JPH06160384A - 糖尿病性腎症の早期診断法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 糖尿病患者の尿中よりヒトアルブミン分解物
を検出することによって早期の糖尿病性腎症の診断方法
を提供する。 【構成】 健常人と糖尿病患者との尿中のヒトアルブミ
ン分解物を検出するにあたり被検者の尿を １）ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法、 ２）等電点ゲル電気泳動法、 ３）セルロースアセテート膜電気泳動法、 ４）高速液体クロマトグラフ法 により分離を行い、それぞれを免疫転写法もしくは免疫
直接発色法あるいはアフィニティークロマトグラフィー
と高速液体クロマトグラフィーの組合せによる紫外部吸
収スペクトルの検出でヒトアルブミンとヒトアルブミン
分解物を特異的に検出することによって早期の糖尿病性
腎症を診断する。 【効果】 本発明の方法によって従来に比べ早期の糖尿
病性腎症に対する診断が可能となる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は糖尿病性腎症の早期診断
方法に関するものである。更に詳しくは糖尿病患者尿中
のアルブミン分解物の検出による糖尿病性腎症の早期診
断方法に関するものである。

【０００２】

【従来の技術ならびに発明が解決すべき問題点】糖尿病
性腎症は腎生検が困難なことから持続性蛋白尿、腎機能
障害、高血圧等の知見から臨床診断がなされてきた。し
かし、蛋白尿が出現すると治療が難しく、５〜６年経過
で末期腎不全に陥るのが通例である。そのため、通常の
尿試験紙法で尿蛋白が陽性となる前に腎病変を診断して
早期治療を行なうことが臨床医学の立場から強く望まれ
ている。この目的で開発されたのが尿中アルブミンの微
量測定法であり、近年腎症の診療にとって必須の検査法
になりつつある。

【０００３】尿中の微量アルブミンはＲＩＡ（ラジオイ
ムノアッセイ）や免疫沈澱法により、正確に定量できる
が、最近は簡易キットが市販されており、アルブシュア
（登録商標）（エーザイ株式会社）もその一つである。
これは免疫凝集阻止反応を原理としており、試薬はアル
ブミン感作ラテックスとアルブミン抗体であり、尿中に
アルブミンが殆どなければ抗原抗体反応でラテックスが
凝集するが、尿中にアルブミンがあればこれを妨害して
凝集が阻止される。

【０００４】このように微量のアルブミンを測定するこ
とにより腎疾患を診断する方法はあるが、さらに早期に
腎症の診断ができるものはない。一方、ヒト尿中アルブ
ミン分解物に関する最初の発見はＲ．Ｃ．Ｗｉｇｇｉｎ
ｓら（Ｃｌｉｎｉｃａ．Ｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ．，
１４９，１５５〜１６３，１９８５．）によって腎症症
候群（Ｎｅｐｈｒｏｔｉｃ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）の患者
における蛋白尿陽性〔臨床的なタンパク尿は１５０〜３
００ｍｇ／ｌ／日以上もしくは簡易タンパク尿試験法
（タンパク質量２００ｍｇ／ｌ／日以上のとき陽性）に
よる持続的陽性の尿をもって判定されている〕の検体に
ついて、アルブミン分解物とアルブミン重合複合体が患
者の尿中に排泄されていることをＳＤＳ−ＰＡＧＥによ
る泳動後、イムノブロット法ではじめて検出した。その
論文の中でＲ．Ｃ．Ｗｉｇｇｉｎｓらは、アルブミンの
分子量６７，０００（６７ＫＤ）より大きな分子量のタ
ンパク質は腎糸球体による濾過機能の異常により漏出
し、またヒトアルブミン（６７ＫＤ）より小さな分子量
のタンパク質は尿細管の障害によって生ずるものと考
え、これらの作用機構は単なる腎の濾過による「分子の
大きさ」に関連した分子ふるいの作用に起因するものと
説明している。この中でＲ．Ｃ．Ｗｉｇｇｉｎｓらの報
告では糖尿病の病態と長期に及ぶ罹患経過をふまえた上
での腎症への移行と進展を説明したものではなく、ただ
単に腎症症候群に罹患した患者の尿の分析からアルブミ
ン分解物を見出したに過ぎない。

【０００５】しかしながら、近年糖尿病性腎症の発生機
序に対する解明が進み、単なる腎糸球体の濾過機能と尿
細管による低分子タンパク質の再吸収の障害だけでは説
明し切れず、腎糸球体の基底膜の構造変化に伴う「Ｓｉ
ｇｅ ｂａｒｒｉｅｒ」と「ｃｈａｒｇｅ ｂａｒｒｉ
ｅｒ」の両面から、アルブミンが特に排泄されやすいと
Ｔ．Ｄｅｃｋｅｒｔら（Ｋｉｄｎｅｙ ｌｎｔ．，３
３，１００〜１０６，１９８８．）は説明している。

【０００６】したがって、Ｒ．Ｃ．Ｗｉｇｇｉｎｓら
（１９８５）は種々の腎疾患をすべて「分子ふるい」の
作用機作のみで説明するには余りにもその論拠に乏し
く、まして糖尿病によって惹起される腎症に至るまでの
経過について当時の糖尿病に関する学問レベルでは到底
説明し得なかった。

【０００７】一方、糖尿病性腎症への移行と微量アルブ
ミン尿（Ｍｉｃｒｏ ａｌｂｕｍｉｎ Ｕｒｉａ）との
関連を最初に予言したのは糖尿病学の大家の１人である
デンマークのＣ．Ｅ．Ｍｏｇｅｎｓｅｎら（Ｓｃａｎ．
Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．，２８，１８３
〜１９３，１９７１）である。彼らは糖尿病性腎症への
移行と増悪について微量アルブミンの尿中への排泄量に
最初に注目し、その後７〜１４年間（平均１１．５年）
の長期にわたった追跡調査を行い、それらの疫学的立場
から、また尿中アルブミン排泄量、糸球体の濾過率、腎
血流量、血圧、さらには過去２〜３ヶ月の血糖状態を示
すＨｂＡ_ICの得られた一連のデータより、糖尿病から糖
尿病性腎症への移行と進展には尿中の微量アルブミンの
量と密接に関連していることを体系づけてＮ．Ｅｎｇ．
Ｊ．Ｍｅｄ．，３１０，３５６〜３６０，１９８４及び
Ｋｉｄｎｅｙ ｌｎｔ．，３１，６７３〜６８９，１９
８７に報告した。

【０００８】さらに、Ｃ．Ｅ．Ｍｏｇｅｎｓｅｎら（Ｄ
ｉａｂｅｔｅｓ，３２，Ｓｕｐｐｌ２，６４，１９８
４）はインスリン依存型の糖尿病に由来する腎症への移
行と増悪についてＩ期からＶ期に分類し、初期腎症をII
I 期と定めた。Ｃ．Ｅ．Ｍｏｇｅｎｓｅｎらによれば、
この病期は可逆的な腎病変を示すが充分な血糖コントロ
ールと血圧コントロールを行えばIV期である顕性腎症へ
進みにくいことを述べており、尿中のアルブミン排泄量
が腎の変化を知る上で重要な手がかりになることを論じ
臨床上の意義を確立してきた。

【０００９】Ｃ．Ｅ．Ｍｏｇｅｎｓｅｎらの発表以来、
Ｇ Ｓｌａｍａら（Ｌａｎｃｅｔ，１，１３３８〜１３
３９，１９８５）、Ａ．Ｓｃｈｉｍｉｔｚら（Ｕｒｅｍ
ｉａｌｎｖｅｓｔ．，９，７９〜８４，１９８６）、
Ｃ．Ｆ．Ｃｌｏｓｅら（Ｌａｎｃｅｔ，１，２６８〜２
６９，１９８６）及びＧ．Ｆ．Ｗａｌｔｓら（Ｄｉａｂ
ｅｔｉｃ Ｍｅｄ．，５，２９８〜３０３，１９８８）
によって実際の臨床の場で微量アルブミンの測定を行い
臨床的意義を認めた。なお、最近では繁田ら（繁田幸
男、吉川隆一：臨床と研究 ６６巻；３７−４１頁，１
９８９年）によると、尿中のアルブミンが３０〜３００
ｍｇ／日の範囲にある場合を一般的に微量アルブミン尿
と称し、初期糖尿病性腎症の診断としている。

