CN110988362A - 抗组蛋白抗体测定试剂、试剂盒及其使用方法 - Google Patents
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- G01N2333/46—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from vertebrates
- G01N2333/47—Assays involving proteins of known structure or function as defined in the subgroups
Abstract
本发明公开一种抗组蛋白抗体测定试剂,包括包被有组蛋白抗原的固相载体,其中,所述组蛋白抗原为经还原处理的天然组蛋白;进一步的,所述组蛋白抗原为经还原处理的天然组蛋白和重组组蛋白H1亚基组成;公开的试剂盒中,还可以包括第三试剂;通过调整第三试剂的渗透压可进一步调整抗原抗体反应的整体环境渗透压。本发明的试剂、试剂盒及使用方法能明显降低漏检率、且特异性好、灵敏度高、重复性好、稳定性好,且配套全自动免疫分析仪,能实现仪器自动化检测等优点。
Description
技术领域
本发明涉及化学发光免疫诊断技术领域,具体涉及一种抗组蛋白抗体测定试剂、试剂盒及其使用方法。
背景技术
His是DNA相关蛋白(11.2~21.5KDα),是核小体的主要组成部分,它们的功能是稳定DNA双螺旋结构,还可能参与DNA修复、转录、复制和表达调节机制。His有五种不同类型:H1、H2A、H2B、H3和H4,其中H3-H4 四聚体和两个H2A-H2B二聚体组成组蛋白八聚体核心,H1起连接核小体的作用。
抗组蛋白抗体是系统性红斑狼疮患者体内是常见的自身抗体,在药物 (普鲁卡因、肼屈嗪等)诱导的系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus, SLE)患者中其阳性率较高,表现为一种或几种抗组蛋白抗体或抗H2A-H2B 复合体的抗体。此外,在播散性红斑狼疮和类风湿性关节炎的患者中也可检测到抗组蛋白抗体。
目前临床上用于检测抗组蛋白抗体的方法主要有间接免疫荧光法,免疫印记法,酶联免疫吸附法,化学发光法等。间接免疫荧光法基本原理是血清样本中的特异性抗体与切片中的抗原特异性结合后,再用间接荧光抗体,与抗原抗体复合物结合,形成抗原抗体荧光复合物。在荧光显微镜下,根据复合物的发光情况来确定阴阳性。该方法操作复杂,容易出现假阳性,且结果需由有经验的专业人员进行判断,分析结果的客观性不足,且检测难以实现自动化。免疫印迹法其基本原理是膜条显色技术,通常固定多个不同类型的抗原在同一膜条上,让其与血浆中的特异性抗体结合,再加入酶标二抗和显色剂,最终通过肉眼进行定性判定。该方法灵敏度低,反应时间长,检测项目只能固定搭配组合,灵活性差,且抗干扰能力差,容易出现假阳性。酶联免疫吸附法的基本原理是将已知的抗原吸附在固相载体(聚苯乙烯微量反应板)表面,与血浆中的特异性抗体结合后,再与酶标记的二抗反应,最后在酶标仪上进行显色检测。该方法灵敏度在免疫印迹法的基础上有所提升,但仍然较低,且操作复杂,重复性差,反应时间长。化学发光法的基本原理是采用磁微粒化学发光免疫分析技术,利用间接法原理进行检测,测量相对发光值(RLU)。相对发光值与样本中的抗组蛋白抗体的浓度呈正比例关系。该方法较其他方法学特异性好,灵敏度高,线性范围宽,可用仪器自动化进行操作,且可实现定量检测,综上所述,化学发光法会成为今后自身抗体检测的主流方法。
据相关文献报道,在系统性红斑狼疮患者中,抗组蛋白抗体的检出率在 30%~70%,且药物性狼疮患者中,检出率>90%,但是在实际工作中,我们应用不同方法学的试剂对系统性红斑狼疮确诊患者的标本进行检测,其检出率远远低于文献报告的比例,因此我们推测,不同厂家不同方法学的试剂均存在大量漏检的风险。
