JP2902095B2 - ヒトヘモグロビンを含有する被検液の保存方法及びそれに用いる便溶解用緩衝液 - Google Patents
ヒトヘモグロビンを含有する被検液の保存方法及びそれに用いる便溶解用緩衝液Info
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Description
【発明の詳細な説明】 ＜産業上の利用分野＞ 本発明はヒトヘモグロビンを含有する被検液の保存方
法に関し、特に、糞便を含有する被検液中に存在するヒ
トヘモグロビンを安定的に保存する方法、およびそれに
用いる便溶解用緩衝液に関する。
法に関し、特に、糞便を含有する被検液中に存在するヒ
トヘモグロビンを安定的に保存する方法、およびそれに
用いる便溶解用緩衝液に関する。
＜従来の技術＞ 近年、大腸癌などの下部消化器の疾患を検査する方法
として、消化器管からの出血に起因する糞便中の潜血成
分、特にヒトヘモグロビンの検出が主に行われている。
として、消化器管からの出血に起因する糞便中の潜血成
分、特にヒトヘモグロビンの検出が主に行われている。
中でも、食品摂取や薬剤投与の制限を必要としない、
抗ヒトヘモグロビン抗体を用いた免疫学的な検出方法が
提案されている。
抗ヒトヘモグロビン抗体を用いた免疫学的な検出方法が
提案されている。
このような検出方法には例えば、寒天板内での抗ヒト
ヘモグロビン抗体と、被検液中のヒトヘモグロビンとの
沈降線を利用してヘモグロビンを検出する一次元免疫拡
散法や、動物血球に抗ヒトヘモグロビン抗体を感作した
ものと、被検液とを混合して生じる沈降現象像を利用し
て検出する逆受身血球凝集法、高分子ラテックス粒子に
抗ヒトヘモグロビン抗体を感作したものと、被検液を混
合して生じる凝集像を利用して検出するラテックス凝集
法、酵素や放射性同位元素で標識した抗ヒトヘモグロビ
ン抗体を利用する酵素免疫法などがある。
ヘモグロビン抗体と、被検液中のヒトヘモグロビンとの
沈降線を利用してヘモグロビンを検出する一次元免疫拡
散法や、動物血球に抗ヒトヘモグロビン抗体を感作した
ものと、被検液とを混合して生じる沈降現象像を利用し
て検出する逆受身血球凝集法、高分子ラテックス粒子に
抗ヒトヘモグロビン抗体を感作したものと、被検液を混
合して生じる凝集像を利用して検出するラテックス凝集
法、酵素や放射性同位元素で標識した抗ヒトヘモグロビ
ン抗体を利用する酵素免疫法などがある。
上記検出法においては被検物質であるヒトヘモグロビ
ンは通常、溶解液状で検査に供され、例えば便潜血検査
では糞便を生理食塩水や緩衝液中に溶解する事により、
糞便中のヒトヘモグロビンを溶解液状態にして被検液と
して用いられている。
ンは通常、溶解液状で検査に供され、例えば便潜血検査
では糞便を生理食塩水や緩衝液中に溶解する事により、
糞便中のヒトヘモグロビンを溶解液状態にして被検液と
して用いられている。
ヒトヘモグロビンの構造は、例えば、ヘモグロビンＡ
ではアミノ酸141個からなるα鎖とアミノ酸146個からな
るβ鎖と呼ばれるポリペプチドが、それぞれ２個から形
成してなる四量体であり、これらが立体構造で配置され
ている。このような構造のヒトヘモグロビンは糞便溶解
液中で徐々に変性するために、従来から用いられている
免疫学的方法では検出感度が著しく低下するものであ
る。特に、被検液中に糞便濃度が高い場合には上記ヒト
ヘモグロビンの変性が著しく、診断上、意義のある低濃
度領域での検出が困難となる。
ではアミノ酸141個からなるα鎖とアミノ酸146個からな
るβ鎖と呼ばれるポリペプチドが、それぞれ２個から形
成してなる四量体であり、これらが立体構造で配置され
ている。このような構造のヒトヘモグロビンは糞便溶解
液中で徐々に変性するために、従来から用いられている