【００１０】その後、これらの研究をもとに微量アルブ
ミンの測定キット（ＲＩＡ法、ＬＡＩＴ法、ＥＩＡ法）
が開発され上市されるに至っている。しかしながら、糖
尿病の病態の形成と増悪は長期にわたって徐々に進展し
ていくものであり、特に糖尿病の三大合併症のうち糖尿
病性腎症は患者の生命と予後に直結するのでその早期発
見は臨床上重要な課題となっている。したがって、現
在、微量アルブミンの測定よりさらに早期の糖尿病性腎
症への移行が予測される測定法の開発が望まれている。

【００１１】

【課題を解決するための手段】本明細書に記載した我々
の研究は糖尿病性腎症の早期診断に関する新しいマーカ
ーの探索過程の中で１９８８年より着手し、確定診断の
下された糖尿病患者および糖尿病性腎症を併発した患者
の尿をＳＤＳ−ＰＡＧＥで泳動後、イムノブロット法で
測定するとヒトアルブミンが生体内で何らかの修飾をう
けたヒトアルブミンとは異なるヒトアルブミン分解物を
検出した。

【００１２】本明細書表１に示した通り、糖尿病性腎症
として確定診断が下された患者の尿では従来の微量アル
ブミン測定キット例えばアルブシュア（登録商標）で測
定した結果、全例（４／４）が陽性を示し、同様にアル
ブミン分解物も全例（４／４）検出された。

【００１３】一方、糖尿病患者９名について同様に微量
アルブミン測定キットで測定した結果、全例（０／９）
陰性を示しだか、それらの尿からアルブミン分解物が６
名（６／９）も検出された。なお、図１に示した通り健
常者における生理的尿（排尿後そのままの尿）を分析し
てもアルブミン（６７ＫＤ）のバンドのみを検出し、そ
の他のバンドは検出されなかった。これらの結果は糖尿
病に罹患し糖尿病性腎症へ移行していく過程で微量アル
ブミンより早期診断が可能であることを示唆しているも
のである。

【００１４】したがって従来の方法は尿中の微量アルブ
ミンの「量」を測定するものであって、本発明はアルブ
ミン分子（６７ＫＤ）に由来するアルブミン分解物、す
なわち「質」を検出するものである。

【００１５】さらに、本発明は「糖尿病性腎症に関する
早期診断」を目的としたものであって、糖尿病患者のう
ち、いまだ糖尿病性腎症へ移行もしくは進展していない
患者の尿を対象にアルブミン分解物を検出することにあ
るので先のＲ．Ｃ．Ｗｉｇｇｉｎｓらの報告とは疾患の
対象および本質的に目的が異なる。

【００１６】すなわち、糖尿病に罹患した患者のうち微
量アルブミン尿（Ｍｉｃｒｏａｌｂｕｍｉｎｕｒｉａ）
として判定されていない尿検体を用いてアルブミン分解
物を検出することは臨床的意義として重要であることを
見出し、本発明を完成するに至った。

【００１７】また、本発明におけるヒトアルブミン分解
物とはヒトアルブミンが酵素などにより生体内で分解さ
れ、本来のヒトアルブミン（６７ＫＤ）が低分子化され
たものすべてが実質的に対象となる。ヒトアルブミン分
解物の存在は分子量の差異または、荷電状態の差異を利
用してヒトアルブミンと分離し、抗原抗体反応を行なう
ことにより検出することができる。

【００１８】ヒトアルブミン及びヒトアルブミン分解物
の検出には、特異的な抗原抗体反応を利用するのが一般
的であり、これらの免疫化学的手法としてはＥＩＡ（エ
ンザイムイムノアッセイ）法、ＲＩＡ法、イムノブロッ
ト法などがあるが、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気
泳動法やセルロースアセテート膜電気泳動法、さらには
等電点ゲル電気泳動法などとの組合せを考慮すると操作
性、迅速性などの面からイムノブロット法が最適であ
る。

【００１９】一方、近年液体クロマトグラフィーによる
生体成分の分析の進歩はめざましく、特に高速液体クロ
マトグラフィーにおいては、カラムの理論段数の増大、
定量ポンプの改良や検出器などの向上により、さらには
全自動化を完遂させるためのオートサンプラー、オート
インジェクターシステムなどの技術が集大成されるに至
り、昼夜を問わず稼動することが可能になってきた。

【００２０】特に臨床検査の分野では、より精度が高
く、より早い分析が望まれ、例えば糖尿病患者における
過去１〜２ケ月間の血糖値の推移の指標とされているヘ
モグロビンＡ_ICなどの分析にはこの高速液体クロマトグ
ラフィーは今や不可欠の分析機器になりつつある。

【００２１】高速液体クロマトグラフィーを含めた液体
クロマトグラフィーを尿中のアルブミン分解物の分離分
析に応用する場合、尿中には複雑かつ多種類の生体成分
が存在するため同一カラムで一挙に分離することも可能
であるが、分離カラムの効率を向上させるためには尿中
のアルブミンおよびアルブミン分解物のみを選択的にポ
ストカラム（前カラム）に吸着せしめた後、溶離液で溶
出して本カラムである分離カラムで各アルブミン分解物
を分離分析することも可能である。以下にヒトアルブミ
ン分解物を分離分析する方法について、詳細に説明する
が本方法はその基本技術の一端を紹介するものであっ
て、これらに限定されるものではない。

【００２２】〔ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動法〕
（以下ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法と略す。） ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法にはＳｈａｐｉｒｏら（Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２
８，８１５，１９６７）とＷｅｂｅｒら（Ｊ．Ｂｉｏ
ｌ．Ｃｈｅｍ．，２４４，４４０６，１９６９）によっ
て報告された連続緩衝液法やＬａｅｍｍｌｉ（Ｎａｔｕ
ｒｅ，２７７，６８０，１９７０）によって報告された
不連続緩衝液法などがあり、いずれの方法でも使用する
ことができるが、分離が優れているＬａｅｍｍｌｉの方
法が最も好ましい。

【００２３】また、分離ゲルの濃度については通常５％
〜１２．５％位が使用されているが、ヒトアルブミンと
ヒトアルブミン分解物の分離が可能であれば特に規定す
る必要はない。さらに、ディスク泳動法およびスラブ泳
動法があり、いずれの方法も用いることができるが、ス
ラブ泳動法が好ましい。イムノブロット法はヒトアルブ
ミンとヒトアルブミン分解物を支持体へ転写後、抗原抗
体反応により発色させる。

【００２４】すなわち、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法でヒトアル
ブミンとヒトアルブミン分解物を分離した後、ゲル中の
各タンパク質を速やかにニトロセルロース膜に転写し、
拡散することなく膜に吸着せしめる。膜上のタンパク質
は拡散することがないので、その後の処理は時間をかけ
て行なうこともできる。次に１次抗体（本発明において
は抗ヒトアルブミン抗体を示す）を反応させ、洗浄後、
酵素を標識した２次抗体と反応させる。さらに洗浄後、
酵素の検出試薬を添加することにより存在の有無を確認
する。

【００２５】転写方法には様々な方法があり、その中で
もＴｏｗｂｉｎらの方法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．，７６，４３５０−４３５４，１９７９）
が最適である。転写に用いる支持体としてはニトロセル
ロース、アミノフェニルチオエーテルペーパー、アミノ
ベンジルオキシメチルペーパー、ジアミノエチルセルロ
ースなどが使用できるが、特にニトロセルロース膜が最
適である。ニトロセルロース膜はＢＡ８５（Ｓｃｈｌｅ
ｉｃｈｅｒ ＆ Ｓｃｈｕｅｌｌ社製）ＨＡＨＹ（Ｍｉ
ｌｌｉｐｏｒｅ社製）として市販されている。なお、Ｓ
ＤＳポリアクリルアミドゲルおよび泳動装置、ニトロセ
ルロース膜および転写装置についてはテフコ株式会社で
一式市販されているのでこれを用いると好都合である。