发明内容
为了解决上述现有试剂盒存在的缺陷,本发明对试剂盒的成分进行了研究,从而完成本发明。
据此,在一方面,本发明提供了一种抗组蛋白抗体测定试剂,包括包被有组蛋白抗原的固相载体,其中,所述组蛋白抗原为经还原处理的天然组蛋白抗原。
本发明的检测试剂盒,在保证其特异性的前提下,显著提高了检出率。不希望收到理论的束缚,我们推测,由于天然组蛋白抗原是复合抗原,由H1、 H2A、H2B、H3和H4等几种亚型构成,除H1外,其他4种组蛋白均分别以二聚体相结合形成八聚体,其抗原位点可能未充分暴露出来,使其与血浆中的抗原反应不充分造成漏检。本发明通过对天然组蛋白进行还原处理,打开二硫键,使其充分暴露其抗原位点,从而检出患者血浆中的抗体,降低漏检率。
在一些实施方式中,组蛋白抗原是由经还原处理的天然组蛋白和重组组蛋白H1亚基组成。
本试剂盒强化了H1亚基的比例,在包被抗原时,补充了一部分重组组蛋白H1亚基;进一步提高了试剂盒的反应性,降低了漏检率。
在一些实施方式中,还原处理为使用0.2~0.4g/L的SDS、1~4ml/L的TX- 200或0.4~0.8g/L的巯基乙醇处理16~20h;
在优选的实施方式中,还原处理为使用0.2~0.4g/L的SDS处理16~20h。
通过使用SDS预处理天然组蛋白抗原,不仅使用安全,而且预处理后的检出率最好。
在第二方面,本发明提供了一种抗组蛋白抗体测定试剂盒,包括第一试剂和第二试剂;
其中,所述第一试剂为包被有组蛋白抗原的固相载体,并且所述组蛋白抗原是经还原处理的天然组蛋白;
所述第二试剂为标记物标记的抗人IgG。
除上述成分外,本发明第一试剂、第二试剂还可以包括适合测定抗组蛋白抗体的其它成分,例如,缓冲物质、盐类物质、稳定剂、表面活性剂和防腐剂。
在一些具体实施方式中,所述第二试剂包括0.1~2ug/ml的抗人IgG单克隆抗体,10~14g/L的缓冲物质,6~10g/L的盐类物质,20~30g/L的稳定剂, 0.5~1.5ml/L的表面活性剂,1~5ml/L的防腐剂。
在一些实施方式中,所述试剂盒还包括第三试剂;其中,
第一试剂包括:0.1~2μg/mL组蛋白抗原、10~14g/L缓冲物质、6~10g/L 盐类物质、6~15g/L稳定剂、1~5ml/L表面活性剂和1~5ml/L防腐剂;所述第一试剂的渗透压为300~400mosm;
第三试剂包括:0.5~3.0g/l的缓冲物质,1~4g/L的盐类物质,2~10g/L的稳定剂,3~6ml/L的表面活性剂,1~5ml/L的防腐剂;第三试剂是渗透压为 60~100mosm的缓冲溶液;优选地,所述第三试剂是渗透压为80~90mosm的缓冲溶液;例如可以为65、70、73、75、78、80、81、82、83、84、85、86、 87、88、89、90、92、95mosm渗透压的缓冲溶液。
所述第一试剂和第三试剂同时与待测样本混合,混合比例为待测样本:第一试剂:第三试剂为1:5:10。
本发明中,第三试剂的目的就是进一步调整样本与第一试剂接触时的整体混合液的渗透压,从而有效降低抗原与抗体反应时的整体渗透压,适当提高反应信号。
进一步地,所述第一试剂的pH值为6.8~7.2;所述第三试剂的pH值为7.5~8.0。
在一些实施方式中,组蛋白抗原是由经还原处理的天然组蛋白和重组组蛋白H1亚基组成。
在示例性的实施方式中,经还原处理的天然组蛋白和重组组蛋白H1亚基的包被质量比为2~5:1~3。
在具体的实施方式中,经还原处理的天然组蛋白的包被质量大于重组组蛋白H1亚基。
在一些实施方式中,还原处理为使用0.2~0.4g/L的SDS、1~4ml/L的TX- 200或0.4~0.8g/L的巯基乙醇处理16~20h;
在优选的实施方式中,还原处理为使用0.2~0.4g/L的SDS处理16~20h。
