JPH08262020A - ヒトヘモグロビンの安定化方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【目的】 ヒトヘモグロビンの溶液中での変性による抗
原性の低下を防止或は抑制し得るヒトヘモグロビンの安
定化方法、及び該安定化方法を利用した、高感度且つ高
精度なヒトヘモグロビンの免疫学的測定方法を提供。 【構成】 トランスフェリン又は／及びフェリチン（或
はヒトヘモグロビン以外の鉄タンパク質とフェリシアン
イオン）をヒトヘモグロビンを含有する溶液中に10μg
／ml以上共存させることを特徴とする、ヒトヘモグロビ
ンの安定化方法、及び該安定化方法によって安定化され
たヒトヘモグロビン含有溶液を被検液として用いること
を特徴とする、ヒトヘモグロビンの免疫学的測定方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、便潜血検査、尿潜血検
査、血中ヘモグロビン検査等における、糞便中、或は尿
中，血中等に含まれるヒトヘモグロビンの安定化方法に
関する。また、本発明は、抗ヒトヘモグロビン抗体を用
いたヒトヘモグロビンの高精度な免疫学的測定方法に関
する。

【０００２】

【従来の技術】一般に、潜血反応検査は、様々な疾患の
診断や、治療効果の判定の際に於いて利用されており、
糞便や尿、或は血液，胃液等の体液を対象として行われ
ている。特に、近年、大腸癌などの下部消化器疾患の検
査法として、消化管出血に起因する糞便中の潜血成分、
特にヒトヘモグロビンの検出が広く行われている。

【０００３】従来からの糞便中のヒトヘモグロビンの検
出法には、分光鏡法、ヘミン結晶試験法、化学的潜血反
応法等があり、なかでも操作が比較的簡単でしかも経済
性が良いこと等から、ヘモグロビン或はその誘導体の有
するペルオキシダーゼ様作用を利用した化学的潜血反応
法（例えば、グアヤック法、フェノールフタレイン法、
オルトトリジン法等）が広く実施されてきた。しかしな
がら、この化学的潜血反応法は、ヒトヘモグロビンに対
する種差特異性がなく、ペルオキシダーゼ活性を有する
野菜や動物ヘモグロビンなどの影響を受けてしまうた
め、検査前に食餌を制限しておかなければならないとい
う問題点や、また、例えば鉄、銅、ビスマス、獣炭、ヨ
ウ化カリウム等の触媒反応促進作用を有する物質、或は
例えばアスコルビン酸等の触媒反応阻害作用を有する化
合物を含む薬剤等の投与（或は食物等の摂取）を予め中
止しておかなければならない等の問題点があった。

【０００４】そこで、これら化学的潜血反応法の問題点
を解消するために、ヒトヘモグロビンに特異的に反応す
る抗体を用いる免疫学的測定方法が開発され、最近の主
流となっている。この免疫学的測定方法には、例えば、
寒天平板上で抗ヒトヘモグロビン抗体と被検液中のヒト
ヘモグロビンとを反応させて生じた沈降線を利用してヘ
モグロビンを検出する単純免疫拡散法や二重免疫拡散法
等の免疫拡散法、抗ヒトヘモグロビン抗体を感作した動
物血球と被検液とを混合し、その結果生じる沈降現象像
を利用して検出する逆受身血球凝集法、抗ヒトヘモグロ
ビン抗体を感作した高分子ラテックス粒子と被検液とを
混合し、その結果生じる凝集像を利用して検出するラテ
ックス凝集法、酵素で標識した抗ヒトヘモグロビン抗体
を利用するエンザイムイムノアッセイ法、ラジオアイソ
トープで標識した抗ヒトヘモグロビン抗体を利用するラ
ジオイムノアッセイ法等がある。

【０００５】これらの検出方法に於いて、被検物質であ
るヒトヘモグロビンは、通常、溶液に含有させた状態で
（被検液として）検査に供される。例えば、糞便を試料
とする場合は、通常生理食塩水や緩衝液中に糞便を溶解
（又は懸濁）した後、その上清が被検液として検査に供
される。

【０００６】しかしながら、ヒトヘモグロビンは、被検
液中では徐々に変性し、抗原性が低下するという性質を
有している。また、被検液中のヒトヘモグロビンは、保
存温度等の保存条件によって変性が促進されたり、糞便
等試料中の細菌、消化酵素等により分解されてしまうこ
とも多い。このような変性、分解の結果、ヒトヘモグロ
ビンの立体構造が破壊されて抗原性の低下を招くことと
なるため、免疫学的なヒトヘモグロビンの測定方法に於
いては、ヒトヘモグロビンの変性は測定誤差を生ずる原
因となる。

