JPH05322888A - 遊離ヘモグロビンの定量方法および遊離ヘモグロビン定量キット - Google Patents

遊離ヘモグロビンの定量方法および遊離ヘモグロビン定量キット

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JPH05322888A
JPH05322888A JP12464092A JP12464092A JPH05322888A JP H05322888 A JPH05322888 A JP H05322888A JP 12464092 A JP12464092 A JP 12464092A JP 12464092 A JP12464092 A JP 12464092A JP H05322888 A JPH05322888 A JP H05322888A
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JP
Japan
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hemoglobin
haptoglobin
free
free hemoglobin
complex
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Pending
Application number
JP12464092A
Other languages
English (en)
Inventor
Masahiro Seko
政弘 世古
Kazunori Inamori
和紀 稲森
Hideyuki Yokota
英之 横田
Masakazu Tanaka
昌和 田中
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Toyobo Co Ltd
Original Assignee
Toyobo Co Ltd
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Publication date
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Abstract

(57)【要約】 【目的】 遊離ヘモグロビンの迅速定量を可能にする遠
心分離法により使用するヘモグロビン−ハプトグロビン
複合体吸着装置を提供する 【構成】ポリスチレン、ポリメタクリル酸およびその誘
導体或いはこれらの共重合体などの合成有機高分子化合
物等の改質天然有機高分子化合物または、多孔質ガラス
に、遊離ハプトグロビンを固定し、この遊離ハプトグロ
ビンによって検体中のヘモグロビン−ハプトグロビン複
合体を除去または捕集して、後遊離ヘモグロビンを定量
する。