【００２６】ニトロセルロース膜上で抗原抗体反応を行
なう場合には、非特異反応を抑制するためウシ血清アル
ブミン（ＢＳＡ）、スキムミルクなどを用いるが、好ま
しくは抗ヒトアルブミン抗体と交差反応性の可能性が少
ないスキムミルクが適している。抗ヒトアルブミン抗体
は家兎に免疫して容易に得ることができるが、市販品を
使用することもできる。さらに好ましくは非特異反応を
防止するために純度の高い抗体を用いるのが好ましい。
高純度にするには、例えば、アフィニティークロマトグ
ラフィーによる精製などを行なう。

【００２７】２次抗体は抗ヒトアルブミン抗体を作出し
た動物種により異なるが、通常はウサギ、ヤギ、マウス
などのＩｇＧに対する抗体が用いられる。さらに好まし
くは抗ヒトアルブミンの場合と同様に非特異反応を防止
するために精製を行なう。酵素標識物に用いる酵素とし
てはペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、グ
ルコースオキシダーゼなどが使用できるが、好ましくは
純品が入手しやすく、活性検出法が確立されているペル
オキシダーゼが適している。

【００２８】なお２次抗体に酵素を標識する方法にはグ
ルタールアルデヒド法（Ｓ．Ａｒｒａｍｅａｓ，Ｉｍｍ
ｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，６，４３，１９６９）や過
ヨウ素酸酸化法（Ｐ．Ｋ．Ｎａｋａｎｅ，Ａ．Ｋａｗａ
ｏｉ，Ｊ．Ｈｉｓｒｏｃｈｅｍ，Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．，
２２，１０８４，１９７４）などがあり容易に標識物を
作製することができる。また、酵素標識した２次抗体は
Ｃａｐｐｅｌ社などでも市販されており、容易に入手す
ることができる。

【００２９】酵素の検出試薬としては、ペルオキシダー
ゼには過酸化水素水とジアミノベンチジンあるいはクロ
ロナフトール、アミノエチルカルバゾールなどが利用で
きるが、過酸化水素水とジアミノベンチジンの組合せが
適している。一方、アルカリフォスファターゼの場合に
は、β−ナフチルリン酸、ブロモクロロインドリルリン
酸、ウンベリフェニルリン酸などが用いられる。さら
に、グルコースオキシダーゼではＤ−グルコースが用い
られる。

【００３０】以下に本診断法の概要について示す。ま
ず、尿中の蛋白質を可溶化する。すなわち、尿中に存在
する蛋白質分解酵素を失活させるとともに、ＳＤＳとβ
−メルカプトエタノールによって蛋白質を効果的に変性
させる目的で沸騰水中で一定時間熱処理する。次に可溶
化した尿をＳＤＳ−ポリアクリルアミドスラブゲルの各
レーンに一定量注入し、ＳＤＳを含むグリシン−トリス
緩衝液を泳動用緩衝液として、定電流で一定時間泳動さ
せる。

【００３１】泳動後、ゲルをあらかじめ冷却しておいた
メタノールを含むグリシン−トリス緩衝液（転写用緩衝
液）に一定時間浸漬し、平衡化する。ゲルを陰極側、転
写用支持体を陽極側としてブロッティング装置に装着す
る。転写槽には転写用緩衝液を加え、氷冷下、定電圧で
一定時間転写を行なう。転写後、Ｔｗｅｅｎ２０を含む
リン酸生理緩衝液（ＰＢＳ）で転写用支持体を洗浄し、
スキムミルクを含むＰＢＳで一定時間、一定温度でマス
キングを行なう。

【００３２】次に、抗ヒトアルブミン抗体をＢＳＡを含
むＰＢＳにて希釈し、一定温度で一定時間反応させる。
さらに、反応後Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで洗浄し、
あらかじめＢＳＡを含むＰＢＳにて一定濃度に希釈した
酵素標識二次抗体を一定温度で一定時間反応させ、ヒト
アルブミン分解物の検出を行なう。

【００３３】〔等電点ゲル電気泳動法〕一般の電気泳動
はある特定のｐＨにおける電解質の荷電状態の差を利用
しているのに対し、等電点ゲル電気泳動法は両性電解質
がある値のｐＨにおいて、その実効電荷が０となり、泳
動しなくなるのを利用して、ｐＨ勾配をもったメディウ
ム中で泳動し、等電点の値に従ってタンパク質を分離し
ようとするものである。

【００３４】ｐＨ勾配を作る担体としては両性電解質
（両性担体Ｃａｒｒｉｅｒ ａｍｐｈｏｌｙｔｅｓ）に
より容易にできる。両性担体はＶｅｓｔｅｂｅｒｇら
（Ａｃｔａ．Ｃｈｅｍ．Ｓｃａｎｄ．，２０，８２０−
８３４，１９６６）によって開発されたものであるが、
最近、商品名Ｐｈａｒｍａｌｙｔｅ（ファルマシア社
製）など数社より市販されている。

【００３５】等電点ゲル電気泳動に用いる支持体として
は（電気滲透のないことが条件であるが、この条件を満
たすものとして）ポリアクリルアミドゲルがあげられ
る。このゲルは通常、分子ふるい作用を有するが、等電
点ゲル電気泳動に用いる場合には分子ふるい効果は逆に
分離を悪くするため、通常５％あるいはそれ以下のゲル
として使用することが好ましい。

【００３６】両性担体を含むゲルの作製については、種
々の実験書に述べられているが例えば、口野嘉幸、平井
久丸、櫻林郁之介（実験操作ブロッティング法、２３９
−２４１、ソフトサイエンス社、１９８７）らの方法が
参考になる。また市販品としてＩＥＦ ＰＡＧＥ ｍｉ
ｎｉ（登録商標）（テフコ株式会社）を利用することも
できる。これらの市販品はスラブゲルとなっており、多
数検体を処理するのに適している。

【００３７】また、等電点ポリアクリルアミドゲル電気
泳動の条件は特に限定されるものではないが、電極液と
して通常、陰極液には０．１〜１．０Ｍ水酸化ナトリウ
ム、陽極液には０．０１〜１Ｍリン酸が用いられる。検
体は両性担体とグリセロールを含む液で溶解し、試料液
として用いる。泳動電圧は１００〜５００Ｖ程度に変化
させて行なうのが好ましい。

【００３８】泳動を終えた各種担体を転写する場合例え
ば、転写に用いる支持体としてはニトロセルロース膜、
アミノフェニルチオエーテルペーパー、アミノベンジル
オキシメチルペーパー、ジアミノエチルセルロースなど
が使用できるが、特にニトロセルロース膜が最適であ
る。ニトロセルロース膜はＢＡ８５（Ｓｃｈｌｅｉｃｈ
ｅｒ ＆ Ｓｃｈｕｅｌｌ社製）ＨＡＨＹ（Ｍｉｌｌｉ
ｐｏｒｅ社製）として市販されている。

【００３９】なお、泳動を終えた等電点ゲルからの転写
はＴｏｗｂｉｎらの方法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．，７６，４３５０−４３５４，１９７９）
に準じて行なう。この場合、ブロッティング緩衝液には
０．５〜１．０％酢酸を用い、ゲルと膜のセットは逆に
して膜を陰極側に装着する。通電下で転写された例えば
ニトロセルロース膜などの支持体上で特異的にヒトアル
ブミン分解物を検出するには、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法で用
いた方法と同様の操作を行えば検出が可能である。

【００４０】例えば、ニトロセルロース膜上に転写を終
えた膜をＢＳＡやスキムミルクなどでマスキング後、抗
ヒトアルブミン抗体を反応せしめ、さらに酵素標識抗体
を作用させ、発色剤例えば過酸化水素水とジアミノベン
チジンなどを用いてヒトアルブミンとヒトアルブミン分
解物を発色せしめ、検出することができる。以下に、等
電点ゲル電気泳動、転写および発色法について、より具
体的に説明するが、本方法は１例であって、この方法に
限定されるものではない。

