从而保证了检测结果的准确性。

2、本申请中校准品缓冲液包含以下组分，具有降低发光值背景信号，提高抗原稳定性的优点：

无机盐150～160mM，蛋白稳定剂25～35g/L，防腐剂0.5～1.5g/L，添加pH缓冲试剂后，使得校准品缓冲液原液的pH为7.5±0.1。

附图说明

图1是以实施例1的校准品缓冲液进行定标拟合的拟合结果图，其中横坐标表示CA125-Tn抗原浓度(单位为U/mL)，纵坐标表示光子数(单位为RLU)；

图2是以实施例2的校准品缓冲液进行定标拟合的拟合结果图，其中横坐标表示CA125-Tn抗原浓度(单位为U/mL)，纵坐标表示光子数(单位为RLU)；

图3是以对比例1的校准品缓冲液进行定标拟合的拟合结果图，其中横坐标表示CA125-Tn抗原浓度(单位为U/mL)，纵坐标表示光子数(单位为RLU)；

图4是以对比例4的校准品缓冲液进行定标拟合的拟合结果图，其中横坐标表示CA125-Tn抗原浓度(单位为U/mL)，纵坐标表示光子数(单位为RLU)。

具体实施方式

以下结合附图和实施例对本申请作进一步详细说明。

实施例

实施例1

校准品缓冲液的制备方法：

S1、向容器中加入约80％纯化水，依次加入磷酸二氢钾2.65mM、磷酸氢二钾11.39mM、氯化钾157mM、防腐剂MIT 1g/L、BSA 30g/L，纯化水充分溶解定容，PH＝7.5±0.1，完成后用0.22μm滤膜过滤保存。即得到校准品缓冲液原液。

S2、将校准品缓冲液原液置于37℃恒温箱保存72h，稳定平衡，即得到校准品缓冲液，可置于2-8℃环境保存或使用。

用配制完成的校准品缓冲液稀释CA125-Tn抗原，配制校准品(试剂盒配套使用和出售)，校准品6个浓度：A～F点，不同点对应的CA125-Tn抗原浓度分别为：A:0U/mL、B:50U/mL、C:100U/mL、D:375U/mL、E:750U/mL、F:1500U/mL。

配制完成后，放置于2～8℃环境密闭保存。

配制完成的校准品用于CA125-Tn测定试剂盒在全自动化学发光免疫分析仪(上海惠中IMS 1200全自动免疫发光分析仪)上定标，结果见表1、图1。同时使用该校准曲线拟合检测120例临床血清样本，具体结果见表2；并对检测结果进行统计，具体统计结果见表3。

其中CA125-Tn测定试剂盒包含有磁分离试剂：CA125抗体包被的羧基磁珠；抗试剂：碱性磷酸酶标记的CA125-Tn抗体；校准品与质控品：使用S1、S2所述校准品缓冲液稀释CA125-Tn抗原进行制备。检测还需要与试剂盒及全自动化学发光免疫分析搭配使用的底物液及清洗液。配制质控品浓度为：质控水平1：100U/mL、质控水平2：750U/mL；配制完成后，放置2～8℃环境密闭保存。

实施例2

本实施例和实施例1的区别在于，制备校准品缓冲液时，步骤S2中，将校准品缓冲液原液置于37℃恒温箱的保存时间为24h；此外，BSA在校准品缓冲液原液中的含量为10g/L，其它同实施例1。

以和实施例1相同的方法配制不同浓度的CA125-Tn抗原校准品，并将配制完成的校准品用于CA125-Tn测定试剂盒在全自动化学发光免疫分析仪上定标，结果见表1、图2。同时使用该校准曲线拟合检测120例临床血清样本，具体结果见表2；并对检测结果进行统计，具体统计结果见表3。

实施例3

本实施例和实施例1的区别在于，制备校准品缓冲液时，步骤S2中，将校准品缓冲液原液置于15℃恒温箱保存，其它同实施例1。

实施例4

本实施例和实施例1的区别在于，制备校准品缓冲液时，步骤S2中，将校准品缓冲液原液置于37℃恒温箱的保存时间为12h，其它同实施例1。

实施例5

校准品缓冲液的制备方法：

S1、向容器中加入约80％纯化水，依次加入Tris 50mM、氯化钠154mM、防腐剂MIT1.5g/L、BSA 30g/L，纯化水充分溶解定容，PH＝7.5±0.1，完成后用0.22μm滤膜过滤保存。即得到得到校准品缓冲液原液。

S2、将校准品缓冲液原液置于25℃恒温箱保存36h，稳定平衡，即得到校准品缓冲液，该校准品缓冲液可置于2-8℃环境保存或使用。

对比例

对比例1

本对比例和实施例1的区别在于，制备校准品缓冲液时，不进行步骤S2的操作，即本对比例中，制备校准品缓冲液的制备方法为：向容器中加入约80％纯化水，依次加入磷酸二氢钾2.65mM、磷酸氢二钾11.39mM、氯化钾157mM、防腐剂MIT 1g/L、BSA 30g/L，纯化水充分溶解定容，PH＝7.5±0.1，完成后用0.22μm滤膜过滤保存；即制备得到校准品缓冲液。

