JPH05322889A - ハプトグロビン−ヘモグロビン複合体の定量方法およびハプトグロビン−ヘモグロビン複合体の定量キット - Google Patents

ハプトグロビン−ヘモグロビン複合体の定量方法およびハプトグロビン−ヘモグロビン複合体の定量キット

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JPH05322889A
JPH05322889A JP12464192A JP12464192A JPH05322889A JP H05322889 A JPH05322889 A JP H05322889A JP 12464192 A JP12464192 A JP 12464192A JP 12464192 A JP12464192 A JP 12464192A JP H05322889 A JPH05322889 A JP H05322889A
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JP
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haptoglobin
hemoglobin
free
complex
carrier
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JP12464192A
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English (en)
Inventor
Masahiro Seko
政弘 世古
Kazunori Inamori
和紀 稲森
Hideyuki Yokota
英之 横田
Masakazu Tanaka
昌和 田中
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Toyobo Co Ltd
Original Assignee
Toyobo Co Ltd
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Abstract

(57)【要約】 【目的】 ハプトグロビン−ヘモグロビン複合体の迅速
算出を可能にする遠心分離法により使用する遊離ヘモグ
ロビン吸着材を提供する。 【構成】 ポリスチレン、ポリメタクリル酸およびその
誘導体或いはこれらの共重合体などまたは、多孔質ガラ
スに、遊離ハプトグロビン等を固定し、この遊離ハプト
グロビンによって検体中の遊離ヘモグロビンを除去また
は捕集することを用いるハプトグロビン−ヘモグロビン
複合体の定量方法。