【００４１】すなわち、等電点電気泳動、転写および発
色法については、まず被検者の尿の一定量に両性担体と
グリセロールを加え、試料液とする。次に試料液を両性
担体を含むポリアクリルアミドスラブゲルの各レーンに
一定量を注入し、泳動用緩衝液として陰極側に水酸化ナ
トリウム溶液、陽極側にリン酸溶液を加え、一定時間泳
動させる。

【００４２】泳動後、ゲルをあらかじめ冷却しておいた
酢酸溶液に一定時間浸漬し、平衡化する。転写用支持体
を陰極側、ゲルを陽極側としてブロッティング装置に装
着する。転写槽には酢酸溶液を加え、氷冷下、定電圧で
一定時間転写を行なう。転写後、Ｔｗｅｅｎ２０を含む
ＰＢＳで転写用支持体を洗浄し、スキムミルクを含むＰ
ＢＳで一定時間、一定温度でマスキングを行なう。次に
抗ヒトアルブミン抗体をＢＳＡを含むＰＢＳにて希釈
し、一定温度で一定時間反応させる。反応後、Ｔｗｅｅ
ｎ２０を含むＰＢＳで洗浄し、あらかじめＢＳＡを含む
ＰＢＳにて一定濃度に希釈した酵素標識二次抗体を一定
温度で一定時間反応させ、ヒトアルブミン分解物の検出
を行なう。

【００４３】〔セルロースアセテート膜電気泳動法〕こ
の方法はセルロースアセテート膜上に被検者の尿検体を
塗布し、電気泳動を行った後、ニトロセルロース膜に泳
動を完了したセルロースアセテート膜を転写するか、セ
ルロースアセテート膜上の蛋白質を直接固定化した後、
抗原抗体反応を行い、選択的にヒトアルブミン分解物の
検出を行うものである。一般にセルロースアセテート膜
は、セルロースの水酸基の一部ないし全部がアセチル基
で置換されたもので均質な細孔をもった膜にしたもので
ある。この膜は濾紙などの支持体と比較して次のような
利点がある。

【００４４】すなわちａ．薄く均質な多孔性の膜、ｂ．
微量の検体で行える、ｃ．泳動時のテーリング現象がほ
とんどない、ｄ．各成分の分離が明瞭である、などの特
徴がある。特に各成分の分離が短い泳動距離で充分に達
成できることなどの利点を有しているので泳動時間の短
縮および支持体の狭小化を可能とし、その結果泳動装置
をより小型化し、ひいては多数の検体を同時に処理し自
動化することが可能となる。セルロースアセテート膜電
気泳動法は血清タンパク分画法などの日常検査の中でも
スクリーニング試験の１つとして広く利用されている。

【００４５】本法に用いるセルロースアセテート膜およ
び電気泳動装置は通常使用されているものでよい。セル
ロースアセテート膜は各種市販されているが、タイタン
III （ヘレナ研究所社製）は裏面をプラスチック板でラ
ミネートされているので強度的に好適である。

【００４６】セルロースアセテート膜電気泳動の条件は
特に限定されるものではないが、泳動用緩衝液としては
一般に血清タンパク分画法に用いられるベロナール緩衝
液（ｐＨ８．６）も使用できるが、より明確な分離を行
なうには０．２〜０．４Ｍトリス−グリシン緩衝液（ｐ
Ｈ９．０〜９．２）が好適である。検体塗布量は幅１ｃ
ｍ当り、一般的には、０．４〜１．２μｌとされている
が、ヒトアルブミンとヒトアルブミン分解物の分離が可
能であれば特に規定する必要はない。通電条件について
も通常行われている方法であれば問題ないが、５０〜２
００Ｖ程度の電流を選択するのが望ましい。

【００４７】泳動を完了したセルロースアセテート膜か
らの転写方法は通常ニトロセルロース膜のごとき支持体
を重ね合せ、室温で数分間圧着しておくことで達成され
る。なお、転写に用いる支持体はＳＤＳポリアクリルア
ミドゲル又は等電点ゲルに用いられるものと同様の製品
でよい。また、泳動を完了したセルロースアセテート膜
に蛋白質変性剤を加え、直接固定化することもできる。

【００４８】ニトロセルロース膜またはセルロースアセ
テート膜上で抗原抗体反応を行なう場合には非特異反応
を抑制する必要があるが、この方法はＳＤＳ−ＰＡＧＥ
法および等電点ゲル電気泳動法と同様の方法でよい。セ
ルロースアセテート膜電気泳動では試料の添加量が少な
いため、抗原抗体反応の感度をさらに上げる必要があ
る。

【００４９】検出感度を上げる方法としては種々ある
が、アビジン−ビオチン法が適している。すなわち、抗
ヒトアルブミン抗体を反応させた後、２次抗体にビオチ
ンを結合させたビオチン化２次抗体を反応させ、さらに
酵素標識アビジンを反応させる方法である。ビオチン化
抗体はＣａｐｐｅｌ社、酵素標識アビジンはＺｙｍｅｄ
社などで市販されており容易に入手することができる。
またアビジン、ビオチン以外の抗ヒトアルブミン抗体、
酵素の検出試薬についてはＳＤＳ−ＰＡＧＥ法、等電点
ゲル電気泳動法で用いたものでよい。

【００５０】以下にセルロースアセテート膜の電気泳
動、転写および発色法について例示するが、本例は１例
であって、これに限定されるものではない。すなわち、
セルロースアセテート膜の電気泳動、転写および発色法
については、まず被検者の尿の一定量をアプリケーター
でセルロースアセテート膜に塗布を行う。なお、セルロ
ースアセテート膜は泳動用緩衝液であらかじめ平衡化し
ておく。

【００５１】市販の泳動装置に装着し、陽極側にトリス
−グリシン緩衝液、陰極側にバルビタールナトリウム−
ホウ酸緩衝液を加え、泳動を定電圧で行う。泳動後、あ
らかじめメタノールを含むグリシン−トリス緩衝液で平
衡化したニトロセルロース膜にセルロースアセテート膜
を数分間圧着する。ヒトアルブミンおよびヒトアルブミ
ン分解物が転写されたニトロセルロース膜に抗ヒトアル
ブミン抗体を一定温度で一定時間反応させる。

【００５２】界面活性剤を添加したＰＢＳでニトロセル
ロース膜を洗浄し、ビオチン化した抗ＩｇＧ抗体を一定
温度で一定時間反応させる。さらに洗浄を行った後、酵
素標識アビジンを一定温度で一定時間反応させる。洗浄
後、発色剤により発色を行ないヒトアルブミン分解物の
有無を確認する。次に、セルロースアセテート膜上で泳
動後、ヒトアルブミンおよびヒトアルブミン分解物を直
接固定化したのちに発色せしめヒトアミブミンおよびヒ
トアルブミン分解物のみを特異的に検出する方法につい
て例示するが、本例はその１例であってこれに限定され
るものではない。

【００５３】被検者の一定量の尿をアプリケーターでセ
ルロースアセテート膜に塗布を行う。なお、セルロース
膜は泳動用緩衝液であらかじめ平衡化しておく。市販の
泳動装置に装着し、陽極側にトリス−グリシン緩衝液、
陰極側にバルビタールナトリウム−ホウ酸緩衝液を加
え、泳動を一定の電圧で行う。泳動後、セルロースアセ
テート膜にトリクロロ酢酸−スルホサリチル酸液を加
え、ヒトアルブミンおよびヒトアルブミン分解物の固定
を行う。その後、純水で洗浄して抗ヒトアルブミン抗体
を一定温度で一定時間反応させる。界面活性剤を添加し
たＰＢＳでセルロースアセテート膜を洗浄し、ビオチン
化した抗ＩｇＧ抗体を一定温度で一定時間反応させる。
さらに洗浄を行った後、酵素標識アビジンを一定温度で
一定時間反応させる。洗浄後、発色剤により発色を行な
いヒトアルブミン分解物の有無を確認する。

