RU2137134C1 - Способ количественного определения аутоантител к липопротеидам низкой плотности в сыворотке крови - Google Patents
Способ количественного определения аутоантител к липопротеидам низкой плотности в сыворотке крови Download PDFInfo
- Publication number
- RU2137134C1 RU2137134C1 RU97105592A RU97105592A RU2137134C1 RU 2137134 C1 RU2137134 C1 RU 2137134C1 RU 97105592 A RU97105592 A RU 97105592A RU 97105592 A RU97105592 A RU 97105592A RU 2137134 C1 RU2137134 C1 RU 2137134C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- autoantibodies
- ldl
- low density
- density lipoproteins
- antibodies
- Prior art date
Links
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Использование: в медицине, в частности в терапии. Проводят твердофазный иммуноферментный анализ, в котором выполняют стандартизацию по аффинным аутоантителам к ЛПНП с известной концентрацией белка легких цепей иммуноглобулинов, причем в качестве связывающего агента используют ЛПНП, выделенные от большого числа доноров и очищенные от циркулирующих иммунных комплексов "ЛПНП + аутоантитело", а в качестве вторых антител для обнаружения аутоантител к ЛПНП в иммуноферментной реакции используют козьи поликлональные антитела к легким цепям иммуноглобулинов человека, меченные пероксидазой. Способ является высокоспецифичным, чувствительным и количественным.
Description
Изобретение относится к медицине, а именно к терапии.
Сущность способа в том, что в сыворотке крови определяют количество аутоантител к ЛПНП, причем в качестве связующего агента используют ЛПНП, которые выделяют от большого числа доноров в связи с наличием аллотипических различий в структуре липопротеидов и очищают от загрязняющих их циркулирующих иммунных комплексов "ЛПНП + аутоантитело", а в качестве вторых антител для обнаружения аутоантител к ЛПНП в иммуноферментной реакции используют козьи поликлональные антитела к легким цепям иммуноглобулинов человека, меченные пероксидазой.
Изобретение может быть также использовано для диагностики атеросклероза.
Известен способ определения антилипопротеиновой активности в сыворотке крови у больных с сердечно-сосудистыми заболеваниями твердофазовым иммуноферментным методом [1], выбранный в качестве прототипа.
Недостаток прототипа - низкая информативность, малая дифференциация и не обработанный в реализации количественный учет уровня аутоантител.
В изобретении решена медико-техническая задача повышения информативности и достоверности диагностики путем количественного определения аутоантител к липопротеидам низкой плотности (ДПНП) с учетом всего их многообразия.
Поставленная задача решается тем, что выполняют стандартизацию по аффинным аутоантителам к ЛПНП с известной концентрацией белка легких цепей иммуноглобулинов, причем в качестве связывающего агента используют ЛПНП, выделенные от большого числа доноров и очищенные от циркулирующих иммунных комплексов "ЛПНП + аутоантитело", а в качестве вторых антител для обнаружения аутоантител к ЛПНП в иммуноферментной реакции используют козьи поликлональные антитела к легким цепям иммуноглобулинов человека, меченные пероксидазой.
Способ осуществляется следующим образом.
1 этап. Выполняют иммобилизацию связывающего агента - (ЛПНП) на твердой фазе физической сорбции.
2 этап. Осуществляют комплементарное присоединение лиганда - (аутоантител к ЛПНП) из калибровочного материала или исследуемой жидкости.
3 этап. Достигают проявление образовавшегося иммунного комплекса (ЛПНП + аутоантитело) с помощью конъюгата козьих поликлональных антител к легким цепям иммуноглобулинов человека с пероксидазой.
4 этап. Учитывают реакцию по экстинции раствора хромагента, изменяющего свою окраску в зависимости от количества кислорода, выделенного из перекиси водорода при разложении ее пероксидазой.
Конструируют диагностикум в следующем порядке.
1. Получают связывающий агент - ЛПНП.
Со станции переливания крови получают смесь плазм от как можно большего числа доноров - 40 - 105 человек. Менее 40, снижается достоверность; более 105, данные всегда стабильны. Липопротеиды выделяют путем последовательного ультрацентрифугирования в титановом роторе T - 45, например в ультрацентрифуге Вес ап "рпо" 12 - 65В. ЛПНП флотируют в плотности бромистого натрия 1,05 г/мл. Полученный препарат ЛПНП подвергают гель-хроматографии на колонке с сефарозой 6В Cl. Фракции второго пика объединяют и концентрируют, например, на ячейке "А соп" на фильтре ХМ 300 до минимального объема, затем разбавляют веронал - мединаловым буферным раствором до концентрации 2 мг/мл и проводят препаративный электрофорез в блоке 1% агарозы при силе тока 150 мА.