Description

【発明の詳細な説明】
【0001】
【産業上の利用分野】本発明は、不溶性担体に遊離ハプ
トグロビン等を固定した担体(吸着材)を検体と接触さ
せ、当該担体により、検体中の遊離ヘモグロビンを除去
または捕集した後、検体中のハプトグロビン−ヘモグロ
ビン複合体を定量することを特徴とするハプトグロビン
−ヘモグロビン複合体の定量方法とその定量キットに関
する。
【0002】
【従来の技術】人工腎臓、人工心肺等の血液体外循環療
法施行時の副作用として機械的溶血が起こる。また、再
生不良性貧血等の疾病により、血液中に多量の遊離ヘモ
グロビンが生ずる場合がある。軽度の溶血の場合には、
遊離ヘモグロビンは血液中の遊離ハプトグロビンと結合
し、ヘモグロビン−ハプトグロビン複合体を形成する。
当該複合体は、引き続き、網内系で処理される。血液中
に存在する遊離ハプトグロビンの結合能力以上の溶血が
あった場合には、遊離ヘモグロビンは毒性物質として作
用し、腎障害、腎不全等を引き起こす。従って、大量溶
血時に、遊離ヘモグロビンを迅速に定量し、早期に適切
な処置をすることは、極めて重要なことである。
【0003】遊離ヘモグロビンの吸着方法として従来か
ら知られている方法は、特公昭55−4417号公報お
よび、特公昭56−51780号公報に開示されてい
る。これらの方法は、何れも体外循環に関するもので、
血液中の遊離ヘモグロビンを体外循環により吸着除去す
る目的で利用されるものであり、定量に利用されるもの
ではない。
【0004】また、遊離ヘモグロビンの定量方法は、特
公平3−272698公報に開示されている。当該方法
は、遊離ハプトグロビン固定化担体に遊離ヘモグロビン
を結合させ、結合させたヘモグロビンに標識抗体を結合
させ、発色定量する方法である。当該方法は、標識抗体
を使用する為、測定費用が割高で、測定に時間がかかる
という難点がある。
【0005】更に、遊離ヘモグロビン値の算出方法に
は、簡易分別定量法が知られている。当該方法は、総ハ
プトグロビン値と総ヘモグロビン値から遊離ヘモグロビ
ン値を算出する方法であるが、ハプトグロビンには、3
種類の型(1−1型、1−2型、2−1型)が存在する
為、正確で迅速な定量が困難を極めるという難点があっ
た。
【0006】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、上記
従来技術の欠点を克服することにある。即ち、本発明
は、ハプトグロビン固定化担体を用いて、検体中の遊離
ヘモグロビンを吸着除去し、ヘモグロビン−ハプトグロ
ビン複合体を分画し、当該複合体のヘモグロビン値を求
め、総ヘモグロビン値との差から、遊離ヘモグロビン値
を算出する方法に関するものである。
【0007】
【課題を解決するための手段】本発明にかかわるハプト
グロビン−ヘモグロビン定量は、遊離ハプトグロビンを
固定した不溶性担体をカラムに充填し、更にそのカラム
を遠沈管に挿入したもので、検体を添加した後、遠心分
離することにより、遊離ヘモグロビンを除去し、ヘモグ
ロビン−ハプトグロビン複合体を迅速に分画、定量する
ことを特徴とするものである。
【0008】本発明に関わる遊離ヘモグロビン吸着材に
は、既知の遊離ヘモグロビン吸着材を用いる事ができ
る。即ち、遊離ヘモグロビン吸着に供する不溶性担体
は、合成有機高分子化合物、天然有機高分子化合物、改
質天然有機高分子化合物が考えられる。また、当該担体
は、スペーサーを保有することも可能である。更に、当
該不溶性担体の型状は、粒子状、繊維状、膜状等、何れ
の公知の形状も用いられ得る。また、担体表面には、有
効表面積を拡大する為、微小孔が存在することが好まし
い。上記の担体に、リガンドである遊離ハプトグロビン
または、抗遊離ヘモグロビン抗体を導入する。
【0009】ヒトハプトグロビンは主に肝実質細胞で生
合成されるほか、網内系組織、脾臓、リンパ節、胞腺で
も生合成される。ヒトハプトグロビンは 1-1型、1-2
型、2-1 型に区別される。ヒトハプトグロビンは免疫グ
ロブリンと同様に、2本のH鎖(β鎖)と2本のL鎖
(α鎖)からなる。ヒトハプトグロビンの型は、α鎖の
一次構造の違いによるもので、α1 (α1 はα1Fとα1S
の2種類がある)とα2 の3種類があり、α鎖は、優劣
のない対立遺伝子HP1F 、HP1S およびHP2によって決
定されている。β鎖はヒトハプトグロビンの各型に共通
している。分子組成は 1-1型は(α1 β)2 : 分子量約
80,000 、2-1 型は(α1 β)2 と(α2 β)n : 分子
量約 200,000の混合した組成を持つものと考えられてい
る。また、2-2 型は種々の程度に重合したポリマーから
なっており、分子組成は(α2 β)n:分子量約400,000
で表される。ヒトハプトグロビンの主要な生理的機能
は、ヘモグロビンと特異的に結合して安定なハプトグロ
ビン・ヘモグロビン複合体を形成することである。この
複合体は、抗原抗体複合体と異なり、pHの低下によっ
ても容易に解離しない。ヒトハプトグロビン 1-1型1分
子はヘモグロビン1分子と結合する。2-1 型、2-2 型に
ついては不明のままである。ヒトハプトグロビンはテト
ラマーであるヘモグロビンと直接結合するのではなく、
テトラマーから解離したαβダイマーと結合する。従っ
て、ヒトハプトグロビン 1-1型は2価として働き、2つ
のαβダイマーと結合する。遊離ハプトグロビンの固定
化方法は、共有結合、物理的吸着、イオン結合、生化学
的特異結合等、特に制限されないが、血液中での結合安
定性を考慮すると、共有結合が好ましい。
【0010】抗遊離ヘモグロビン抗体は常法により調製
された遊離ヘモグロビンを、常法により哺乳類、或い
は、鳥類に免疫することにより、哺乳類では血液中に、
鳥類では、卵黄中に産生させることが可能である。産生
された抗体を常法に従い分画し、上記担体に直接、間接
にリガンドとして固定する。
【0011】
【実施例】以下、実施例を用いて本発明を説明する。 〈実施例1〉 <ヘモグロビン−ハプトグロビン複合体の定量>ヒト遊
離ハプトグロビン固定担体1mlを容量3mlのカラム
に充填し、更に、当該カラムを遠沈管に挿入し、当該遠
沈管を3,000rpmで5分間、遠心分離し、担体か
ら水分を分離した。当該カラムを別の遠沈管に入れ替え
た後、被検検体0.5mlを添加し、3,000rpm
で5分間、遠心分離し、検体からヘモグロビン−ハプト
グロビン複合体を分画した。分画したヘモグロビン−ハ
プトグロビン複合体をテトラメチルベンジジン法により
定量した。予め、定量した総ヘモグロビン値と当該担体
の値の差から遊離ヘモグロビン値を算出した。
【0012】〈実施例2〉 <標準ヘモグロビン−ハプトグロビン複合体の調製>市
販ハプトグロビンの濃縮操作、或いは希釈操作により調
整したハプトグロビン溶液と、対応する同濃度の遊離ヘ
モグロビン溶液を等量混合し、4mg/ml、2mg/
ml、1mg/ml、0.5mg/ml、0.25mg
/ml、0.125mg/mlの濃度のヘモグロビン-
ハプトグロビン複合体を調製し、前述の遠心分離法によ
り遊離ハプトグロビン固定化装置を通過させた後、凍結
乾燥し、標準ヘモグロビン−ハプトグロビン複合体とし
た。
【0013】〈実施例3〉抗遊離ハプトグロビン抗体固
定化担体を用いて調製したウシ、ウマ、ブタ由来の遊離
ハプトグロビンを固定化し、キトサン−エポキシド−ウ
シ遊離ハプトグロビン担体、キトサン−エポキシド−ウ
マ遊離ハプトグロビン担体、キトサン−エポキシド−ブ
タ遊離ハプトグロビン担体を各々調製した。各担体2m
lをカラムに充填し、以下、実施例1と同様の方法でヘ
モグロビン−ハプトグロビン複合体の定量を行い、遊離
ヘモグロビン値を算出した。
【0014】〈実施例4〉遺伝子組み替え操作により得
られたヒト遊離ハプトグロビンを多孔質ガラスに固定化
し、多孔質ガラス−PEG−遺伝子操作ヒト遊離ハプト
グロビン担体を調製した。同担体2mlを充填したカラ
ムを用いてヘモグロビン−ハプトグロビン複合体の定量
を行った。即ち、テトラメチルベンジジン法により、検
体の総ヘモグロビン値(a)を求めた。次に、実施例1
の方法に準じてヘモグロビン−ハプトグロビン複合体を
分画し、テトラメチルベンジジン法により、結合型ヘモ
グロビン値(b)を求めた。(a)値から(b)値の差
から遊離ヘモグロビン値を算出した。
【0015】〈実施例5〉 遊離ハプトグロビン固定化担体を用いたヘモグロビン-
ハプトグロビン複合体の通過試験 遊離ハプトグロビンを固定化したSepharose1
mlを容量3mlのカラムに充填し、更にそのカラムを
遠沈管に挿入した。当該遠沈管を3,000rpmで5
分間遠心分離し、Sephaeoseの水分を分離し
た。当該カラムを別の遠沈管に移した後、ヘモグロビン
−ハプトグロビン複合体0.5mlを添加し、3,00
0rpmで遠心分離し、流下液を得、ヘモグロビン−ハ
プトグロビン複合体の定量を行った。Sepharos
e量、ヘモグロビン−ハプトグロビン複合体の量を変え
て同様の操作を行い、結果を表1に示した。表1に示し
た様に、溶液はほぼ100%回収された。
【0016】
【表1】
【0017】〈実施例6〉 <抗遊離ヘモグロビン抗体固定化担体を用いたヘモグロ
ビン−ハプトグロビン複合体の通過試験>抗遊離ヘモグ
ロビン抗体を固定化したSepharose1mlを容
量3mlのカラムに充填し、更にそのカラムを試験管に
挿入した。当該試験管を3,000rpmで5分間遠心
分離し、Sephaeoseの水分を分離した。当該カ
ラムを別の試験管に移した後、ヘモグロビン−ハプトグ
ロビン複合体0.5mlを添加し、3,000rpmで
遠心分離し、流下液を得、ヘモグロビン−ハプトグロビ
ン複合体の定量を行った。Sepharose量、ヘモ
グロビン−ハプトグロビン複合体の量を変えて同様の操
作を行い、結果を表2に示した。表2に示した様に、溶
液はほぼ100%回収された。
【0018】
【表2】 以上の結果から明かなように、本発明の遊離ヘモグロビ
ン吸着材は血中の遊離ヘモグロビンを選択的かつ簡便に
除去でき、ヘモグロビン−ハプトグロビン複合体を迅速
に分画でき、遊離ヘモグロビン値も簡便に算出できるこ
とがわかった。
【0019】
【発明の効果】本発明の遊離ヘモグロビン吸着材は、遠
心分離法により使用する為、ヘモグロビン−ハプトグロ
ビン複合体を迅速に分画でき、総ハプトグロビンの定量
を行うことなく、ハプトグロビン−ヘモグロビン複合体
値の迅速な算出を可能にする。本方法は、体外循環時の
機械的溶血や、再生不良性貧血患者の溶血によって生ず
る遊離ヘモグロビンの迅速除去に広く利用され得る。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 田中 昌和 滋賀県大津市堅田二丁目1番1号 東洋紡 績株式会社総合研究所内