免疫学的方法では検出感度が著しく低下するものであ
る。特に、被検液中に糞便濃度が高い場合には上記ヒト
ヘモグロビンの変性が著しく、診断上、意義のある低濃
度領域での検出が困難となる。
一方、便潜血検査では検査員の手間や不快感を少なく
するために、被検者自身が自宅などで糞便中に含まれる
ヒトヘモグロビンを溶解液状態にする場合があり、この
ような場合は溶解液状態で数日間放置されることが多
い。また、検査員がヒトヘモグロビンを溶解液状態にし
た場合でも、作業の都合上、検査までに数時間放置され
る場合もあり、このような放置状態では前述のようにヒ
トヘモグロビンの変性が起こってしまい好ましくない。
するために、被検者自身が自宅などで糞便中に含まれる
ヒトヘモグロビンを溶解液状態にする場合があり、この
ような場合は溶解液状態で数日間放置されることが多
い。また、検査員がヒトヘモグロビンを溶解液状態にし
た場合でも、作業の都合上、検査までに数時間放置され
る場合もあり、このような放置状態では前述のようにヒ
トヘモグロビンの変性が起こってしまい好ましくない。
また、酵素免疫法のような検出方法を採用した場合、
高温度下で数分間上記溶解液をインキュベートすること
があり、やはりヒトヘモグロビンの変性によって正確な
検出が困難となる。このようなヒトヘモグロビンの変性
を防止する目的で、例えばウシ血清アルブミンや糖類な
どを添加することが行われているが、充分に効果を発揮
できるものとはいえないのが実情である。
高温度下で数分間上記溶解液をインキュベートすること
があり、やはりヒトヘモグロビンの変性によって正確な
検出が困難となる。このようなヒトヘモグロビンの変性
を防止する目的で、例えばウシ血清アルブミンや糖類な
どを添加することが行われているが、充分に効果を発揮
できるものとはいえないのが実情である。
＜発明が解決しようとする課題＞ 本発明は上記従来の技術の欠点を解決するためになさ
れたものであって、その目的とするところは糞便を含有
する被検液中に存在するヒトヘモグロビンの放置下での
変性を防止する方法、およびこれに用いる便溶解用緩衝
液を提供することにある。
れたものであって、その目的とするところは糞便を含有
する被検液中に存在するヒトヘモグロビンの放置下での
変性を防止する方法、およびこれに用いる便溶解用緩衝
液を提供することにある。
＜課題を解決するための手段＞ 即ち、本発明は、抗ヒトヘモグロビン抗体を用いたヒ
トヘモグロビンの検出における被検液の保存方法であっ
て、糞便を含有する被検液中に人以外の動物血清を添加
することを特徴とするヒトヘモグロビンを含有する被検
液の保存方法、及びこれに用いる便溶解用緩衝液に関す
る。
トヘモグロビンの検出における被検液の保存方法であっ
て、糞便を含有する被検液中に人以外の動物血清を添加
することを特徴とするヒトヘモグロビンを含有する被検
液の保存方法、及びこれに用いる便溶解用緩衝液に関す
る。
本発明の方法において被検体としてのヒトヘモグロビ
ンもしくはヒトヘモグロビンを含有する糞便を溶解する
ための液としては、例えばりん酸緩衝液、グリシン緩衝
液、トリス−塩酸緩衝液、ほう酸緩衝液などがベース液
として用いられる。緩衝液のpHは６〜９、好ましくは6.
5〜8.5の範囲とする。緩衝液中には生理食塩濃度近傍の
食塩を添加することが好ましい。また、細菌などによる
ヒトヘモグロビンの変性を抑制するために、0.05〜0.5
重量％濃度のアジ化ナトリウムなどの抗菌剤を添加する
ことが好ましい。
ンもしくはヒトヘモグロビンを含有する糞便を溶解する
ための液としては、例えばりん酸緩衝液、グリシン緩衝
液、トリス−塩酸緩衝液、ほう酸緩衝液などがベース液
として用いられる。緩衝液のpHは６〜９、好ましくは6.
