JP7005785B2 - ヘモグロビンの測定試薬、測定キット及び測定方法 - Google Patents
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Description
[1] 抗ヘモグロビン抗体を担持する不溶性担体と、抗ハプトグロビン抗体を担持する不溶性担体とを含む、ヘモグロビンを測定するための試薬。
[2] 抗ヘモグロビン抗体が少なくとも2種である、[1]の試薬。
[3] 不溶性担体がラテックス粒子及び/又は金コロイド粒子である、[1]又は[2]のいずれかの試薬。
[4] 抗ヘモグロビン抗体及び抗ハプトグロビン抗体がモノクローナル抗体である、[1]~[3]のいずれかの試薬。
[5] 抗ハプトグロビン抗体が1種である、[1]~[4]のいずれかの試薬。
[6] 検体中のヘモグロビンを測定するための方法であって、
(1)検体とハプトグロビンとを混合し、ヘモグロビン-ハプトグロビン複合体を形成させ、ヘモグロビン-ハプトグロビン複合体を含む試料を得る工程と、
(2)工程(1)で得られた試料と、抗ヘモグロビン抗体を担持する不溶性担体、及び抗ハプトグロビン抗体を担持する不溶性担体とを接触させ、免疫凝集させる工程と、
を含むヘモグロビンの測定方法。
[7] 抗ヘモグロビン抗体が少なくとも2種である、[6]の測定方法。
[8] 不溶性担体がラテックス粒子及び/又は金コロイド粒子である、[6]又は[7]の測定方法。
[9] 抗ヘモグロビン抗体及び抗ハプトグロビン抗体がモノクローナル抗体である、[6]~[8]のいずれかの測定方法。
[10] 検体が糞便、唾液、又は尿である、[6]~[9]のいずれかの測定方法。
[11] ハプトグロビンが検体保存用溶液に含まれる、[6]~[10]のいずれかの測定方法。
[12] 検体保存用溶液におけるハプトグロビン濃度が0.05単位/L~50単位/Lである、[11]の測定方法。
[13] 検体中のヘモグロビンが、遊離ヘモグロビン、ヘモグロビン-ハプトグロビン複合体中間体、及び完全ヘモグロビン-ハプトグロビン複合体からなる群から選ばれる少なくとも一つを含み、上記遊離ヘモグロビンの少なくとも一部は、工程(1)の後に、上記ハプトグロビンと、ヘモグロビン-ハプトグロビン複合体中間体及び/又は完全ヘモグロビン-ハプトグロビン複合体を形成する、[6]~[12]のいずれかの測定方法。
[14] 検体と、抗ヘモグロビン抗体を担持する不溶性担体、及び抗ハプトグロビン抗体を担持する不溶性担体とを接触させ、免疫凝集させる工程を含む、検体中のヘモグロビンを測定するための方法。
[15] 検体と、抗ヘモグロビン抗体を担持する不溶性担体、及び抗ハプトグロビン抗体を担持する不溶性担体とを接触させ、免疫凝集させる工程を含む、検体中のヘモグロビンの測定値の低下を抑制する方法。
[16] 検体中のヘモグロビンを測定するためのキットであって、抗ヘモグロビン抗体を担持する不溶性担体と、抗ハプトグロビン抗体を担持する不溶性担体と、ハプトグロビンとを含む、キット。
[17] [1]~[5]のいずれかの試薬と、ハプトグロビンとを含む、検体中のヘモグロビンを測定するためのキット。
[ヘモグロビン-ハプトグロビン複合体]
ヘモグロビンは、赤血球の中に存在するタンパク質であり、αサブユニット(又はα鎖)とβサブユニット(又はβ鎖)と呼ばれる2種類のサブユニットそれぞれ2つから構成される四量体構造[α2β2]を有している。ハプトグロビンは、血漿中に存在し、血中に遊離したヘモグロビンと結合するタンパク質であり、3つの型の構造を有する。例えば、1-1型ハプトグロビンは、αサブユニット(又はα鎖)とβサブユニット(又はβ鎖)と呼ばれる2種類のサブユニットそれぞれ2つから構成される四量体構造[α2β2]を有する。