在一些实施方式中,所述固相载体为磁珠、微孔板、电极、塑料板、胶体金、乳胶珠、琼脂糖珠、玻璃、硝酸纤维素膜、尼龙膜、二氧化硅板或微芯片;所述标记物为辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、吖啶酯或吖啶酯衍生物。
在第三方面,该试剂盒的使用方法,包括如下步骤:
(1)将待测样本与第一试剂混合,使其充分反应;
(2)洗涤后,加入第二试剂,充分反应形成抗体抗原抗体免疫复合物;
(3)第二次洗涤后加入发光底物,测定反应后的相对发光值。
在一些实施方式中,当试剂盒还包括第三试剂时,试剂盒的使用方法包括如下步骤:
(1)将待测样本与第一试剂和第三试剂混合,使其充分反应;
(2)洗涤后,加入第二试剂,充分反应形成抗体抗原抗体免疫复合物;
(3)第二次洗涤后加入发光底物,测定反应后的相对发光值。
在一些实施方式中,步骤(1)中,所述待测样本与第一试剂和第三试剂的体积比为1:5:10。
在具体实施方式中,10μL待测样本、50μL第一试剂和100μL第三试剂混合反应5~10min后,洗涤,加入100μL第二试剂,反应5~10min;洗涤后加入发光底物,在化学发光全自动发光仪中检测相对发光值。
本发明的试剂盒能明显降低漏检率、且特异性好、灵敏度高、重复性好、稳定性好,且配套全自动免疫分析仪,能实现仪器自动化检测等优点。
具体实施方式
下文将结合具体实施方式和实施例,具体阐述本发明,本发明的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解,这些具体实施方式和实施例是用于说明本发明,而非限制本发明。
在整个说明书中,除非另有特别说明,本文使用的术语应理解为如本领域中通常所使用的含义。因此,除非另有定义,本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员的一般理解相同的含义。若存在矛盾,本说明书优先。
在第一方面,本发明提供了一种抗组蛋白抗体测定试剂,该试剂包括包被有组蛋白抗原的固相载体,其中,所述组蛋白抗原为经还原处理的天然组蛋白。
在本发明中,术语“固相载体”、“固体支持物”、“固相支持物”和“固体载体”可以互换使用,其是指可以附着组蛋白抗原的固体表面。对用于本发明的固相支持物没有特别的限制,商品化的固相支持物及任何可用于免疫检测的固相支持物均可用于本发明。示例性的固相支持物可以是磁珠、微孔板、电极、塑料板、胶体金、乳胶珠、琼脂糖珠、玻璃、硝酸纤维素膜、尼龙膜、二氧化硅板或微芯片等,但本发明不限于此。
在一个优选实施方式中,所述固相载体为磁微粒。
在本发明中,术语“磁珠”可与“磁微粒”和“磁性粒子”互换使用。
在本发明中,术语“天然组蛋白”是指从牛胸腺中提取的天然抗原蛋白,该类抗原是天然序列,抗原表位全面,与血浆中的抗体亲和力高,反应性强。
在一些实施方式中,组蛋白抗原是由还原处理的天然组蛋白和重组组蛋白H1亚基组成。
术语“重组组蛋白抗原”,包括组蛋白抗原的几种亚型。该类抗原是人工设计序列,突出重点表位,产量大,且批间差异小。但是这类抗原一般只有线性表位具有免疫原性,构象表位空间结构不完整,不具有免疫原性,因此与血浆中抗体的亲和力与反应性均不如天然抗原强。
本发明意外发现,使用经还原处理的天然组蛋白和重组组蛋白H1亚基组合包被固相载体,在保证其检测特异性的前提下,又提高了检出率,为临床医生诊断疾病提供参考。本发明所述的还原处理可以是任意能打开天然组蛋白二硫键的方法,并且该方法不影响天然组蛋白与抗体之间的亲和力。
在第二方面,本发明提供了一种抗组蛋白抗体测定试剂盒,该试剂盒包括第一试剂和第二试剂;
其中,所述第一试剂为包被有组蛋白抗原的固相载体,并且所述组蛋白抗原是经还原处理的天然组蛋白;
所述第二试剂为标记物标记的抗人IgG。
除上述成分外,本发明第一试剂、第二试剂还可以包括适合测定抗组蛋白抗体的其它成分,例如,缓冲物质、盐类物质、稳定剂、表面活性剂和防腐剂。