【００５４】〔液体クロマトグラフ法〕液体クロマトグ
ラフィーの手法には、吸着クロマトグラフィー、イオン
交換クロマトグラフィー、パーティションクロマトグラ
フィー、ゲルフィルトレーションクロマトグラフィーさ
らにはアフィニティークロマトグラフィーなどがある
が、尿中のアルブミン分解物の分離分析にはこれらの液
体クロマトグラフィーの手法を単独もしくは各種液体ク
ロマトグラフィーの組合せで達成することができる。本
発明においてはアフィニティークロマトグラフィーとゲ
ルフィルトレーションクロマトグラフィーの組合せの例
を示すが、これに限定するものではない。

【００５５】まず、被検者の尿中よりヒトアルブミンと
ヒトアルブミン分解物の混合物を得るためには、抗ヒト
アルブミン抗体を結合した担体を用いるアフィニティー
クロマトグラフィーが有利に利用できる。担体への抗体
の結合は通常アガロースのような多糖類をハロゲン化シ
アン、特にシアノジェンブロマイド（ＢｒＣＮ）で処理
して得られる活性化アガロースに蛋白質のアミノ基を介
して共有結合させる方法が一般に利用されている。（Ａ
ｘｅｎ，Ｒ．，Ｐｏｒａｔｈ，Ｊ．＆ Ｅｒｎｂａｃ
ｋ，Ｓ．Ｎａｔｕｒｅ，２１４，１３０２，１９６７）

【００５６】アフィニティークロマトグラフィーに用い
る担体としては種々の多糖類などが報告され、担体と抗
体の結合は容易になされる。例えば、セファロース４Ｂ
（ファルマシア社製）をアルカリ条件（ｐＨ１１−１
２）下でＢｒＣＮと反応せしめ、ＢｒＣＮ活性化セファ
ロース４Ｂを作製する。タンパク質溶液、この場合には
抗ヒトアルブミン抗体などを通常ｐＨ８−１０の条件下
で加え、撹拌することにより目的のアフィニティークロ
マト用担体を得ることができる。

【００５７】ＢｒＣＮは毒物であるので、ＣＮＢｒ−ａ
ｃｔｉｖａｔｅｄ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ（登録商
標）（ファルマシア社製）を用いれば容易にタンパク
質、この場合には抗ヒトアルブミン抗体などをカップリ
ングさせることができる。さらに近年、高速液体グラフ
ィー用の活性化型担体も市販され、利用することができ
る。すなわち親水性ポリマーを利用したＴＳＫｇｅｌ
Ｇ５０００ＰＷ（東ソー社製）にトレシル基を導入した
ＴＳＫｇｅｌ Ｔｒｅｓｙｌ−５ＰＷ（東ソー社製）が
あり、これは蛋白質分子の一級アミノ基あるいはチオー
ル基と反応する担体である。

【００５８】リガンド部分に使用するタンパク質例え
ば、抗ヒトアルブミン抗体はいずれの動物種で得られた
ポリクロナール抗体、またはモノクロナール抗体でも可
能であり、自家調製でも容易に得ることができる。この
場合にはヒトアルブミンを家兎に免疫して得られた抗血
清をアフィニティーカラム（ヒトアルブミン−セファロ
ース４Ｂ）で精製することによりさらに純度のすぐれた
抗ヒトアルブミン抗体を得ることができる。アフィニテ
ィークロマトグラフィーにより得られるヒトアルブミン
とヒトアルブミン分解物の混合物はゲルフィルトレーシ
ョンクロマトグラフィーによりヒトアルブミンとヒトア
ルブミン分解物に分離分析することが可能である。

【００５９】一方、通常のセファデックス（ファルマシ
ア社製）などの担体をゲルフィルトレーションクロマト
グラフィーに用いることは可能であるが、サンプルが多
量に必要なこと、操作時間が長いことおよび再現性など
の点で問題となることもあり、通常余り好ましいとは言
えない。一方、高速液体クロマトグラフィーは短時間で
かつ、少量のサンプルで分離分析を行なうことができ、
さらに再現性にすぐれているなどの利点を有している。
通常蛋白質の高速液体クロマトグラフィーの充填剤とし
てはＴＳＫｇｅｌ（東ソー社製）、ＣＰＧ−１０（Ｅｌ
ｅｃｔｒｏ−Ｎｕｃｌｅｏｎｉｃｓ社製）、Ｐｒｏｔｅ
ｉｎ ｃｏｌｕｍｎ Ｉ−１２５（Ｗａｔｅｒｓ社製）
などが市販されているが、この中でもＴＳＫｇｅｌは分
子量からみて種々の排除限界を有する担体が揃ってお
り、担体への非特異的吸着が非常に弱く、タンパク質の
分離および分析には好適である。特に、ＴＳＫｇｅｌ
Ｇ３０００ＳＷ，ＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０００ＳＷｘＬお
よびＴＳＫｇｅｌ Ｇ２０００ＳＷ，ＴＳＫｇｅｌ Ｇ
２０００ＳＷｘＬは分子量からみてそれぞれの排除限界
は５００ＫＤａ，１００ＫＤａであり、ヒトアルブミン
（６７ＫＤ）とヒトアルブミン分解物の分離には両カラ
ムが適している。

【００６０】次に測定法の概要を示すが本法はその１例
であってこれに限定されるものではない。被検者の一定
量の尿サンプルを抗ヒトアルブミン結合担体に吸着させ
洗浄後、酸性下で溶出を行いヒトアルブミンとヒトアル
ブミン分解物を得る。得られた混合液を直接、高速ゲル
フィルトレーションクロマトグラフィーに付し、溶離パ
ターンを紫外部（Ａ２８０ｎｍ）の吸収により求める。
なお、検出感度をさらに向上させたい場合にはアフィニ
ティークロマトグラフィーの溶出液にＦＩＴＣなどの蛍
光物質を結合させ高速ゲルフィルトレーションクロマト
グラフィーの溶離パターンを蛍光強度で求めることもで
きる。

【００６１】

【実施例】次に実施例をもってさらに具体的に本発明を
説明するが、これによって本発明が限定されるものでは
ない。 〔実施例１〕尿中のヒトアルブミン分解物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ法によ
る検出 （ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法） 尿の可溶化：２％ＳＤＳ、２％２−メルカプトエタノー
ル、４０％グリセリンを含む２０ｍＭトリス−塩酸緩衝
液（ｐＨ６．８）に尿を等量加え５分間沸騰浴中で可溶
化した。 電気泳動：Ｌａｅｍｍｌｉの方法に準じて行なった。 濃縮ゲル４％、分離ゲル１２％のポリアクリルアミドゲ
ル（商品名ＳＤＳ−ＰＡＧＥｍｉｎｉ、テフコ株式会社
製）を用いた。各レーンに可溶化した被検尿を１０μｌ
注入した。泳動用緩衝液は０．１％ＳＤＳを含む３８０
ｍＭグリシン−５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．３）を
用い、泳動は２０ｍＡで１．５時間行なった。

【００６２】（イムノブロット法） 転写：泳動後のポリアクリルアミドゲルをＴｏｗｂｉｎ
らの方法により、ニトロセルロース膜（テフコ株式会社
製）に転写した。すなわち、泳動後のゲルをあらかじめ
冷却しておいた転写用緩衝液（２０％メタノールを含む
１９０ｍＭグリシン−２５ｍＭトリス緩衝液ｐＨ８．
３）に３０分間浸漬し、平衡化する。ポリアクリルアミ
ドゲルを陰極側、ニトロセルロース膜を陽極側としてブ
ロッティング装置に装着する。転写槽にはあらかじめ冷
却した転写用緩衝液を入れる。転写は氷冷下４２Ｖ、２
時間で行なった。

