CN117054671B - 一种叶酸检测样本的解离方法及叶酸的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及医学分析技术领域，特别涉及一种叶酸检测样本的解离方法及叶酸的检测方法，所述叶酸检测样本的解离方法包括以下步骤：向待测叶酸样本中加入解离液，解离样本后，得叶酸样本解离液；其中，所述解离液包括蛋白变性剂及还原剂，所述解离液的pH值＜8.5。通过采用蛋白变性剂解离叶酸与叶酸结合蛋白之间的氢键，采用还原剂解离叶酸与叶酸结合蛋白之间的二硫键，从而使得叶酸结合蛋白与叶酸分离，得到叶酸样本解离液，便于进一步试验以检测叶酸的含量，提高了操作的简便性。同时，将解离液的pH值设置在8.5以下，避免解离液碱性过强从而干扰叶酸含量的检测过程，因此，提高叶酸样本解离液的稳定性，进而提高了叶酸检测的准确性。
Description
技术领域
本发明涉及医学分析技术领域，特别涉及一种叶酸检测样本的解离方法及叶酸的检测方法。
背景技术
目前现有技术中，体外检测人体中叶酸水平的方法主要有化学发光法、酶联免疫法等。从结合蛋白释放叶酸的方式主要是选择R1和R2的双解离试剂37℃解离，且大部分时间R1为强碱试剂，R2为中和剂，操作过程较为繁琐，且强碱试剂会对免疫反应和检测过程造成一定的干扰，精度和准确度较低。
发明内容
本发明的目的是提供一种叶酸检测样本的解离方法及叶酸的检测方法，旨在解决强碱试剂会对免疫反应和检测过程造成一定的干扰，导致精度和准确度较低的技术问题。
为实现上述目的，本发明提出一种叶酸检测样本的解离方法，包括以下步骤：
向待测叶酸样本中加入解离液，解离样本后，得叶酸样本解离液；
其中，所述解离液包括蛋白变性剂及还原剂，所述解离液的pH值＜8.5。
可选地，所述蛋白变性剂包括全氟辛酸、十二烷基硫酸钠、尿素及盐酸胍中的至少一种；和/或，
所述还原剂包括三(2-羧乙基)膦盐酸盐及二硫苏糖醇中的至少一种。
本发明还提出一种叶酸的检测方法，包括以下步骤：
提供叶酸试剂盒及待测叶酸样本，所述叶酸试剂盒包括试纸条、解离液及标记液，所述解离液包括蛋白变性剂及还原剂，所述标记液包括标记叶酸结合蛋白；
采用叶酸试剂盒中的解离液使用上述叶酸检测样本的解离方法对待测叶酸样本进行解离，得叶酸样本解离液；
对叶酸样本解离液进行检测，测定叶酸的含量；
其中，所述标记叶酸结合蛋白用以结合所述叶酸样本解离液中的叶酸。
可选地，对叶酸样本解离液进行检测测定叶酸的含量包括以下步骤：
向叶酸样本解离液中加入标记液混合，得样本标记混合液；
取定量的样本标记混合液，加在试纸条上，20~28℃下孵育10~20分钟后，通过检测标记叶酸结合蛋白的含量，根据标记叶酸结合蛋白与叶酸的含量关系，测定叶酸的含量。
可选地，所述解离液还包括缓冲剂、保护剂、增敏剂、表面活性剂、抗氧化剂及防腐剂；和/或，
所述标记液还包括缓冲液、保护剂、增敏剂、表面活性剂、标记检验抗体及防腐剂。
可选地，所述缓冲剂包括三羟基氨基甲烷、磷酸盐缓冲溶液、醋酸、磷酸、磷酸盐、氯化钾、硼酸、硼酸-硼砂、柠檬酸、柠檬酸盐、Tris、4-吗啉乙磺酸、4-羟乙基哌嗪乙磺酸及哌嗪-1,4-二乙磺酸中的至少一种；和/或，
所述保护剂包括甘氨酸、酪蛋白、牛血清白蛋白、精氨酸、人血清白蛋白及明胶中的至少一种；和/或，
所述增敏剂包括PEG-2000、PEG-4000、PEG-6000、PEG-8000、PEG-10000、PEG-20000、PVP及PVA中的至少一种；和/或，
所述表面活性剂包括吐温-20、表面活性剂S9及Triton X-100中的至少一种；和/或，
所述防腐剂包括proclin300及叠氮钠中的至少一种；和/或，
所述抗氧化剂包括EDTA、抗坏血酸、PVA及NTA中的至少一种；和/或，
所述标记检验抗体包括标记兔抗鸡IgY抗体及标记羊抗鸡IgY抗体中的至少一种；和/或，
