TWI832901B - 血紅素之測定試劑、測定套組及測定方法 - Google Patents
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Abstract
本發明之課題在於提供一種可抑制因添加結合球蛋白所致之血紅素之測定值之降低而更準確地測定血紅素之量的血紅素之測定試劑及測定方法。本發明之用以測定血紅素之試劑包含擔載抗血紅素抗體之不溶性載體、及擔載抗結合球蛋白抗體之不溶性載體。本發明之用以測定檢體中之血紅素之方法包括:(1)將檢體與結合球蛋白混合,形成血紅素-結合球蛋白複合體,獲得包含血紅素-結合球蛋白複合體之試樣之步驟;及(2)使步驟(1)中獲得之試樣與擔載抗血紅素抗體之不溶性載體、及擔載抗結合球蛋白抗體之不溶性載體接觸而使之免疫凝集之步驟。
Description
本發明係關於一種血紅素之測定試劑及測定方法。
糞便、尿、唾液等檢體中包含之血液之檢測對多數疾病之診斷有用。例如,檢測糞便中之血液之糞便潛血檢查用於大腸癌之檢查診斷。作為檢測潛血之方法,已知有使用抗血紅素抗體檢測糞便等檢體中之潛血中包含之血紅素之免疫學方法。
供於潛血檢查之檢體通常被受驗者採集至放有保存溶液之容器中,送至醫院等檢查機構。多數情況下,含有檢體之保存溶液於實際上供於檢查之前保管數天,期間多次置於高溫下之情況屢見不鮮。血紅素於溶液中不穩定,於高溫條件下尤其易改性或分解。若因血紅素改性或分解而使得表位或其周邊部位之結構發生變化,則抗體變得無法識別血紅素,因此利用免疫學方法之血紅素之檢測之準確性降低。
因此,為了使血紅素穩定化,而使用向檢體之保存溶液添加結合球蛋白之方法(例如專利文獻1)。結合球蛋白係存在於廣泛之動物之血液中,擔負回收藉由紅血球之溶血而釋出至血液中之血紅素之作用之蛋白質。已知結合球蛋白與血紅素快速地不可逆地結合,形成穩定之血紅素-結合球蛋白複合體。藉由於保存溶液等中預先添加結合球蛋白,而於將檢體添加於保存溶液等時,檢體中包含之血紅素藉由形成血紅素-結合球蛋白複合體而穩定化。
然而,於添加結合球蛋白之情形時,尤其若相對於檢體中之游離血紅素過量添加結合球蛋白,則存在確認到血紅素之測定值之降低之情形(專利文獻1)。
[先前技術文獻]
[專利文獻]
專利文獻1:日本專利特開平10-132824公報
[發明所欲解決之問題]
本發明之目的在於提供一種可抑制因添加結合球蛋白所致之血紅素之測定值之降低而可更準確地測定血紅素之量的血紅素之測定試劑及測定方法。
[解決問題之技術手段]
本發明人等為解決上述先前技術之課題而反覆進行銳意研究,結果發現,藉由使結合有抗血紅素抗體之不溶性載體與結合有抗結合球蛋白抗體之不溶性載體共存,可抑制因添加結合球蛋白所致之血紅素之測定值之降低,可更準確地測定血紅素之量,從而完成本發明。
即,本發明例如關於以下之各發明。
[1]一種用於測定血紅素之試劑,其包含擔載抗血紅素抗體之不溶性載體、及擔載抗結合球蛋白抗體之不溶性載體。
[2]如[1]之試劑,其中抗血紅素抗體為至少2種。
[3]如[1]或[2]中任一項之試劑,其中不溶性載體為乳膠粒子及/或金膠體粒子。
[4]如[1]至[3]中任一項之試劑,其中抗血紅素抗體及抗結合球蛋白抗體為單株抗體。
[5]如[1]至[4]中任一項之試劑,其中抗結合球蛋白抗體為1種。
[6]一種血紅素之測定方法,其係用以測定檢體中之血紅素之方法,且包括:
(1)將檢體與結合球蛋白混合,形成血紅素-結合球蛋白複合體,獲得包含血紅素-結合球蛋白複合體之試樣之步驟;及
(2)使步驟(1)中獲得之試樣與擔載抗血紅素抗體之不溶性載體、及擔載抗結合球蛋白抗體之不溶性載體接觸而使之免疫凝集之步驟。
[7]如[6]之測定方法,其中抗血紅素抗體為至少2種。