【００６３】ヒトアルブミンの検出：転写後、０．０５
％Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳ（ｐＨ７．２）でニトロセル
ロース膜を３回洗浄後、３％スキムミルク／ＰＢＳにて
４℃で１晩マスキングした。次にウサギ抗ヒトアルブミ
ン血清（ＭＢＬ社製）を１％ＢＳＡ／ＰＢＳにて１：２
００に希釈し、室温で１時間反応させた。反応後０．０
５％Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳで３回洗浄し、１％ＢＳＡ
／ＰＢＳにて１：４００に希釈したＨＲＰＯ抗ウサギＩ
ｇＧ抗体（Ｃａｐｐｅｌ社製）と室温で１時間反応させ
た。洗浄後、０．００７％過酸化水素水と０．０２５％
３，３′−ジアミノベンチジンを含む０．０５Ｍトリス
−塩酸緩衝液（ｐＨ７．２）（尾形研二、他、臨床病
理、３１，２１５，１９８３）にて発色させた。反応停
止は蒸留水により行ない、ヒトアルブミン分解物の有無
を確認した。健常者について行なったところ、ヒトアル
ブミン（６７ＫＤ）にのみにバンドが検出され、ヒトア
ルブミン分解物の存在は認められなかった。

【００６４】〔比較例１〕健常者５名、糖尿病性腎症の
患者４名、糖尿病患者９名の尿について各々実施例１と
同様の操作でヒトアルブミン分解物の検出を行なった。
図１に健常者尿のイムノブロットパターンの結果を示
す。健常者５名はすべてヒトアルブミン（６７ＫＤ）に
由来する１本のバンドしか検出されなかった。図２に健
常者の尿と糖尿病性腎症患者尿のイムノブロットパター
ンの結果を示す。糖尿病性腎症の患者ではヒトアルブミ
ン以外にさらに低分子域にヒトアルブミン分解物が４名
すべてに検出された。図３に健常者の尿と糖尿病患者尿
のイムノブロットパターンの結果を示す。糖尿病患者９
名のうち、６名にヒトアルブミン以外にさらに低分子域
にヒトアルブミン分解物が検出された。

【００６５】〔比較例２〕比較例１で使用した尿サンプ
ルを用いて微量アルブミンの検出を行ない、本法との感
度における比較を行なった。なお、微量アルブミンの検
出にはアルブシュア（登録商標）（エーザイ株式会社）
を用いた。表１に結果を示す。

【００６６】〔実施例２〕尿中のヒトアルブミン分解物の等電点電気泳動法による
検出 ヒト尿を下記に示すサンプルバッファーで５倍に希釈し
た。 〔サンプルバッファー：Ｓｅｒｖａｌｙｔ（Ｓｅｒｖａ
社）ｐＨ３−１０，０．２ｍｌ、グリセロール３．０ｍ
ｌを蒸留水で１０ｍｌとしたもの。〕 上記で調製した尿試料液をＩＥＦ ＰＡＧＥｍｉｎｉ
ｐＨ３−１０（テフコ社製）のレーンに１０μｌ注入し
た。泳動緩衝液は陰極側に０．０５Ｍ ＮａＯＨ、陽極
側に０．０１Ｍ Ｈ₃ ＰＯ₄ を用い、１００Ｖ３０分、
２００Ｖ３０分、５００Ｖ６０分と段階的に電圧をかけ
て泳動を行なった。泳動後、ゲルをあらかじめ冷却して
おいた０．５％酢酸に３０分浸漬し平衡化した。ニトロ
セルロース膜（Ｓ＆Ｓ社製）をブロッティング装置の陰
極側にポリアクリルアミドゲルを陽極側に装着した。転
写槽にはあらかじめ冷却した０．５％酢酸を入れ、転写
は氷冷下４２Ｖ、２時間で行なった。

【００６７】転写後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢ
Ｓ（ｐＨ７．２）でニトロセルロース膜を３回洗浄後、
３％スキムミルク／ＰＢＳにて４℃、１晩マスキングし
た。次にウサギ抗ヒトアルブミン血清（ＭＢＬ社製）を
１％ＢＳＡ／ＰＢＳにて１：２００に希釈し、室温で１
時間反応させた。反応後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０−
ＰＢＳで３回洗浄し、１％ＢＳＡ／ＰＢＳにて１：４０
０に希釈したＨＲＰＯ抗ウサギＩｇＧ抗体（Ｃａｐｐｅ
ｌ社製）と室温で１時間反応させた。洗浄後、０．００
７％過酸化水素水と０．０２５％３，３′−ジアミノベ
ンチジンを含む０．０５Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ
７．２）（尾形研二、他、臨床病理，３１，２１５，１
９８３）にて発色させた。発色後、蒸留水で洗浄しヒト
アルブミン分解物の有無を確認した。なお、健常者の尿
について行なったところ、対照のヒトアルブミン（６７
ＫＤ）と移動度が同じ等電点（以下ｐＩと略す）４．０
付近に単一バンドとして検出された。

【００６８】〔比較例３〕健常者１名、糖尿病患者２
名、糖尿病性腎症の患者１名について等電点電気泳動転
写法にて検出を行なった。その結果を図４に示す。健常
者および糖尿病患者１についてはヒトアルブミン（６７
ＫＤ）に由来するバンドがｐＩ ４．０付近に単一バン
ドとして認められたが、糖尿病患者２および糖尿病性腎
症の患者についてはｐＩ５〜７付近にヒトアルブミン分
解物が数本から十数本のバンドとして認められた。

【００６９】〔実施例３〕セルロースアセテート膜からの転写発色法を用いた尿中
のヒトアルブミン分解物の検出 （電気泳動操作）０．３４Ｍトリス−グリシン緩衝液
（ｐＨ９．１）にて平衡化したセルロースアセテート膜
（商品名タイタンIII −ＺＺ、ヘレナ研究所社製）に尿
サンプルをアプリケーター（商品名スーパーＺアプリケ
ーター、ヘレナ研究所社製）を用い、約１μｌを塗布し
た。泳動用緩衝液は陽極側に０．３４Ｍトリス−グリシ
ン緩衝液（ｐＨ９．１）、陰極側に０．０５Ｍバルビタ
ールナトリウム−ホウ酸緩衝液（ｐＨ８．９）（商品名
エレクトラＡＣバッファー、ヘレナ研究所社製）を用
い、泳動条件は１００Ｖで４５分間で行った。

【００７０】（転写操作）泳動後のセルロースアセテー
ト膜をニトロセルロース膜に転写するにあたり、泳動後
のセルロースアセテート膜に２０％メタールを含む０．
１９Ｍグリシン−０．０２５Ｍトリス緩衝液（ｐＨ８．
３）で平衡化したニトロセルロース膜を圧着し、室温で
５分間転写を行った。

【００７１】（発色操作）ウサギ抗ヒトアルブミン抗体
（ＭＢＬ社製）を１％ＢＳＡ／ＰＢＳにて１：４００に
希釈し、室温で３０分反応させた。反応後、０．０５％
Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳで３回洗浄し、１％ＢＳＡ／Ｐ
ＢＳにて１：２０００に希釈したビオチン抗ウサギＩｇ
Ｇ抗体（Ｃａｐｐｅｌ社製）と室温で３０分間反応させ
た。次に０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳで洗浄後、
ストレプトアビジン−ＨＲＰＯ（Ｚｙｍｅｄ社製）を１
％ＢＳＡ／ＰＢＳにて１：１０００に希釈し、室温で３
０分間反応させた。反応後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０
−ＰＢＳで洗浄を行い、０．００７％過酸化水素水と
０．０２５％３，３′−ジアミノベンチジンを含む０．
０５Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．２）にて発色させ
た。発色後、純水で洗浄しヒトアルブミン分解物の有無
を確認した。健常者の尿について行ったところ、対照の
ヒトアルブミン（６７ＫＤ）と移動度が同じ単一バンド
で検出され、ヒトアルブミン分解物の存在は認められな
かった。

【００７２】〔実施例４〕セルロースアセテート膜上での直接固定化発色法による
尿中のヒトアルブミン分解物の検出 （電気泳動操作）０．３４Ｍトリス−グリシン緩衝液
（ｐＨ９．１）にて平衡化したセルロースアセテート膜
（商品名タイタンIII −ＺＺ、ヘレナ研究所社製）に被
検尿をアプリケーター（商品名スーパーＺアプリケータ
ー、ヘレナ研究所社製）を用い、約１μｌ塗布した。泳
動用緩衝液は陽極側に０．３４Ｍトリス−グリシン緩衝
液（ｐＨ９．１）、陰極側に０．０５Ｍバルビタールナ
トリウム−ホウ酸緩衝液（ｐＨ８．９）（商品名エレク
トラＡＣバッファー、ヘレナ研究所社製）を用い、泳動
条件は１００Ｖで４５分間行った。