5〜8.5の範囲とする。緩衝液中には生理食塩濃度近傍の
食塩を添加することが好ましい。また、細菌などによる
ヒトヘモグロビンの変性を抑制するために、0.05〜0.5
重量％濃度のアジ化ナトリウムなどの抗菌剤を添加する
ことが好ましい。
本発明の方法においては、上記緩衝液中にヒト以外の
動物血清を添加し、ヒトヘモグロビンの変性を抑制す
る。添加するヒト以外の動物種としては、例えばウサ
ギ、ヤギ、ウマ、ウシ（ウシ胎児）、ブタ、マウスなど
が挙げられる。これらのうちヒトヘモグロビンとアミノ
酸配列が非常に類似したサルやヒヒなどの血清を用いる
と、検出時に抗ヒトヘモグロビン抗体と結合してしま
う、所謂交差反応を起こすことがあるので、このような
ときはこれらの動物血清を用いないほうがよい。
動物血清を添加し、ヒトヘモグロビンの変性を抑制す
る。添加するヒト以外の動物種としては、例えばウサ
ギ、ヤギ、ウマ、ウシ（ウシ胎児）、ブタ、マウスなど
が挙げられる。これらのうちヒトヘモグロビンとアミノ
酸配列が非常に類似したサルやヒヒなどの血清を用いる
と、検出時に抗ヒトヘモグロビン抗体と結合してしま
う、所謂交差反応を起こすことがあるので、このような
ときはこれらの動物血清を用いないほうがよい。
ヒト以外の動物血清の添加量は被検液中の糞便の濃度
によって適宜設定するが、糞便濃度4mg/mlの場合、0.01
体積％以上、好ましくは0.1〜40体積％の濃度となるよ
うに添加する。添加量が少なすぎるとヒトヘモグロビン
の変性を抑制する作用が充分でなくなり好ましくなく、
また多すぎると増量効果が認められず不経済である。
によって適宜設定するが、糞便濃度4mg/mlの場合、0.01
体積％以上、好ましくは0.1〜40体積％の濃度となるよ
うに添加する。添加量が少なすぎるとヒトヘモグロビン
の変性を抑制する作用が充分でなくなり好ましくなく、
また多すぎると増量効果が認められず不経済である。
本発明の方法では上記のようにしてヒト以外の動物血
清を添加した緩衝液中に、被検物質であるヒトヘモグロ
ビンもしくはヒトヘモグロビンを含有する糞便を溶解し
て被検液とする。具体的には、便潜血検査の場合、被験
者の糞便の一定量をヒト以外の動物血清を含有する一定
量の緩衝液中に溶解することにより調製すことができ
る。
清を添加した緩衝液中に、被検物質であるヒトヘモグロ
ビンもしくはヒトヘモグロビンを含有する糞便を溶解し
て被検液とする。具体的には、便潜血検査の場合、被験
者の糞便の一定量をヒト以外の動物血清を含有する一定
量の緩衝液中に溶解することにより調製すことができ
る。
本発明の方法によって保持された被検液を用いて、ヒ
トヘモグロビンを検出するには、従来から知られている
抗ヒトヘモグロビン抗体を用いた免疫学的検出方法が採
用できる。
トヘモグロビンを検出するには、従来から知られている
抗ヒトヘモグロビン抗体を用いた免疫学的検出方法が採
用できる。
以下にラテックス凝集法を利用した検出方法について
例示する。
例示する。
精製したヘモグロビンＡを抗原としてウサギ、ヤギな
どの動物に免疫したのち、血清、精製をして抗ヒトヘモ
グロビン抗体を得る。この抗体を中性pHでポリスチレン
ラテックス（粒径0.3μｍ）と混合して数時間吸着反応
させたのち、ウシ血清アルブミンおよび食塩を含む緩衝
液などで遠心分離精製を行い、抗ヒトヘモグロビン抗体
感作ラテックス試薬を得る。
どの動物に免疫したのち、血清、精製をして抗ヒトヘモ
グロビン抗体を得る。この抗体を中性pHでポリスチレン
ラテックス（粒径0.3μｍ）と混合して数時間吸着反応
させたのち、ウシ血清アルブミンおよび食塩を含む緩衝
液などで遠心分離精製を行い、抗ヒトヘモグロビン抗体
感作ラテックス試薬を得る。
次に、このラテックス試薬と被検液とをガラス板上で
撹拌混合し、数分後のラテックスの凝集像によって、ヒ
トヘモグロビンを定性的に検出することができる。
撹拌混合し、数分後のラテックスの凝集像によって、ヒ
トヘモグロビンを定性的に検出することができる。