[8]如[6]或[7]之測定方法,其中不溶性載體為乳膠粒子及/或金膠體粒子。
[9]如[6]至[8]中任一項之測定方法,其中抗血紅素抗體及抗結合球蛋白抗體為單株抗體。
[10]如[6]至[9]中任一項之測定方法,其中檢體為糞便、唾液、或尿。
[11]如[6]至[10]中任一項之測定方法,其中檢體保存用溶液中包含結合球蛋白。
[12]如[11]之測定方法,其中檢體保存用溶液中之結合球蛋白濃度為0.05單位/L~50單位/L。
[13]如[6]至[12]中任一項之測定方法,其中檢體中之血紅素包含選自由游離血紅素、血紅素-結合球蛋白複合體中間物、及完全血紅素-結合球蛋白複合體所組成之群中之至少一種,上述游離血紅素之至少一部分於步驟(1)之後,形成上述結合球蛋白與血紅素-結合球蛋白複合體中間物及/或完全血紅素-結合球蛋白複合體。
[14]一種用以測定檢體中之血紅素之方法,其包括使檢體與擔載抗血紅素抗體之不溶性載體、及擔載抗結合球蛋白抗體之不溶性載體接觸而使之免疫凝集之步驟。
[15]一種抑制檢體中之血紅素之測定值之降低之方法,其包括使檢體與擔載抗血紅素抗體之不溶性載體、及擔載抗結合球蛋白抗體之不溶性載體接觸而使之免疫凝集之步驟。
[16]一種套組,其係用以測定檢體中之血紅素之套組,且包含擔載抗血紅素抗體之不溶性載體、擔載抗結合球蛋白抗體之不溶性載體及結合球蛋白。
[17]一種用以測定檢體中之血紅素之套組,其包含如[1]至[5]中任一項之試劑及結合球蛋白。
[發明之效果]
根據本發明,提供一種可更準確地測定血紅素之量之測定試劑及測定方法。
<定義>
[血紅素-結合球蛋白複合體]
血紅素係存在於紅血球中之蛋白質,具有由被稱為α次單元(或α鏈)及β次單元(或β鏈)之2種次單元各2個構成之四聚物結構[α2
β2
]。結合球蛋白係存在於血漿中並與血中游離之血紅素結合之蛋白質,具有3種型之結構。例如,1-1型結合球蛋白具有由被稱為α次單元(或α鏈)及β次單元(或β鏈)之2種次單元各2個構成之四聚物結構[α2
β2
]。
血紅素與結合球蛋白形成穩定之複合體。通常相對於結合球蛋白1分子結合有血紅素1分子。此種複合體被稱為血紅素-結合球蛋白複合體,於本說明書中亦稱為完全血紅素-結合球蛋白複合體。
另一方面,於血紅素相對於結合球蛋白之莫耳比(血紅素:結合球蛋白)未達1之情形時,即,於相對於血紅素而結合球蛋白存在過量之情形時,存在形成被稱為血紅素-結合球蛋白複合體中間物(intermediate)之複合體之傾向(J.V.PASTEWKA et al., Biochimica et Biophysica Acta, 386 (1975) 530-537)。認為於形成血紅素-結合球蛋白複合體中間物時,1分子之四聚物血紅素[α2
β2
]解離為2分子之二聚物(αβ),各αβ二聚物與結合球蛋白1分子結合。即,認為血紅素-結合球蛋白複合體中間物為1分子之結合球蛋白[α2
β2
]中結合有1/2分子之血紅素(αβ)之複合體。
於本說明書中,只要無特別說明,則血紅素-結合球蛋白複合體包含完全血紅素-結合球蛋白複合體與血紅素-結合球蛋白複合體中間物兩者。
[檢體]
本說明書中之檢體係自包含或可能包含血紅素之受檢對象採集之生物樣本。檢體可為糞便、唾液、或尿,尤佳為糞便。又,亦可將全血、血清、血漿等作為檢體,測定該等之血紅素量例如作為使用溶血或結合球蛋白製劑之治療之指標有用。
[試樣]
本說明書中之試樣係包含檢體者,尤其係將檢體與結合球蛋白混合而獲得者。檢體中之游離血紅素藉由與結合球蛋白混合,而形成穩定之血紅素-結合球蛋白複合體。