【０００７】一方、便潜血検査に於いては、検査員の手
間や不快感を少なくするために、被検者自身が自宅等に
て糞便を緩衝液等を含む密閉容器に採取して検査に供す
る場合があり、この場合糞便中のヒトヘモグロビンは、
溶液中で数日間放置されたり、郵便等の輸送手段を利用
することにより高温下に曝されることも多い。また、検
査員が糞便から測定用被検液を調製する場合でも、作業
の都合上、検査までにヒトヘモグロビンを溶液状態で数
時間放置したままとなる場合もある。このような状況下
では前述したようにヒトヘモグロビンの変性が起こり抗
原性が低下するため、免疫学的方法によりヒトヘモグロ
ビンを精度よく測定する際の妨げとなっていた。また、
例えばエンザイムイムノアッセイ法を利用したヒトヘモ
グロビンの測定に於いては、その操作上、ヒトヘモグロ
ビンを含む被検液を高温下で加温する必要があるため、
ヒトヘモグロビンが変性して（抗原性が低下して）測定
誤差が生じ易いという問題点もあった。

【０００８】そこで、上記した如き問題点、即ち溶液中
でのヒトヘモグロビンの変性を防止するために、例えば
ヒト以外の動物ヘモグロビン（特開平２−２９６１４９
号公報）やヒト以外の動物血清（特開平４−１４５３６
６号公報）や鉄プロトポルフィリン（特開平５−２８１
２２７号公報）等をヒトヘモグロビンを含む溶液中に添
加、共存させることが提案されているが、これらの方法
によってもヒトヘモグロビンの変性による抗原性の低下
を十分に防止することができない状況にある。

【０００９】

【発明の目的】本発明は、上記した如き状況に鑑みなさ
れたもので、ヒトヘモグロビンの溶液中での変性、特に
ヒトヘモグロビンを低濃度溶液として保存した場合や、
ヒトヘモグロビンを含有する溶液を高温下に放置した場
合の変性による抗原性の低下を防止或は抑制し得るヒト
ヘモグロビンの安定化方法、及び該安定化方法によって
安定化されたヘモグロビン含有溶液を被検液として用い
る、高感度且つ高精度なヒトヘモグロビンの免疫学的測
定方法等を提供することを目的とする。

【００１０】

【課題を解決するための手段】本発明は、トランスフェ
リン又は／及びフェリチンをヒトヘモグロビンを含有す
る溶液中に10μg／ml以上共存させることを特徴とす
る、ヒトヘモグロビンの安定化方法の発明である。

【００１１】また、本発明は、ヒトヘモグロビンと特異
的に反応する抗ヒトヘモグロビン抗体を用いるヒトヘモ
グロビンの免疫学的測定方法に於いて、トランスフェリ
ン又は／及びフェリチンを含有する溶液と、ヒトヘモグ
ロビンを含有する試料とから調製された溶液であって、
トランスフェリン又は／及びフェリチンを10μg／ml以
上含有する溶液を被検液として用いることを特徴とす
る、ヒトヘモグロビンの測定方法の発明である。

【００１２】更に、本発明は、トランスフェリン又は／
及びフェリチンを含有することを特徴とする、ヒトヘモ
グロビン検出用被検液調製用溶液の発明である。

【００１３】また、本発明は、ヒトヘモグロビン以外の
鉄タンパク質10μg／ml以上とフェリシアンイオンとを
ヒトヘモグロビンを含有する溶液中に共存させることを
特徴とする、ヒトヘモグロビンの安定化方法の発明であ
る。

【００１４】更に、本発明は、ヒトヘモグロビンと特異
的に反応する抗ヒトヘモグロビン抗体を用いるヒトヘモ
グロビンの免疫学的測定方法に於いて、ヒトヘモグロビ
ン以外の鉄タンパク質とフェリシアンイオンとを含有す
る溶液と、ヒトヘモグロビンを含有する試料とから調製
された溶液であって、ヒトヘモグロビン以外の鉄タンパ
ク質を10μg／ml以上含有する溶液を被検液として用い
ることを特徴とする、ヒトヘモグロビンの測定方法の発
明である。

【００１５】更にまた、本発明は、ヒトヘモグロビン以
外の鉄タンパク質とフェリシアンイオンを含有すること
を特徴とする、ヒトヘモグロビン検出用被検液調製用溶
液の発明である。