Description

【発明の詳細な説明】
【0001】
【産業上の利用分野】本発明は、不溶性担体に抗ヘモグ
ロビン−ハプトグロビン複合体抗体を固定化し、当該担
体により、検体中のヘモグロビン−ハプトグロビン複合
体を除去または捕集した後、検体中の残余の遊離ヘモグ
ロビンを定量することを特徴とする遊離ヘモグロビンの
定量方法およびその定量キットに関する。
【0002】
【従来の技術】人工腎臓、人工心肺等の血液体外循環療
法施行時の副作用として機械的溶血が起こる。また、再
生不良性貧血等の疾病により、血液中に多量の遊離ヘモ
グロビンが生ずる場合がある。軽度の溶血の場合には、
遊離ヘモグロビンは血液中の遊離ハプトグロビンと結合
し、ヘモグロビン−ハプトグロビン複合体を形成する。
当該複合体は、引き続き、網内系で処理される。血液中
に存在する遊離ハプトグロビンの結合能力以上の溶血が
あった場合には、遊離ヘモグロビンは毒性物質として作
用し、腎障害、腎不全等を引き起こす。従って、大量溶
血時に、遊離ヘモグロビンを迅速に定量し、早期に適切
な処置をすることは、極めて重要なことである。
【0003】遊離ヘモグロビンの吸着方法として従来か
ら知られている方法は、特公昭55−4417号公報お
よび、特公昭56−51780号公報に開示されてい
る。これらの方法は、何れも体外循環に関するもので、
血液中の遊離ヘモグロビンを体外循環により吸着除去す
る目的で利用されるもので、定量に利用されるものでは
ない。
【0004】また、遊離ヘモグロビンの定量方法は、特
公平3−272698号公報に開示されている。当該方
法は、遊離ハプトグロビン固定化担体に遊離ヘモグロビ
ンを結合させ、結合させたヘモグロビンに標識抗体を結
合させ、発色定量する方法である。当該方法は、標識抗
体を使用する為、測定費用が割高で、測定に時間がかか
るという難点がある。
【0005】更に、遊離ヘモグロビン値の算出方法に
は、簡易分別定量法が知られている。当該方法は、総ハ
プトグロビン値と総ヘモグロビン値から遊離ヘモグロビ
ン値を算出する方法であるが、ハプトグロビンには、3
種類の型(1−1型、1−2型、2−1型)が存在する
為、正確で迅速な定量が困難を極めるという難点があっ
た。
【0006】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、上記
従来技術の欠点を克服することにある。即ち、本発明
は、抗ヘモグロビン−ハプトグロビン複合体抗体固定化
担体を用いて、検体中のヘモグロビン−ハプトグロビン
複合体を吸着除去し、遊離ヘモグロビンを分画定量する
方法に関するものである。
【0007】
【課題を解決するための手段】本発明にかかわる遊離ヘ
モグロビン分画装置は、抗ヘモグロビン−ハプトグロビ
ン複合体抗体を固定した不溶性担体をカラムに充填し、
更にそのカラムを遠沈管に挿入したもので、検体を添加
した後、遠心分離することにより、遊離ヘモグロビンを
迅速に分画、定量することを特徴とするものである。
【0008】本発明に関わるヘモグロビン−ハプトグロ
ビン複合体の吸着に供する不溶性担体は、架橋ポリスチ
レン、ポリビニルアルコール、ポリメタクリル酸等の合
成有機高分子化合物、セルロース、キチン、キトサン等
の天然有機高分子化合物、アシルセルロース、アシルキ
チン等の改質天然有機高分子化合物が考えられる。ま
た、当該担体は、スペーサーを保有することも可能であ
る。更に、当該不溶性担体の型状は、粒子状、繊維状、
膜状等、何れの公知の形状も用いられ得る。また、担体
表面には、有効表面積を拡大する為、微小孔が存在する
ことが好ましい。上記の担体に、リガンドである抗ヘモ
グロビン−ハプトグロビン複合体抗体を導入する。
【0009】ヒトハプトグロビンは主に肝実質細胞で生
合成されるほか、網内系組織、脾臓、リンパ節、胞腺で
も生合成される。ヒトハプトグロビンは 1-1型、1-2
型、2-1 型に区別される。ヒトハプトグロビンは免疫グ
ロブリンと同様に、2本のH鎖(β鎖)と2本のL鎖
(α鎖)からなる。ヒトハプトグロビンの型は、α鎖の
一次構造の違いによるもので、α1 (α1 はα1Fとα1S
の2種類がある)とα2 の3種類があり、α鎖は、優劣
のない対立遺伝子HP1F 、HP1S およびHP2によって決
定されている。β鎖はヒトハプトグロビンの各型に共通
している。分子組成は 1-1型は(α1 β)2 : 分子量約
80,000 、2-1 型は(α1 β)2 と(α2 β)n : 分子
量約 200,000の混合した組成を持つものと考えられてい
る。また、2-2 型は種々の程度に重合したポリマーから
なっており、分子組成は(α2 β)n:分子量約400,000
で表される。ヒトハプトグロビンの主要な生理的機能
は、ヘモグロビンと特異的に結合して安定なハプトグロ
ビン・ヘモグロビン複合体を形成することである。この
複合体は、抗原抗体複合体と異なり、pHの低下によっ
ても容易に解離しない。ヒトハプトグロビン 1-1型1分
子はヘモグロビン1分子と結合する。2-1 型、2-2 型に
ついては不明のままである。ヒトハプトグロビンはテト
ラマーであるヘモグロビンと直接結合するのではなく、
テトラマーから解離したαβダイマーと結合する。従っ
て、ヒトハプトグロビン 1-1型は2価として働き、2つ
のαβダイマーと結合する。
【0010】抗ヘモグロビン−ハプトグロビン複合体抗