所述试纸条包括底板、样本垫、硝酸纤维素膜及吸水纸中的至少一种。
可选地，所述试纸条包括硝酸纤维素膜，硝酸纤维素膜上包被有T线区域及C线区域；
所述T线区域的硝酸纤维素膜上包被有叶酸偶联BSA抗原、海藻糖及PBS缓冲液；
所述C线区域的硝酸纤维素膜上包被有鸡IgY抗体、海藻糖及PBS缓冲液；
其中，叶酸偶联BSA抗原用以结合未与叶酸结合的标记叶酸结合蛋白，鸡IgY抗体用以结合所述标记检验抗体。
可选地，所述试剂盒的制备方法包括以下步骤：
获取试纸条；
获取蛋白变性剂及还原剂；
获取含荧光标记兔抗鸡IgY抗体的溶液及含荧光标记叶酸结合蛋白的溶液；
配制解离液及标记液。
可选地，获取试纸条的步骤包括：
配制T线包被液及C线包被液；
将T线包被液及C线包被液对应包被于硝酸纤维素膜上的T线区域及C线区域，得包被硝酸纤维素膜；
获取样本垫及吸水纸；
将包被硝酸纤维素膜、样本垫及吸水纸组装并固定在底板上，得试纸条。
可选地，获取含荧光标记兔抗鸡IgY抗体的溶液及含荧光标记叶酸结合蛋白的溶液的步骤包括：
配制缓冲液、活化液、偶联封闭液及偶联储存液；
向缓冲液中加入荧光微球及活化液，离心，得活化荧光微球；
将活化荧光微球分别与兔抗鸡IgY抗体及叶酸结合蛋白混合，加入偶联封闭液，离心，得偶联复合物；
向偶联复合物中加入偶联储存液，得含荧光标记兔抗鸡IgY抗体的溶液及含荧光标记叶酸结合蛋白的溶液。
本发明的技术方案中，通过采用蛋白变性剂解离叶酸与叶酸结合蛋白之间的氢键，采用还原剂解离叶酸与叶酸结合蛋白之间的二硫键，从而使得叶酸结合蛋白与叶酸分离，得到叶酸样本解离液，便于进一步试验以检测叶酸的含量，提高了操作的简便性。同时，将解离液的pH值设置在8.5以下，避免解离液碱性过强从而干扰叶酸含量的检测过程，因此，提高叶酸样本解离液的稳定性，进而提高了叶酸检测的准确性。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图示出的结构获得其他的附图。
图1为本发明一实施例中检测叶酸标准品得到的叶酸含量及荧光信号强度的关系曲线图；
图2为本发明中实施例1与对比例1的叶酸检测结果拟合图；
图3为本发明中实施例1与对照组的叶酸检测结果拟合图；
图4为本发明中对比例1与对照组的叶酸检测结果拟合图。
本发明目的的实现、功能特点及优点将结合实施例，参照附图做进一步说明。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。
需要说明的是，实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。另外，全文中出现的“和/或”的含义，包括三个并列的方案，以“A和/或B”为例，包括A方案、或B方案、或A和B同时满足的方案。此外，各个实施例之间的技术方案可以相互结合，但是必须是以本领域普通技术人员能够实现为基础，当技术方案的结合出现相互矛盾或无法实现时应当认为这种技术方案的结合不存在，也不在本发明要求的保护范围之内。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
目前现有技术中，体外检测人体中叶酸水平的方法主要有化学发光法、酶联免疫法等。从结合蛋白释放叶酸的方式主要是选择R1和R2的双解离试剂37℃解离，且大部分时间R1为强碱试剂，R2为中和剂，操作过程较为繁琐，且强碱试剂会对免疫反应和检测过程造成一定的干扰，精度和准确度较低。
鉴于此，本发明提出一种叶酸检测样本的解离方法，其特征在于，包括以下步骤：
向待测叶酸样本中加入解离液，解离样本后，得叶酸样本解离液；
其中，所述解离液包括蛋白变性剂及还原剂，所述解离液的pH值＜8.5。
需要说明的是，待测叶酸样本中，叶酸与叶酸结合蛋白结合在一起，检测叶酸的含量需优先将叶酸从叶酸结合蛋白中解离出来；待测叶酸样本为人血浆或人血清样本。