【００１６】即ち、本発明者らは、溶液中のヒトヘモグ
ロビンの変性による抗原性の低下を防止或は抑制する方
法を見出すべく鋭意研究を重ねた結果、ヒトヘモグロビ
ンを含有する溶液中に、トランスフェリン又は／及びフ
ェリチンを共存させれば、従来のヒトヘモグロビンの安
定化方法として知られていた方法、例えばヒト以外の動
物ヘモグロビン、ヒト以外の動物血清、鉄プロトポルフ
ィリン等を共存させる方法よりもヒトヘモグロビンをよ
り安定化することができること、更には、これらトラン
スフェリンやフェリチン等に代表される鉄タンパク質
と、フェリシアンイオンとを共存させて使用することに
より、溶液中でのヒトヘモグロビンの安定性をより向上
させることができ、変性による抗原性の低下を防止或は
抑制できることを見出した。更にまた、本発明者らは、
これらのヒトヘモグロビンの安定化方法により安定化さ
れたヒトヘモグロビンを含有する溶液を被検液として用
いれば、抗ヒトヘモグロビン抗体を用いた免疫学的測定
法によりヒトヘモグロビンを高感度且つ高精度に測定し
得ることを見出し、本発明を完成するに至った。

【００１７】本発明のヒトヘモグロビンの安定化方法に
使用される、トランスフェリン及びフェリチンは、その
由来は特に限定されないが、例えば、ヒト、サル、ウサ
ギ、ウマ、ウシ、ブタ、マウス等に由来するもの等が好
ましく挙げられる。尚、このようなトランスフェリン又
はフェリチンであっても測定対象であるヒトヘモグロビ
ンと交差反応を引き起こすものを本発明のヒトヘモグロ
ビン測定用の被検液を調製するために用いることはあま
り好ましくない。即ち、本発明の測定方法では抗ヒトヘ
モグロビン抗体を使用するため、このようなトランスフ
ェリンやフェリチンを用いると、これらが測定時に抗ヒ
トヘモグロビン抗体と結合して測定に影響を与えてしま
うからである。尚、このような交差反応性が、それほど
強くないものであれば、盲検値が若干高くなるとして
も、本発明の測定方法に於て被検液を調製するために使
用することは可能である。また、トランスフェリン、フ
ェリチンの使用濃度としては、ヒトヘモグロビンを含有
する該溶液中の濃度として通常10μg/ml以上、好ましく
は50μg/ml以上、より好ましくは100μg/ml以上となる
ように適宜選択される。尚、安定化剤としてトランスフ
ェリンを使用する場合は、５mg/ml付近でヒトヘモグロ
ビン安定化効果がほぼプラトーに達するため、経済性等
を考慮すれば10μg/ml〜５mg/mlの範囲から、好ましく
は50μg/ml〜５mg/mlの範囲から、より好ましくは100μ
g/ml〜５mg/mlの範囲から適宜選択される。また、安定
化剤としてフェリチンを使用する場合は、１mg/ml付近
でヒトヘモグロビン安定化効果がほぼプラトーに達する
ため、経済性等を考慮すれば10μg/ml〜１mg/mlの範囲
から、好ましくは50μg/ml〜１mg/mlの範囲から、より
好ましくは100μg/ml〜１mg/mlの範囲から適宜選択され
る。また、フェリチンを用いる場合、10mg/ml以上の濃
度を使用することは溶液の着色が著しくなるので実用上
好ましくない。尚、トランスフェリン、フェリチンは、
夫々単独で使用することも、或はこれらを適宜組み合わ
せて使用することも可能であることは言うまでもない。

【００１８】トランスフェリンやフェリチンを使用する
本発明のヒトヘモグロビンの安定化方法は、ヒトヘモグ
ロビンを含有する溶液中に、トランスフェリン又は／及
びフェリチンを上記した如き濃度となるように共存させ
ることにより実施できる。