【００７３】（タンパク質の固定化操作）泳動終了後、
５％トリクロロ酢酸−５％スルホサリチル酸液でセルロ
ースアセテート膜上のタンパク質を固定し、蒸留水で３
回洗浄した。

【００７４】（発色操作）ウサギ抗ヒトアルブミン抗体
（ＭＢＬ社製）を１％ＢＳＡ／ＰＢＳにて１：４００に
希釈し、室温で３０分反応させた。反応後、０．０５％
Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳで３回洗浄し、１％ＢＳＡ／Ｐ
ＢＳにて１：２０００に希釈したビオチン抗ウサギＩｇ
Ｇ抗体（Ｃａｐｐｅｌ社製）と室温で３０分反応させ
た。次に０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳにて洗浄
後、ストレプトアビジン−ＨＲＰＯ（Ｚｙｍｅｄ社製）
を１％ＢＳＡ／ＰＢＳにて１：１０００に希釈し、室温
で３０分反応させた。反応後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２
０−ＰＢＳにて洗浄を行い、０．００７％過酸化水素水
と０．０２５％３，３′−ジアミノベンチジンを含む
０．０５Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．２）にて発色
させた。発色後、蒸留水で洗浄してヒトアルブミン分解
物の有無を確認した。健常者の尿について行ったとこ
ろ、対照のヒトアルブミン（６７ＫＤ）と移動度が同じ
単一バンドで検出され、ヒトアルブミン分解物の存在は
認められなかった。

【００７５】〔比較例４〕健常者１名、糖尿病患者２
名、糖尿病性腎症の患者１名について、各々の尿を先の
実施例３，４で記載した方法すなわち、セルロースアセ
テート膜からの転写発色法およびセルロースアセテート
膜上での直接固定化発色法を用い、それぞれの泳動パタ
ーンの比較を行った。その結果を図５にセルロースアセ
テート膜からの転写発色法でのイムノブロットパターン
を示す。健常者および糖尿病患者１についてはヒトアル
ブミン（分子量６７，０００）に由来する単一バンドの
みが検出された。一方、糖尿病患者２および糖尿病性腎
症の患者では、アルブミン分解物が数多くのバンドとし
て検出された。一方、図６にセルロースアセテート膜上
での直接固定化発色法のイムノブロットパターンの結果
を示す。セルロースアセテート膜からの転写発色法と同
様の泳動パターンを示したが、拡散または発色などの強
弱によりヒトアルブミン分解物の各バンドが巾の広いバ
ンドとして検出された。

【００７６】〔実施例５〕ゲルフィルトレーションクロマトグラフィーによるヒト
アルブミンとヒトアルブミン分解物（ＢｒＣＮ分解）の
分離分析 （標品の調製）ヒトアルブミンの標品はクロマトグラフ
ィーによる精製品（Ｃａｐｐｅｌ社製）を用いた。一
方、ＢｒＣＮによるアルブミン分解物はＭｃＭｅｎａｍ
ｙらの方法（Ｊ．Ｂｉｏｌ，Ｃｈｅｍ．，２４６，４７
４４−４７５０，１９７１）に準じて調製した。すなわ
ち、ヒトアルブミン（フラクションＶ、シグマ社製）１
ｇを蒸留水４ｍｌに溶解した後、蟻酸１６ｍｌ、ＢｒＣ
Ｎ１ｇを加え、４℃、２４時間反応させた。次に、あら
かじめ１％プロピオン酸で平衡化したセファデックスＧ
−２５（ファルマシア社製）に付し、２８０ｎｍの吸収
を示す画分を集め、アルブミン分解物８００ｍｇを得
た。

【００７７】（ゲルフィルトレーションクロマトグラフ
ィー）ＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０００ＳＷ（７．５ｍｍφ×
６０ｃｍ）を、ｐＨ３．０の０．５５Ｍグリシン−塩酸
緩衝液を作り、これにＮａＣｌを０．１５モルになるよ
うに加え、さらにＳＤＳを０．１重量％になるように加
え、均一な溶液とし、これを用いて平衡化を行った。ヒ
トアルブミンおよびヒトアルブミン分解物を上記緩衝液
で１ｍｇ／ｍｌに溶解した。ヒトアルブミン分子にはＳ
−Ｓ結合が１７個所にわたって存在するため１％２−メ
ルカプトエタノールを加えた試料も別途に調製した。こ
の試料をカラムに１００μｌ注入し、溶離液を流速０．
６ｍｌ／ｍｉｎで通液し、検出は紫外部（Ａ２８０ｎ
ｍ）で行った。その結果を図７に示すように、非還元条
件下でヒトアルブミンは単一のピークとして示される
が、ヒトアルブミン分解物は４つのピークに分離した。
また、還元条件下ではヒトアルブミンは非還元と同様に
単一ピークであるがヒトアルブミン分解物は先きの４ピ
ークがさらに低分子領域に移動し、還元条件下でのクロ
マトグラフィーの方が分子量の差による分離が明確に示
された。

【００７８】〔実施例６〕糖尿病患者尿を用いたアフィニティークロマトグラフィ
ー、ゲルフィルトレーションクロマトグラフィーの組合
せによるヒトアルブミン分解物の検出 （その１）（抗ヒ
トアルブミン抗体−セファロース４Ｂの調製法） ＣＮＢｒ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ
４Ｂ（登録商標）（ファルマシア社製）３ｇ（約１０ｍ
ｌのゲル）を１ｍＭ ＨＣｌ中で膨潤させ、１ｍＭ Ｈ
Ｃｌ ５００ｍｌで洗浄後、０．５Ｍ ＮａＣｌを含む
０．１Ｍ ＮａＨＣＯ₃ 溶液（ｐＨ８．３）（以下カッ
プリングバッファーと呼ぶ）５００ｍｌで洗浄を行っ
た。あらかじめカップリングバッファーに溶解したアフ
ィニティークロマトグラフィーで精製したウサギ抗ヒト
アルブミン抗体５０ｍｇを加え、室温２時間反応させ
た。その後、カップリングバッファー５００ｍｌで洗浄
後、０．２Ｍグリシン溶液、ｐＨ８．０ ５０ｍｌで室
温、２時間残存活性基をブロックし、過剰の吸着タンパ
ク質を除去するため、カップリングバッファーと０．５
５Ｍグリシン−塩酸緩衝液（ｐＨ３．０）で交互にアフ
ィニティークロマトグラフ用担体を洗浄した。本担体は
１ｍｌゲルあたり５ｍｇの抗ヒトアルブミン抗体が結合
したものであった。

【００７９】（イムノアフィニティークロマトグラフィ
ー）尿サンプル（２ｍｌ）をあらかじめ５ｍＭホウ酸緩
衝液（ｐＨ８．０）で平衡化した抗ヒトアルブミン抗体
−セファロース４Ｂ（３ｍｌ）に吸着させた。吸着後５
倍量の５ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ８．０）で洗浄し、
０．５Ｍグリシン緩衝液（ｐＨ３．０）にて溶出を行っ
た。紫外部（Ａ２８０ｎｍ）の吸収を示す分画を集めヒ
トアルブミンおよびヒトアルブミン分解物の混合液（２
ｍｌ）を得た。

【００８０】（ＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０００ＳＷを用いた
アルブミンとアルブミン分解物の分離分析）ＴＳＫｇｅ
ｌ Ｇ３０００ＳＷ（７．５ｍｍφ×６０ｃｍ）を、ｐ
Ｈ３．０の０．５５Ｍグリシン−塩酸緩衝液を作り、こ
れにＮａＣｌを０．１５モルになるように加えさらにＳ
ＤＳを０．１重量％になるように加え、均一な溶液と
し、これを用いて平衡化を行った。イムノアフィニティ
ークロマトグラフィーの溶離液〔ヒトアルブミンとヒト
アルブミン分解物の混合液（１ｍｌ）〕に終濃度０．１
％になるようにＳＤＳを加え、その１００μｌを注入し
た。溶離液は流速０．６ｍｌ／ｍｉｎ通液し、検出は紫
外部（Ａ２８０ｎｍ）で行った。