通过采用蛋白变性剂解离叶酸与叶酸结合蛋白之间的氢键，采用还原剂解离叶酸与叶酸结合蛋白之间的二硫键，从而使得叶酸结合蛋白与叶酸分离，得到叶酸样本解离液，便于进一步试验以检测叶酸的含量，提高了操作的简便性。同时，将解离液的pH值设置在8.5以下，避免解离液碱性过强从而干扰叶酸含量的检测过程，因此，提高叶酸样本解离液的稳定性，进而提高了叶酸检测的准确性。
进一步地，所述蛋白变性剂包括全氟辛酸、十二烷基硫酸钠、尿素及盐酸胍中的至少一种；
所述还原剂包括三(2-羧乙基)膦盐酸盐及二硫苏糖醇中的至少一种。
通过采用全氟辛酸、十二烷基硫酸钠、尿素及盐酸胍中的至少一种作为蛋白变性剂，采用三(2-羧乙基)膦盐酸盐及二硫苏糖醇中的至少一种作为还原剂，以将解离液的pH值设置在8.5以下，且不采用强碱物质，避免解离液碱性过强从而干扰叶酸含量的检测过程，从而进一步提高叶酸样本解离液的稳定性。上述蛋白变性剂的组分及还原剂的组分可同时设置也可分开设置，同时设置时，所述蛋白变性剂及所述还原剂可配合使用，发挥协同作用，以将待测叶酸样本中的叶酸从叶酸结合蛋白中解离出来。在本发明的一实施例中，所述蛋白变性剂采用全氟辛酸，所述还原剂采用三(2-羧乙基)膦盐酸盐，在保存pH值小于8.5的同时，提高解离液的解离效果。
本发明还提出一种叶酸的检测方法，包括以下步骤：
提供叶酸试剂盒及待测叶酸样本，所述叶酸试剂盒包括试纸条、解离液及标记液，所述解离液包括蛋白变性剂及还原剂，所述标记液包括标记叶酸结合蛋白；
采用叶酸试剂盒中的解离液使用上述叶酸检测样本的解离方法对待测叶酸样本进行解离，得叶酸样本解离液；
对叶酸样本解离液进行检测，测定叶酸的含量；
其中，所述标记叶酸结合蛋白用以结合所述叶酸样本解离液中的叶酸。
通过采用含有标记叶酸结合蛋白的标记液，将叶酸样本解离液中解离出的叶酸与标记叶酸结合蛋白相结合，使得叶酸附带标记从而可通过检测标记的强度，以间接检测出叶酸的含量。需要说明的是，标记可以是胶体金标记，也可以是荧光标记，还可以是放射性元素标记，只要能够键合在叶酸结合蛋白上制备出标记叶酸结合蛋白，并在特定条件下根据标记物浓度的不同，释放不同的标记强度，以测得标记含量即可。具体地，在本实施例中，标记叶酸结合蛋白为荧光微球标记叶酸结合蛋白。
进一步地，对叶酸样本解离液进行检测测定叶酸的含量包括以下步骤：
向叶酸样本解离液中加入标记液混合，得样本标记混合液；
取定量的样本标记混合液，加在试纸条上，20~28℃下孵育10~20分钟后，通过检测标记叶酸结合蛋白的含量，根据标记叶酸结合蛋白与叶酸的含量关系，测定叶酸的含量。
通过采用20~28℃下孵育，使得孵育可在室温环境下进行，无需另外设置孵育器以维持孵育温度，提高操作便捷性。需要说明的是，标记叶酸结合蛋白的含量与叶酸的含量可以是正相关，也可以是负相关，只要能根据标记叶酸结合蛋白的含量确定叶酸的含量即可。具体地，在本申请的实施例中，未与叶酸结合的标记叶酸结合蛋白留在所述试纸条上，未结合的标记叶酸结合蛋白的含量与叶酸的含量呈负相关。
此外，所述解离液还包括缓冲剂、保护剂、增敏剂、表面活性剂、抗氧化剂及防腐剂；
所述标记液还包括缓冲液、保护剂、增敏剂、表面活性剂、标记检验抗体及防腐剂。
通过采用缓冲剂、保护剂、增敏剂、表面活性剂及防腐剂以提升所述解离液及所述标记液的稳定性及灵敏度；通过采用抗氧化剂，进一步提高所述解离液的稳定性；通过采用标记检验抗体，使得标记液中的标记检验抗体能够留在所述试纸条上，以检验样本标记混合液是否顺利从试纸条的一端层析至另一端，提高了检验叶酸的稳定性。上述解离液的组分及标记液的组分可同时设置也可分开设置，同时设置时，所述解离液的稳定性进一步提高，配合所述标记液，能够稳定地测得叶酸样本解离液中叶酸的含量。