【００１９】本発明のヒトヘモグロビンの安定化方法に
於て、フェリシアンイオンと共に使用されるヒトヘモグ
ロビン以外の鉄タンパク質としては、分子中に鉄イオン
を含むタンパク質であって、且つヒトヘモグロビン以外
のものであれば特に限定されないが、例えば、トランス
フェリン、ラクトフェリン、フェリチン、ヘモシデリ
ン、フェレドキシン、オキシゲナーゼ等の鉄イオンが直
接タンパク質に結合している非ヘム鉄タンパク質、例え
ば、ヒト以外の動物ヘモグロビン、フェリシトクロム
ｃ、ミオグロビン、ペルオキシダーゼ、カタラーゼ等の
鉄イオンがポルフィン核と錯体を形成してタンパク質に
結合しているヘム鉄タンパク質等が好ましく挙げられ
る。また、ヒト以外の動物ヘモグロビンとしては、その
由来は特に限定されないが、例えば、ヒト、サル、ウサ
ギ、ウマ、ウシ、ブタ、マウス等に由来するもの等が好
ましく挙げられる。尚、このようなヒトヘモグロビン以
外の鉄タンパク質であっても測定対象であるヒトヘモグ
ロビンと交差反応を引き起こすものを本発明のヒトヘモ
グロビン測定用の被検液を調製するために用いることは
あまり好ましくない。即ち、本発明の測定方法では抗ヒ
トヘモグロビン抗体を使用するため、このような性質を
有するヒトヘモグロビン以外の鉄タンパク質を用いる
と、これらが測定時に抗ヒトヘモグロビン抗体と結合し
て測定に影響を与えてしまうからである。尚、このよう
な交差反応性がそれほど強くないものであれば、盲検値
が若干高くなるとしても、本発明の測定方法に使用する
ことは可能である。本発明に於て、フェリシアンイオン
と共に用いられるヒトヘモグロビン以外の鉄タンパク質
の使用濃度としては、用いる鉄タンパク質の種類によっ
て若干異なるが、ヒトヘモグロビンを含有する溶液中の
濃度として通常10μg/ml以上、好ましくは50μg/ml以
上、より好ましくは100μg/ml以上となるように該溶液
中に添加される。より具体的には、例えば、安定化剤と
してトランスフェリンを使用する場合は、５mg/ml付近
でヒトヘモグロビン安定化効果がほぼプラトーに達する
ため、経済性等を考慮すれば10μg/ml〜５mg/mlの範囲
から、好ましくは50μg/ml〜５mg/mlの範囲から、より
好ましくは100μg/ml〜５mg/mlの範囲から適宜選択され
る。また、安定化剤としてフェリチンを使用する場合
は、１mg/ml付近でヒトヘモグロビン安定化効果がほぼ
プラトーに達するため、経済性等を考慮すれば10μg/ml
〜１mg/mlの範囲から、好ましくは50μg/ml〜１mg/mlの
範囲から、より好ましくは100μg/ml〜１mg/mlの範囲か
ら適宜選択される。また、フェリチンを用いる場合、10
mg/ml以上の濃度を使用することは溶液の着色が著しく
なるので実用上好ましくない。また、例えば、安定化剤
としてヒト以外の動物ヘモグロビンを使用する場合は、
25μg/mlからヒトヘモグロビン安定化効果が現れ、200
μg/ml付近でほぼプラトーに達するため、これらと経済
性等を考慮して適宜使用濃度を選択すればよいが、交差
反応や、溶液の着色等による実用上の問題が生じないよ
うにするためには１mg/ml以下の濃度で使用することが
好ましい。尚、この場合にヒトヘモグロビン以外の鉄タ
ンパク質は、単独で使用しても良いし、２種以上適宜組
み合わせて用いても良いことは言うまでもない。

【００２０】本発明に於いて、ヒトヘモグロビン以外の
鉄タンパク質と共に使用されるフェリシアンイオンは、
通常、例えばフェリシアン化カリウム、フェリシアン化
ナトリウム等、塩の形になったものが好ましく用いられ
るが、特にこれらに限定されるものではない。また、フ
ェリシアンイオンの使用濃度としては、用いるフェリシ
アンイオンの由来（例えば金属塩の種類等）によっても
若干異なるが、ヒトヘモグロビンを含有する溶液中の濃
度として通常0.05〜３mM、好ましくは0.15〜1.5mMとな
るように該溶液中に添加される。

【００２１】ヒトヘモグロビン以外の鉄タンパク質とフ
ェリシアンイオンとを安定化剤として使用する、本発明
のヒトヘモグロビンの安定化方法は、ヒトヘモグロビン
を含有する溶液中にヒトヘモグロビン以外の鉄タンパク
質とフェリシアンイオンとを上記した如き濃度となるよ
うに共存させることにより実施できる。

【００２２】トランスフェリンやフェリチン（或はヒト
ヘモグロビン以外の鉄タンパク質とフェリシアンイオ
ン）を、ヒトヘモグロビンを含有する溶液中に一定量以
上共存させる方法としては、最終的にトランスフェリン
やフェリチン（或はヒトヘモグロビン以外の鉄タンパク
質とフェリシアンイオン）をヒトヘモグロビンを含有す
る溶液中に一定量以上共存させることができる方法であ
ればよく、特に限定されないが、最も一般的な方法とし
ては、例えば糞便や尿、或は血清，血液，胃液等の体液
等に含有されるヒトヘモグロビンを測定するための被検
液を調製するために用いられる緩衝液等にトランスフェ
リンやフェリチン（或はヒトヘモグロビン以外の鉄タン
パク質とフェリシアンイオン）を予め含有させておく方
法が好ましく挙げられる。