体は以下の様にして調製される。即ち、常法により調製
された遊離ヘモグロビンと市販のハプトグロビン製剤を
等モル混合し(遊離ヘモグロビンをやや過剰に混合す
る)、遊離ハプトグロビン固定化担体を充填したカラム
を通過させた後、常法により哺乳類、或いは、鳥類に免
疫することにより、哺乳類では血液中に、鳥類では、卵
黄中に産生させることが可能である。産生された抗体を
常法に従い分画精製し、上記担体に直接、間接にリガン
ドとして固定する。遊離ハプトグロビンの固定化方法
は、共有結合、物理的吸着、イオン結合、生化学的特異
結合等、特に制限されないが、血液中での結合安定性を
考慮すると、共有結合が好ましい。
【0011】
【実施例】以下、実施例を用いて本発明を説明する。 〈実施例1〉 <遊離ヘモグロビンの定量>抗ヘモグロビン−ハプトグ
ロビン複合体抗体固定化担体1mlを容量3mlのカラ
ムに充填し、更に、当該カラムを遠沈管に挿入し、当該
遠沈管を3,000rpmで5分間、遠心分離し、担体
から水分を分離した。当該カラムを別の遠沈管に入れ換
えた後、被検検体0.5mlを添加し、3,000rp
mで5分間、遠心分離し、検体から遊離ヘモグロビンを
分画した。分画した遊離ヘモグロビンをテトラメチルベ
ンジジン法により定量した。
【0012】〈実施例2〉 <抗ヘモグロビン−ハプトグロビン複合体抗体の調製と
固定化>少量の市販ハプトグロビン製剤と、当該ハプト
グロビン製剤が結合し得る量よりやや過剰の遊離ヘモグ
ロビン溶液を等量混合し、37℃で1時間インキュベー
トした。当該反応液を遊離ハプトグロビン固定化学セフ
ァロースを充填したカラムにアプライし、室温で1時間
インキュベートした後、pH7.0のリン酸緩衝液でカ
ラムを洗浄した。流下液の蛋白濃度を1mg /ml
に調製した。この操作で調製したヘモグロビン−ハプト
グロビン複合体をウサギ2羽に注射免疫(0.1mg
(1日目)、0.2mg(4日目)、0.3mg(7日
目)、0.5mg (11日目))し、15日目に試
験採血した。抗体価が640倍以上の場合には、16日
目に全採血を行い、抗血清を得た。抗血清の硫安塩析、
Blue−Sepharose、 Prote
inGSepharose処理し、精製抗ヘモグロビン
−ハプトグロビン複合体抗体を得た。当該精製抗体を常
法に従い、CNBr活性化Sepharoseに固定化
した。
【0013】〈実施例3〉 <抗ヘモグロビン−ハプトグロビン複合体抗体固定化担
体充填カラムを用いた遊離ヘモグロビンの通過試験>抗
ヘモグロビン−ハプトグロビン複合体抗体固定化セファ
ロース1mlを容量3mlのカラムに充填し、更にその
カラムを遠沈管に挿入した。当該遠沈管を3,000r
pmで5分間遠心分離し、セファロースの含有する緩衝
液を分離した。当該カラムを別の遠沈管に移し、遊離ヘ
モグロビン溶液(1mg/ml)0.5mlを添加し、
3,000rpmで5分間遠心分離し、流下液を得、当
該溶液のヘモグロビン濃度を定量した。抗ヘモグロビン
-ハプトグロビン複合体抗体固定化セファロースの充填
量、および遊離ヘモグロビンの添加量を変えて同様の操
作を行い、結果を表1に示した。表1に示した様に、溶
液の回収量および遊離ヘモグロビンの回収量は共に、1
00%近い値となった。
【0014】
【表1】
【0015】以上の結果から明かなように、本発明のヘ
モグロビン−ハプトグロビン複合体吸着材は血中のヘモ
グロビン−ハプトグロビン複合体を選択的かつ簡便に除
去でき、遊離ヘモグロビンを迅速に分画、定量できるこ
とがわかった。
【0016】
【発明の効果】本発明のヘモグロビン−ハプトグロビン
複合体吸着材は、遠心分離法により使用する為、ヘモグ
ロビン−ハプトグロビン複合体を迅速に分画でき、総ハ
プトグロビンの定量を行うことなく、遊離ヘモグロビン
値の迅速な定量を可能にする。本方法は、体外循環時の
機械的溶血や、再生不良性貧血患者の溶血によって生ず
る遊離ヘモグロビンの迅速定量に広く利用され得る。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 田中 昌和 滋賀県大津市堅田二丁目1番1号 東洋紡 績株式会社総合研究所内

Claims (2)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】 不溶性担体に抗ヘモグロビン−ハプト
    グロビン複合体抗体を固定したヘモグロビン−ハプトグ
    ロビン複合体の吸着材と検体を接触させ、検体中のヘモ
    グロビン−ハプトグロビン複合体を除去または捕集した
    後、検体中の遊離ヘモグロビンを定量することを特徴と
    する遊離ヘモグロビンの定量方法。
  2. 【請求項2】 不溶性担体に抗ヘモグロビン−ハプト
    グロビン複合体抗体を固定したヘモグロビン−ハプトグ
    ロビン複合体の吸着材を少なくとも構成要素として有す
    ることを特徴とする遊離ヘモグロビン定量キット。
JP12464092A 1992-05-18 1992-05-18 遊離ヘモグロビンの定量方法および遊離ヘモグロビン定量キット Pending JPH05322888A (ja)

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Cited By (4)

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