即,於試樣中,可包含未與結合球蛋白形成複合體之游離血紅素、檢體中本來存在之血紅素-結合球蛋白複合體(來自檢體之血紅素-結合球蛋白複合體)、及/或藉由添加結合球蛋白而形成之血紅素-結合球蛋白複合體(調製血紅素-結合球蛋白複合體)。
尤其就穩定性之方面而言,於混合有檢體與結合球蛋白之試樣中,較佳為全部游離血紅素與結合球蛋白形成複合體並形成調製血紅素-結合球蛋白複合體,試樣較佳為包含來自檢體之血紅素-結合球蛋白複合體及調製血紅素-結合球蛋白複合體。
試樣例如藉由自受檢者等採集檢體後,快速地向含有結合球蛋白之檢體保存用溶液(以下視情況稱為「保存溶液」)中添加檢體而獲得。試樣可於測定血紅素之前於常溫下保存數天,較佳為於2~10℃下冷藏保存。於檢體為包含固形物之糞便等之情形時,亦可將過濾保存溶液並去除固形物者設為試樣。
[保存溶液]
保存溶液意指用以保存檢體之檢體保存用溶液,較佳為包含結合球蛋白者。
保存溶液較佳為進而包含緩衝液等。作為緩衝液等,可為包含2-嗎啉乙磺酸(MES)、2-[4-(2-羥乙基)-1-哌𠯤基]-乙磺酸(HEPES)、哌𠯤-1,4-雙(2-乙磺酸)(PIPES)等古德緩衝劑之緩衝液,亦可為磷酸緩衝液、三羥甲基胺基甲烷緩衝液或甘胺酸緩衝液。保存溶液之pH值可為5~10,亦可為6~8。
保存溶液中之結合球蛋白之濃度根據檢體之種類及量不同,例如為0.05單位/L~50單位/L、0.1單位/L~10單位/L、或0.2單位/L~2單位/L。此處,1單位意指1 mg之血紅素所結合之結合球蛋白量。上述範圍之結合球蛋白濃度係對於使檢體中之全部血紅素與結合球蛋白形成複合體而言充分之濃度。
例如,於相對於保存溶液0.2~20 mL,糞便之濃度成為0.05%~25%(W/V%)之方式懸浮之情形時,檢體相對於結合球蛋白之量比可設為0.075 g/單位~5000 g/單位。
本發明中之結合球蛋白只要為與作為測定對象之血紅素複合化而生成血紅素-結合球蛋白複合體者即可,並無特別限制。血紅素與結合球蛋白之結合由於物種特異性較小,故可利用廣泛之結合球蛋白。於將人類-血紅素設為測定對象時,可利用來自以人為首之馬、豬、猿、犬、兔、大鼠等之結合球蛋白。結合球蛋白不必使用高度地精製之狀態者。
保存溶液中可進而添加疊氮化鈉(NaN3
)等抗菌劑、pH值調整劑、用以調節離子強度之鹽等保存血紅素時可使用之公知之添加劑。抗菌劑包含抗生素及溶菌酵素。添加劑之例亦包含離胺酸、組胺酸等胺基酸、白蛋白、蛋白質分解酶抑制劑、過渡金屬離子之水溶性錯合物、乙二胺四乙酸(EDTA)等已知具有使血紅素穩定化之作用之公知之成分。白蛋白之例包含牛血清白蛋白(BSA)等血清白蛋白、及來自卵白之白蛋白(卵白蛋白)。
<血紅素之測定試劑>
本發明之一實施形態之血紅素之測定試劑包含擔載抗血紅素抗體之不溶性載體、及擔載抗結合球蛋白抗體之不溶性載體。作為使用本發明之試劑之測定法,乃使用免疫學方法,作為免疫學方法,可為利用抗血紅素抗體之公知之免疫學方法,例如可列舉:免疫凝集法(例如,乳膠凝集法、或金膠體凝集法)、免疫層析法、ELISA(enzyme linked immunosorbent assay,酵素結合免疫吸附分析)法。本發明之試劑尤其適合用於免疫凝集法,更佳為適合用於乳膠凝集法。
本發明之一實施形態之血紅素之測定試劑於測定時將游離血紅素及血紅素-結合球蛋白複合體兩者設為測定對象,測定血紅素之總量。本發明之試劑於免疫學測定法(尤其是免疫凝集法)中,對游離血紅素、完全血紅素-結合球蛋白複合體、及血紅素-結合球蛋白複合體中間物之各抗原,表現出以血紅素計幾乎同等之反應性。尤其是,藉由使不溶性載體中結合之抗結合球蛋白抗體共存,而發揮出對完全血紅素-結合球蛋白複合體與血紅素-結合球蛋白複合體中間物之兩抗原,表現出以血紅素計同等之反應性(「對血紅素之同值反應性」)之優異之效果。