以和实施例1相同的方法配制不同浓度的CA125-Tn抗原校准品，并将配制完成的校准品用于CA125-Tn测定试剂盒在全自动化学发光免疫分析仪上定标，结果见表1、图3。同时使用该校准曲线拟合检测120例临床血清样本，具体结果见表2；并对检测结果进行统计，具体统计结果见表3。

对比例2

本对比例和实施例1的区别在于，制备校准品缓冲液时，步骤S2中，将校准品缓冲液原液置于10℃恒温箱保存，其它同实施例1。

对比例3

本对比例和实施例1的区别在于，制备校准品缓冲液时，步骤S2中，将校准品缓冲液原液置于37℃恒温箱保存6h，其它同实施例1。

对比例4

本实施例和实施例5的区别在于，制备校准品缓冲液时，不进行步骤S2的操作，即本对比例中，制备校准品缓冲液的制备方法为：向容器中加入约80％纯化水，依次加入Tris50mM、氯化钠154mM、防腐剂MIT 1.5g/L、BSA 30g/L，纯化水充分溶解定容，PH＝7.5±0.1，完成后用0.22μm滤膜过滤保存；即制备得到校准品缓冲液。

以和实施例2相同的方法配制不同浓度的CA125-Tn抗原校准品，并将配制完成的校准品用于CA125-Tn测定试剂盒在全自动化学发光免疫分析仪上定标，结果见表1、图4。同时使用该校准曲线拟合检测120例临床血清样本，具体结果见表2；并对检测结果进行统计，具体统计结果见表3。

同时，使用实施例3-5、对比例2-3制备得到的校准品缓冲液，以和实施例1相同的方法配制不同浓度的CA125-Tn抗原标准品，并将配制完成的校准品用于CA125-Tn测定试剂盒在全自动化学发光免疫分析仪上定标。同时使用该校准曲线拟合检测120例临床血清样本，并对检测结果进行统计，具体统计结果见表3。

表1定标结果

结合表1及图1～4，可以看出实施例1中A点发光值最低，即非特异最低，效果最好。此外，通过比较实施例1和对比例1(或者比较实施例2和对比例4)的数据结果可以看出，通过对制备得到的校准品缓冲液原液做进一步的15～38℃的至少12h的保存，能够显著降低A点(即零浓度点)的发光值，从而使得检测结果更加准确。

表2血清样本检测结果值

表3测值结果统计

从表3中实施例1-5的数据结果看出，首先，采用本申请制备得到的校准品缓冲液用于试剂盒制备并进行CA125-Tn抗原检测时，其检测得到的≤0U/mL的样本数量控制在0～7个，占比仅仅为0～5.83％；此外，实施例1-5中，检测范围在0～10U/mL的样本占比高达53.33～63.33％。这说明本申请制备得到的校准品缓冲液用于试剂盒中质控品和校准品的制备后，将该试剂盒在全自动发光免疫分析仪定标时，校准曲线低浓度点发光值更低，通过校准曲线能够更准确计算低浓度Tn抗原样本，从而保证了检测结果的准确性。

而通过比较实施例1和对比例1(或者通过比较实施例5和对比例4)的数据结果表明：在制备校准品缓冲液时，若是不进行步骤S2的保存步骤，并将该方法制备得到的校准品缓冲液用于试剂盒中质控品和校准品的制备，随后将该试剂盒在全自动发光免疫分析仪定标时，其检测得到的≤0U/mL的样本数量将显著增加(46～49个，占比高达38.33～40.83％)；并且，检测范围在0～10U/mL的样本占比仅仅为24.17～25.00％。这一数据结果充分说明，在制备校准品缓冲液时，步骤S2的重要性：进行步骤S2后，将使得校准曲线低浓度点发光值更低，而通过校准曲线能够更准确计算低浓度Tn抗原样本，从而保证了检测结果的准确性。

而实施例1、对比例2-3的数据结果分别说明了在进行步骤S2时，其恒温保存的时间和温度的重要性：该保存温度建议为15～38℃，保存时间建议为至少12h。

本具体实施例仅仅是对本申请的解释，其并不是对本申请的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本申请的权利要求范围内都受到专利法的保护。

Claims

1.一种糖类抗原CA125表面Tn抗原检测用校准品缓冲液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、向容器中加入约80％纯化水，依次加入磷酸二氢钾2.65mM、磷酸氢二钾11.39mM、氯化钾157mM、防腐剂MIT 1g/L、BSA 30g/L，纯化水充分溶解定容，pH＝7.5±0.1，完成后用0.22μm滤膜过滤保存，即得到校准品缓冲液原液；

S2、将校准品缓冲液原液置于37℃恒温箱保存72h，稳定平衡，即得到校准品缓冲液。

2.一种糖类抗原CA125表面Tn抗原检测用校准品缓冲液，其特征在于，采用权利要求1所述的制备方法制备得到。

3.根据权利要求2所述的校准品缓冲液，其特征在于，所述校准品缓冲液用于糖类抗原CA125表面Tn抗原检测试剂盒中质控品和校准品的制备，检测Tn抗原的最低浓度在2U/mL以下。

4.一种糖类抗原CA125表面Tn抗原检测用试剂盒，其特征在于，包括权利要求2-3任一所述的校准品缓冲液制备的质控品和校准品。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括磁分离试剂和抗试剂。