Полоску агарозы с ЛПНП вырезают и подвергают электроэлюированию в стандарном для данной процедуре приборе. Препарат ЛПНП вновь концентрируют в ячейке для ультрафильтрации. Очищенный таким образом препарат ЛПНП не содержит ЦИК и сохраняет свои нативные свойства. Проверку на чистоту осуществляют диск-электрофорезом в ПААГ и иммуноэлектрофорезом с антисыворотками, преципитирующими все человеческие белки и иммуноглобулины. Предложенный препарат дает только одну полосу в диск-электрофорезе при окраске на липопротеиды и белки и одну линию преципитации при иммунофорезе против антисыворотки, преципитирующей все человеческие белки в зоне ЛПНП.
2. Выделяют аутоантитела к ЛПНП.
На основе полученного иммунохимически чистого препарата ЛПНП и СпВ - сефарозы 4В синтезируют иммуносорбент. Смесь человеческих сывороток от 6300 доноров пропускают через колонку с иммуносорбентом, из расчета 100,0 мл на 1 г носителя. Колонку тщательно отмывают от несвязавшихся сывороточных белков и элюируют аффинные аутоантитела к ЛПНП. В препарате аутоантител определяют количество и состав иммуноглобулинов, а также количество белка легких цепей иммуноглобулинов, одинаковых для всех классов.
3. Готовят конъюгат к легким цепям иммуноглобулинов.
Из иммуноглобулинов человека выделяют легкие цепи и проводят иммунизацию лабораторных животных. Антитела к легким цепям конъюгируют с пероксидазой корня хрена периодатным окислением.
4. Перед употреблением готовят субстратную смесь из 0,05% раствора ортофенилендиамина и 0,02% раствора перекиси водорода в 0,05 М имидазол-цитратном буферном растворе pH 5,5.
5. Твердая фаза. В качестве твердой фазы выбирают полистероловые плоскодонные планшеты, например, 8 х 12 лунок отечественные "Медполимер" или зарубежных фирм: "Нунк", "Линбро", "Титертек" и др.
Для конструирования тест-системы подбирают следующие параметры:
1. Концентрацию связывающего агента 10 • 10-3 г/л.
1. Концентрацию связывающего агента 10 • 10-3 г/л.
2. pH сорбирующего буферного раствора 8,5 - 0,01 М фосфатный буферный раствор с 0,15 М хлористого натрия.
3. Температура и время иммобилизации связывающего агента составляют +4oC в течение 18 часов.
4. Температура и время инкубации лиганда +52oC в течение 3 часов.
5. Скрининг-титр исследуемого материала составляет 1:50.
6. Калибровку реакции проводят на основе поликлональных моноспецифических аутоантител к ЛПНП с количеством белка легких цепей иммуноглобулинов человека - (104 - 78) • 10-3 г/л.
Специфичность реакции проверяют с помощью использования в качестве связывающих агентов миоглобина, апопротеинов апо-С-II, апо-С-III и апо-А-I.
Разработанным диагностикумом (способом) определяют уровни аутоантител к ЛПНП в норме у здоровых доноров.
Пример 1. Для исследования были взяты 52 здоровых донора с московской городской Станции переливания крови. Содержание холестерина в сыворотке крови не превышало 4,68 - 5,20 ммоль/л, триглицеридов не более 1,14 - 1,38 ммоль/л Из них 28 - мужчин и 24 женщины. 30 человек в возрасте до 30 лет, 12 - от 30 до 39, а 10 обследованных были в возрасте 40 лет и старше. У исследуемых среднее значение количества аутоантител в сыворотке крови составило 45,32 ± 4,25 мкг/мл, а в циркулирующих иммунных комплексах 0,52 • 0,066 мкг/мл. Способ апробирован в КНЦ АМН РФ.
Пример 2. Для исследования были взяты 100 больных ИБС и гиперлипопротеидемией с верифицированным атеросклерозом с помощью селективной коронарографии. Больные были разделены на 5 групп в зависимости от количества пораженных коронарных артерий. Среднее значение количества аутоантител у больных с верифицированным атеросклерозом составило в сыворотке крови от 115,1 ± 11,5 мкг/мл до 175,7 ± 8,8 мкг/мл, а в циркулирующих иммунных комплексах от 1,12 ± 0,08 мкг/мл до 2,04 ± 0,13 мкг/мл.
Эффективность способа количественного определения аутоантител к ЛПНП в том, что количественно определяют нормальные уровни аутоантител к ЛПНП у здоровых доноров и определяют их границы у больных с верифицированным атеросклерозом.
Литература
1. Szondy E., Mezey Z., Antilipoprotein activity in sera and circulation imminne compolexces. Abstz. Intern. Sump. Aterosclerotis, 1982. W. Berlin, P. 536 - 543.
1. Szondy E., Mezey Z., Antilipoprotein activity in sera and circulation imminne compolexces. Abstz. Intern. Sump. Aterosclerotis, 1982. W. Berlin, P. 536 - 543.