【００２３】本発明のヒトヘモグロビンの安定化方法
は、上記した如き各種試料中のヒトヘモグロビン濃度を
測定するための被検液を調製する際に利用することによ
り、ヒトヘモグロビンの測定精度を向上させることがで
きる。

【００２４】このような目的で使用される本発明のヒト
ヘモグロビン測定用被検液調製用溶液は、上記した如き
性質を有するトランスフェリン又は／及びフェリチン
（或はヒトヘモグロビン以外の鉄タンパク質とフェリシ
アンイオン）を、これを用いて調製された被検液中の濃
度が前述の濃度範囲となるように含有するものであれば
良く、特に限定されないが、例えば、リン酸緩衝剤、グ
リシン緩衝剤、ホウ酸緩衝剤、イミダゾール緩衝剤、ト
リス−塩酸緩衝剤、トリス−クエン酸緩衝剤、アンモニ
ア緩衝剤、グッド緩衝剤等の緩衝剤を通常500mM以下、
好ましくは５〜200mM含有するｐＨが通常5.0〜10.0、好
ましくは6.5〜8.5の緩衝液にトランスフェリン又は／及
びフェリチン（或はヒトヘモグロビン以外の鉄タンパク
質とフェリシアンイオン）を上記した如き濃度範囲で含
有させたものが好ましく挙げられる。尚、該溶液中に
は、細菌等によるヒトヘモグロビンの変性を抑制するた
めに、アジ化ナトリウム等の抗菌剤や非イオン性界面活
性剤等を通常この分野で用いられる濃度範囲で添加して
おいても良い。

【００２５】本発明の安定化方法を利用して、或は本発
明のヒトヘモグロビン測定用被検液調製用溶液を使用し
て調製されたヒトヘモグロビンを含有する被検液は、種
々のヒトヘモグロビンの測定方法に於ける被検液として
使用することが可能である。これら本発明の安定化方法
を利用できるヒトヘモグロビンの測定方法としては、例
えば、抗ヒトヘモグロビン抗体を用いた免疫学的測定方
法、分光鏡法、ヘミン結晶試験法、シアンメトヘモグロ
ビン法〔医学と生物学,92(4),483(1976)〕、アザイドメ
トヘモグロビン法〔J.Lab.Clin.Med.,67(1),116(196
6)〕等が挙げられる。尚、上記免疫学的測定方法を、よ
り具体的に挙げれば、例えば単純免疫拡散法（東京化学
同人 続生化学実験講座５ 免疫生化学研究法 P.43-4
4）や二重免疫拡散法（東京化学同人 続生化学実験講
座５ 免疫生化学研究法 P.40-43）等の免疫拡散法、
逆受身血球凝集法（東京化学同人 続生化学実験講座５
免疫生化学研究法 P.36-39）、ラテックス凝集法
（特開昭59-125064号公報）、ラテックス凝集阻害法
（特開昭63-58262号公報、特開昭63-289453号公報）、
抗ヒトヘモグロビン抗体を感作した金コロイド粒子を用
いる金コロイド凝集法（特開平2-141665号公報）、酵素
を標識した抗ヒトヘモグロビン抗体を使用するエンザイ
ムイムノアッセイ法（東京化学同人 続生化学実験講座
５ 免疫生化学研究法P.62-65、特開昭56-106154号公
報、特開昭58-23796号公報）、ラジオアイソトープを標
識した抗ヒトヘモグロビン抗体を使用するラジオイムノ
アッセイ法（東京化学同人 続生化学実験講座５ 免疫
生化学研究法 P.57-61）等の自体公知の免疫学的測定
方法等が挙げられる。

【００２６】本発明のヒトヘモグロビンの測定方法によ
りヒトヘモグロビンの測定を行うには、例えば、被検者
の糞便等のヒトヘモグロビンを含有する試料の一定量
と、トランスフェリン又は／及びフェリチン（或はヒト
ヘモグロビン以外の鉄タンパク質とフェリシアンイオ
ン）を一定量以上含有した溶液とを用いて被検液を調製
し、該被検液について上述した如き自体公知のヒトヘモ
グロビン測定方法の操作方法に従ってヒトヘモグロビン
の測定を行えば足りる。