再者,所謂「以血紅素計同等之反應性」,係指於試樣中存在以血紅素計同濃度之游離血紅素、完全血紅素-結合球蛋白複合體、血紅素-結合球蛋白複合體中間物或該等之混合物之各抗原之情形時,藉由不溶性載體之免疫凝集反應而測定之血紅素濃度於各抗原中實質上相等。此處,藉由不溶性載體之免疫凝集反應而測定之血紅素濃度「實質上相等」意指於將游離血紅素之測定值設為100%之情形時,測定以血紅素計同濃度之其他各種抗原時之血紅素濃度之測定值之下限為80%以上,較佳為90%以上,更佳為95%以上,又,測定值之上限值為120%以下,較佳為110%以下,更佳為105%以下。
本發明之試劑除先前之擔載抗血紅素抗體之不溶性載體以外,亦包含擔載抗結合球蛋白抗體之不溶性載體,藉此可抑制先前之因添加結合球蛋白所致之血紅素之測定值之降低。尤其是,於添加之結合球蛋白與檢體中之游離血紅素之莫耳比(血紅素/結合球蛋白)未達1之情形時,即,即使於存在血紅素-結合球蛋白複合體中間物之情形時,亦可抑制血紅素之測定值之降低,準確地檢測並測定檢體中之血紅素。進而,於檢體中不添加結合球蛋白之情形時,即便檢體中原本存在結合球蛋白(可為游離結合球蛋白、血紅素-結合球蛋白複合體中間物、血紅素-結合球蛋白複合體),亦可抑制血紅素之測定值之降低,準確地檢測並測定檢體中之血紅素。
本發明人等認為血紅素-結合球蛋白複合體中間物之存在係導致先前之因添加結合球蛋白所致之血紅素之測定值之降低的一個原因,藉由添加擔載抗結合球蛋白抗體之不溶性載體而解決該問題。
作為不溶性載體,只要為可擔載抗血紅素抗體或抗結合球蛋白抗體者即可,較佳為免疫學方法中可使用之不溶性粒子,可列舉:一般使用之金膠體粒子等金屬膠體粒子、乳膠粒子、二氧化矽粒子、磁性粒子、螢光粒子、紅血球等,但並不限定於該等。作為不溶性粒子,較佳為乳膠粒子,進而較佳為聚苯乙烯系乳膠粒子。不溶性載體較佳為粒子狀,作為其平均粒徑,較佳為5~1000 nm,更佳為30~500 nm,進而較佳為75~350 nm,但可不特別侷限於該範圍而使用。
擔載抗體係指抗體藉由物理吸附或化學結合於不溶性載體之表面而固定化。作為擔載方法(固定化方法),例如作為公知之技術之藉由將抗體與不溶性載體粒子混合並使抗體物理吸附於不溶性載體粒子之表面而實現抗體對不溶性載體粒子之固定化。又,於使用表面導入有胺基或羧基之不溶性載體粒子之情形時,可藉由使用戊二醛或羧醯亞胺試劑之化學結合而實現抗體對不溶性載體粒子之表面之固定化。
抗體之擔載量並無特別限制,只要為0.5~2000 μg/ mg乳膠即可,亦可為1~1000 μg/ mg乳膠、或2~500 μg/ mg乳膠。抗體之擔載量可利用自不溶性載體中固定化之前之抗體量減去固定化之後之抗體量所得之量而算出。
抗血紅素抗體並無特別限制,較佳為可識別血紅素-結合球蛋白複合體中之血紅素之表位,且不與結合球蛋白發生交叉反應。可為多株抗體或單株抗體,但就特異性之方面而言,較佳為單株抗體,較佳為抗人類血紅素單株抗體。測定試劑中包含之抗血紅素抗體為至少1種,較佳為至少2種。
另一方面,抗結合球蛋白抗體並無特別限制,可識別血紅素-結合球蛋白複合體中之結合球蛋白之表位,且不與血紅素發生交叉反應。尤其是,抗結合球蛋白抗體較佳為至少於用以使游離之血紅素形成血紅素-結合球蛋白複合體之游離之結合球蛋白之添加量之範圍內,於擔載有游離之結合球蛋白與抗結合球蛋白抗體之不溶性載體中不凝集者。進而,抗結合球蛋白抗體更佳為於擔載有游離之結合球蛋白與抗結合球蛋白抗體之不溶性載體中不凝集者。抗結合球蛋白抗體可為多株抗體或單株抗體,但較佳為單株抗體,較佳為抗結合球蛋白單株抗體。於抗結合球蛋白抗體為單株抗體之情形時,其識別部位可為結合球蛋白之α鏈(α鏈識別抗體)或β鏈(β鏈識別抗體)。測定試劑中包含之抗結合球蛋白抗體為至少1種。