在具体实施方式中,缓冲物质选自甘氨酸缓冲液、Tris缓冲液、MOPS 缓冲液、MES缓冲液、Hepes缓冲液和磷酸缓冲液;所述盐类物质选自氯化钠、氯化钾、氯化镁、硫酸镁、氯化锌和氯化钙;所述稳定剂选自牛血清白蛋白、酪蛋白、脱脂奶粉、葡萄糖、壳聚糖、山梨醇、海藻糖、果糖、蔗糖、甘露醇和丙三醇;所述防腐剂选自叠氮钠、苯酚、对羟基苯甲酸、PC系列防腐剂如PC300、PC950。
在一些实施方式中,试剂盒还包括第三试剂,其中,所述第三试剂是渗透压为60~100mosm的缓冲溶液;在优选的实施方式中,所述第三试剂是渗透压为80~90mosm的缓冲溶液。
在本发明中,表述“第一”、“第二”和“第三”等仅用于描述目的,用以区分所限定的对象,而不以任何方式限定次序或主次。
优选的,本发明的试剂组合包含于试剂盒中。本领域技术人员能够理解,用于测定抗组蛋白抗体的试剂盒除本发明的第一试剂和第二试剂外,还可以包括第三试剂、样品稀释液、清洗缓冲液和/或校准品等。
本发明意外的发现,组蛋白对反应环境的要求可能与其它抗原不同,在试验中,使用不同厂家的组蛋白抗原,均对反应环境即组蛋白抗原与血浆中的抗体反应时,如果渗透压稍高,会造成大量中低值浓度样本漏检。因此,在实验过程中,针对上述问题,本发明提供了一种低渗透压的第三试剂,该第三试剂在样本与第一试剂接触前或与第一试剂同时加入到样本中,从而调节抗原抗体的反应环境渗透压,使抗原抗体在最适宜的环境中进行反应。经过以上优化生产的试剂盒相比较于其他厂家的试剂盒,能明显的提高其检出率,并且特异性好,灵敏度高,重复性好,稳定性好,且配套全自动免疫分析仪,能实现仪器自动化检测。
以下通过实施例更详细地说明本发明,但本发明不限于这些实施例。
本发明提供了一种抗组蛋白抗体测定试剂盒,用于人血清或血浆中抗组蛋白抗体的检测。
实验材料
天然组蛋白抗原,购自四川迈克生物新材料科技有限公司,货号 XCL1107;
重组组蛋白H1亚基,购自immunovision公司,货号HIS-1011;
磁微粒(羧基磁微粒),购自四川迈克生物新材料科技有限公司,货号 XCL1026。
鼠抗人IgG抗体,购自四川迈克生物新材料科技有限公司,货号 XCL1616。
SDS,购自深圳美凯特科技有限公司;
TX-100,购自Wako;
巯基乙醇,购自南京国晨化工有限公司。
实施例1抗组蛋白抗体测定试剂盒的制备
1.1天然抗原的预处理
第一步,根据下表1中的记载配制预处理液(分别配制不同浓度的SDS、 TX-200、巯基乙醇);
表1
第二步,取1mg天然组蛋白,用预处理液将抗原稀释至0.125mg/mL,装入透析袋中,用5L预处理液静置透析18h(2~8℃),中间换液至少两次;得到还原处理的天然组蛋白。
1.2试剂R1的配制
实验步骤:
1)磁珠的活化:按照说明书的记载对羧基磁珠进行前处理,采用 10mg/ml EDC·HCl对羧基磁珠进行活化0.5h;
2)磁珠的包被:活化洗涤后,根据各自项目情况,计算抗原包被质量,将抗原加入到磁珠溶液中,室温下混匀反应2h;本发明使用的抗原为预处理的天然组蛋白加入到磁珠溶液中混匀,室温反应 2h;
3)磁珠的封闭:包被完成后,取封闭剂室温封闭0.5h;洗涤,
4)按照表2的配方配制试剂R1,以使抗原终浓度为0.1~2μg/mL;
本实施例中,配制的试剂R1中抗原终浓度为1.2μg/mL。
表2
成分 | 浓度 |
Tris缓冲液 | 12.11g/L |
氯化钠 | 8.5g/L |
盐酸 | 用盐酸调pH至6.80~7.20 |
海藻糖 | 10.00g/L |
TWeen-20 | 2.5mL/L |
生物防腐剂PC-950 | 3.0mL/L |
纯化水 | 定容至1L |
1.3试剂R2按照表3配制而成
表3
成分 | 浓度 |
吖啶酯标记的鼠抗人IgG | 0.1μg/mL |
Tris | 12.11g/L |
氯化钠 | 8.5g/L |
BSA | 10.00g/L |