【００２７】以下に実施例を挙げて本発明をより具体的
に説明するが、本発明はこれらの実施例により何等限定
されるものではない。

【００２８】

【実施例】

実施例．１ （１）抗ヒトヘモグロビン抗体感作ラテックス試液の調
製 抗ヒトヘモグロビンモノクロナール抗体（日本バイオテ
スト研究所製）３mgを含む50mMホウ酸緩衝液（pH7.1）
１mlと、ポリスチレンラテックス〔粒径0.12μm、積水
化学工業（株）〕を２％（W/V）となるように懸濁させ
た50mMホウ酸緩衝液（pH7.1）１mlとを混合し、４℃で
２時間反応させた。その後遠心分離により分離したラテ
ックスを50mMホウ酸緩衝液（pH7.1）で洗浄、再遠心分
離し、ラテックス濃度が0.2％（W/V）となるように、牛
血清アルブミン（以下、ＢＳＡと略記する。）を0.5％
（W/V）含有する50mMホウ酸緩衝液（pH7.3）に再懸濁し
て、抗ヒトヘモグロビン抗体感作ラテックス試液とし
た。 （２）被検液調製用溶液の調製 8.2mMトリス−クエン酸緩衝液（pH7.4）に、トランスフ
ェリン〔牛由来、和光純薬工業（株）製〕、フェリチン
〔馬脾臓由来、和光純薬工業（株）製〕及び牛ヘモグロ
ビン（牛由来、ＳＩＧＭＡ社製）から選ばれた鉄タンパ
ク質を所定濃度、フェリシアン化カリウムを0.61mM、Ｂ
ＳＡを0.1％（W/V）、アジ化ナトリウムを0.3％（W/V）
及び塩化ナトリウムを200mMとなるように溶解し、これ
を被検液調製用溶液とした。 （３）被検液の調製 （２）で調製した各被検液調製用溶液に、ヒトヘモグロ
ビン（ＳＩＧＭＡ社製）を0.1μg/ml、健常人の糞便を
５mg/mlとなるように溶解（又は懸濁）し、35℃で１日
間保存したものの上清を被検液とした。 （４）測定方法 ポリエチレングリコール６０００を0.7％（W/V）、アジ
化ナトリウムを0.1％（W/V）及び塩化ナトリウムを200m
M含有する50mM ３−（Ｎ−モルホリノ）−２−プロパン
スルホン酸（以下、ＭＯＰＳと略記する。）緩衝液（pH
7.0）200μlと、上記（３）で調製した被検液 25μlと
を混合し、37℃で５分間予備加温を行った後、これに更
に上記（１）で調製した抗ヒトヘモグロビン抗体感作ラ
テックス試液 50μlを加えて反応を開始させ、該ラテッ
クス試液添加直後からの５分間の吸光度変化量（△Ｅ）
を測定した。得られた△Ｅを、予め濃度既知のヒトヘモ
グロビン溶液を被検液とした以外は上記と同じ試薬を用
い同様に操作を行って求めた、△Ｅとヒトヘモグロビン
濃度との関係を表す検量線にあてはめて被検液中のヒト
ヘモグロビン量を算出した。尚、測定装置は、自動汎用
測定機ＣＯＢＡＳ ＭＩＲＡ（日本ロシュ製）を使用
し、測定波長 660nm、測定温度 37℃で測定を行った。
結果を表１に示す。尚、測定結果は、被検液調製直後に
測定して得られたヒトヘモグロビン濃度を100％とした
場合の相対値（抗原性残存率）として示してある。

【００２９】

【表１】

【００３０】（結果）表１から明らかなように、フェリ
シアン化カリウムと鉄タンパク質とを共存させた場合に
は、ヒトヘモグロビンの安定化に効果があることが判
る。また、トランスフェリン又はフェリチンを使用した
場合の方が、牛ヘモグロビンを使用した場合よりも、ヒ
トヘモグロビンの安定化効果が高いことも判る。

【００３１】実施例．２ （１）抗ヒトヘモグロビン抗体感作ラテックス試液 実施例．１の（１）と同じ。 （２）被検液調製用溶液の調製 8.2mMトリス−クエン酸緩衝液（pH7.4）に、トランスフ
ェリン〔牛由来、和光純薬工業（株）製〕、フェリチン
〔馬脾臓由来、和光純薬工業（株）製〕及び牛ヘモグロ
ビン（牛由来、ＳＩＧＭＡ社製）から選ばれた鉄タンパ
ク質を所定濃度、フェリシアン化カリウムを0.61mM、Ｂ
ＳＡを0.1％（W/V）、アジ化ナトリウムを0.3％（W/V）
及び塩化ナトリウムを200mMとなるように溶解したもの
と、8.2mMトリス−クエン酸緩衝液（pH7.4）に、トラン
スフェリン〔牛由来、和光純薬工業（株）製〕、フェリ
チン〔馬脾臓由来、和光純薬工業（株）製〕及び牛ヘモ
グロビン（牛由来、ＳＩＧＭＡ社製）から選ばれた鉄タ
ンパク質を所定濃度、ＢＳＡを0.1％（W/V）、アジ化ナ
トリウムを0.3％（W/V）及び塩化ナトリウムを200mMと
なるように溶解したものを被検液調製用溶液とした。 （３）被検液の調製 （２）で調製した各被検液調製用溶液に、ヒトヘモグロ
ビン（ＳＩＧＭＡ社製）を0.1μg/ml、健常人の糞便を
５mg/mlとなるように溶解（又は懸濁）し、所定温度で
所定期間保存したものの上清を被検液とした。 （４）測定方法 被検液として上記（３）で調製したものを用いた以外
は、実施例．１の（４）と同じ試薬を用い同様の操作法
により測定を行った。結果を表２、表３及び表４に夫々
示す。尚、測定結果は、被検液調製直後に測定して得ら
れたヒトヘモグロビン濃度を100％とした場合の相対値
（抗原性残存率）として示してある。