作為本發明中可使用之上述抗體,來源之動物種類並無特別限制,例如可列舉來自兔、山羊、小鼠、大鼠、馬、綿羊等動物之抗體,可使用藉由公知之方法自已免疫之動物之血清獲得測定對象物之多株、使已免疫之動物之脾臓與骨髓瘤細胞進行細胞融合而獲得測定對象物之單株抗體之任一者。又,可使用其等之片段[例如,F(ab')2、Fab、Fab'、或Fv]。
用於擔載抗血紅素抗體之不溶性載體為至少1種,但亦可為至少2種。1種不溶性載體中可擔載1種或2種以上之抗血紅素抗體。又,1種抗血紅素抗體可擔載於1種或2種以上之不溶性載體。
於測定試劑中包含2種以上之抗血紅素抗體之情形時,2種以上之抗血紅素抗體可共同擔載於相同之不溶性載體。或者,亦可將1種不溶性載體中擔載有1種抗血紅素抗體之不溶性載體混合複數種而使用。此時,用於擔載不同種類之抗血紅素抗體之不溶性載體可為同種不溶性載體,亦可為材質或粒徑等不同之不同種類之不溶性載體。
用於擔載抗結合球蛋白抗體之不溶性載體為至少1種,但亦可為至少2種。1種不溶性載體中可擔載1種或2種以上之抗結合球蛋白抗體。又,1種抗結合球蛋白抗體可擔載於1種或2種以上之不溶性載體。於測定試劑中包含2種以上之抗結合球蛋白抗體之情形時,與上述測定試劑中包含2種以上之抗血紅素抗體之情形相同。
測定試劑之形態並無特別限制,例如可由不含有不溶性載體之試劑(第1試劑)及含有擔載抗體之不溶性載體(抗體擔載不溶性載體)之試劑(第2試劑)之二試劑系構成,亦可由僅含有抗體擔載不溶性載體之試劑之一試劑系構成。
就反應系中之測定對象物或夾雜物之濃度之調整或反應速度之調整等方面而言,第1試劑用作稀釋液等,亦可用於調整測定環境。第2試劑含有抗體擔載不溶性載體,與第1試劑及試樣混合,發生免疫凝集反應。第1試劑及第2試劑可適當包含pH值緩衝劑、鹽、界面活性劑、凝集促進劑、防腐劑等。作為凝集反應時之pH值,較佳為5~9。
又,測定試劑與保存溶液混合而獲得反應液,但不溶性載體於反應液中之濃度根據使用之不溶性載體之粒徑或測定系整體之設計,例如可自0.0001 mg/mL~10 mg/mL之範圍適當選擇。測定試劑中之擔載抗血紅素抗體之不溶性載體之濃度可為0.01~20 mg/mL、或0.05~1 mg/mL,擔載抗結合球蛋白抗體之不溶性載體之濃度可為0.01~20 mg/mL、或0.05~1 mg/mL。
再者,不溶性載體於第二試劑中之濃度係藉由使用時與保存溶液混合、或藉由與第一試劑及保存溶液混合而稀釋,故而該第二試劑中之不溶性載體之濃度可根據稀釋倍率適當選擇,例如可以於稀釋2倍使用之情形時成為0.004 mg/mL~80 mg/mL、於稀釋3倍使用之情形時成為0.06 mg/mL~120 mg/mL之方式適當調整。
<血紅素之測定方法>
[步驟(1)]
於步驟(1)中,將檢體與結合球蛋白混合,形成血紅素-結合球蛋白複合體,獲得包含血紅素-結合球蛋白複合體之試樣。
檢體與結合球蛋白之混合如上述[試樣]之項目中所記載。此處,試樣中包含之血紅素-結合球蛋白複合體可包含完全血紅素-結合球蛋白複合體及血紅素-結合球蛋白複合體中間物兩者。又,試樣可包含來自檢體之游離血紅素、來自檢體之血紅素-結合球蛋白複合體、及來自檢體之其他成分,進而可包含未與血紅素形成複合體之游離結合球蛋白。用以與檢體混合之結合球蛋白可包含於檢體保存用溶液中,於結合球蛋白以包含於檢體保存用溶液之形態添加之情形時,試樣除未與血紅素形成複合體之游離結合球蛋白以外,亦可包含除保存溶液以外之成分。較佳為來自檢體之游離血紅素全部與結合球蛋白形成複合體,故而檢體中混合之結合球蛋白之量可為相對於檢體中之游離血紅素過量。
[步驟(2)]