进一步地，所述缓冲剂包括三羟基氨基甲烷、磷酸盐缓冲溶液、醋酸、磷酸、磷酸盐、氯化钾、硼酸、硼酸-硼砂、柠檬酸、柠檬酸盐、Tris、4-吗啉乙磺酸、4-羟乙基哌嗪乙磺酸及哌嗪-1,4-二乙磺酸中的至少一种；和/或，
所述保护剂包括甘氨酸、酪蛋白、牛血清白蛋白、精氨酸、人血清白蛋白及明胶中的至少一种；
所述增敏剂包括PEG-2000、PEG-4000、PEG-6000、PEG-8000、PEG-10000、PEG-20000、PVP及PVA中的至少一种；和/或，
所述表面活性剂包括吐温-20、表面活性剂S9及Triton X-100中的至少一种；
所述防腐剂包括proclin300及叠氮钠中的至少一种；
所述抗氧化剂包括EDTA、抗坏血酸、PVA及NTA中的至少一种；
所述标记检验抗体包括标记兔抗鸡IgY抗体及标记羊抗鸡IgY抗体中的至少一种；
所述试纸条包括底板、样本垫、硝酸纤维素膜及吸水纸中的至少一种。
需要说明的是，所述PEG为聚乙二醇，所述PVP为聚乙烯吡咯烷酮，所述PVA为聚乙烯醇，所述Triton X-100为聚乙二醇辛基苯基醚，所述proclin300为一种抑菌剂，其主要活性成分包括甲基氯异噻唑啉酮和甲基异噻唑啉酮，所述EDTA为乙二胺四乙酸，所述NTA为次氮基三乙酸，所述IgY抗体为家禽卵黄免疫球蛋白。
通过采用标记兔抗鸡IgY抗体及标记羊抗鸡IgY抗体中的至少一种作为标记检验抗体，能与鸡IgY抗体特异性结合，进一步提高标记液的特异性及灵敏度；通过设置底板、样本垫、硝酸纤维素膜及吸水纸，从而构建一个稳定的层析板，使得所述样本标记混合液能够从样本垫向吸水纸层析，并将标记检验抗体及未与叶酸结合的标记叶酸结合蛋白留在所述硝酸纤维素膜上，以测定叶酸的含量。上述保护剂的组分、增敏剂的组分、表面活性剂的组分、防腐剂的组分、抗氧化剂的组分、标记检验抗体的组分及试纸条的组成可同时设置也可分开设置，同时设置时，所述解离液能够稳定解离样本且不影响样本中的叶酸含量，所述标记液中部分与叶酸结合，未与叶酸结合的部分能够留在所述试纸条上，以提高检测叶酸样本解离液中叶酸含量的准确性，所述试纸条能够形成完整的层析膜组，以供叶酸样本解离液顺利从样本垫层析通过硝酸纤维素膜最后层析至吸水纸。在本申请的实施例中，所述缓冲剂包括三羟基氨基甲烷、磷酸盐缓冲溶液及氯化钾，所述保护剂包括甘氨酸、酪蛋白及牛血清白蛋白，所述增敏剂包括PEG-4000，所述表面活性剂包括吐温-20，所述防腐剂包括proclin300，所述抗氧化剂包括EDTA，所述标记检验抗体包括兔抗鸡IgY抗体。
此外，所述试纸条包括硝酸纤维素膜，硝酸纤维素膜上包被有T线区域及C线区域；
所述T线区域的硝酸纤维素膜上包被有叶酸偶联BSA抗原、海藻糖及PBS缓冲液；
所述C线区域的硝酸纤维素膜上包被有鸡IgY抗体、海藻糖及PBS缓冲液；
进一步地，叶酸偶联BSA抗原用以结合未与叶酸结合的标记叶酸结合蛋白，鸡IgY抗体用以结合所述标记检验抗体。
通过将叶酸偶联BSA抗原与鸡IgY抗体分区域包被，使得样本标记混合液在试纸条上层析的过程中，叶酸偶联BSA抗原与未与叶酸结合的标记叶酸结合蛋白结合并固定在T线区域内，鸡IgY抗体与标记检验抗体结合并固定在C线区域内，以便于分别检测T线与C线标记的含量，并根据C线标记含量与T线标记含量的比值，校准T线标记的含量，进而提高叶酸检验的精确度。
进一步地，所述试剂盒的制备方法包括以下步骤：
获取试纸条；
获取蛋白变性剂及还原剂；
获取含荧光标记兔抗鸡IgY抗体的溶液及含荧光标记叶酸结合蛋白的溶液；
配制解离液及标记液。
通过配制蛋白变性剂、还原剂、含荧光标记兔抗鸡IgY抗体的溶液及含荧光标记叶酸结合蛋白的溶液，以配制得到解离液及标记液，现配现用，提高解离液及标记液的稳定性，避免放置时间过长造成的溶液变质，导致叶酸检测的灵敏度及精确度下降。
具体地，在本申请的实施例中，试剂盒的制备方法可以包括以下步骤：