Claims (1)
- Способ количественного определения аутоантител к липопротеидам низкой плотности в сыворотке крови путем проведения твердофазного иммуноферментного анализа, отличающийся тем, что выполняют стандартизацию по аффинным аутоантителам к ЛПНП с известной концентрацией белка легких цепей иммуноглобулинов, причем в качестве связывающего агента используют ЛПНП, выделенные от большого числа доноров и очищенные от циркулирующих иммунных комплексов "ЛПНП + аутоантитело", а в качестве вторых антител для обнаружения аутоантител к ЛПНП в иммуноферментной реакции используют козьи поликлональные антитела к легким цепям иммуноглобулинов человека, меченные пероксидазой.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU97105592A RU2137134C1 (ru) | 1997-04-15 | 1997-04-15 | Способ количественного определения аутоантител к липопротеидам низкой плотности в сыворотке крови |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU97105592A RU2137134C1 (ru) | 1997-04-15 | 1997-04-15 | Способ количественного определения аутоантител к липопротеидам низкой плотности в сыворотке крови |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU97105592A RU97105592A (ru) | 1999-04-20 |
| RU2137134C1 true RU2137134C1 (ru) | 1999-09-10 |
Family
ID=20191730
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU97105592A RU2137134C1 (ru) | 1997-04-15 | 1997-04-15 | Способ количественного определения аутоантител к липопротеидам низкой плотности в сыворотке крови |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2137134C1 (ru) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2623879C2 (ru) * | 2015-11-25 | 2017-06-29 | Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Научно-исследовательский институт общей патологии и патофизиологии" | Способ оценки содержания циркулирующих десиалированных липопротеидов низкой плотности |
-
1997
- 1997-04-15 RU RU97105592A patent/RU2137134C1/ru active
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 3. Szondy E, Mezey Z.Antilipoprotein activity in sera and circulation immune complexces. Abser. Intern. Sump. Aterosclerotis, 1982, N.Berlin, p. 536 - 543. * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2623879C2 (ru) * | 2015-11-25 | 2017-06-29 | Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Научно-исследовательский институт общей патологии и патофизиологии" | Способ оценки содержания циркулирующих десиалированных липопротеидов низкой плотности |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| AMINO et al. | Measurment of circulating thyroid microsomal antibodies by the tanned red cell haemagglutination technique: its usefulness in the diagnosis of autoimmune thyroid diseases | |
| NL7915050A (nl) | Kwantitatieve bepalingsmethode voor biologische stoffen. | |
| EP0535162B1 (en) | Analyte variant analysis | |
| JP2592121B2 (ja) | ＩｇＡ腎臓病の診断のための方法及びキツト | |
| JP3436444B2 (ja) | 酸化ｈｄｌの測定法及びキット | |
| CZ287467B6 (en) | Method of quick determination of an organ state based on detection one or more isoenzymes of glutathione S-transferase and apparatus for making the same | |
| EP1169647B1 (en) | Method for analyzing the amount of intraabdominal adipose tissue | |
| RU2137134C1 (ru) | Способ количественного определения аутоантител к липопротеидам низкой плотности в сыворотке крови | |
| JP3998245B2 (ja) | 酸化アポリポタンパク質ａｉ及びそれを含有する酸化リポタンパク質の測定法及びキット | |
| JPH02193071A (ja) | ハプトグロビン―ヘモグロビン複合体測定用試薬キット及びそれを用いるハプトグロビン―ヘモグロビン複合体の測定法 | |
| JP3499875B2 (ja) | 解離性大動脈瘤を検出するための抗体試薬及びその用途 | |
| Rothbarth et al. | Immunofluorescence studies with 4-acetamido-4′-isothio-cyanato stilbene-2, 2′-disulphonic acid (SITS) | |
| Lannfelt et al. | ELISA for measuring porphobilinogen deaminase in human erythrocytes | |
| Qiaojia et al. | Qualitative bedside assay of increased human serum myoglobin by sandwich dot-immunogold filtration for the diagnosis of acute myocardial infarction | |
| JPH0690203B2 (ja) | 前立腺特異抗原とα▲下１▼−アンチトリプシン複合体の定量方法 | |
| JP4588053B2 (ja) | 酸化アポリポタンパク質ａｉ及びそれを含有する酸化リポタンパク質の測定法及びキット | |
| Romano et al. | Circulating immune complexes, immunoglobulins, complement, antibodies to dietary antigens, cholesterol and lipoproteins levels in patients with occlusive coronary lesions | |
| JP4844187B2 (ja) | 腎機能判定用または制癌剤の効果もしくは影響判定用マーカーおよびそれを用いた判定方法 | |
| RU2144676C1 (ru) | Способ определения функциональной активности субкомпонента c1q комплемента человека | |
| JP3043528B2 (ja) | コレステリルエステル転送蛋白の測定法 | |
| JPH05302922A (ja) | 腎疾患の診断法 | |
| JP2762058B2 (ja) | カルボニル化合物− タンパク質複合体の定量法 | |
| JPH06160384A (ja) | 糖尿病性腎症の早期診断法 | |
| JPH09318627A (ja) | 腎不全またはバセドウ病における骨組織の代謝異常をスクリーニングする方法 | |
| JP2000304747A (ja) | 動脈硬化症惹起性リポ蛋白の検出方法およびこれに用いる抗体 |