於步驟(2)中,使步驟(1)中獲得之試樣與擔載抗血紅素抗體之不溶性載體、及擔載抗結合球蛋白抗體之不溶性載體接觸而使之發生免疫凝集反應。
藉由上述接觸,抗血紅素抗體識別試樣中之血紅素,藉此擔載抗血紅素抗體之不溶性載體結合於血紅素或血紅素-結合球蛋白複合體,進而不溶性載體彼此凝集。藉由不溶性載體之凝集而溶液之濁度發生變化,故而測定溶液之濁度之變化,藉由使用血紅素濃度已知之血紅素或血紅素-結合球蛋白複合體製成之校準曲線,而求出試樣中之血紅素濃度。
濁度之變化之測定可列舉藉由光學方法而測定免疫反應液之吸光度或散射光等之方法。作為光學方法,例如可使用泛用之光學測定裝置,例如可使用生物化學自動分析裝置「JCA-BM2250」(日本電子股份有限公司製造)或「JCA-BM6070」(日本電子股份有限公司製造)測定。
本發明之測定方法藉由除先前之擔載抗血紅素抗體之不溶性載體以外,使擔載抗結合球蛋白抗體之不溶性載體亦與試樣接觸,而可抑制先前之因添加結合球蛋白所致之血紅素之測定值之降低,可更準確地檢測及測定檢體中之血紅素。再者,於測定檢體中之血紅素時不添加結合球蛋白之情形(即,不進行步驟(1)之情形)時,即便檢體中原本存在結合球蛋白(可為游離結合球蛋白、血紅素-結合球蛋白複合體中間物、完全血紅素-結合球蛋白複合體),藉由使檢體與擔載抗血紅素抗體之不溶性載體、及擔載抗結合球蛋白抗體之不溶性載體接觸而使之免疫凝集(即僅步驟(2)),而亦可抑制血紅素之測定值之降低,可準確地檢測、測定檢體中之血紅素。
本發明進而提供一種於藉由上述方法檢測檢體中之血紅素時可使用之套組。套組可包含含有抗血紅素抗體擔載不溶性載體及抗結合球蛋白抗體擔載不溶性載體之測定試劑、結合球蛋白(較佳為包含結合球蛋白之保存溶液)、校準物、及對照組等構成,又,亦可包含用於採集檢體之器具及容器、用於保存檢體之保存溶液等構成。
[實施例]
<實施例1-1~4-2、比較例1>
[測定試劑之製備]
作為測定試劑,製備第1試劑及第2試劑。
作為第1試劑,使用50 mM HEPES緩衝液(pH值7.4)。
作為第2試劑,以表1所示之濃度將50 mM HEPES緩衝液(pH值7.4)、擔載複數種抗血紅素單株抗體(抗Hb抗體)各自之抗體之各聚苯乙烯乳膠、及擔載抗結合球蛋白單株抗體之聚苯乙烯乳膠混合,製備具有表1所示之最終乳膠濃度之實施例1-1~1-4及比較例1之免疫凝集反應測定用之試劑。同樣地,作為第2試劑,以特定之濃度混合,製備具有表2所示之最終乳膠濃度之實施例2-1~2-3、實施例3-1~3-3、及實施例4-1~4-2之免疫凝集反應測定用之試劑。
作為抗結合球蛋白單株抗體,使用AO-53(α鏈識別)、AO-27(α鏈識別)、AO-35(α鏈識別)、或AN12-8(β鏈識別)。抗結合球蛋白抗體使用確認於下述之[試樣之製備]之項目中添加之量之游離結合球蛋白不與擔載有抗結合球蛋白抗體之不溶性載體凝集者。
抗體擔載聚苯乙烯乳膠藉由公知之方法製備。即,藉由將各抗血紅素單株抗體或抗結合球蛋白單株抗體與聚苯乙烯乳膠粒子(平均粒徑200 nm)混合,並於聚苯乙烯乳膠粒子表面擔載抗血紅素單株抗體或抗結合球蛋白單株抗體而製備。
[表1]
[表2]
[試樣之製備]
以成為表3所示之濃度之方式將自人類血液精製之人類血紅素(hHb)、及人類結合球蛋白(hHp)(Haptoglobin Human,Phenotype 1-1(SIGMA公司製造))混合於Hb校正稀釋液‘榮研’(榮研化學股份有限公司)中,製備No.0~6之試樣。No.3中,相對於人類血紅素800 μg/L,混合有人類結合球蛋白0.8單位/L,血紅素與結合球蛋白全部形成完全血紅素-結合球蛋白複合體。
[免疫凝集]