分别称取三羟甲基氨基甲烷 6.057g、全氟辛酸 13.5g、三(2-羧乙基)膦盐酸盐4g、甲醇 50mL、吐温-20 3mL、聚乙二醇-4000 5g、乙二胺四乙酸 2g、甘氨酸 2g、proclin300 0.3mL，用超纯水定容至1000mL并于4℃下保存，得解离液；
分别称取磷酸氢二钠十二水 28.8g、磷酸二氢钠 2.4g、氯化钾10g、聚乙二醇40001g、酪蛋白 5g、牛血清白蛋白 1g、吐温-20 5mL、proclin300 0.3mL，用超纯水定容至1000mL并于4℃下保存，得标记液基础液；
分别称取荧光微球标记的叶酸结合蛋白溶液7.5mL、荧光微球标记羊抗鸡IgY抗体溶液6mL，用所述标记液基础液定容至100L并于4℃下保存，得标记液。
进一步地，获取试纸条的步骤包括：
配制T线包被液及C线包被液；
将T线包被液及C线包被液对应包被于硝酸纤维素膜上的T线区域及C线区域，得包被硝酸纤维素膜；
获取样本垫及吸水纸；
将包被硝酸纤维素膜、样本垫及吸水纸组装并固定在底板上，得试纸条。
具体地，在本申请的实施例中，获取试纸条的步骤可以包括以下步骤：
分别量取叶酸偶联BSA抗原0.1mg，20%海藻糖50uL加入离心管，量取0.01M pH7.4的PBS缓冲液补充体积至1mL，混匀，得T线包被液；
分别量取鸡IgY抗体1mg，20%海藻糖50uL加入离心管，量取0.01M pH7 .4的PBS缓冲液补充体积至1mL，混匀，得C线包被液；
分别量取三羟甲基氨基甲烷0.5g、海藻糖2g、酪蛋白0.3g、吐温-20 0.8mL，加纯化水定容至100mL，混匀，得样本垫处理液。
设定喷膜仪的工艺参数，浓度33uL/cm，气压5MPa将空白样本垫放至喷膜仪平台固定位置上进行样本垫处理液包被，均匀喷涂在样本垫上，于45℃烘箱干燥24小时，得到样本垫；
将NC膜（硝酸纤维素膜）粘贴到PVC底板，贴好的NC膜放在划膜仪上，T线和C线包被液在硝酸纤维素膜上按0.1uL/cm进行划线；
将包被好的NC膜放置于干燥箱（45℃+2℃）放置72±2小时，得包被硝酸纤维素膜；
将样本垫、包被硝酸纤维素膜及吸水纸依次组装并固定在PVC底板上，得试纸条。
进一步地，获取含荧光标记兔抗鸡IgY抗体的溶液及含荧光标记叶酸结合蛋白的溶液的步骤包括：
配制缓冲液、活化液、偶联封闭液及偶联储存液；
向缓冲液中加入荧光微球及活化液，离心，得活化荧光微球；
将活化荧光微球分别与兔抗鸡IgY抗体及叶酸结合蛋白混合，加入偶联封闭液，离心，得偶联复合物；
向偶联复合物中加入偶联储存液，得含荧光标记兔抗鸡IgY抗体的溶液及含荧光标记叶酸结合蛋白的溶液。
具体地，在本申请的实施例中，获取含荧光标记兔抗鸡IgY抗体的溶液及含荧光标记叶酸结合蛋白的溶液的步骤可以包括以下步骤：
量取0.2M硼酸溶液235mL、0.05M硼砂溶液15mL，加纯化水定容至1000mL，0.45um滤膜过滤，得0.05M硼酸-硼砂缓冲液（PH7.0）；
量取0.2M硼酸溶液225mL、0.05M硼砂溶液25mL，加纯化水定容至1000mL，0.45um滤膜过滤，得0.05M硼酸-硼砂缓冲液（PH7.5）；
量取0.2M硼酸溶液175mL、0.05M硼砂溶液75mL，加纯化水定容至1000mL，0.45um滤膜过滤，得0.05M硼酸-硼砂缓冲液（PH8.0）；
称取0.015g EDC（1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亚胺）至1mL纯化水中，溶解完全，得EDC溶液；
称取0.015g NHS（N-羟基丁二酰亚胺）至1mL纯化水中，溶解完全，得NHD溶液；
称取牛血清白蛋白10g，量取吐温-20 100uL，0.05M 三羟甲基氨基甲烷-HCL定容至100mL，加入proclin300 50uL，搅拌溶解完全，0.45μm滤膜过滤，得偶联封闭液；