海藻糖 | 10.00g/L |
TWeen-20 | 1.5mL/L |
生物防腐剂PC-950 | 1.0mL/L |
纯化水 | 定容至1L |
实施例2抗组蛋白抗体测定试剂盒
本实施例的抗组蛋白抗体测定试剂盒中,磁珠包被的抗原为还原处理的天然组蛋白与重组组蛋白H1亚基按照质量比为2:1混合;然后包被在磁微粒上,其余成分同实施例1。
实施例3抗组蛋白抗体测定试剂盒
本实施例的抗组蛋白抗体测定试剂盒中,还包括试剂R3,试剂R3的配方见下表。
表4
利用雅森国际的渗透压仪(型号为OM815)测试试剂R3的渗透压为 80~90mosm;其余配方同实施例1。
实施例4抗组蛋白抗体测定试剂盒
本实施例的抗组蛋白抗体测定试剂盒中,还包括试剂R3,试剂R3的配方见下表。
表5
成分 | 浓度 |
Tris | 1.21g/L |
EDTA-Na<sub>2</sub> | 2g/L |
BSA | 5.0g/L |
Tween-20 | 4.5ml/L |
PC-950 | 3mL/L |
纯水 | 定容 |
利用雅森国际的渗透压仪(型号为OM815)测试试剂R3的渗透压为 80~90mosm;其余配方同实施例2。
实施例5不同的预处理方法处理天然组蛋白抗原
根据下表中的记载配制预处理液
表6
根据实施例1的还原方法处理天然组蛋白抗原,然后根据实施例4的方式配制抗组蛋白抗体测定试剂盒,然后进行样本检测。对照为未经预处理的天然组蛋白抗原。
实验步骤:
1)将10μL样本与50μL的试剂R1、100μL试剂R3同时混合,反应 10min后,清洗缓冲液洗涤;
2)加入100μL的试剂R2,继续反应10min,洗涤;
3)加入发光底物,使用迈克生物化学发光自动分析仪i3000测量发光值 RLU。
使用的样本分别为纯化水、阴性样本1、阴性样本2、阳性样本1、阳性样本2;检测结果分别见表7~9。其中,阴性样本1和阴性样本2为非SLE 患者的临床样本;阳性样本1和阳性样本2为SLE患者的临床样本。
表7为不同浓度SDS预处理的天然组蛋白(单位:RLU)
表8为不同浓度TX-100处理的天然组蛋白(单位:RLU)
表9为不同浓度的巯基乙醇预处理天然组蛋白(单位:RLU)
综上,用合适量的SDS、TX-100,巯基乙醇处理抗原,均能明显使阳性样本信号升高,使部分漏检抗体被检出;但是在实际操作中,用TX-100处理抗原时,抗原容易出现聚集,而巯基乙醇剧毒,且味臭,会污染环境,因此优先推荐使用SDS处理抗原,不仅使用安全,且效果最佳。
实施例6不同渗透压的试剂R3的试剂盒
调节试剂R3成分配比,使其渗透压为20mosm、60mosm、100mosm、 200mosm、300mosm;渗透压的检测仪器为雅森国际的渗透压仪(型号为 OM815)。其余同实施例4,根据实施例5的而检测方法,检测不同的临床样本,检测结果见下表。
表10(单位:RLU)
从上表试剂数据看出,因为试剂R3的渗透压最终影响了组蛋白抗原抗体反应时的反应溶液渗透压,当试剂R3渗透压过高(比如300mosm),抗原抗体的反应增高,反应信号明显降低,且会出现部分阳性样本漏检。若渗透压太低,本底信号也会升高,因此综合考虑,试剂R3的渗透压最佳范围在 60~100mosm。
比较例1
抗组蛋白抗体测定试剂盒中,试剂R1的磁微粒使用不经还原处理的天然组蛋白抗原包被,其余同实施例1。
实施例9
使用实施例1~4、比较例1、厂家A、厂家B、厂家C分别对SLE确诊病人的血液样本和随机样本进行检测,实施例1、实施例2和比较例1中不加入试剂R3,其余实验步骤同实施例5。检测的结果见表11~13。
表11(RLU)
表12
表13