【００３２】

【表２】

【００３３】

【表３】

【００３４】

【表４】

【００３５】（結果）表２、３及び４の結果から以下の
ことが判る。 安定化剤として鉄タンパク質のみを使用した場合。 比較的低温（11℃）で保存した場合には、何れの鉄タン
パク質を用いても、ヒトヘモグロビンに対する安定化効
果は認められるが、比較的高温（25℃及び35℃）で保存
した場合には、トランスフェリンやフェリチンの方が牛
ヘモグロビンよりもヒトヘモグロビンの安定化効果が高
められることが判る。 フェリシアンイオンの共存による効果。 比較的低温（11℃）で保存した場合、安定化剤が鉄タン
パク質のみであっても、鉄タンパク質とフェリシアンイ
オンとの併用であっても、ヒトヘモグロビンの安定化効
果は認められる。しかしながら、比較的高温（25℃及び
35℃）で保存した場合には、安定化剤として、鉄タンパ
ク質とフェリシアンイオンとを併用した方が、ヒトヘモ
グロビンの安定化効果が高くなることが判る。尚、安定
化剤として鉄タンパク質とフェリシアンイオンとを併用
した場合、比較的低温（11℃）で保存した場合には、鉄
タンパク質の種類によるヒトヘモグロビンの安定化効果
の差はそれ程大きくないが、比較的高温（25℃及び35
℃）で保存した場合には、鉄タンパク質として、トラン
スフェリンやフェリチンを用いた方が牛ヘモグロビンを
用いるよりもヒトヘモグロビンの安定化効果が高められ
ることが判る。

【００３６】実施例．３ （１）抗ヒトヘモグロビン抗体感作ラテックス試液 実施例．１の（１）と同じ。 （２）被検液調製用溶液の調製 8.2mMトリス−クエン酸緩衝液（pH7.4）に、牛由来ヘモ
グロビン（牛由来、ＳＩＧＭＡ社製）、羊由来ヘモグロ
ビン（羊由来、ＳＩＧＭＡ社製）、山羊由来ヘモグロビ
ン（山羊由来、ＳＩＧＭＡ社製）、ヘミン〔和光純薬工
業（株）製〕から選ばれたものを所定濃度、フェリシア
ン化カリウムを0.61mM、ＢＳＡを0.1％（W/V）、アジ化
ナトリウムを0.3％（W/V）及び塩化ナトリウムを200mM
となるように溶解したものと、8.2mMトリス−クエン酸
緩衝液（pH7.4）に、牛由来ヘモグロビン（牛由来、Ｓ
ＩＧＭＡ社製）、羊由来ヘモグロビン（羊由来、ＳＩＧ
ＭＡ社製）、山羊由来ヘモグロビン（山羊由来、ＳＩＧ
ＭＡ社製）から選ばれたものを所定濃度、ＢＳＡを0.1
％（W/V）、アジ化ナトリウムを0.3％（W/V）及び塩化
ナトリウムを200mMとなるように溶解したものを被検液
調製用溶液とした。尚、ヘミンを溶解する際にはＮａＯ
Ｈを使用したため、ヘミンは糞便溶解用溶液中ではアル
カリ性ヘマチンとして存在している。 （３）被検液の調製 （２）で調製した各被検液調製用溶液に、ヒトヘモグロ
ビン（ＳＩＧＭＡ社製）を0.05μg/ml、健常人の糞便を
５mg/mlとなるように溶解（又は懸濁）し、35℃で所定
期間保存したものの上清を被検液とした。 （４）測定方法 被検液として上記（３）で調製したものを用いた以外
は、実施例．１の（４）と同じ試薬を用い同様の操作に
より測定を行った。結果を表５に示す。尚、測定結果
は、被検液調製直後に測定して得られたヒトヘモグロビ
ン濃度を100％とした場合の相対値（抗原性残存率）と
して示してある。