称取酪蛋白0.2g、牛血清白蛋白0.4g、海藻糖2g，量取吐温-20 100uL，0.05M 三羟甲基氨基甲烷-HCL定容至100mL，加入proclin300 50uL搅拌溶解完全，0.45μm滤膜过滤，得偶联储存液；
取0.05M硼酸-硼砂缓冲液（PH 7.0）225uL及200nm荧光微球25uL于离心管中，混匀；加入10uL EDC溶液（15mg/ml）、20uL NHS溶液（15mg/ml）活化，室温摇床振荡20min，180r，得活化荧光微球溶液；
将活化荧光微球溶液离心14000r/m，25分钟，去除上清，用0.05M硼酸-硼砂缓冲液（PH 7.5）复溶，重复两遍，最后一次复溶后超声分散使荧光微球均匀分散于缓冲液中，分别加入相对应的蛋白（质控线荧光微球的标记加入兔抗鸡IgY抗体，使得蛋白终浓度为200μg/mL，检验线荧光微球的标记加叶酸结合蛋白，使得蛋白终浓度为100μg/mL），室温摇床振荡3h，160r，得荧光微球标记溶液；
每25μL荧光微球标记溶液加入30μL偶联封闭液，室温摇床封闭1.5h，160r，得荧光微球封闭液；
将荧光微球封闭液离心14000r/m，25分钟，去除上清，用0.05M硼酸-硼砂缓冲液（PH 8.0）复溶；离心洗涤两遍，最后一次离心洗涤后用偶联储存液复溶，超声分散，得含荧光标记兔抗鸡IgY抗体的溶液及含荧光标记叶酸结合蛋白的溶液。
以下结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步详细说明，应当理解，以下实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
提供了一种叶酸检测方法，用到了叶酸检测试剂盒及配套的读数仪，所述叶酸检测试剂盒包括解离液、标记液及试纸条。
所述叶酸检测方法，包括以下步骤：
量取40μL样本加入90μL解离液中，混合得样本解离液；
量取10μL标记液加入样本解离液中，混合后于25℃下静置15分钟，得样本标记液；
量取70μL样本标记液加在试纸条中，于25℃下孵育15分钟；
将孵育好的试纸条放入叶酸检测试剂盒配套的读数仪中，读取结果。
每1L解离液包括以下组分：三羟甲基氨基甲烷 6.057g、全氟辛酸 13.5g、三(2-羧乙基)膦盐酸盐 4g、甲醇 50mL、吐温-20 3mL、聚乙二醇-4000 5g、乙二胺四乙酸 2g、甘氨酸 2g、proclin300 0.3mL，其余组分为超纯水；
每1L标记液包括以下组分：分别称取荧光微球标记的叶酸结合蛋白溶液 7.5mL、荧光微球标记羊抗鸡IgY抗体溶液 6mL、磷酸氢二钠十二水 28.8g、磷酸二氢钠 2.4g、氯化钾 10g、聚乙二醇-4000 1g、酪蛋白 5g、牛血清白蛋白 1g、吐温-20 5mL、proclin3000.3mL，其余组分为超纯水；
试纸条的NC膜上设置于T线区域及C线区域，T线区域包被有叶酸偶联BSA抗原，C线区域包被有鸡IgY抗体。
实施例1还提供了叶酸浓度值与荧光信号的关系，按浓度梯度获取10组不同浓度的叶酸标准品，按照实施例1的检测方法检测10组叶酸标准品，得到叶酸浓度值与荧光信号强度如表1所示：
表1 实施例1对不同浓度的叶酸标准品检测得到荧光信号强度
根据表1中叶酸标准品的叶酸浓度值与荧光信号强度，绘制叶酸浓度值与荧光信号的关系图，如图1所示，并得到拟合趋势线公式：
y = 2×10-8x2-0.0014x+21.303
其中，y表示叶酸浓度值，x表示荧光信号强度，拟合趋势线的R2=0.9979。在测定叶酸含量时，读数仪根据上述公式中叶酸浓度值与荧光信号的关系，根据荧光信号强度计算得出叶酸的浓度值。
对比例1
提供了一种叶酸检测方法，用到了罗氏叶酸检测试剂盒及配套的检测仪，购买获得罗氏叶酸检测试剂盒，按照产品说明书所述，所述罗氏叶酸检测试剂盒包括PT1试剂、PT2试剂、M试剂、R1试剂及R2试剂。