Claims (2)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】 不溶性担体に遊離ハプトグロビンまた
    は、抗遊離ヘモグロビン抗体を固定し、当該担体によ
    り、検体中の遊離ヘモグロビンを除去または捕集した
    後、検体中の残余のハプトグロビン−ヘモグロビン複合
    体を定量することを特徴とするハプトグロビン−ヘモグ
    ロビン複合体の定量方法。
  2. 【請求項2】 不溶性担体に遊離ハプトグロビンまた
    は、抗遊離ヘモグロビン抗体を固定した遊離ヘモグロビ
    ンの吸着材を少なくとも構成要素として有することを特
    徴とするハプトグロビン−ヘモグロビン複合体の定量キ
    ット。
JP12464192A 1992-05-18 1992-05-18 ハプトグロビン−ヘモグロビン複合体の定量方法およびハプトグロビン−ヘモグロビン複合体の定量キット Pending JPH05322889A (ja)

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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2016114573A (ja) * 2014-12-18 2016-06-23 国立大学法人金沢大学 オキシトシン検出のためのサンプルの前処理方法
WO2020066722A1 (ja) * 2018-09-26 2020-04-02 栄研化学株式会社 ヘモグロビンの測定試薬、測定キット及び測定方法

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2016114573A (ja) * 2014-12-18 2016-06-23 国立大学法人金沢大学 オキシトシン検出のためのサンプルの前処理方法
WO2020066722A1 (ja) * 2018-09-26 2020-04-02 栄研化学株式会社 ヘモグロビンの測定試薬、測定キット及び測定方法
JPWO2020066722A1 (ja) * 2018-09-26 2021-09-16 栄研化学株式会社 ヘモグロビンの測定試薬、測定キット及び測定方法

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