【００８１】（尿サンプル）健常者１名、糖尿病患者２
名、糖尿病性腎症１名の尿について分析を行った。その
結果を図８に示すと、健常者および糖尿病患者１の尿で
はヒトアルブミンの単一ピークが認められたが、糖尿病
患者尿２ではヒトアルブミンのピークの他にヒトアルブ
ミン分解物のピークが認められた。さらに糖尿病性腎症
患者においてもヒトアルブミン分解物が顕著に認められ
た。

【００８２】〔実施例７〕糖尿病患者の尿を用いたアフィニティークロマトグラフ
ィー、ゲルフィルトレーションクロマトグラフ法の組合
せによるヒトアルブミン分解物の検出 （その２） （抗ヒトアルブミン抗体−ＴＳＫｇｅｌ ５ＰＷの調
製）ＴＳＫｇｅｌ Ｔｒｅｓｙｌ−５ＰＷ０．５ｇに
１．０Ｍリン酸カリウム２ｍｌ、ウサギ抗ヒトアルブミ
ン抗体２０ｍｇを加え、三角フラスコで室温１６時間振
とうしながら固定化を行なった。固定された抗ヒトアル
ブミン抗体量はゲル１ｍｌあたり９ｍｇであった。この
抗ヒトアルブミン抗体−ＴＳＫｇｅｌ ５ＰＷ（１．０
ｍｌ）を１０ｍｍφ×２０ｍｍにアスピレーターによる
減圧下で充填し、高速イムノアフィニティーカラムとし
た。カラムのヒトアルブミン結合量はゲル１ｍｌあたり
２ｍｇであった。

【００８３】（抗ヒトアルブミン抗体−ＴＳＫｇｅｌ
５ＰＷを用いたヒトアルブミンおよびヒトアルブミン分
解物の精製）抗ヒトアルブミン抗体−ＴＳＫｇｅｌ ５
ＰＷカラム（１０ｍｍφ×２０ｍｍ）を高速液体クロマ
トグラフ装置に装着し、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ
７．４）を流速２．０ｍｌ／ｍｉｎで洗浄した。尿検体
５０〜１００μｌを注入し、溶出は０．１Ｍクエン酸−
塩酸（ｐＨ１．６）で行い、溶出時間は１０分以内で完
了した。

【００８４】（ＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０００ＳＷを用いた
ヒトアルブミンとヒトアルブミン分解物の分離）ＴＳＫ
ｇｅｌ Ｇ３０００ＳＷ（７．５ｍｍφ×６０ｃｍ）
を、ｐＨ３．０の０．５５Ｍグリシン−塩酸緩衝液を作
り、これにＮａＣｌを０．１５モルになるように加えさ
らにＳＤＳを０．１重量％になるように加え、均一な溶
液とし、これを用いて平衡化を行った。イムノアフィニ
ティークロマトグラフィーの溶離液〔ヒトアルブミンと
ヒトアルブミン分解物の混合液（２ｍｌ）〕をｐＨ３．
０に調整し、終濃度０．１％になるようにＳＤＳを加え
た試料を１００μｌ注入した。溶離液は流速０．６ｍｌ
／ｍｉｎで通液し、検出は紫外部（Ａ２８０ｎｍ）で行
った。

【００８５】（尿サンプル）健常者１名、糖尿病患者２
名、糖尿病性腎症１名の尿について分析を行ったが、実
施例６と全く同様な結果が得られたのでデーターは省略
した。

【００８６】

【表１】

【００８７】ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法による分析の結果、糖
尿病では本法９例中６例が陽性であったのに対し、微量
アルブミン検出法では全例陰性を示した。さらに、糖尿
病腎症では本法および微量アルブミン検出法とも全例陽
性であった。一方、健常者においては両方とも全例陰性
であった。したがって、本法は糖尿病に対して従来の方
法より感度が良く、特に糖尿病の腎症の早期発見に役立
つことが判明した。

【図面の簡単な説明】

【図１】ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法による健常者５名の免疫転
写法のパターンを示す写真である。

【図２】ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法による健常者と糖尿病性腎
症４名の免疫転写法のパターンを示す写真である。

【図３】ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法による健常者と糖尿病９名
の免疫転写法のパターンの写真である。

【図４】等電点ゲル電気泳動−免疫転写法による健常者
と糖尿病患者の尿中のヒトアルブミンおよびヒトアルブ
ミン分解物の比較である。

【図５】セルロースアセテート膜電気泳動−免疫転写法
による健常者と糖尿病患者の尿中のヒトアルブミンおよ
びヒトアルブミン分解物の比較である。

【図６】セルロースアセテート膜電気泳動−免疫直接発
色法による健常者と糖尿病患者の尿中のヒトアルブミン
およびヒトアルブミン分解物の比較である。

【図７】ヒトアルブミンをＢｒＣＮで分解したヒトアル
ブミン分解物の高速液体クロマトグラムである。

【図８】高速液体クロマトグラフィーによる健常人およ
び糖尿病患者の尿中のヒトアルブミン、ヒトアルブミン
分解物の比較である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 33/493 Ａ 7055−2Ｊ 33/561 9015−2Ｊ 33/68 7055−2Ｊ

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 微量アルブミン尿（マイクロアルブミン
   ウリヤ）を呈しない糖尿病患者の尿中のヒトアルブミン
   分解物を検出することによる糖尿病性腎症の早期診断
   法。
2. 【請求項２】 上記の微量アルブミン尿を呈しない糖尿
   病患者の尿中のヒトアルブミン分解物の検出が電気泳動
   法で尿中のタンパク質を分離後、免疫化学的分析方法に
   より検出する請求項１記載の方法。
3. 【請求項３】 微量アルブミン尿を呈しない糖尿病患者
   の尿をＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動または等
   電点ゲル電気泳動で尿中のタンパク質を分離後、ゲル中
   の分離されたタンパク質を転写用支持体に転写固相化
   し、該固相化支持体に一次抗体として抗ヒトアルブミン
   抗体を反応させた後、酵素を標識した２次抗体を反応さ
   せ、しかる後、酵素の検出試薬を用いてヒトアルブミン
   とヒトアルブミン分解物を着色させ、ヒトアルブミン分
   解物を検出することを特徴とする請求項２記載の方法。
4. 【請求項４】 微量アルブミン尿を呈しない糖尿病患者
   の尿をセルロースアセテート膜上で電気泳動を行うこと
   により、尿中のタンパク質を分離して、次いで膜上の分
   離されたタンパク質を直接または転写用支持体に固相化
   し、該固相化支持体に一次抗体として抗ヒトアルブミン
   抗体を反応させた後、二次抗体としてビオチン抗ＩｇＧ
   抗体を反応させ、さらに酵素標識したアビジンを反応さ
   せ、しかる後に酵素の検出試薬を用いてヒトアルブミン
   とヒトアルブミン分解物を着色させ、ヒトアルブミン分
   解物を検出することを特徴とする請求項２記載の方法。
5. 【請求項５】 上記微量アルブミン尿を呈しない糖尿病
   患者の尿中のヒトアルブミン分解物の検出が液体クロマ
   トグラフィーを用いた分析方法である請求項１記載の方
   法。
6. 【請求項６】 微量アルブミン尿を呈しない糖尿病患者
   の尿から抗ヒトアルブミン抗体を用いたアフィニティク
   ロマトグラフィーにより、ヒトアルブミンとヒトアルブ
   ミン分解物の混合物を収得し、さらにこの混合物をゲル
   クロマトグラフィーを用いてヒトアルブミンとヒトアル
   ブミン分解物に分離することによりヒトアルブミン分解
   物を検出することを特徴とする請求項５記載の方法。
7. 【請求項７】 アフィニティークロマトグラフィーのリ
   ガンドが抗ヒトアルブミン抗体である請求項６記載の方
   法。
8. 【請求項８】 ゲルフィルトレーションに用いる担体が
   タンパク質の分離分析に用いられる担体である請求項６
   記載の方法。