所述叶酸检测方法，包括以下步骤：
使用含有分离胶的肝素锂抗凝血浆试管收集肝素锂血浆，或，使用标准试管或有分离胶的真空管收集血清；
第1次孵育：将25 μL样本与叶酸预处理试剂1和2一起孵育，结合的叶酸会从内源性叶酸结合蛋白上释出；
第2次孵育：将预处理的样本和钌标记的内因子一起孵育，形成一种叶酸复合物，而该复合物的量取决于样本中分析物的浓度；
第3次孵育：添加包被链霉亲合素的微粒和生物素标记的叶酸后，钌标记的叶酸结合蛋白的未结合位点被占据，形成一种钌标记的叶酸结合蛋白-叶酸生物素复合物，复合物在生物素和链霉亲合素的相互作用下结合到固相载体上；
将反应液吸入测量池中，通过电磁作用将磁珠吸附在电极表面。未与磁珠结合的物质通过ProCell/ProCell M除去。给电极加以一定的电压，使复合物化学发光，并通过光电倍增器测量发光强度；
通过检测仪的定标曲线得到最后的检测结果，定标曲线是通过2点定标和试剂条形码上获得的一级定标曲线生成的。
其中，PT1试剂为预处理试剂1，包括2-巯基乙烷磺酸钠（MESNA）40g/L，pH5.5；PT2试剂为预处理试剂2，包括氢氧化钠25g/L；M试剂为链霉亲和素包被的磁珠微粒，包括包被链霉亲和素的磁珠微粒0.72mg/mL及防腐剂；R1试剂为钌标记的叶酸结合蛋白，包括钌标记的叶酸结合蛋白质75μg/L、人血清蛋白（稳定剂）、硼酸盐/磷酸盐/枸橼酸盐缓冲液70mmol/L，pH5.5及防腐剂；R2试剂为生物素化叶酸，包括生物素化叶酸17μg/L、生物素120μg/L、人血清蛋白（稳定剂）、硼酸盐缓冲液100mmol/L，pH9.0及防腐剂。
叶酸样本检测
获取40份叶酸样本，根据实施例1及对比例1的叶酸检测方法，对40份叶酸样本分别检测，并设置对照组，对照组使用微生物法以检测叶酸样本中的叶酸含量，得到的检测数据如表2所示：
表2 实施例1及对比例1对40份叶酸样本检测的叶酸含量
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根据表1中实施例1与对比例1的检测结果，绘制实施例1与对比例1的叶酸检测结果的拟合图，如图2所示；根据表1中实施例1与对照组的数据，绘制实施例1与对照组的叶酸检测结果的拟合图，如图3所示；根据表1中对比例1与对照组的叶酸检测结果，绘制对比例1与对照组的叶酸检测结果的拟合图，如图4所示。
根据图2的拟合曲线R2=0.9789，表明实施例1的试剂盒与现有的叶酸检测试剂盒一致性高，准确度好。
根据图3的拟合曲线R2=0.9953及图4的拟合曲线R2=0.9897，表明实施例1的检测结果相比于对比例1的检测结果更接近微生物法的检测结果；图4表明在叶酸浓度较高时，拟合曲线的离散度较大，表明对比例1在检测高浓度叶酸时的精度较差，对比例1中加入的强碱与叶酸及叶酸结合蛋白发生反应，使叶酸含量变化并使得叶酸结合蛋白部分失活，导致叶酸检测结果与实际值偏差较大，即实施例1中不使用强碱解离叶酸样本的检测结果更精准。
综上所述，采用本申请的前处理方法能够降低强碱对叶酸样本的影响，从而提高检测叶酸的灵敏度与精确度。
以上仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包括在本发明的专利保护范围内。
Claims (9)
1.一种叶酸检测样本的解离方法，其特征在于，包括以下步骤：
向待测叶酸样本中加入解离液，解离样本后，得叶酸样本解离液；
其中，所述解离液包括蛋白变性剂及还原剂，所述解离液的pH值＜8.5；
每1L解离液包括以下组分：三羟甲基氨基甲烷 6.057g、全氟辛酸 13.5g、三(2-羧乙基)膦盐酸盐 4g、甲醇 50mL、吐温-20 3mL、聚乙二醇-4000 5g、乙二胺四乙酸 2g、甘氨酸2g、proclin300 0.3mL，其余组分为超纯水。