向No.0~6之試樣分別添加實施例1-1~1-4、實施例2-1~2-3、實施例3-1~3-3、實施例4-1~4-2及比較例1之測定試劑,使用自動分析機BM2250測定濁度,基於預先製成之校準曲線,算出血紅素之濃度換算值。進而亦算出相對於No.0(不含人類結合球蛋白之試樣)之血紅素之相對值(%)。將結果示於表3。
JCA-BM2250中之測定條件如下。
檢體量:2.0 μL
第1試劑:60 μL
第2試劑:30 μL
測定波長:658 nm
根據表3判明,與於測定血紅素時添加結合球蛋白之情形時,僅添加擔載抗血紅素抗體之乳膠,而不添加擔載抗結合球蛋白抗體之乳膠之比較例1相比,與擔載抗血紅素抗體之乳膠一同添加擔載抗結合球蛋白抗體之乳膠之各實施例可抑制因添加結合球蛋白所致之血紅素測定值之降低,即,獲得更接近於實際之值之測定值。於使用之α鏈識別及β鏈識別之任一種抗結合球蛋白抗體時均獲得該結果,故而證明抗結合球蛋白抗體不依存於識別之次單元。
<比較例2-1~2-3、3-1~3-3、4~7>
代替實施例1-1中之抗結合球蛋白抗體擔載乳膠,將未擔載於乳膠之游離之抗結合球蛋白抗體與抗血紅素抗體擔載乳膠混合而製備試劑,添加至No.0~6之試樣中,同樣地使其發生凝集反應,算出血紅素之濃度換算值及血紅素之相對值(%)。各比較例之試劑之組成示於表4,結果示於表5。再者,抗結合球蛋白抗體AN11-2及AN12-3為β鏈識別抗結合球蛋白單株抗體,藉由公知之方法製作。
根據表5,即便添加未結合於乳膠之游離之抗結合球蛋白抗體,亦無法抑制因添加結合球蛋白所致之血紅素測定值之降低。反而,表現出成為更低值之傾向。推測或許其原因在於,因過剩地存在之抗結合球蛋白抗體,而阻礙結合於乳膠之抗血紅素抗體與血紅素-結合球蛋白複合體之結合。
[表4]
<實施例5-1~5-5、比較例8>
[測定試劑之製備]
作為測定試劑,製備第1試劑及第2試劑。
作為第1試劑,使用50 mM HEPES緩衝液(pH值7.4)。
作為第2試劑,以表6所示之濃度將50 mM HEPES緩衝液(pH值7.4)及擔載複數種抗血紅素單株抗體(抗Hb抗體)各自之抗體之各聚苯乙烯乳膠、及擔載抗結合球蛋白單株抗體之聚苯乙烯乳膠混合,製備具有表6所示之最終乳膠濃度之實施例5-1~5-5及比較例8之免疫凝集反應測定用之試劑。
使用AO-53(α鏈識別)、或AN12-8(β鏈識別)作為抗結合球蛋白單株抗體。抗結合球蛋白抗體使用確認於下述之[試樣之製備]之項目中添加之量之游離結合球蛋白不與擔載有抗結合球蛋白抗體之不溶性載體凝集者。
確認之方法係使用擔載AO-53(α鏈識別)、或AN12-8(β鏈識別)之聚苯乙烯乳膠1.0 mg/mL作為第2試劑,使用將游離結合球蛋白以成為0 ng/mL或24.5 pmol/mL之方式添加於保存溶液(Hb校正稀釋液‘榮研’(榮研化學股份有限公司))中者(不包含血紅素)作為試樣,除此以外,以與後文中敍述之試樣之製備及免疫凝集方法同樣地進行。再者,24.5 pmol/mL之結合球蛋白濃度相當於1.2單位/L之游離結合球蛋白添加濃度。
抗體擔載聚苯乙烯乳膠藉由公知之方法製備。即,藉由將各抗血紅素單株抗體或抗結合球蛋白單株抗體與聚苯乙烯乳膠粒子(平均粒徑200 nm)混合,於聚苯乙烯乳膠粒子表面擔載抗血紅素單株抗體或抗結合球蛋白單株抗體而製備。
[表6]
[試樣之製備]
自健康者採集2種(糞便檢體1及2)糞便檢體。以糞便濃度成為0.5%(W/V%)之方式,使各糞便檢體混合於保存溶液(Hb校正稀釋液‘榮研’(榮研化學股份有限公司))中,又,以成為表7及8所示之濃度之方式使自人類血液精製之人類血紅素(hHb)、及人類結合球蛋白(hHp)(Haptoglobin Human,Phenotype 1-1(SIGMA公司製造))混合於保存溶液(Hb校正稀釋液‘榮研’(榮研化學股份有限公司))中,製備No.0~5之試樣。No.3中,相對於人類血紅素600 μg/L,混合人類結合球蛋白0.6單位/L,血紅素與結合球蛋白全部形成完全血紅素-結合球蛋白複合體。