また、酵素免疫法の場合には、抗ヒトヘモグロビン抗
体を感作したマイクロプレートのウエルに被検液を入
れ、洗浄した後、ペルオキシダーゼやアルカリフォスフ
ァターゼで標識した抗体を添加し、洗浄して基質溶液を
添加する。
体を感作したマイクロプレートのウエルに被検液を入
れ、洗浄した後、ペルオキシダーゼやアルカリフォスフ
ァターゼで標識した抗体を添加し、洗浄して基質溶液を
添加する。
＜発明の効果＞ 以上のように本発明の方法によれば、ヒト以外の動物
血清を添加しているので、被検液中のヒトヘモグロビン
が糞便中の酵素・細菌などによって変性することを制御
できるので、被検液を長時間放置する場合でも高感度に
ヒトヘモグロビンを検出することができるものである。
血清を添加しているので、被検液中のヒトヘモグロビン
が糞便中の酵素・細菌などによって変性することを制御
できるので、被検液を長時間放置する場合でも高感度に
ヒトヘモグロビンを検出することができるものである。
＜実施例＞ 以下に本発明の実施例を示し、さらに具体的に説明す
る。
る。
実施例１ 0.2mol/−グリシン、0.1％BSA、0.1％アジ化ナトリ
ウム、0.9％塩化ナトリウムからなる水溶液を作製し、1
N−水酸化ナトリウム水溶液にてpH8.0に調製し、この溶
液にヒト以外の動物血清としてウシ胎児血清を濃度を変
えて溶解した。
ウム、0.9％塩化ナトリウムからなる水溶液を作製し、1
N−水酸化ナトリウム水溶液にてpH8.0に調製し、この溶
液にヒト以外の動物血清としてウシ胎児血清を濃度を変
えて溶解した。
次に、５％カルボキシル化ポリスチレン10mlに、1mg/
mlの１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）
カルボジイミド10mlを加え、20分間撹拌しながら反応さ
せた後、0.01mol/1−ほう酸緩衝液（pH8.0）で２回遠心
分離精製した。
mlの１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）
カルボジイミド10mlを加え、20分間撹拌しながら反応さ
せた後、0.01mol/1−ほう酸緩衝液（pH8.0）で２回遠心
分離精製した。
このラテックス（濃度５％）10mlに、精製ヒトヘモグ
ロビンをウサギに免疫して作製した抗ヒトヘモグロビン
抗体（ウサギ1gG、濃度5mg/ml）7mlを添加し、５時間ゆ
っくりと撹拌しながら反応させ、さらに0.1％−ウシ血
清アルブミンを含む0.01mol−ほう酸緩衝液（pH8.0）で
３回遠心分離精製し、ラテックス濃度１％の抗ヒトヘモ
グロビン抗体感作ラテックス試薬を得た。
ロビンをウサギに免疫して作製した抗ヒトヘモグロビン
抗体（ウサギ1gG、濃度5mg/ml）7mlを添加し、５時間ゆ
っくりと撹拌しながら反応させ、さらに0.1％−ウシ血
清アルブミンを含む0.01mol−ほう酸緩衝液（pH8.0）で
３回遠心分離精製し、ラテックス濃度１％の抗ヒトヘモ
グロビン抗体感作ラテックス試薬を得た。
次に、前記にて調製したウシ胎児血清溶解溶液中にヒ
トヘモグロビン濃度を変えて溶解し、さらに健常人便を
4mg/ml濃度で溶解し、この溶液80μと前記ラテックス
試薬20μとをウエル内で混合、撹拌して、10分後の凝
集像を肉眼にて観察した。その結果を第１表に示す。
トヘモグロビン濃度を変えて溶解し、さらに健常人便を
4mg/ml濃度で溶解し、この溶液80μと前記ラテックス
試薬20μとをウエル内で混合、撹拌して、10分後の凝
集像を肉眼にて観察した。その結果を第１表に示す。
第１表から明らかなように、高感度でヒトヘモグロビ
ンを検出できることが判明した。
ンを検出できることが判明した。
次に、前記ヒトヘモグロビン溶解液を25℃で６日間放
置した後、再び前記ラテックス試薬と混合して、凝集像
を観察した。その結果を第２表に示す。
置した後、再び前記ラテックス試薬と混合して、凝集像
を観察した。その結果を第２表に示す。