本明細書における検体は、ヘモグロビンを含む又は含む可能性のある、被検対象から採取した生体サンプルである。検体は、糞便、唾液、又は尿であってよく、特に糞便であることが好ましい。また、全血、血清、血漿等を検体とすることもでき、これらのヘモグロビン量を測定することは、例えば、溶血やハプトグロビン製剤を用いた治療の指標として有用となりうる。
本明細書における試料は、検体を含むものであり、特に検体とハプトグロビンとを混合して得られたものである。検体中の遊離ヘモグロビンは、ハプトグロビンと混合することで、安定なヘモグロビン-ハプトグロビン複合体を形成する。
すなわち、試料中において、ハプトグロビンと複合体を形成していない遊離ヘモグロビン、検体中に元々存在していたヘモグロビン-ハプトグロビン複合体(検体由来のヘモグロビン-ハプトグロビン複合体)、及び/又はハプトグロビンの添加によって形成されたヘモグロビン-ハプトグロビン複合体(調製ヘモグロビン-ハプトグロビン複合体)が含まれ得る。
特に、安定性の点から、検体とハプトグロビンを混合した試料中において、全ての遊離ヘモグロビンがハプトグロビンと複合体を形成して調製ヘモグロビン-ハプトグロビン複合体を形成していることが好ましく、試料は、検体由来のヘモグロビン-ハプトグロビン複合体及び調製ヘモグロビン-ハプトグロビン複合体からなることが好ましい。
保存溶液は、検体を保存するための検体保存用溶液を意味し、ハプトグロビンを含むものであることが好ましい。
本発明の一実施形態のヘモグロビンの測定試薬は、抗ヘモグロビン抗体を担持する不溶性担体と、抗ハプトグロビン抗体を担持する不溶性担体とを含む。本発明の試薬が用いられる測定法としては免疫学的手法が用いられ、免疫学的手法としては、抗ヘモグロビン抗体を利用する公知の免疫学的手法であってよく、例えば、免疫凝集法(例えば、ラテックス凝集法、又は金コロイド凝集法)、イムノクロマトグラフ法、ELISA法が挙げられる。本発明の試薬は特に免疫凝集法、より好ましくはラテックス凝集法に好適に用いられる。
[工程(1)]
工程(1)において、検体とハプトグロビンとを混合し、ヘモグロビン-ハプトグロビン複合体を形成させ、ヘモグロビン-ハプトグロビン複合体を含む試料を得る。
工程(2)において、工程(1)で得られた試料と、抗ヘモグロビン抗体を担持する不溶性担体、及び抗ハプトグロビン抗体を担持する不溶性担体とを接触させ、免疫凝集反応を生じさせる。
[測定試薬の調製]
測定試薬として、第1試薬及び第2試薬を調製した。
第1試薬として、50mM HEPES緩衝液(pH7.4)を用いた。
第2試薬として50mM HEPES緩衝液(pH7.4)と、複数種の抗ヘモグロビンモノクローナル抗体(抗Hb抗体)それぞれの抗体を担持する各ポリスチレンラテックス、及び抗ハプトグロビンモノクローナル抗体を担持するポリスチレンラテックスを、表1に示す濃度で混合して、表1に示す最終的なラテックス濃度を有する実施例1-1~1-4及び比較例1の免疫凝集反応測定用の試薬を調製した。同様に、第2試薬として、所定の濃度で混合し、表2に示す最終的なラテックス濃度を有する実施例2-1~2-3、実施例3-1~3-3、及び実施例4-1~4-2の免疫凝集反応測定用の試薬を調製した。
ヒト血液から精製したヒト・ヘモグロビン(hHb)、及びヒト・ハプトグロビン(hHp)(Haptoglobin Human, Phenotype 1-1(SIGMA社製))をHbキャリブレータ希釈液‘栄研’(栄研化学株式会社製)中に、表3に示す濃度となるように混合し、No.0~6の試料を調製した。No.3は、ヒト・ヘモグロビン800μg/Lに対してヒト・ハプトグロビン0.8単位/Lを混合しており、ヘモグロビンとハプトグロビンがすべて完全ヘモグロビン-ハプトグロビン複合体を形成している。