从上表可以看出,同一批样本,不同厂家检测结果差异较大,可能是由于方法学、抗原批间差异,反应体系不同造成的。目前自免项目尚无行业标准,各厂家在开发-研制项目时,除了比对厂家试剂检测结果,尚无参考标准。因此若不同厂家检测结果无可比性的情况下,我们尽量与临床诊断进行比较,比如组蛋白抗体,经常在系统性红斑狼疮患者中出现,特别是药物诱导的系统性红斑狼疮患者,其检出率大于90%,因此在系统性红斑狼疮患者样本中,我们尽量的提高其检出率,给予临床医生诊断时提供正确的参考;而在正常随机人群中,则保证其特异性,尽量不出假阳。
从样本比对结果来看,不同厂家在系统性红斑狼疮患者中,其检出率在 20%左右,远远低于文献报道的30%~70%,因此不同厂家的试剂在组蛋白抗体检测时,均存在不同程度的漏检。而经过本发明介绍的方法生产的试剂盒,在系统性红斑狼疮患者中,明显提高了检出率,与对照相比,从10%提高到 47%,明显高于其它厂家。因此证明本发明介绍方法是有效的。
应该理解到披露的本发明不仅仅限于描述的特定的方法、方案和物质,因为这些均可变化。还应理解这里所用的术语仅仅是为了描述特定的实施方式方案的目的,而不是意欲限制本发明的范围,本发明的范围仅受限于所附的权利要求。
本领域的技术人员还将认识到,或者能够确认使用不超过常规实验,在本文中所述的本发明的具体的实施方案的许多等价物。这些等价物也包含在所附的权利要求中。
Claims (10)
1.一种抗组蛋白抗体测定试剂,包括包被有组蛋白抗原的固相载体,其中,所述组蛋白抗原为经还原处理的天然组蛋白。
2.如权利要求1所述的抗组蛋白抗体测定试剂,所述组蛋白抗原是由经还原处理的天然组蛋白和重组组蛋白H1亚基组成。
3.如权利要求1或2所述的抗组蛋白抗体测定试剂,其中,所述还原处理为使用0.2~0.4g/L的SDS、1~4ml/L的TX-200或0.4~0.8g/L的巯基乙醇处理16~20h;优选地,所述还原处理为使用0.2~0.4g/L的SDS处理16~20h。
4.一种抗组蛋白抗体测定试剂盒,包括第一试剂和第二试剂;
其中,所述第一试剂为包被有组蛋白抗原的固相载体,并且所述组蛋白抗原是经还原处理的天然组蛋白;
所述第二试剂为标记物标记的抗人IgG。
5.如权利要求4所述的抗组蛋白抗体测定试剂盒,所述试剂盒还包括第三试剂;其中,
第一试剂包括:0.1~2μg/mL组蛋白抗原、10~14g/L缓冲物质、6~10g/L盐类物质、6~15g/L稳定剂、1~5ml/L表面活性剂和1~5ml/L防腐剂;所述第一试剂的渗透压为300~400mosm;
第三试剂包括:0.5~3.0g/l的缓冲物质,1~4g/L的盐类物质,2~10g/L的稳定剂,3~6ml/L的表面活性剂,1~5ml/L的防腐剂;第三试剂是渗透压为60~100mosm的缓冲溶液;优选地,所述第三试剂是渗透压为80~90mosm的缓冲溶液。
6.如权利要求4或5所述的抗组蛋白抗体测定试剂盒,所述组蛋白抗原是由经还原处理的天然组蛋白和重组组蛋白H1亚基组成;所述经还原处理的天然组蛋白和重组组蛋白H1亚基的包被质量比为2~5:1~3;优选地,所述经还原处理的天然组蛋白的包被质量大于重组组蛋白H1亚基。
7.如权利要求4~6任一项所述的抗组蛋白抗体测定试剂盒,其中,所述还原处理为使用0.2~0.4g/L的SDS、1~4ml/L的TX-200或0.4~0.8g/L的巯基乙醇处理16~20h;优选地,所述还原处理为使用0.2~0.4g/L的SDS处理16~20h。
8.如权利要求4或5所述的抗组蛋白抗体测定试剂盒,所述第二试剂还包括缓冲物质、盐类物质、稳定剂、表面活性剂和防腐剂。
9.如权利要求5所述试剂盒的使用方法,包括如下步骤:
(1)将待测样本与第一试剂和第三试剂混合,使其充分反应;
(2)洗涤后,加入第二试剂,充分反应形成抗体抗原抗体免疫复合物;
(3)第二次洗涤后加入发光底物,测定反应后的相对发光值。
10.如权利要求9所述的使用方法,在步骤(1)中,所述待测样本与第一试剂和第三试剂的体积比为1:5:10。
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