【００３７】

【表５】

【００３８】（結果）表５の結果から、安定化剤として
各種動物由来のヘモグロビンのみを用いるよりも、フェ
リシアンイオンと各種動物由来のヘモグロビンとを併用
して用いる方がヒトヘモグロビンの安定化効果が高いこ
と、また、併用の場合には、その由来に関係なくヒトヘ
モグロビンの安定化効果が認められること、更に、ヘモ
グロビンの構成成分であるヘミン（ヘマチン）をフェリ
シアンイオンと併用した場合には、ヒトヘモグロビンの
安定化効果は殆ど認められないことが判る。

【００３９】

【発明の効果】本発明は、溶液中のヒトヘモグロビンの
安定化方法を提供するものであり、本発明によれば、ヒ
トヘモグロビンの溶液中での変性、特にヒトヘモグロビ
ンを低濃度溶液として保存した場合や、ヒトヘモグロビ
ンを含有する溶液を高温下に放置した場合に於ける変性
による抗原性の低下を防止或は抑制できるという効果、
更には、該安定化方法により安定化されたヒトヘモグロ
ビン含有液を、被検液として用いれば、抗ヒトヘモグロ
ビン抗体を用いた免疫学的測定法に於て、ヒトヘモグロ
ビンを高感度且つ高精度に測定できるという効果をも奏
するものであり、斯業に貢献するところ大なる発明であ
る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 33/72 Ｇ０１Ｎ 33/72 Ａ

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 トランスフェリン又は／及びフェリチン
   をヒトヘモグロビンを含有する溶液中に10μg／ml以上
   共存させることを特徴とする、ヒトヘモグロビンの安定
   化方法。
2. 【請求項２】 ヒトヘモグロビンと特異的に反応する抗
   ヒトヘモグロビン抗体を用いるヒトヘモグロビンの免疫
   学的測定方法に於いて、トランスフェリン又は／及びフ
   ェリチンを含有する溶液と、ヒトヘモグロビンを含有す
   る試料とから調製された溶液であって、トランスフェリ
   ン又は／及びフェリチンを10μg／ml以上含有する溶液
   を被検液として用いることを特徴とする、ヒトヘモグロ
   ビンの測定方法。
3. 【請求項３】 試料が糞便である、請求項２に記載のヒ
   トヘモグロビンの測定方法。
4. 【請求項４】 トランスフェリン又は／及びフェリチン
   を含有することを特徴とする、ヒトヘモグロビン測定用
   被検液調製用溶液。
5. 【請求項５】 ヒトヘモグロビン以外の鉄タンパク質10
   μg／ml以上とフェリシアンイオンとをヒトヘモグロビ
   ンを含有する溶液中に共存させることを特徴とする、ヒ
   トヘモグロビンの安定化方法。
6. 【請求項６】 鉄タンパク質がトランスフェリン、フェ
   リチン及びヒト以外の動物ヘモグロビンからなる群より
   選ばれた少なくとも１つである、請求項５に記載のヒト
   ヘモグロビンの安定化方法。
7. 【請求項７】 ヒトヘモグロビンと特異的に反応する抗
   ヒトヘモグロビン抗体を用いるヒトヘモグロビンの免疫
   学的測定方法に於いて、ヒトヘモグロビン以外の鉄タン
   パク質とフェリシアンイオンとを含有する溶液と、ヒト
   ヘモグロビンを含有する試料とから調製された溶液であ
   って、ヒトヘモグロビン以外の鉄タンパク質を10μg／m
   l以上含有する溶液を被検液として用いることを特徴と
   する、ヒトヘモグロビンの測定方法。
8. 【請求項８】 試料が糞便である、請求項７に記載のヒ
   トヘモグロビンの測定方法。
9. 【請求項９】 鉄タンパク質がトランスフェリン、フェ
   リチン及びヒト以外の動物ヘモグロビンからなる群より
   選ばれた少なくとも１つである、請求項７又は８に記載
   のヒトヘモグロビンの測定方法。
10. 【請求項１０】 ヒトヘモグロビン以外の鉄タンパク質
    とフェリシアンイオンを含有することを特徴とする、ヒ
    トヘモグロビン測定用被検液調製用溶液。
11. 【請求項１１】 鉄タンパク質がトランスフェリン、フ
    ェリチン及びヒト以外の動物ヘモグロビンからなる群よ
    り選ばれた少なくとも１つである、請求項１０に記載の
    ヒトヘモグロビン測定用被検液調製用溶液。