2.一种叶酸的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
提供叶酸试剂盒及待测叶酸样本，所述叶酸试剂盒包括试纸条、解离液及标记液，所述解离液包括蛋白变性剂及还原剂，所述标记液包括标记叶酸结合蛋白；
采用叶酸试剂盒中的解离液，使用如权利要求1所述的叶酸检测样本的解离方法对待测叶酸样本进行解离，得叶酸样本解离液；
对叶酸样本解离液进行检测，测定叶酸的含量；
其中，所述标记叶酸结合蛋白用以结合所述叶酸样本解离液中的叶酸。
3.如权利要求2所述叶酸的检测方法，其特征在于，对叶酸样本解离液进行检测，测定叶酸的含量包括以下步骤：
向叶酸样本解离液中加入标记液混合，得样本标记混合液；
取定量的样本标记混合液，加在试纸条上，20~28℃下孵育10~20分钟后，通过检测标记叶酸结合蛋白的含量，根据标记叶酸结合蛋白与叶酸的含量关系，测定叶酸的含量。
4.如权利要求2所述叶酸的检测方法，其特征在于，所述解离液还包括缓冲剂、保护剂、增敏剂、表面活性剂、抗氧化剂及防腐剂；和/或，
所述标记液还包括缓冲液、保护剂、增敏剂、表面活性剂、标记检验抗体及防腐剂。
5.如权利要求4所述叶酸的检测方法，其特征在于，所述缓冲剂包括三羟基氨基甲烷、醋酸、磷酸、磷酸盐、氯化钾、硼酸、硼酸-硼砂、柠檬酸、柠檬酸盐、Tris、4-吗啉乙磺酸、4-羟乙基哌嗪乙磺酸及哌嗪-1,4-二乙磺酸中的至少一种；和/或，
所述保护剂包括甘氨酸、酪蛋白、牛血清白蛋白、精氨酸、人血清白蛋白及明胶中的至少一种；和/或，
所述增敏剂包括PEG-2000、PEG-4000、PEG-6000、PEG-8000、PEG-10000、PEG-20000、PVP及PVA中的至少一种；和/或，
所述表面活性剂包括吐温-20、表面活性剂S9及Triton X-100中的至少一种；和/或，
所述防腐剂包括proclin300及叠氮钠中的至少一种；和/或，
所述抗氧化剂包括EDTA、抗坏血酸、PVA及NTA中的至少一种；和/或，
所述标记检验抗体包括标记兔抗鸡IgY抗体及标记羊抗鸡IgY抗体中的至少一种；和/或，
所述试纸条包括底板、样本垫、硝酸纤维素膜及吸水纸中的至少一种。
6.如权利要求4所述叶酸的检测方法，其特征在于，所述试纸条包括硝酸纤维素膜，硝酸纤维素膜上包被有T线区域及C线区域；
所述T线区域的硝酸纤维素膜上包被有叶酸偶联BSA抗原、海藻糖及PBS缓冲液；
所述C线区域的硝酸纤维素膜上包被有鸡IgY抗体、海藻糖及PBS缓冲液；
其中，叶酸偶联BSA抗原用以结合未与所述标记叶酸结合蛋白结合的叶酸，鸡IgY抗体用以结合所述标记检验抗体。
7.如权利要求2至3任意一项所述的叶酸的检测方法，其特征在于，所述试剂盒的制备方法包括以下步骤：
获取试纸条；
获取蛋白变性剂及还原剂；
获取含荧光标记兔抗鸡IgY抗体的溶液及含荧光标记叶酸结合蛋白的溶液；
配制解离液及标记液。
8.如权利要求7所述的叶酸的检测方法，其特征在于，获取试纸条的步骤包括：
配制T线包被液及C线包被液；
将T线包被液及C线包被液对应包被于硝酸纤维素膜上的T线区域及C线区域，得包被硝酸纤维素膜；
获取样本垫及吸水纸；
将包被硝酸纤维素膜、样本垫及吸水纸组装并固定在底板上，得试纸条。
9.如权利要求7所述的叶酸的检测方法，其特征在于，获取含荧光标记兔抗鸡IgY抗体的溶液及含荧光标记叶酸结合蛋白的溶液的步骤包括：
配制缓冲液、活化液、偶联封闭液及偶联储存液；
向缓冲液中加入荧光微球及活化液，离心，得活化荧光微球；
将活化荧光微球分别与兔抗鸡IgY抗体及叶酸结合蛋白混合，加入偶联封闭液，离心，得偶联复合物；
向偶联复合物中加入偶联储存液，得含荧光标记兔抗鸡IgY抗体的溶液及含荧光标记叶酸结合蛋白的溶液。
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