No.0~6の試料に、それぞれ実施例1-1~1-4、実施例2-1~2-3、実施例3-1~3-3、実施例4-1~4-2及び比較例1の測定試薬を添加し自動分析機BM2250を用いて濁度を測定し、あらかじめ作成した検量線に基づき、ヘモグロビンの濃度換算値を算出した。さらにNo.0(ヒト・ハプトグロビンを含まない試料)に対するヘモグロビンの相対値(%)も算出した。結果を表3に示す。
実施例1-1における抗ハプトグロビン抗体担持ラテックスの代わりに、ラテックスに担持されていない遊離の抗ハプトグロビン抗体を、抗ヘモグロビン抗体担持ラテックスと混合した試薬を調製し、No.0~6の試料に添加し、同様に凝集反応を生じさせ、ヘモグロビンの濃度換算値及びヘモグロビンの相対値(%)を算出した。各比較例の試薬の組成は表4に、結果は表5に示す。なお、抗ハプトグロビン抗体AN11-2及びAN12-3はβ鎖認識抗ハプトグロビンモノクローナル抗体であり、公知の方法により作製した。
[測定試薬の調製]
測定試薬として、第1試薬及び第2試薬を調製した。
第1試薬として、50mM HEPES緩衝液(pH7.4)を用いた。
第2試薬として50mM HEPES緩衝液(pH7.4)と、複数種の抗ヘモグロビンモノクローナル抗体(抗Hb抗体)それぞれの抗体を担持する各ポリスチレンラテックス、及び抗ハプトグロビンモノクローナル抗体を担持するポリスチレンラテックスを、表6に示す濃度で混合して、表6に示す最終的なラテックス濃度を有する実施例5-1~5-5及び比較例8の免疫凝集反応測定用の試薬を調製した。
抗ハプトグロビンモノクローナル抗体としてAO-53(α鎖認識)、若しくはAN12-8(β鎖認識)を使用した。抗ハプトグロビン抗体は、下記の[試料の調製]の項目において添加する量の遊離ハプトグロビンでは、抗ハプトグロビン抗体を担持した不溶性担体と凝集しないことを確認したものを用いた。
健常者から糞便検体を2つ(糞便検体1及び2)採取した。それぞれの糞便検体を、糞便濃度が0.5%(W/V%)となるように、また、ヒト血液から精製したヒト・ヘモグロビン(hHb)、及びヒト・ハプトグロビン(hHp)(Haptoglobin Human, Phenotype 1-1(SIGMA社製))を、表7及び8に示す濃度となるように、保存溶液(Hbキャリブレータ希釈液‘栄研’(栄研化学株式会社製))中に混合し、No.0~5の試料を調製した。No.3は、ヒト・ヘモグロビン600μg/Lに対してヒト・ハプトグロビン0.6単位/Lを混合しており、ヘモグロビンとハプトグロビンがすべて完全ヘモグロビン-ハプトグロビン複合体を形成している。
糞便検体1及び2のそれぞれのNo.0~5の試料に、それぞれ実施例5-1~5-5及び比較例8の測定試薬を添加し自動分析機JCA-BM6070を用いて濁度を測定し、あらかじめ作成した検量線に基づき、ヘモグロビンの濃度換算値を算出した。さらにNo.0(ヒト・ハプトグロビンを含まない試料)に対するヘモグロビンの相対値(%)も算出した。結果を表7及び8に示す。
Claims (5)
- 抗ヘモグロビン抗体を担持する不溶性担体と、抗ハプトグロビン抗体を担持する不溶性担体とを含む、ヘモグロビンを測定するための免疫凝集法用試薬。
- 抗ヘモグロビン抗体が少なくとも2種である、請求項1に記載の試薬。
- 不溶性担体がラテックス粒子及び/又は金コロイド粒子である、請求項1又は2に記載の試薬。
- 抗ヘモグロビン抗体及び抗ハプトグロビン抗体がモノクローナル抗体である、請求項1~3のいずれか一項に記載の試薬。
- 抗ハプトグロビン抗体が1種である、請求項1~4のいずれか一項に記載の試薬。
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