比較例 ウシ胎児血清を添加しなかった以外は実施例１と同様
にしてラテックス凝集反応を行い凝集像を観察した。そ
の結果を第１表および第２表に併記した。
にしてラテックス凝集反応を行い凝集像を観察した。そ
の結果を第１表および第２表に併記した。
＋＋：非常に強い凝集がみられた ＋：強い凝集がみられた ±：弱い凝集がみられた −：凝集がみられない
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭59−125024（ＪＰ，Ａ) 特開 昭59−60262（ＪＰ，Ａ) 特表 昭63−500401（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) G01N 33/53 ＢＩＯＳＩＳ
Claims (2)
- 【請求項１】抗ヒトヘモグロビン抗体を用いたヒトヘモ
グロビンの検出における被検液の保存方法であって、糞
便を含有する被検液中に人以外の動物血清を添加するこ
とを特徴とするヒトヘモグロビンを含有する被検液の保
存方法。 - 【請求項２】請求項（１）記載の被検液の保存方法に用
いる緩衝液であって、ヒト以外の動物形成を含有するこ
とを特徴とする便溶解用緩衝液。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP27134790A JP2902095B2 (ja) | 1990-10-08 | 1990-10-08 | ヒトヘモグロビンを含有する被検液の保存方法及びそれに用いる便溶解用緩衝液 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP27134790A JP2902095B2 (ja) | 1990-10-08 | 1990-10-08 | ヒトヘモグロビンを含有する被検液の保存方法及びそれに用いる便溶解用緩衝液 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04145366A JPH04145366A (ja) | 1992-05-19 |
| JP2902095B2 true JP2902095B2 (ja) | 1999-06-07 |
Family
ID=17498798
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP27134790A Expired - Lifetime JP2902095B2 (ja) | 1990-10-08 | 1990-10-08 | ヒトヘモグロビンを含有する被検液の保存方法及びそれに用いる便溶解用緩衝液 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2902095B2 (ja) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP5422108B2 (ja) | 2007-10-16 | 2014-02-19 | 栄研化学株式会社 | ヘムタンパク質の安定化方法及び保存溶液 |
| CN107615069B (zh) | 2015-03-31 | 2021-04-20 | 荣研化学株式会社 | 血红素蛋白保存液和血红素蛋白稳定化方法 |
| JP7325334B2 (ja) | 2017-12-01 | 2023-08-14 | 栄研化学株式会社 | ヘモグロビンとハプトグロビンとの複合体を安定化する方法、及びヘモグロビンを含む検体を保存するための保存溶液 |
-
1990
- 1990-10-08 JP JP27134790A patent/JP2902095B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH04145366A (ja) | 1992-05-19 |
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