[免疫凝集]
向糞便檢體1及2之各自之No.0~5之試樣分別添加實施例5-1~5-5及比較例8之測定試劑,並使用自動分析機JCA-BM6070測定濁度,基於預先製成之校準曲線,算出血紅素之濃度換算值。進而亦算出相對於No.0(不包含人類結合球蛋白之試樣)之血紅素之相對值(%)。將結果示於表7及8。
JCA-BM6070中之測定條件如下。
檢體量:2.0 μL
第1試劑:60 μL
第2試劑:30 μL
測定波長:658 nm
[表7]
[表8]
糞便檢體2
Claims (18)
- 一種用以測定試樣中之血紅素之試劑,其包含擔載抗血紅素抗體之不溶性載體、及擔載抗結合球蛋白抗體之不溶性載體,上述試樣包含血紅素-結合球蛋白複合體,將上述試樣中之游離血紅素及血紅素-結合球蛋白複合體兩者設為測定對象,測定上述血紅素之總量。
- 一種用以測定血紅素之免疫凝集法用試劑,其包含擔載抗血紅素抗體之不溶性載體、及擔載抗結合球蛋白抗體之不溶性載體。
- 如請求項1或2之試劑,其中抗血紅素抗體為至少2種。
- 如請求項1或2之試劑,其中不溶性載體為乳膠粒子及/或金膠體粒子。
- 如請求項1或2之試劑,其中抗血紅素抗體及抗結合球蛋白抗體為單株抗體。
- 如請求項1或2之試劑,其中抗結合球蛋白抗體為1種。
- 一種血紅素之測定方法,其係用以測定檢體中之血紅素者,且包括: (1)將檢體與結合球蛋白混合,形成血紅素-結合球蛋白複合體,獲得包含血紅素-結合球蛋白複合體之試樣之步驟;及(2)使步驟(1)中獲得之試樣與擔載抗血紅素抗體之不溶性載體、及擔載抗結合球蛋白抗體之不溶性載體接觸而使之免疫凝集之步驟;並且將上述檢體中之游離血紅素及血紅素-結合球蛋白複合體兩者設為測定對象,測定上述血紅素之總量。
- 如請求項7之測定方法,其中抗血紅素抗體為至少2種。
- 如請求項7或8之測定方法,其中不溶性載體為乳膠粒子及/或金膠體粒子。
- 如請求項7或8之測定方法,其中抗血紅素抗體及抗結合球蛋白抗體為單株抗體。
- 如請求項7或8之測定方法,其中檢體為糞便、唾液、或尿。
- 如請求項7或8之測定方法,其中結合球蛋白係包含於檢體保存用溶液中。
- 如請求項12之測定方法,其中檢體保存用溶液中之結合球蛋白濃度為0.05單位/L~50單位/L。
- 如請求項7或8之測定方法,其中檢體中之血紅素包含選自由游離血紅素、血紅素-結合球蛋白複合體中間物、及完全血紅素-結合球蛋白複合體所組成之群中之至少一種,上述游離血紅素之至少一部分於步驟(1)之後,形成上述結合球蛋白與血紅素-結合球蛋白複合體中間物及/或完全血紅素-結合球蛋白複合體。
- 一種用以測定檢體中之血紅素之方法,其包括使檢體與擔載抗血紅素抗體之不溶性載體、及擔載抗結合球蛋白抗體之不溶性載體接觸而使之免疫凝集之步驟,且將游離血紅素及血紅素-結合球蛋白複合體兩者設為測定對象,測定血紅素之總量。
- 一種抑制檢體中之血紅素之測定值之降低之方法,其包括使檢體與擔載抗血紅素抗體之不溶性載體、及擔載抗結合球蛋白抗體之不溶性載體接觸而使之免疫凝集之步驟,且將游離血紅素及血紅素-結合球蛋白複合體兩者設為測定對象,測定血紅素之總量。
- 如請求項15或16之方法,其中不溶性載體為乳膠粒子及/或金膠體粒子。
- 如請求項15或16之方法,其中檢體為糞便、唾液、或尿。
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